Популяційно-генетична характеристика великої білої породи свиней за різними типами молекулярно-генетичних маркерів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

АВТОРЕФЕРАТ

ПОПУЛЯЦІЙНО-ГЕНЕТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕЛИКОЇ БІЛОЇ ПОРОДИ СВИНЕЙ ЗА РІЗНИМИ ТИПАМИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ МАРКЕРІВ

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті свинарства ім. О.В. Квасницького Національної академії аграрних наук України

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Балацький Віктор Миколайович, завідувач лабораторії генетики Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького НААН

Офіційні опоненти:

доктор сільськогосподарських наук Подоба Борис Євгенович, Інститут розведення і генетики тварин НААН, головний науковий співробітник лабораторії генетичних ресурсів тварин

кандидат сільськогосподарських наук Шельов Андрій Володимирович, Українська лабораторія якості і безпеки продукції АПК Національного університету біоресурсів і природокористування України, старший науковий співробітник відділу молекулярно-діагностичних досліджень

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин НААН.

Автореферат розісланий « 18 » березня 2011 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Ю.В. Мільченко

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Ефективність селекції у тваринництві, і свинарстві зокрема, значною мірою залежить від точності оцінки генотипу, яка гарантує відбір генетично кращих тварин. Такий підхід дає змогу одержувати тварин з бажаним комплексом ознак продуктивності, резистентності до хвороб, пристосованості до технологічних умов утримання, сприяє закріпленню цих ознак та збільшенню продуктивності у наступних генераціях (Зубець М.В., 2000; Буркат В.П., 2003; Буркат В.П., Подоба Б.Є., Гузєв І.В., 2006).

Традиційно спадкові якості свиней оцінюють за власною продуктивністю та якістю нащадків, що дає змогу визначити генетичний потенціал окремих тварин, лінії, родини, стада чи породи (Агапова Є.П.,1995; Рибалко В.П., 2005). Водночас з таким підходом існують методи аналізу генотипів свиней, що ґрунтуються на використанні генетичних маркерів, які все більше залучаються в практику селекційної роботи. Вони дозволяють аналізувати не тільки окремі генотипи, але і генетичну структуру популяцій свиней, визначати напрямок мікроеволюційних процесів в них, вирішувати завдання щодо збереження і раціонального використання генофонду порід та низку інших питань. Урахування популяційно-генетичних параметрів, отриманих на основі молекулярно-генетичного маркірування, підвищує ефективність селекційної роботи, сприяє програмованому отриманню бажаних генотипів тварин (Ернст Л.К., 2004).

Останні 35 років селекція свиней великої білої породи в Україні здійснювалась, в основному, у двох напрямках: за відтворювальними та відгодівельними якостями. Результат цієї роботи по першому напрямку - створення внутрішньопородного материнського типу свиней - української великої білої-1 (УВБ-1). Результатом роботи по другому напрямку стало створення внутрішньопородного батьківського типу свиней - української великої білої-2 (УВБ-2). Крім того, окремою групою у великій білій породі є велика біла порода англійської селекції (ВБА). Кожен з типів представлений цілим рядом ліній та родин (Березовський М.Д, 2004)

Велика біла порода характеризується складною генеалогічною структурою, яка потребує вивчення на популяційно-генетичному рівні шляхом визначення генетичних взаємин між окремими складовими її структури, рівню генетичної диференціації (внутрішньопородному, внутрішньопопуляційному та міжпопуляційному рівнях). Цим зумовлений вибір напрямку досліджень дисертаційної роботи із залученням імуногенетичних маркерів і систем ДНК-маркерів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького НААН: «Розробити нові ефективні молекулярно-генетичні методи оцінки генотипів з метою їх використання в селекції свиней і ембріоінженерних дослідженнях» (№ держ. реєстр.0101U003257); «Розробити ДНК-технології для генетичної паспортизації сільськогосподарських тварин» (№ держ. реєстр. 0106U004209); «Розробити загальну методологію і впровадити систему селекційно-генетичного моніторингу в генофондних популяціях сільськогосподарських тварин» (№ держ. реєстр. 0106U004218).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - провести популяційно-генетичний аналіз типів свиней великої білої породи УВБ-1, УВБ-2 та ВБ англійської селекції на основі типування тварин за імуногенетичними маркерами і локусами мікросателітної ДНК для визначення генетичної диференціації породи та оцінки інформативності молекулярних маркерів різних класів в популяційних дослідженнях.

Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

дослідити популяційно-генетичну структуру великої білої породи за результатами імуногенетичного типування тварин провідних племінних підприємств України;

оптимізувати техніку мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції мікросателітних локусів для ДНК-типування;

дослідити популяційно-генетичну структуру типів великої білої породи УВБ-1, УВБ-2 та ВБА провідних племінних підприємств за локусами мікросателітної ДНК;

порівняти популяційно-генетичні характеристики внутрішньопородних типів великої білої породи вітчизняної та англійської селекції за різними типами генетичних маркерів;

дослідити генеалогічну структуру внутрішньопородних типів УВБ-1 і УВБ-2 з використанням імуногенетичного типування;

дослідити генеалогічну структуру внутрішньопородних типів УВБ-1 і УВБ-2 за допомогою типування за локусами мікросателітної ДНК;

порівняти ефективність використання різних типів молекулярно-генетичних маркерів для отримання популяційно-генетичної характеристики родин і ліній великої білої породи;

провести аналітичне співставлення популяційно-генетичних параметрів різних популяцій великої білої породи, одержаних за допомогою різних типів молекулярно-генетичних маркерів;

оптимізувати техніку ДНК-типування за мікросателітними локусами для контролю походження поросят.

Об'єкт дослідження: популяційно-генетичні процеси в популяціях свиней внутрішньопородних типів великої білої породи.

Предмет дослідження: поліморфізм імуногенетичних та мікросателітних маркерів в популяціях внутрішньопородних типів великої білої породи в Україні.

Методи дослідження: імуногенетичні (визначення еритроцитарних антигенів свиней), молекулярно-генетичні (ампліфікація мікросателітних локусів в полімеразній ланцюговій реакції та подальше їх генотипування), статистичні, біометричні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні розроблено організаційно-технологічні засади типування свиней за локусами мікросателітної ДНК в мультиплексній полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) для оцінки генетичної диференціації внутрішньопородних типів у великій білій породі свиней. Вперше оцінено генетичну структуру популяцій тварин типів УВБ-1, УВБ-2 та ВБА з використанням молекулярно-генетичних маркерів різних типів (імуногенетичних та мікросателітних). Порівняно популяційно-генетичні характеристики, що було одержано за різними типами маркерів. Встановлено генетичні взаємовідносини між генеалогічними структурами всередині типів УВБ-1 та УВБ-2. Показано генетичні особливості внутрішньопородних типів УВБ-1 і УВБ-2 та ВБА на рівні ДНК та імуногенетичних маркерів, які є результатом тривалої переважаючої селекції у різних напрямах продуктивності. Вперше в Україні експертизу встановлення походження поросят-трансплантантів, в дослідах з ембріотрансплантації, здійснювали за допомогою мікросателітного типування.

Практичне значення одержаних результатів. В ході досліджень розроблено організаційно-технологічні засади генотипування свиней за локусами мікросателітної ДНК в мультиплексній ПЛР для одержання популяційно-генетичних характеристик. Одержано популяційно-генетичні характеристики стад свиней великої білої породи внутрішньопородних типів УВБ-1 і УВБ-2 та ВБА на сучасному етапі, які дозволяють оцінити мікроеволюцій процеси, що відбуваються в породі. Застосовані імуногенетичний та мікросателітний аналіз (МКС-аналіз), демонструють генетичну відмінність типів УВБ-1 та УВБ-2, що створює передумови для використання міжтипових поєднань на внутрішньопородній основі з метою отримання гетерозисного ефекту молодняка за відгодівельними та м'ясними якостями.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконаний увесь обсяг експериментальних досліджень в лабораторії генетики Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького НААН. Самостійно проаналізована наукова література за темою дисертаційної роботи, проведені лабораторні дослідження, статистична обробка одержаного цифрового матеріалу результатів лабораторних досліджень та формулювання висновків. Планування досліджень і обговорення їх результатів здійснено за участю наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи представлені і обговорені на: розширених засіданнях вченої ради Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького УААН (2000-2003); Міжнародній науковій конференції «Генетика і селекція вищих організмів» (Полтава 2001); Конференції молодих вчених і спеціалістів «Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні» (Київ, 2002); Науково-практичній конференції молодих вчених «Актуальні питання розвитку галузі свинарства та шляхи її реалізації», присвяченій 100-річчю від дня народження вченого селекціонера М.І. Матійця (Полтава, 2003); Всеукраїнській теоретичній конференції “Генетичні аспекти онто- і філогенезу (Дніпропетровськ, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів «Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики» (Львів, 2004); Міжнародній науковій конференції «Актуальні проблеми розвитку тваринництва, ветеринарної медицини, харчових технологій, економіки та освіти, присвяченій 220-річчю академії» (Львів, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції «Стан, проблеми та перспективи сучасної аграрної науки і практики», присвяченої 105-річчю від дня народження С.З. Гжицького (Львів, 2005); Міжнародній науково-практичній конференції «Інноваційність розвитку сучасного аграрного виробництва» присвяченої 550-річчю з часу заснування університету та початків ветеринарної медицини в Україні (Львів, 2008).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано в 7 наукових працях (з них 4 одноосібні), 2 ДСТУ, патент на корисну модель, інструкції.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, розділів з викладом результатів досліджень, їх обговорення, висновків, практичних рекомендацій виробництву, списку літератури та додатків. Текст викладено на 148 сторінках комп'ютерного набору, містить 22 таблиці, 37 рисунків. Список літератури включає 230 джерело, з них 148 іноземних.

