Метаболічна інженерія неконвенційних дріжджів Candida famata з метою конструювання надпродуцентів флавінових нуклеотидів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ

УДК 577.21+582.282.23+579.222:577.164.1

МЕТАБОЛІЧНА ІНЖЕНЕРІЯ НЕКОНВЕНЦІЙНИХ ДРІЖДЖІВ Candida famata З МЕТОЮ КОНСТРУЮВАННЯ НАДПРОДУЦЕНТІВ ФЛАВІНОВИХ НУКЛЕОТИДІВ

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ЯЦИШИН ВАЛЕНТИНА ЮРІЇВНА

Львів 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка МОН України та у відділі молекулярної генетики і біотехнології Інституту біології клітини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Федорович Дарія Василівна, Львівський національний університет імені Івана Франка, біологічний факультет, професор кафедри мікробіології; Інститут біології клітини НАН України, відділ молекулярної генетики і біотехнології, провідний науковий співробітник

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, академік НАН України, професор Підгорський Валентин Степанович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, директор, завідувач відділу фізіології промислових мікроорганізмів

доктор біологічних наук, професор Лущак Володимир Іванович, Прикарпатський національний університет імені Василя Стефаника, завідувач кафедри біохімії

Захист відбудеться «7» квітня 2010 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01, Інститут біології клітини НАН України, 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України, 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розісланий «5» березня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук В. М. Убийвовк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

флавінаденіндинуклеотид фермент штам нуклеотид

Актуальність теми. Флавінові нуклеотиди - біологічно активні похідні рибофлавіну (РФ), відіграють важливу роль у живих системах, оскільки вони задіяні в метаболізмі вуглеводів, жирів і білків, синтезі вітаміну В₁₂, піридоксин 5?-фосфату, а також у процесах генерації енергії, активації кисню, біолюмінесценції та фототропізмі.

Вітамін В₂ (РФ) виконує свої метаболічні функції переважно у вигляді флавінмононуклеотиду (ФМН) та флавінаденіндинуклеотиду (ФАД) у складі флавіновмісних білків. Відомо сотні флавопротеїнів, більшість із них містять нековалентно зв'язані ФАД чи ФМН або обидві форми флавінів. Флавіни беруть участь у різних ланках метаболізму клітини, тому порушення в обміні флавінових коферментів призводять до серйозних змін на клітинному та тканинному рівнях. Пошкодження мітохондріальних мембран, зниження вмісту білка в мітохондріях, зміни морфології мітохондрій, структури і функцій клітини, які супроводжуються дегенерацією тканин - це неповний перелік процесів, що виникають при порушенні метаболізму флавінів. Флавінові коферменти (зокрема ФМН) мають вищий від РФ терапевтичний потенціал при лікуванні деяких захворювань (дерматози, захворювання очей). ФМН, як активна форма вітаміну В₂, входить до складу вітамінних препаратів та харчових барвників. Широке застосування коферментних форм вітаміну В₂ гальмується їх високою вартістю та відсутністю активних промислових продуцентів ФМН і ФАД.

Оскільки флавопротеїни беруть участь у численних клітинних процесах, їх синтез, транспорт та деградація повинні чітко регулюватись. Дослідження механізмів регуляції біосинтезу флавінових нуклеотидів у мікроорганізмів є важливою фундаментальною науковою проблемою, а також має значення для конструювання надпродуцентів ФМН і ФАД. Відомо досить багато мікроорганізмів, здатних до надсинтезу РФ, проте не описано жодного прикладу прямого мікробного синтезу значних кількостей ФМН і лише мутанти цвільового гриба Eremothecium ashbyii здатні до надсинтезу ФАД, однак такі штами-продуценти нестабільні.

Препарати флавінових нуклеотидів, які отримують шляхом хімічного синтезу, містять значну кількість РФ і фосфорних ефірів. Штами бактерій Corynebacterium ammoniagenes, сконструйовані із застосуванням методів генетичної інженерії, хоч і були здатними до перетворення екзогенного РФ до ФМН, але потребували додавання до середовища РФ (оскільки не здатні до надсинтезу вітаміну В₂) та сполуки з високою вартістю - АТФ (Hagihara et al., 1995).

Ферменти, які забезпечують перетворення РФ до ФМН і ФАД описано у різних видів мікроорганізмів (цит. за Сибірний та співавт., 2006). Структурні гени біосинтезу ФМН та ФАД було клоновано у дріжджів Saccharomyces cerevisiae та бактерії C. ammoniagenes (Nakagawa et al., 1995; Wu et al., 1995; Santos et al., 2000). Встановлено, що у здатних до надсинтезу РФ дріжджів іони заліза не задіяні в регуляції синтезу ферментів, які забезпечують перетворення РФ у флавінові нуклеотиди, на відміну від ферментів біосинтезу РФ. Молекулярні механізми регуляції згаданих вище процесів дотепер остаточно не з'ясовані.

