Метаболічна інженерія неконвенційних дріжджів Candida famata з метою конструювання надпродуцентів флавінових нуклеотидів

15. Production of flavin nucleotides by metabolically engineered yeast Candida famata / V. Y. Yatsyshyn, D. V. Fedorovych, O. P. Ishchuk, K. V. Dmytruk, A. Y. Voronovsky, A. А. Sibirny // 12^th International congress on yeasts, Kyiv, August 11-15 2008. K., 2008. Р. 272.

16. Конструювання надпродуцентів та оптимізація умов надсинтезу флавінових нуклеотидів / В. Ю. Яцишин, О. П. Іщук, К. В. Дмитрук, А. Я. Вороновський, Д. В. Федорович, А. А. Сибірний // ХІІ З'їзд товариства мікробіологів України ім. С. М. Виноградського, Ужгород, 25-30 травня 2009 р. Ужгород: «Патент», 2009. С. 417.

17. Metabolic engineering of the flavinogenic yeast Candida famata for construction of the advanced producers of riboflavin, flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD) / K. V. Dmytruk, D. V. Fedorovych, V. Y. Yatsyshyn, O. P. Ishchuk, A. А. Sibirny // 27-th ISSY Pasteur's legacy, Yeast for health and biotechnologies, Paris, 26-29 August 2009. Paris, 2009. P. 32.

18. Biotechnological production of riboflavin, flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD) / A. Sibirny, K. Dmytruk, D. Fedorovych, V. Yatsyshyn, O. Ischuk // VII Parnas Conference, Yalta, 3-7 October 2009. Укр. біохім. журн., 2009. Т. 81, № 4. С. 42.

АНОТАЦІЯ

Яцишин В.Ю. Метаболічна інженерія неконвенційних дріжджів Candida famata з метою конструювання надпродуцентів флавінових нуклеотидів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2010.

У дисертації розроблено підходи до конструювання штамів-продуцентів флавінових нуклеотидів із застосуванням метаболічної інженерії, вперше отримано штами-надсинтетики флавінових нуклеотидів - флавінмононуклеотиду (ФМН) та флавінаденіндинуклеотиду (ФАД) на основі флавіногенних дріжджів C. famata та оптимізовано склад поживних середовищ для максимального нагромадження флавінових нуклеотидів.

Внаслідок заміни нативного промотора гена FMN1 (кодує РФ-кіназу) дріжджів D. hansenii на сильний конститутивний промотор TEF1 C. famata питома активність рибофлавінкінази зростає у трансформантів до 200 разів, порівняно зі штамом дикого типу VKM-Y9 C. famata; отримані рекомбінантні штами-надпродуценти синтезують до 385 мг/л ФМН (в 962 рази більше, ніж у штаму VKM-Y9 C. famata) в середовищі оптимізованого складу. Внаслідок експресії гена FAD1 під контролем сильного конститутивного промотора TEF1 у геномі рекомбінантних штамів C. famata, здатних до надсинтезу ФМН, питома активність ФАД-синтетази рекомбінантних штамів зростає в 16 разів, порівняно зі штамом дикого типу; такі штами синтезують у середовищі, оптимізованому для продукції ФАД до 450 мг/л цього нуклеотиду.

Ключові слова: дріжджі, Candida famata, надсинтез, рибофлавінкіназа, флавінмононуклеотид, флавінаденіндинуклеотидсинтетаза, флавінаденін-динуклеотид.

АННОТАЦИЯ

Яцишин В.Ю. Метаболическая инженерия неконвенционных дрожжей Candida famata для конструирования сверхпродуцентов флавиновых нуклеотидов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2010.

В диссертации разработаны подходы к конструированию штаммов-сверхпродуцентов флавиновых нуклеотидов с использованием метаболической инженерии, впервые получены штаммы сверхпродуценты флавиновых нуклеотидов - флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД) флавиногенных дрожжей C. famata, оптимизирован состав питательных сред для максимального накопления флавиновых нуклеотидов. Вследствие замены нативного промотора гена FMN1 дрожжей D. hansenii на сильний конститутивний промотор TEF1 C. famata удельная активность рибофлавинкиназы увеличивается у трансформантов до 200 раз, по сравнению со штаммом дикого типа VKM-Y9 C. famata; полученные рекомбинантные штаммы-сверхпродуценты синтезируют до 385 мг/л ФМН (в 962 раза больше, чем штамм VKM-Y9 C. famata) в среде оптимизированного состава. Вследствие экспрессии гена FAD1 под контролем сильного конститутивного промотора TEF1 в геноме рекомбинантных штаммов C. famata, способных к сверхсинтезу ФМН, удельная активность ФАД-синтетазы рекомбинантных штаммов увеличивается в 16 раз, по сравнению со штаммом дикого типа; такие штаммы синтезируют в оптимизированной для продукции ФАД среде до 451 мг/л этого нуклеотида.