Матеріал та методика досліджень

Дослідження виконані в лабораторії генетики Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького НААН, на базі племзаводів: «Комсомолець» Миколаївської обл., 58 голів, «Любомирівка» Дніпропетровської обл., 100 голів, «Степной» Запорізької обл. 59 голів. Загальну схему досліджень представлено на рис. 1.

Антигени еритроцитів свиней систем A, B, D, E, F, G, H, K, L визначали за допомогою специфічних імунних сироваток, використовуючи реакцію аглютинації, непряму пробу Кумбса і гемолітичний тест (Безенко та ін 1971).

Виділення ДНК проводили сольовим методом (Соколов Б.П., Джемелинський В.В. 1989), для довготривалого зберігання в банку ДНК та за допомогою реагенту "Chelex-100" (Walsh P.S. et al. 1991), для поточних досліджень. Генотипування свиней за локусами мікросателітної ДНК (МКС-типування) проводили шляхом ампліфікації ДНК в мультиплексній ПЛР мікросателітних локусів, за допомогою праймерів наступної структури: S0005 F: 5' TCCTTCCCTCCTGGTAACTA 3', R: 5' GCACTTCCTGATTCTGGGTA 3'; S0155 F: 5' TGTTCTCTGTTTCTCCTCTGTTTG3', R: 5' GTTAAAGTGGAAAGAGTCAATGGCTAT 3'; S0101 F: 5' GAATGCAAAGAGTTCAGTGTAGG 3', R: 5' GTCTCCCTCACACTTACCGCAG 3'; SW875 F: 5' TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC 3', R: 5' GATCCTCCTCCAAATCCCAT 3' та SW240 F: 5' AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG 3', R: 5' AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA 3', які рекомендовані FAO для дослідження генетичної різноманітності (Barker J.S.F. et al. 1998), схвалені дорадчим комітетом FАО-ISAG для дослідження генетичних дистанцій (Laval G. et al. 2000).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Загальна схема досліджень

Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК проводили в 10%-вому денатуруючому поліакриламідному гелі згідно рекомендацій компанії «Promega», (США). Візуалізацію електрофореграм здійснювали шляхом фарбування гелів в розчині бромистого етидію (0,5 мкг/мл) з експозицією 10 хв. та методом сріблення, за прописом компанії «Promega», (США). Визначення розмірів продуктів ампліфікації здійснювали за допомогою маркера молекулярної маси pBR322/BsuRI, («Fermentas», Литва).

Генотипування тварин здійснювали за результатами електрофоретичного розділення продуктів ампліфікації, які візуалізували одним з наведених вище методів. Після одержання цифрового зображення визначення розмірів ампліфікованих фрагментів здійснювали з використанням комп'ютерної програми «Dzek» («Тапотили», Росія).

Основні популяційно-генетичні параметри груп тварин, одержаних за імуногенетичними маркерами були обчислені з використанням програми «BYOSIS-1» (Swofford D.L., Selander A.W.F. 1981). Розрахунки популяційних параметрів мікросателітного маркірування здійснювали за допомогою програми GENALEX 6. Кластерний аналіз проводили з використанням програмами «MEGA-4» (Tamura et al. 2007) та «Neighbor» програмного пакету «PHYLIP» за методом UPGMA (J. Felsenstein. University of Washington © Copyright 1986-2006).

Результати досліджень

Імуногенетична характеристика свиней великої білої породи. В результаті аналізу імуногенетичної структури популяцій ВБА та внутрішньопородних типів великої білої породи УВБ-1 і УВБ-2 було виявлено достовірні відмінності частот алелів між популяціями за Н, К, E та L системами груп крові (табл.1), що є відображенням їх генетичних особливостей При цьому зберігається загальний імуногенетичний профіль великої білої породи. На імуногенетичну структуру внутрішньопородного типу УВБ-2 наклало відбиток прилиття крові генотипів свиней великої білої естонської та шведської селекції на різних етапах його створення (М.Д. Березовський та ін. 2004).

Частоти алелів груп крові в популяціях великої білої породи свиней

Система груп крові	Алель	Генотипи
		УВБ-1	УВБ-2	ВБА
		n = 52	n = 100	n = 59
H	Ho	0,548 ***/*	0,922 ***/а	0,783 */а
	Ha	0,303 ***	0,073***	0,159
	Hb	0,150 ***	0,005***	0,058
K	Ko	0,474	0,387 *	0,599
	Kd	0,029 ***/а	0,245***	0,153а
L	Lai	0,125 **	0,010 **/а	0,085 а
	Laki	0,135 *	0,295 *	0,203
E	Eedg	0,385	0,330 *	0,475 *

Примітка: *, **,. *** p<0,05, p<0,01, p<0,001, відповідно, а - p<0,05, критерій Фішера

Рівень гетерозиготності є однією з найважливіших генетичних характеристик популяції, за якою можна визначати рівень генетичної консолідованості, генетичної варіабельності стада та ступінь селекційного тиску. За фактичним та очікуваним рівнями гетерозиготності достовірних відмінностей між досліджуваними популяціями великої білої породи, нами не виявлено. Гетерозиготність популяцій тварин великої білої породи за 9 системами імуногенетичних маркерів знаходились в межах від 0,312 у тварин ВБА до 0,347 - УВБ-2. Гетерозиготність внутрішньопородного типу УВБ-1 мала проміжне значення 0,337. Достовірних відмінностей між фактичною та очікуваною гетерозиготністю не виявлено.