Доброю моделлю для дослідження генетичного контролю біосинтезу флавінових нуклеотидів є дріжджі Сandida famata. У цього мікроорганізму клоновано структурні та деякі регуляторні гени флавіногенезу, розроблено ряд методів молекулярної генетики (трансформація, інсерційний мутагенез, аналіз промоторних ділянок та інші). Дріжджі C. famata є також промисловими продуцентами вітаміну В₂, крім того, вони виділяють незначні кількості ФМН у культуральну рідину. Можна сподіватись, що надекспресія генів, які кодують ферменти біосинтезу флавінових нуклеотидів у C. famata, дасть можливість отримати штами з високою активністю цих ферментів, що утворюватимуть значні кількості ФМН і ФАД.

На даний момент в Україні відсутнє виробництво вітаміну В₂ та його похідних біологічно активних форм - ФМН і ФАД. Основною перевагою мікробіологічного синтезу ФМН та ФАД є відсутність утворення побічних продуктів, які можуть мати небажану біологічну активність. Конструювання продуцентів флавінових нуклеотидів на основі флавіногенних дріжджів дасть змогу використати їх для промислової продукції цих коферментів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота була виконана у рамках цільової наукової програми НАН України «Новітні медико-біологічні проблеми та оточуюче середовище людини», розділ 2: «Біологічно-активні речовини для здоров'я людини» за темами «Створення штамів флавіногенних дріжджів Candida famata, здатних до надсинтезу флавінового коферменту, флавінмононуклеотиду (ФМН)» (№ держреєстрації 0104U007458, 2004-2006 рр.) та «Конструювання стабільного продуцента флавінового коферменту, флавінмононуклеотиду (ФМН) на основі дріжджів Candida famata» (№ держреєстрації 0107U007747, 2007-2009 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи була розробка підходів до конструювання надсинтетиків ФМН та ФАД на основі флавіногенних дріжджів C. famata, використовуючи методи метаболічної інженерії. Відповідно до мети, були поставлені наступні завдання:

У розділі викладено дані про структуру, метаболічні функції та застосування флавінів, біосинтез флавінових нуклеотидів та його регуляцію в мікроорганізмів, локалізацію і транспорт флавінових коферментів, їх катаболізм. Також проаналізовано та узагальнено дані літератури щодо біотехнологічного отримання ФМН і ФАД. На основі аналітичного огляду наукової літератури обґрунтовано необхідність та перспективність проведення досліджень за темою дисертації.

Матеріали і методи досліджень.

У роботі використовували штами дріжджів C. famata і D. hansenii дикого типу та сконструйовані протягом виконання роботи рекомбінантні штами, що містили гени FMN1 та FAD1 D. hansenii під контролем промоторів RIB1 або TEF1 C. famata. Дріжджові штами вирощували при 28-30 °С у багатому середовищі YPD (2% глюкоза, 1% бактопептон, 0,5% дріжджовий екстракт) та модифікованому мінеральному середовищі Беркгольдера (СБ). Виділення та очистку плазмідної ДНК, підготовку і трансформацію компетентних клітин E. coli, електрофорез ДНК в агарозному гелі, елюцію фрагментів ДНК із агарозного гелю, розщеплення ДНК рестриктазами, дефосфорилювання «липких» кінців ДНК, лігування лінеаризованих фрагментів ДНК, ампліфікацію фрагментів ДНК за допомогою полімеразнї ланцюгової реакції (ПЛР), аналіз ДНК методом гібридизації за Саузерном здійснювали як описано в Sambrook et al. (1989) із застосуванням модифікацій (Voronovsky et al., 2002).

Вміст різних форм флавінів визначали на флюорометрі Turner Quantech Digital Filter Fluorometer FM109510-33 після хроматографічного розділення у 2,5% гідрофосфаті натрію.

Визначення активності ферментів проводили у безклітинних екстрактах після визначення концентрації білка за методом Лоурі. Визначення активності ГТФ-циклогідролази ІІ проводили як описано Шавловським та співавт. (1980), РФ-синтази - за Плаутом (Plaut, 1963) із наступними модифікаціями, внесеними Шавловським та співавт. (1972), РФ-кінази - за Кащенком та Шавловським (1976), ФАД-синтетази - за Шавловським та Федорович (1977), а визначення активності фосфатаз - за Струговщиковою та співавт. (1973, 1976). За одиницю активності ферменту [Од] приймали його кількість, яка забезпечує синтез 1 мкмоль продукту за 1 хв.