Ключевые слова: дрожжи, Candida famata, сверхсинтез, рибофлавинкиназа, флавинмононуклеотид, флавинадениндинуклеотид-синтетаза, флавинадениндинуклеотид.

SUMMARY

Yatsyshyn V.Y. Metabolic engineering of the nonconventional yeast Candida famata aimed at constructing overproducers of flavin nucleotides. - Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.07 - microbiology. - Institute of Cell Biology, National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv, 2010.

The work is devoted to the development of approaches for designing the overproducers of flavin nucleotides using metabolic engineering. For the first time the strains overproducing flavin nucleotides - flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD) were obtained, and the growth media compositions for maximum production of flavin nucleotides were proposed.

The D. hansenii FMN1 gene (encoding the riboflavin (RF) kinase) was cloned and placed under the control of strong regulated by Fe²⁺ ions promoter RIB1. The replicative and integrative plasmids for FMN1 gene expression were constructed and the recombinant strains of C. famata were obtained. The strains which contain FMN1 gene under the RIB1 promoter demonstrated the 8-12-fold increased RF kinase activity as compared to C. famata parental strain, but no FMN in cultural medium.

The recombinant strains of the flavinogenic yeast C. famata that contain FMN1 gene (2-8 copies) driven by the strong constitutive promoter TEF1 were isolated. The 200-fold increase in the RF kinase activity and 55-fold increase in FMN production (but less then 30 mg/l) were observed in constructed strains. A small quantity of FMN in culture medium upon high RF kinase activity and a high percentage of FMN (80%) of the total flavin content indicate a lack of substrate for phosphorylation reaction of RF to FMN.

Production of FMN was observed only in iron deficient medium, apparently as only at such conditions overexpressed RF kinase could be supplied with sufficient amount of its substrate (RF) for phosphorylation. Recombinant strains based on the mutant that has a deregulated RF biosynthesis pathway and high level of RF production were characterized by 20-fold increase in the RF kinase activity and significant increase in FMN production.

The obtained earlier C. famata strain overproducing FMN was used as recipient for construction of strains with high production of FAD. The D. hansenii FAD1 gene (encoding the FAD synthetase) was cloned and placed under the control of strong constitutive promoter TEF1. The recombinant strains of C. famata, which contain the DNA construct consisting of the FAD1 gene (2 copies) driven by the TEF1 promoter were isolated. The constructed strains demonstrated 7-15-fold increase in FAD synthetase activity. The increase in FAD content in cultural medium was observed in some transformants only during the early exponential phase of growth.

The effectiveness of FMN and FAD production by strains-overproducers under different conditions was evaluated. After preliminary experiments for nitrogen source selection, the two-level Plackett-Burman design was performed to screen for medium components that significantly influence the FMN and FAD production. Among the variables tested, РО₄^3-, Ca²⁺, Mo₇O₂₄^6-, Cu²⁺ ions and yeast extract were identified as the most significant factors for FMN production. The (NH₄)₂SO₄, glycine, adenine and РО₄^3- ions were identified as the most important factors for FAD production.

In order to investigate the quantitative effects for variables selected from Plackett-Burman design on flavin nucleotides production, a central composite design was subsequently employed for further optimization. The used optimization strategies led to a 36-fold increase in the FMN production and 28-fold increase in the FAD production. A final FMN content of 385 mg/l and final FAD production of 451 mg/l were obtained after 40 h of incubation, which further verified the practicability of the used strategy.

Consequently, the scheme of construction of the flavin nucleotides overproducers allowed obtaining C. famata recombinant strains with 962-fold increased FMN production and more then 1000-fold increased FAD production, as compared to the parental strain of C. famata.

Several approaches allowed developing of metabolic engineering scheme for construction of the C. famata flavin nucleotides overproducers. These were the insertion of the target genes under the control of strong regulated or constitutive promoters, use of the replicative or integrative plasmids for constructing recombinant strains, use of one or more copies of the target genes, introduction of genes that affect the synthesis of precursors of FMN and FAD into genome of C. famata strains, identifying factors important for flavin nucleotides oversynthesis.

The obtained recombinant C. famata strains containing the FAD1 and/or FMN1 genes under the strong constitutive TEF1 promoter can be used for further improvement of flavin nucleotide overproducers.

Key words: yeast, Candida famata, overproduction, riboflavin kinase, flavin mononucleotide, flavin adenine dinucleotide synthetase, flavin adenine dinucleotide.

Размещено на Allbest.ru