У тварин типу УВБ-1 спостерігалось порушення рівноваги від врівноваженої за Гарді-Вайнбергом за G, E (p < 0,05), та B системою (p < 0,01) в популяції ВБА - за системами груп крові - G, D і E (p < 0,01) та L (p < 0,05), в УВБ-2 за B, E, G, L (p < 0,001) та D локусом (p < 0,01). Такі достовірні відмінності в розподілах генотипів пояснюються адаптаціями тварин до умов утримання, а також селекційним тиском, при відборі морфотипів характерних для УВБ-1, УВБ-2 та ВБА.

Генетичні дистанції між різними типами великої білої породи, ВБА та миргородською породою племзаводу ім. Декабристів, яку було залучено для коректної побудови дендрограми в якості аутгрупи, обчислювали за алгоритмами Нея та Роджерса (табл. 2).

2. Генетичні дистанції між популяціями великої білої породи за групами крові

Популяція	1	2	3	4
1	ВБА	*****	0,010	0,009	0,055
2	УВБ-1	0,098	*****	0,021	0,045
3	УВБ-2	0,095	0,126	*****	0,049
4	Миргородська	0,197	0,182	0,186	*****

Примітка: вище діагоналі дистанції - за Неєм (Nei 1978), нижче діагоналі дистанції - за Роджерсом (Wright, 1978)

Кластерний аналіз різних типів великої білої породи, який базується на генетичних дистанціях свідчить, що популяції тварин великої білої породи утворюють спільну групу, а популяція миргородських свиней - окрему гілку (аутгрупу). Популяція внутрішньопородного типу УВБ-2 розташувалася в одному підкластері з ВБА. На нашу думку, ці популяції можуть мати подібні частоти алелів, тому що обидві групи тварин селекціонувалися за відгодівельними та м'ясними якостями, проти УВБ-1, де переважаюча селекція була спрямована на покращення репродуктивних якостей.

Отже, популяції свиней внутрішньопородних типів УВБ-1, УВБ-2 і ВБА є відселекціонованими групами тварин, які мають своєрідний генофонд, відмінний від миргородської породи, що підтверджується результатами імуногенетичного типування та кластерного аналізу. за даними імуногенетичного аналізу Тип УВБ-2, має більше спільних рис з ВБА ніж з типом УВБ-1, що може бути наслідком використання свиней великої білої породи англійського походження для поліпшення відгодівельних якостей типу УВБ-2.

Оптимізація техніки типування за локусами мікросателітної ДНК. Типування тварин за мікросателітними локусами геному передбачає ПЛР-ампліфікацію відповідних фрагментів ДНК та їх електрофоретичний аналіз із визначенням розмірів ампліфікованих фрагментів. Ці етапи роботи потребували певної оптимізації.

Перш за все було проведено аналіз баз даних мікросателітних локусів свині, за результатами якого відібрано п'ять МКС-локусів: S0005, S0155, S0101, SW857 та SW240, придатних в певній комбінації для одночасного (мультиплексного) аналізу за умовами ампліфікації та електрофоретичного розділення ампліфікатів. Оптимізовано умови проведення полімеразної ланцюгової реакції: температуру ренатурації праймерів, концентрацію олігонуклеотидних праймерів, Taq-полімерази, іонів магнію та умови електрофоретичного розділення одержаних в мультиплексній ПЛР фрагментів. Досліджено різні способи фарбування гелів срібленням та бромистим етидієм, в залежності від комбінацій праймерів та інтенсивності ампліфікації.

Оптимізовану нами техніку типування було задіяно для популяційно-генетичних досліджень стад свиней великої білої породи. Типування здійснювалось за допомогою триплексу (S0101, SW857 та SW240) і диплексу (S0005, S0155) (рис. 2).

Генетичний аналіз популяцій свиней великої білої породи за мікросателітними маркерами. За результатами типування визначили середню кількість алелів на локус. Вона становила в популяції УВБ-1 - 6,2 алеля, УВБ-2 - 6 алелів та ВБА - 6,4 алеля на локус. Середня ефективна кількість алелів за п'ятьма локусами дорівнювала для УВБ-1 - 4,675, УВБ-2 - 3,794 та ВБА - 3,410. Ці дані свідчать про те, що поліморфні системи МКС локусів залежно від досліджуваної популяції тварин мають неоднакову інформативність, яка характеризується різною середньою кількістю алелів та кількістю ефективних алелів. Наші дані не розходяться з результатами досліджень L. Putnova (2003), та C. Chevalet (2000) щодо ВБ породи європейської селекції.