Для виявлення компонентів середовища, важливих для продукції ФМН і ФАД, застосовувався аналіз Плакетта-Бермана (Plackett and Burman, 1946), який полягає у вивченні впливу різних факторів на отримання цільового продукту. Аналіз «на поверхні відзиву» використовувався для оптимізації концентрації досліджуваних компонентів середовища і для цього було застосовано центральний композиційний аналіз (Montgomery, 1997). Статистичний аналіз математичних моделей здійснено за допомогою пакету статистики ANOVA. Для цих процедур було використано програмний пакет Statistica® 6.0 Stat Soft, Inc.

У роботі використовували комп'ютерні бази даних відомих генів. Статистичну обробку результатів проводили стандартними методами. Графічне відображення одержаних результатів здійснювали за допомогою програмних пакетів Statistica® 6.0 Stat Soft, Inc. та OriginPro 7.5 SR5 v7.5870 (B870), OriginLab Corporation. Набір і макетування тексту проводили за допомогою програми Microsoft® Office Word 2003 SP3.

Результати досліджень.

Отримання рекомбінантних штамів дріжджів Candida famata, що містять ген FMN1 під контролем промотора RIB1. Клоновано ген FMN1 (кодує РФ-кіназу) флавіногенних дріжджів D. hansenii. Сконструйовано вектори для експресії гена FMN1 D. hansenii або Candida albicans під контролем сильного, регульованого іонами двовалентного заліза, промотора RIB1 C. famata. Автономну реплікацію відповідних плазмід забезпечував ARS елемент C. famata. Цими плазмідами трансформували реципієнтний штам C. famata L20105 (Leu-), селекцію Leu⁺ трансформантів, які містили плазміду з геном FMN1, проводили на мінімальному середовищі СБ без лейцину. Наявність рекомбінантних конструкцій у геномі трансформантів перевіряли за допомогою ПЛР із використанням відповідних праймерів до промотора RIB1 та гена FMN1. Для підтвердження наявності автономних реплікативних плазмід у клітинах трансформантів, ці плазміди виділяли через ретрансформацію в E. coli.

Отримано колекцію рекомбінантних штамів флавіногенних дріжджів C. famata та проаналізовано їх фенотипові характеристики (РФ-кіназна активність, вміст флавінів у клітинах та культуральному середовищі). Трансформанти, які містили ген FMN1 C. albicans або модифікований (без інтрона) ген FMN1 D. hansenii під контролем промотора RIB1 у складі реплікативної плазміди за питомою активністю РФ-кінази та вмістом флавінів не відрізнялись від батьківського штаму C. famata L20105. Трансформанти, що містили немодифікований ген FMN1 (з інтроном) у складі реплікативної плазміди, виявляли у 8-12 разів вищу питому активність РФ-кінази, ніж батьківський штам, однак не нагромаджували ФМН у культуральній рідині.

Наступний етап роботи полягав у конструюванні інтегративних плазмід, які несуть ген FMN1 C. albicans і D. hansenii під промотором RIB1, та отриманні відповідних рекомбінантних штамів C. famata. Плазмідами трансформували реципієнтний штам C. famata L20105, серед низки трансформантів відібрано стабільні інтегранти, які не втрачали плазміду в неселективних умовах. Сконструйовані рекомбінантні штами не мали вищої, ніж штам дикого типу, питомої активності РФ-кінази та не були здатними до надсинтезу ФМН.

Проведені експерименти свідчать про принципову можливість отримання рекомбінантних штамів із підвищеною питомою активністю РФ-кінази внаслідок заміни нативного промотора гена FMN1 на сильний регульований промотор RIB1.

Отримання та властивості рекомбінантних штамів дріжджів C. famata, що містять ген FMN1 під контролем промотора TEF1. Оскільки використання промотора RIB1 для конструювання надсинтетиків ФМН було неефективним, застосовували інший промотор, а саме промотор гена TEF1 C. famata. Для отримання відповідних штамів сконструйовано плазміди, що містили ген FMN1 D. hansenii (з інтроном) під контролем промотора TEF1 (рис. 1). Плазмідою pTFMN1 (див. рис. 1, А) протрансформовано штам L20105 C. famata. Серед низки рекомбінантних штамів відібрано стабільні інтегранти (позначено як Т-І). Наявність в геномі трансформантів гена FMN1 під контролем промотора TEF1 підтверджено за допомогою ПЛР.

Частина відібраних рекомбінантних штамів (Т-І 3, 9, 18, 33) характеризувалась у 4-8 разів вищою питомою активністю РФ-кінази та 9-15-кратним зростанням продукції ФМН у порівнянні з вихідним штамом C. famata L20105 при інкубації за умов дефіциту заліза (табл. 1). У культуральному середовищі отриманих рекомбінантних штамів 37-41% від загального вмісту флавінів припадало на ФМН, в той час як у вихідного штаму L20105 та штаму К9 (отриманий трансформацією плазмідою без гена FMN1) вміст ФМН не перевищував 10%.

Таблиця 1

Питома активність РФ-кінази та вміст флавінів у культуральній рідині рекомбінантних штамів C. famata, що містять ген FMN1 D. hansenii під контролем промотора TEF1

«-»: не визначали; Р < 0,05 (*) та Р < 0,025 (**)

Незважаючи на високу питому активність РФ-кінази, в культуральній рідині рекомбінантних штамів нагромаджувалась значна кількість РФ, але вміст ФМН у культуральному середовищі був досить низьким.

Для з'ясування того, чи введення додаткових копій гена FMN1 під контролем сильного промотора TEF1 у геном C. famata призведе до підвищення питомої активності РФ-кінази і зростання кількості синтезованого ФМН у культуральній рідині, плазмідою pTRIB1_FMN1 (див. рис. 1, Б) було протрансформовано отриманий нами штам C. famata Т-І 18, який характеризувався підвищеною активністю РФ-кінази. Стабільні інтегранти (позначено як T-RM), що містили введену рекомбінантну конструкцію, відбирали для подальшого аналізу. Щоби з'ясувати, скільки копій гена FMN1 інтегрувалося у геном C. famata, було проведено Саузерн-блот аналіз. Виявилось, що штами, які містили 3-4 копії гена FMN1 під контролем TEF1 промотора, характеризувались у 5-6 разів вищою питомою активністю РФ-кінази, у порівнянні з реципієнтним штамом C. famata Т-І 18, і в 46 разів - порівняно із контрольним штамом К9 та штамом L20105 C. famata (див. табл. 1). Питома активність РФ-кінази трансформантів із 6-8 копіями гена FMN1 перевищувала активність цього ферменту в реципієнтного та контрольного штамів у 24 та в 200 разів відповідно (див. табл. 1).

Вміст флавінів (зокрема ФМН) у культуральній рідині рекомбінантних штамів також залежав від копійності інтеграції гена FMN1. Штами із 6-8 копіями гена FMN1 нагромаджували до 34,2 мг/л флавінів, при цьому ФМН становив 86% від загального вмісту флавінів культуральної рідини (до 29,4 мг/л). Однак, трансформанти синтезували лише в 4-5 разів більше ФМН, ніж реципієнтний штам Т-І 18.

Внаслідок введення кількох копій гена FMN1 D. hansenii під контролем промотора TEF1 у геном дріжджів C. famata отримано штами, які характеризувались у 200 разів вищою питомою активністю РФ-кінази та у 46 разів більшою кількістю ФМН у культуральній рідині, порівняно зі штамом дикого типу C. famata. Невеликий кількісний вміст ФМН у культуральній рідині, при підвищеній РФ-кіназній активності та високому вмісті ФМН, - понад 85% від загального вмісту флавінів, вказує на брак субстрату для реакції фосфорилювання РФ до ФМН.

Отримання штамів, здатних до надпродукції ФМН, на основі штаму С. famata - надсинтетика РФ. Сконструйовані рекомбінантні штами були здатні до надсинтезу флавінів лише за умов дефіциту заліза. Відповідно, синтез ФМН хоч і не регулюється іонами цього металу, був лімітованим за субстратом (РФ), якщо середовище не було додатково очищене від іонів заліза. Для забезпечення РФ-кінази достатньою кількістю субстрату, плазмідою pTRIB1_FMN1 (див. рис. 1) протрансформували мутантний штам-надсинтетик РФ С. famata AF-4, синтез РФ у якого не залежить від забезпечення залізом. Трансформанти відбирали на середовищі, що містило флеоміцин у концентрації 1,8 мг/л. Стабільні, резистентні до флеоміцину рекомбінантні штами, що, за даними аналізу ПЛР, містили ген FMN1 під контролем промотора TEF1, було позначено С. famata Т-ОР.

Отримані трансформанти характеризувались у 5-9 разів вищою питомою активністю РФ-кінази, у порівнянні з реципієнтним штамом C. famata AF-4, та приблизно у 20 разів вищою, ніж у штаму дикого типу VKM Y-9. У культуральній рідині цих трансформантів нагромаджувалось від 5,3 до 24,9 мг/л ФМН, що в 2-9 разів перевищувало кількість ФМН, синтезованого реципієнтним штамом. Частка ФМН від загального вмісту флавінів коливалася від 40 до 70%, в той час як у реципієнтного штаму менше 10% флавінів культуральної рідини становив ФМН (табл. 2).