Встановлено достовірні відмінності за частотами ряду алелів досліджуваних локусів мікросателітної ДНК (табл. 3). Наявність таких відмінностей вказує на можливість диференціації різних внутрішньопородних типів УВБ-1, УВБ-2 та ВБА на основі типування за МКС локусами.

Щодо значення фактичної гетерозиготності за різними МКС локусами, то вона знаходилась в межах від 0,150 до 0,675 на відміну від очікуваних рівнів гетерозиготності, які варіювали від 0,633 до 0,817.

Рівень середньої фактичної гетерозиготності за всіма досліджуваними локусами в трьох популяціях виявився практично однаковим від 0,435 до 0,460, тоді як значення очікуваної гетерозиготності, варіювали в межах (0,695 - 0,783), на відміну від імуногенетичних маркерів, де така ситуація не спостерігалась - рівні фактичної та очікуваної гетерозиготності різнились несуттєво. В усіх популяціях виявлено дефіцит гетерозигот, що може бути результатом помірного інбридингу, наслідком якого є збільшення частки гомозиготних генотипів.

3. Генетична структура досліджуваних популяцій за частотами алелів мікросателітних локусів

МКС-локус	Алель №	Досліджені популяції
		УВБ-1 n = 40	УВБ-2 n = 40	ВБА n = 40
S0005	5	0,125*/b	0,013 *	0,000 b
	8	0,088 **/b	0,000 **	0,000 b
S0155	3	0,100	0,238 **	0,025 **
	4	0,200 **	0,075	0,013**
SW857	3	0,238	0,413 **	0,125 **
SW240	2	0,338 ***/c	0,000 ***	0,025 c
	3	0,250 **	0,113	0,025 **
	4	0,213 **/b	0,013 **	0,013 b
	5	0,088 ***	0,213 b	0,525 ***/b
	6	0,000 ***/c	0,300 ***	0,188 c
	7	0,038 **/a	0,263 **	0,188 a

Примітка: *, **, *** p<0,05, p<0,01, p<0,001, відповідно, a, b, c p<0,05, p<0,01, p<0,001, відповідно, критерій Фішера

Виявлено достовірні відмінності показників фактичної гетерозиготності за певним локусом між популяціями тварин. Так, за локусом S0005 достовірно відрізнялись популяції ВБА та УВБ-1 (p < 0,05). Відмінність фактичної гетерозиготності за локусом S0155 зафіксовано між популяціями ВБА та УВБ-2 (p < 0,05). Популяція тварин УВБ-2 за фактичною гетерозиготністю локусу S0101 достовірно відрізнялась від популяції ВБА та від популяції УВБ-1. За рівнем гетерозиготності мікросателітного локусу SW857 достовірні відмінності виявлено між внутрішньопородними типами УВБ-2 і ВБА та УВБ-2 і УВБ-1, (p < 0,01). За локусом SW240 достовірні відмінності відмічені між внутрішньопородними типами УВБ-1 та УВБ-2.

Достовірні відмінності між фактичним та очікуваним рівнями гетерозиготності та дефіцит гетерозигот за окремими локусами вказують на відбір в процесі селекційної роботи саме гомозиготних тварин, що є особливо актуальним в замкнених популяціях.

Проаналізовано розподіл генотипів в досліджених популяціях. Достовірні відхилення фактичного розподілу генотипів від очікуваного за Гарді-Вайнбергом серед досліджених популяцій не було відмічено лише за локусом SW240 для тварин ВБА та УВБ-2, за локусом SW857 для УВБ-1 та за локусом S0005 для тварин УВБ-2. Проте, в популяції ВБА відмічено достовірні відхилення (p < 0,001) за локусами S0105, S0101, SW857 та за локусом S0005 (p < 0,01). У вибірці УВБ-1 відмічено достовірні відхилення (p < 0,001) за локусами S0105, S0101, SW240, та S0005 (p < 0,01). Відхилення від стану рівноваги в розподілі генотипів популяції УВБ-2 було статистично достовірним за локусами S0105 та SW857 (p < 0,001) та S0101 (p < 0,05). В більшості випадків, відхилення фактичного розподілу генотипів від очікуваного відбувалось в бік збільшення гомозигот, що вказує на існування помірного інбридингу.

Ще одним важливим популяційно-генетичним параметром є генетична дистанція між групами тварин. Розраховані генетичні дистанції за Неєм між досліджуваними групами тварин. Максимальне значення дистанції спостерігали між популяціями ВБА та УВБ-1 - 0,356. Дещо меншою виявилась генетична дистанція між популяціями УВБ-1 та УВБ-2 - 0,304. Мінімальним значенням дистанції характеризувалися популяції ВБА і УВБ-2 - 0,161. Найбільша дистанція за Неєм виявилась між тваринами УВБ-1 та ВБА, цей факт, є підтвердженням результатів селекції цих популяцій свиней за різними напрямками продуктивності.

Кластерний аналіз популяцій тварин великої білої породи англійської та української селекції на основі генетичних дистанцій Нея, представлено на рис. 3.