Для введення додаткових копій гена FMN1 під контролем сильного промотора TEF1 у геном сконструйованого нами рекомбінантного штаму Т-ОР 13-76 C. famata, який містив 3-4 копії гена FMN1 і синтезував близько 25 мг/л ФМН, було сконструйовано вектор рIMH3_TFMN1, що містив ген резистентності до мікофенольної кислоти (МФК; рис. 2). Цією плазмідою, попередньо лінеаризованою рестриктазою PstI, методом електропорації трансформували реципієнтний штам-надсинтетик ФМН C. famata Т-ОР 13-76. Отримано колекцію стабільних, резистентних до МФК рекомбінантних штамів, які, за результатами Саузерн-блот аналізу, містили 5-6 копій гена FMN1.

Питома активність РФ-кінази у трансформантів C. famata, що містять додаткові копії гена FMN1 під контролем промотора TEF1, становила 10-17 мОд/мг білка і була у 5-6 разів вищою, ніж у реципієнтного штаму та в 120 разів - ніж у штаму дикого типу C. famata (див. рис. 2).

Таблиця 2

Питома активність РФ-кінази та вміст флавінів у культуральній рідині рекомбінантних штамів C. famata, що містять ген FMN1 під контролем промотора TEF1

Отримані рекомбінантні штами виділяли в культуральну рідину за 48 год. вирощування до 350 мг/л флавінів, з яких 31-130 мг/л припадало на ФМН (табл. 3). Вміст ФМН був у 1,2-5,0 разів вищим, ніж у реципієнтного штаму C. famata Т-ОР 13-76, та у 8-32 рази вищим, ніж у контрольного штаму AF-4. Частка ФМН від загального вмісту флавінів коливалася від 25 до 60%.

Внаслідок введення гена FMN1 D. hansenii під контролем промотора TEF1 у штам-надсинтетик РФ дріжджів C. famata, було, очевидно, забезпечено достатню кількість субстрату для реакції фосфорилювання РФ до ФМН. Отримані стабільні рекомбінантні штами, що містили від 3 до 6 копій гена FMN1, характеризувались вищою питомою активністю РФ-кінази та нагромадженням більшої кількості ФМН у культуральній рідині, порівняно зі штамом дикого типу, контрольним та реципієнтним штамами. А саме, питома активність РФ-кінази окремих трансформантів становила до 17 мОд/мг білка, а кількість нагромадженого протягом 24 год. ФМН - понад 130 мг/л.

Таблиця 3

Вміст флавінів у культуральній рідині рекомбінантних штамів C. famata, що містять додаткові копії гена FMN1

Отримані результати свідчать, що заміна нативного промотора гена FMN1 на сильний конститутивний промотор веде до значного підвищення активності РФ-кінази, а також до зростання продукції ФМН.

Отримання штамів, здатних до надпродукції ФАД, на основі надсинтетика ФМН С. famata Т-ОР 13-76. Розроблену схему генно-інженерного конструювання штамів дріжджів, які нагромаджують в культуральній рідині ФМН, застосували для отримання штамів, здатних до надсинтезу ФАД. Як реципієнтний було використано сконструйований нами штам Т-ОР 13-76 C. famata, здатний до надсинтезу ФМН. Клоновано ген FAD1 (кодує ФАД-синтетазу) D. hansenii. Сконструйовано плазміду pTFAD1 (рис. 3), що містила ген FAD1 під контролем промотора TEF1, а також ген резистентності до МФК. Цією плазмідою методом електропорації трансформували штам C. famata Т-ОР 13-76. Отримані рекомбінантні штами, резистентні до МФК, було позначено T-FD C. famata; проведений Саузерн-блот аналіз показав, що вони містили 3-4 копії гена FMN1 та 2 копії гена FAD1.

Питома активність ФАД-синтетази отриманих рекомбінантних штамів, вирощених у синтетичному середовищі СБ, була в 7-15 разів вищою, ніж у реципієнтного штаму Т-ОР 13-76 C. famata (див. рис. 3). Активність РФ-кінази, як і очікувалося, була такою ж високою як і в реципієнтного штаму.

За таких умов в культуральній рідині нагромаджувалося до 2 мг/л ФАД протягом 17-21 год. Отримані результати свідчать про можливість посилення експресії гена FAD1 у C. famata шляхом заміни власного промотора цього гена на сильний промотор TEF1, що призводить до нагромадження в культуральній рідині ФАД. Високі активності РФ-кінази та ФАД-синтетази, наявність достатньої кількості субстратів не забезпечували повного перетворення РФ у ФМН і ФАД, що вказує на необхідність оптимізації умов синтезу даних нуклеотидів, зокрема, підбору складу поживного середовища.

Оптимізація середовища культивування для максимального нагромадження ФМН сконструйованими штамами. Досліджено вплив окремих компонентів інкубаційного середовища на синтез ФМН сконструйованими штамами-надсинтетиками C. famata. Виявилось, що продукція ФМН сильно залежить від джерела азоту. Найвищий вихід ФМН спостерігався при використанні сечовини або гліцину. Підбір джерела азоту дає змогу підвищити синтез ФМН у 4,8 і 5,7 раза для рекомбінантних штамів Т-ОР 13-76 C. famata та Т-ОРM 19 C. famata відповідно. Для з'ясування, які компоненти середовища є важливими для підвищення рівня синтезу ФМН, було застосовано методи математичного моделювання експериментів, зокрема, аналіз Плакетта-Бермана. Використовуючи експериментальні дані, створено математичні моделі, що дали змогу передбачити склад середовища, найкращий для синтезу ФМН. Встановлено, що на нагромадження цього коферменту впливають наступні іони: РО₄^3-, Ca²⁺, Mo₇O₂₄^6-, Cu²⁺, а також дріжджовий екстракт. За допомогою центрального композиційного аналізу показано, що оптимальними для синтезу ФМН є в 5 разів вищий (порівняно із середовищем СБ) вміст іонів фосфату, в 2,6 раза вищий - іонів кальцію, у 800 разів вищий - іонів молібдату, у 260-500 разів вищий - іонів міді, а також дріжджовий екстракт (0,2-0,3%).

Оптимізація складу середовища за допомогою методів математичного моделювання експериментів дала змогу підвищити синтез ФМН отриманими нами рекомбінантними штамами у 29-36 разів. Так, штам Т-ОР 13-76 синтезував до 169,2 мг/л ФМН, а штам Т-ОРM 19 - до 318,2 мг/л ФМН (у немодифікованому середовищі СБ ці штами синтезували 5,9 та 8,8 мг/л ФМН відповідно). У ферментері, при використанні середовища оптимізованого складу, вдалося досягнути синтезу до 231 мг/л ФМН штамом Т-ОР 13-76 (містить 3-4 копії гена FMN1) та до 385 мг/л ФМН штамом Т-ОРM 19 (містить 5-6 копій гена FMN1) протягом 40-48 год. інкубації.

Оптимізація середовища культивування для максимального нагромадження ФАД у культуральній рідині. Досліджено вплив окремих компонентів інкубаційного середовища на продукцію ФАД штамом C. famata T-FD 5, що містить ген FAD1 під контролем промотора TEF1.

Оптимізацію складу поживного середовища починали з підбору джерела азотного живлення. Для цього використовували сульфат амонію, гідрофосфат амонію, сечовину та комбінацію цих джерел азоту з гліцином. Використані сполуки додавали у кількості, еквівалентній кількості азоту в складі середовища СБ. Залежно від джерела азоту, кількість синтезованого ФАД змінювалася з 13,7 до 46,8 мг/л, найбільше ФАД нагромаджувалося при інкубації з сульфатом амонію та гліцином, а найменше - при інкубації з гідрофосфатом амонію або сечовиною.

Згідно аналізу Плакетта-Бермана, факторами, що достовірно впливають на синтез ФАД (у вищих, ніж у звичайному середовищі, концентраціях), виявились (у порядку зниження впливу): аденін > КН₂РО₄ > гліцин > (NH₄)₂SO₄). Використовуючи експериментальні дані, створено математичну модель, що дала змогу спрогнозувати склад середовища, найкращий для синтезу цього коферменту. За даними центрального композиційного аналізу, середовище СБ, оптимальне для синтезу ФАД, містить наступні модифікації: (NH₄)₂SO₄ - у 1,8 раза більше, КН₂РО₄ - у 3 рази більше, також у середовище необхідно вводити гліцин - 0,7% та аденін - 0,1%.

Підбір джерела азоту дає змогу підвищити синтез ФАД у 3,5 раза. Застосування методів математичного моделювання експериментів забезпечило підвищення продукції ФАД ще у 8,3 раза. При інкубації у ферментері в середовищі оптимізованого складу вдалося досягнути синтезу до 451 мг/л ФАД протягом 40 год.

Результати перевірки теоретичних моделей в експерименті показали, що використання оптимізованого середовища помітно покращує продукцію ФМН і ФАД рекомбінантними штамами C. famata. Механізми впливу більшості виявлених факторів, що покращують продукцію ФМН та ФАД, потребують подальшого дослідження.

Таким чином, застосування ряду підходів, а саме: експресія цільових генів під контролем сильного регульованого або конститутивного промотора, використання реплікативних або інтегративних плазмід, однієї або кількох копій цільових генів, введення генів, що впливають на синтез попередників ФМН і ФАД, виявлення факторів, важливих для оптимізації синтезу флавінових нуклеотидів, дозволило розробити метаболічно-інженерну схему отримання та подальшого покращення продуцентів ФМН і ФАД, що є передумовою для отримання ефективних промислових надсинтетиків флавінових нуклеотидів.