Для коректної побудови дендрограми залучено ще чотири популяції тварин - європейської дикої свині, шведського ландрасу, бельгійського п'єтрену та великої білої породи голландської селекції. Дані алельних частот були люб'язно надані учасником європейської групи з вивчення біорізноманітності свиней С. Chevalet (INRA, France). Як видно з дендрограми, популяції великої білої породи, як української, так і європейської селекції, створюють один кластер, що може свідчити про спільність їхнього походження.

Рис. 3. Кластерний аналіз українських та європейських популяцій свиней

Таким чином, типування стад свиней за локусами мікросателітної ДНК дозволяє виявити певні особливості, характерні як для породи, так і для окремих популяцій зокрема.

Популяційно-генетичний аналіз родин внутрішньопородних типів УВБ-1 та УВБ-2 на основі імуногенетичного типування. Популяція тварин УВБ-1 в нашій виборці представлена чотирма родинами: Беатриси, Волшебниці, Тайги та Герані. В розподілі частот алелів імуногенетичних систем було виявлено достовірні відмінності (табл. 4.)

4. Частоти алелів груп крові в родинах внутрішньопородного типу УВБ-1

Система груп крові	Алель	Досліджені родини
		Беатриси	Волшебниці	Тайги	Герані
		n=10	n=13	n=14	n=9
L	Laki	0,100	0,192 *	0,214 а	0,000 */а
Е	Eaef	0,000 *	0,038	0,071	0,222 *

Примітка: *, р< 0,05, а - р< 0,05, критерій Фішера

Популяція тварин внутрішньопородного типу УВБ-2 представлена п'ятьма родинами, а саме, - Беатриси, Чорної Птички, Тайги, Реклами та Фортуни.

Частоти алелів родин внутрішньопородного типу УВБ-2, що достовірно різнилися представлені в таблиці 5.

5. Алелофонд родин типу УВБ-2 за системами імуногенетичних маркерів

Система груп крові	Алель	Частоти алелів в досліджених родинах
		Беатриси	Ч. Птички	Тайги	Реклами	Фортуни
		n = 9	n = 10	n = 58	n = 7	n = 9
H	H0	1,000 */а	0,800	0,862 b	1,000 c	0,667 */а/b/c
	Hb	0,000 *	0,200	0,138 *	0,000	0,222
K	K0	0,111	0,100 *	0,190 а	0,571 */а	0,444
	Ka	0,500 *	0,300	0,147 *	0,143	0,167
E	Eedf	0,278 *	0,050	0,155 а	0,143	0,000 */а
	Eaef	0,056	0,050	0,060 *	0,071	0,389 *

Примітка: * - р< 0,05, а, b, c - р< 0,05 між різними родинами, критерій Фішера.

Виявлено значно більшу кількість достовірних відмінностей за частотою алелів між родинами внутрішньопородних типів УВБ-1 та УВБ-2. Особливо значимими виявились відмінності за системою Н груп крові (табл. 6).

6. Відмінності родин різних типів за алелями H системи групи крові

Система груп крові	Алель	Частоти алелів в досліджених родинах
		тип УВБ-1	тип УВБ-2
Н	Н0	Беатриси 0,581 **	Беатриси 1,000
		Волшебниці 0,561 **
		Тайги 0,566 **
		Волшебниці 0,561 **	Реклами 1,000
		Тайги 0,566 **
	Ha	Беатриси 0,269	Тайги 0,000 **
		Волшебниці 0,269	Тайги 0,000 **
		Тайги 0,327	Беатриси 0,000 **
			Чорна птички 0,000 **
			Тайги 0,000 ***
	Нb	Герані 0,000	Тайги 0,138 *

Примітка: **,. *** - р < 0,01, р < 0,001, відповідно, критерій Фішера.

В розподілі генотипів між очікуваними та фактичними достовірна різниця була виявлена тільки в родині Тайги типу УВБ-2 за системами L, B, D за першим порогом та Е системи за третім порогом достовірності. В усіх випадках зміщення рівноваги відбувалось в бік збільшення гомозиготності.

Наведені дані дають нам змогу стверджувати, що в процесі селекційної роботи сформувався алелофонд, характерний для окремих родин в різних внутрішньопородних типах свиней великої білої породи української селекції.

Розраховано генетичні дистанції між родинами типів УВБ-1 та УВБ-2. Для цього використовували два алгоритми - Нея та Роджерса. Слід відмітити, що з шести значень генетичних дистанцій Нея чотири виявились нульовими. Також нульовими виявились чотири дистанції між родинами типу УВБ-2. І навіть між родинами Герані типу УВБ-1 та Фортуни УВБ-2. Ці дані можуть вказувати на непридатність методу Нея для визначення генетичних дистанцій за групами крові між генеалогічними родинами породи.

Для визначення дистанцій на внутрішньопородному рівні, а також на рівні родин доцільніше використовувати дистанцію Роджерса. Середнє значення генетичних дистанцій Роджерса між родинами внутрішньопородного типу УВБ-1 знаходилось на рівні 0,127, між родинами УВБ-2 - 0,137. Між родинами типів УВБ-1 і УВБ-2 середнє значення генетичних дистанцій Роджерса було дещо вищим - 0,172, що може свідчити про відмінності родин УВБ-1 та УВБ-2, які виникли внаслідок переважаючої селекції за різними напрямами продуктивності.