ВИСНОВКИ

У дисертації, відповідно до поставленої мети та завдань, використовуючи методи метаболічної інженерії, розроблено підходи до конструювання штамів-надсинтетиків флавінових нуклеотидів - ФМН та ФАД на основі флавіногенних дріжджів Candida famata, досліджено вплив окремих компонентів інкубаційного середовища на продукцію ФМН і ФАД рекомбінантними штамами та оптимізовано склад поживних середовищ для максимального нагромадження флавінових нуклеотидів.

1. Клоновано гени FMN1 (кодує РФ-кіназу) та FAD1 (кодує ФАД-синтетазу) флавіногенних дріжджів Debaryomyces hansenii.

2. Гени FMN1 та FAD1 експресовано під контролем сильного, регульованого іонами заліза, промотора RIB1 та сильного конститутивного промотора TEF1 у штамах C. famata дикого типу та надсинтетика РФ. Отримано колекцію стабільних рекомбінантних штамів, що містять 2-8 копій гена FMN1 та 2 копії гена FAD1.

3. Заміна нативного промотора гена FMN1 D. hansenii на сильний конститутивний промотор TEF1 C. famata призводить до зростання питомої активності РФ-кінази у трансформантів C. famata до 200 разів, порівняно зі штамом дикого типу VKM-Y9, та до накопичення ФМН у культуральній рідині.

4. Заміна нативного промотора гена FAD1 D. hansenii на сильний конститутивний промотор TEF1 C. famata в штамі-надсинтетику ФМН призводить до 15-кратного зростання питомої активності ФАД-синтетази в безклітинних екстрактах рекомбінантних штамів C. famata та до накопичення ФАД у культуральній рідині.

5. За допомогою методів математичного моделювання експериментів встановлено, що іони фосфату, кальцію, молібдату, міді, а також дріжджовий екстракт збільшують продукцію ФМН. Важливими факторами для нагромадження ФАД є наступні компоненти середовища: сульфат амонію, гліцин, іони фосфату та аденін.

6. За допомогою аналізу теоретично створених математичних моделей, оптимізовано склад середовищ для максимальної продукції флавінових нуклеотидів. Модифікація середовища дає змогу підвищити синтез ФМН у 36 разів, а синтез ФАД - у 28 разів. Отримані рекомбінантні штами здатні до нагромадження близько 385 мг/л ФМН або близько 450 мг/л ФАД при інкубації в ферментері.

7. Внаслідок застосування сукупності методів метаболічної інженерії отримано рекомбінантні штами дріжджів C. famata, які здатні до синтезу в 962 рази більше ФМН і в понад 1000 разів більше ФАД, ніж у штаму дикого типу C. famata.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Генно-інженерне конструювання штамів флавіногенних дріжджів Candida famata з високою активністю рибофлавінкінази / О. П. Іщук, В. Ю. Яцишин, К. В. Дмитрук, А. Я. Вороновський, Д. В. Федорович, А. А. Сибірний // Український біохім. журн. 2006. Т. 78, № 5. С. 63-69. (Дисертант здійснив біохімічні дослідження, проаналізував та узагальнив джерела літератури, експериментальні дані, написав та оформив статтю).

2. Характеристика рекомбінантних штамів дріжджів Candida famata, здатних до продукції флавінмононуклеотиду / В. Ю. Яцишин, О. П. Іщук, К. В. Дмитрук, А. Я. Вороновський, Д. В. Федорович, А. А. Сибірний // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб. наук. праць. К., 2007. Т. 1. С. 386-389. (Дисертант провів дослідження, проаналізував та узагальнив джерела літератури, експериментальні дані, взяв участь у написанні та оформленні статті).

3. Утворення флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata, що містять ген FMN1 під промотором TEF1 / В. Ю. Яцишин, О. П. Іщук, А. Я. Вороновський, Д. В. Федорович, А. А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. праць. К., 2008. Т. 5. С. 478-482. (Дисертант здійснив біохімічні дослідження, провів узагальнення та статистичну обробку даних, проаналізував джерела літератури, взяв участь у написанні та оформленні статті).

4. Яцишин В. Ю. Микробный синтез флавиновых нуклеотидов (обзор) / В. Ю. Яцишин, Д. В. Федорович, А. А. Сибирный // Прикл. биохим. микробиол. 2009. Т. 45, № 2. С. 133-142. (Дисертант проаналізував та узагальнив джерела літератури, взяв участь у написанні та оформленні статті).