Популяційно-генетичний аналіз родин внутрішньопородних типів УВБ-1 та УВБ-2 з використанням мікросателітних маркерів. В ході досліджень виявлено різну кількість фактичних та ефективних алелів, мікросателітних локусів в родинах двох внутрішньопородних типів УВБ-1 і УВБ-2. Даний факт можна пояснити різними заходами, які мали місце в господарствах при створенні генеалогічних груп та подальшій селекційній роботі з ними (закріпленнях, відборі, підборі) при переважаючій селекції за материнськими та батьківськими якостями.

Достовірні відмінності за частотами алелів мікросателітних локусів, які було знайдено між родинами всередині типів УВБ-1 (табл. 7) та УВБ-2 (табл. 8), можуть свідчити про різнорідність родин зазначених типів, та можливість використання даних щодо маркерних алелів в селекційній роботі (паспортизація родин).

7. Генетична структура досліджуваних родин типу УВБ-1 за частотами алелів мікросателітних локусів

Локус	Алель №	Частоти алелів в досліджених родинах
		Беатриси	Волшебниці	Тайги	Герані
S0101	2	0,231 *	0,115	0,143	0,000 *
	5	0,308 *	0,038	0,000 *	0,286

Примітка: * - р < 0,05, критерій Фішера

Виявлено достовірні відмінності частот алелів мікросателітних локусів між родинами двох внутрішньопородних типів УВБ1 і УВБ-2 за всіма локусами мікросателітної ДНК (табл. 9).

8. Генетична структура досліджуваних родин типу УВБ-2 за частотами алелів мікросателітних локусів

Локус	Алель №	Частоти алелів в досліджених родинах
		Tайги	Ч.птички	Беатриси	Фортуни	Реклами
S0155	1	0,000 **	0,143	0,600 **	0,200	0,100
	2	0,639 **	0,429 а	0,200	0,600 b	0,000 **/а/b
S0101	4	0,333 *	0,000 *	0,200	0,100	0,100
SW240	4	0,306 */a	0,357	0,000 *	0,000 a	0,100
	8	0,000 *	0,071	0,400*	0,000	0,000

Примітка: *, ** р < 0,05, р < 0,01, відповідно а - р < 0,05, b - р < 0,01, критерій Фішера

Фактичний розподіл генотипів у вибірці достовірно відрізнявся від очікуваного в родині Волшебниці (УВБ-1) за локусами S0005 (p < 0,05), S0155 (p < 0,001), Тайги УВБ-1 за локусами S0155 і SW240 (p < 0,001), S0101 (p < 0,01), Беатриси за локусом S0101 (p < 0,01).

Серед родин внутрішньопородного типу УВБ-2 достовірні відхилення за розподілом генотипів було відмічено в родині Тайги за локусами S0155 (p < 0,001), S0101 та SW857 (p < 0,01).

При аналізі вищенаведених результатів виявлено наступні закономірності. По-перше, за локусом S0155 у більшості родин внутрішньопородних типів УВБ-1 та УВБ-2 спостерігається достовірне відхилення в розподілі генотипів, що може свідчити про відбір тварин за певними ознаками продуктивності, які контролюються генами, фізично зчепленими з мікросателітним локусом S0155, або асоційовані з ним за принципом міжлокусної асоціації. По-друге, всі достовірні відхилення, йдуть в напрямку переважного відбору гомозиготних тварин, що також може свідчити про певний селекційний тиск в даних внутрішньопородних типах та родинах тварин.

9. Відмінності родин різних типів за частотою алелів мікросателітних локусів

Локус	Алель №	Частоти алелів в досліджених родиниах
		тип УВБ-1	тип УВБ-2
S0155	1	Волшебниці 0,269 **	Тайги 0,000 **
	2	Волшебниці 0,154 **	Тайги 0,639 **
S0101	4	Тайги 0,577 **	Ч. птички 0,000 **
SW857	5	Герані 0,000 **	Беатриси 0,700 **
SW240	3	Герані 0,571 **	Ч. птички 0,000 **
	7	Волшебниці 0,000 **	Реклами 0,500 **

Примітка: ** - р < 0,01, критерій Фішера

Абсолютний рівень фактичної гетерозиготності (1,000) в родинах двох типів зафіксовано в родині Фортуни (УВБ-2) за локусом S0101 та Реклами за локусом S0005. Дещо меншим значення було у родини Беатриси (УВБ-1) за локусом S0005 - 0,857 та у родин Беатриси і Реклами (УВБ-2) за локусом S0101 (0,800). Рівні фактичної гетерозиготності родин Беатриси (УВБ-1) за локусом S0101 та Беатриси і Фортуни (УВБ-2) за локусом S0155 дорівнювали 0,000. Останнє, пояснюється опосередкованим залученням алелів цих локусів у селекційний процес та відбором переважно гомозиготних тварин.