5. Production of flavin mononucleotide by metabolically engineered yeast Candida famata / V. Y. Yatsyshyn, O. P. Ischuk, A. Y. Voronovsky, D. V. Fedorovych, A. А. Sibirny // Metabol. Eng. 2009. V. 11, №. 3. Р. 163-167. (Дисертант отримав рекомбінантні штами, провів біохімічний та молекулярно-генетичний аналіз, статистичну обробку даних, узагальнив джерела літератури, взяв участь у написанні та оформленні статті).

6. Оптимізація умов синтезу флавінмононуклеотиду рекомбінантними штамами дріжджів Candida famata / В. Ю. Яцишин, Д. В. Федорович, А. Я. Вороновський, А. А. Сибірний // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. праць. К., 2009. Т. 7. С. 270-274. (Дисертант провів біохімічні та статистичні дослідження, проаналізував та узагальнив джерела літератури та дані експериментів, взяв участь у написанні та оформленні статті).

7. Yatsyshyn V. Y. Medium optimization for production of flavin mononucleotide by the recombinant strain of the yeast Candida famata using statistical designs / V. Y. Yatsyshyn, D. V. Fedorovych, A. А. Sibirny // Biochem. Eng. J. 2009. V. 49, № 1. P. 52-60. (Дисертант провів біохімічні та математичні аналізи, узагальнив джерела літератури та результати експериментів, взяв участь у написанні та оформленні статті).

8. Пат. 42499 Україна, МПК C 12 N 1/19. Штам дріжджів Candida famata ІМВ У-5028 - продуцент флавінмононуклеотиду (5?-ФМН) / А. А. Сибірний, В. Ю. Яцишин, Д. В. Федорович, О. П. Іщук, А. Я. Вороновський; заявник і власник Інститут біології клітини НАН України. № u 2009 00725; заявл. 02.02.2009; опубл. 10.07.2009, бюл. № 13. (Дисертант отримав рекомбінантний штам, провів дослідження та статистичну обробку даних, проаналізував та узагальнив джерела літератури і дані експериментів, взяв участь у написанні та оформленні патента).

9. Пат. 87684 Україна, МПК C 12 P 25/00, C 12 N 15/00. Спосіб отримання флавінмононуклеотиду (5'-ФМН) / А. Я. Вороновський, К. В. Дмитрук, О. П. Іщук, А. А. Сибірний, Д. В. Федорович, В. Ю. Яцишин; заявник і власник Інститут біології клітини НАН України. № a200612203; заявл. 20.11.2006; опубл. 10.08.2009, бюл. № 15. (Дисертант провів дослідження та статистичну обробку даних, проаналізував та узагальнив джерела літератури і дані експериментів, взяв участь у написанні та оформленні патента).

10. Флавіногенез рекомбінантних штамів дріжджів Candida famata, що містять ген FMN1 під контролем промотору TEF1 / В. Ю. Яцишин, О. П. Іщук, К. В. Дмитрук, А. Я. Вороновський, Д. В. Федорович // Матеріали IX Українського біохімічного з'їзду, Харків, 24-27 жовтня 2006 р. К.:, 2006. Т. 2. С. 239.

11. Використання генно-інженерних підходів для конструювання штамів дріжджів Candida famata, здатних до надсинтезу флавінмононуклеотиду / Д. В. Федорович, В. Ю. Яцишин, О. П. Іщук, К. В. Дмитрук, А. Я. Вороновський, А. А. Сибірний // Міжнародна наукова конференція «Мікробні біотехнології», Одеса, 11-15 вересня 2006 р. Одеса: «Астропринт», 2006. С. 32.

12. Яцишин В. Ю. Использование методов генной инженерии для получения дрожжевых продуцентов флавиновых нуклеотидов / В. Ю. Яцишин, Д. В. Федорович // Материалы І международной научной конференции молодых ученых и студентов «Медико-биологические и социальные проблемы современного человека», г. Тирасполь, 1-4 апреля 2007 г. Тирасполь, 2007. С. 64-65.

13. New approaches for construction of the yeast overproducers of flavin nucleotides / D. V. Fedorovych, V. Y. Yatsyshyn, O. P. Ishchuk, K. V. Dmytruk, A. Y. Voronovsky, A. А. Sibirny // 2-nd Polish-Ukrainian Weigl Conference «Microbiology in the XXI century», Warsaw, 24-26 September 2007. Warsaw Agricultural University: SGGW, 2007. Р. 130-133.

14. Construction of the yeast Candida famata overproducers of flavin adenine dinucleotide / V. Y. Yatsyshyn, D. V. Fedorovych, O. P. Ishchuk, K. V. Dmytruk, A. Y. Voronovsky, A. А. Sibirny // 2-ий з'їзд українського товариства клітинної біології, Київ, 23-26 жовтня 2007 р. К.: Київський національний університет ім. Т. Г. Шевченка, 2007. С. 38.