При аналізі фактичної і очікуваної гетерозиготності достовірна різниця в родинах Волшебниці (p < 0,01) і Тайги (p < 0,05) спостерігалась за локусом S0155, що може свідчити про опосередковане залучення локусу S0155 в селекційний процес.

За фактичною гетерозиготністю статистично достовірно різнилися родини УВБ-1 Волшебниці і Беатриси за локусом S0155 (p < 0,05) та Беатриси і Волшебниці та Беатриси і Тайги за локусом S0101 (p < 0,01)

Серед генеалогічних структур типу УВБ-2 зафіксовані достовірні відмінності між рівнем фактичної і очікуваної гетерозиготності. Це мало місце в родинах Тайги, Беатриси і Фортуни за локусом S0155 (p < 0,05) та Тайги за локусом S0101 (p < 0,01). Достовірні відмінності рівнів гетерозиготності за локусом S0155 в родинах обох типів великої білої породи, що селекціонуються за різними напрямками продуктивності, можуть бути результатом зв'язку даного локусу з якимись із важливих генів, що мають вплив на життєдіяльність всього організму, незалежно від напрямку селекційної роботи.

Між родинами внутрішньопородних типів УВБ-1 і УВБ-2, найменша генетична дистанція виявилася між родинами Тайги та Фортуни типу УВБ-2.

Аналіз генетичних дистанцій між родинами різних внутрішньопородних типів за імуногенетичними та ДНК маркерами свідчать про доцільність використання методу Нея для розрахунку генетичних дистанцій за мікросателітними локусами внутрішньопородних структур (типів та родин) завдяки високій інформативності даного типу молекулярно-генетичних маркерів.

Генеалогія відносин за імуногенетичним та ДНК-маркерами вказує на те, що родини внутрішньопородних типів УВБ-1 і УВБ-2 чітко розділились на два окремих кластера. Це свідчить про проходження процесу дивергенції даних популяцій тварин з чого витікає, що дані типи є відселекціонованими популяціями, які можна диференціювати із залученням різних типів молекулярно-генетичних маркерів.

Популяційно-генетичний аналіз ліній свиней великої білої породи з використанням імуногенетичних маркерів. Внутрішньопородні типи великої білої породи в нашому дослідженні були представлені наступними лініями: Свата, Драчуна, Лафета, Кінга (УВБ-1) та Тоомаса, Славутича, Драчуна, Давида, Громкого, Вілгаса (УВБ-2).

За частотою алелів систем груп крові вірогідних відмінностей між лініям всередині типів УВБ-1 та УВБ-2 нами не виявлено.

При порівнянні ліній, різних типів УВБ-1 і УВБ-2 найбільш достовірні різниці за частотами алелів відмічено за К і Е системами груп крові (табл. 10).

За дистанцією Роджерса мінімальні значення 0,084 спостерігалися між лініями Вілгаса УВБ-2 та Громкого УВБ-2, а також Тоомаса і Славутича (обидві лінії типу УВБ-2). Максимальне значення 0,200 даної дистанції зафіксовано між лініями Кінга УВБ-1 та Громкого УВБ-2. При аналізі генетичних дистанцій Нея між лініями типів УВБ-1 і УВБ-2 найменше середнє значення дистанції Нея було відмічено між лініями внутрішньопородного типу УВБ-1 (0,003), дещо більше - між лініями УВБ-2 (0,008) та між лініями УВБ-1 і УВБ-2 середнє значення дорівнювало 0,038. Також нами відмічено чотири пари ліній типу УВБ-1 та п'ять пар ліній УВБ-2, дистанція між якими дорівнювала 0,000.

10. Відмінності ліній різних типів за частотою алелів груп крові

Система	Алель	Частоти алелів в досліджених лініях
		тип УВБ-1	тип УВБ-2
K	Kа	Свата 0,237 **	Драчуна 0,000**
		Драчуна 0,350**	Драчуна 0,000 **
	Kd	Драчуна 0,000**	Драчуна 0,300 **
Е	Eedf	Свата 0,237**	Тоомаса 0,000 **

Примітка: **, р < 0,01, критерій Фішера

Ці результати підтверджують висновок що до недоцільності використання дистанції Нея для дослідженнях генеалогічних структур за імуногенетичними маркерами.

Щодо дистанцій Роджерса, то середні значення були наступними: між лініями УВБ-1 - 0,123, між лініями УВБ-2 - 0,122 і між лініями УВБ-1 та УВБ-2 - 0,165. Це може свідчити про певну генетичну диференціацію ліній як між внутрішньопородними типами, так і всередині типів.

Філогенетичні взаємини за імуногенетичними маркерами між лініями внутрішньопородних типів УВБ-1, УВБ-2 представлено на рис. 4.

Максимальна дистанція між лініями всередині внутрішньопородного типу УВБ-2, в більшості випадків, набагато перевищує значення дистанцій між лініями різних внутрішньопородних типів великої білої породи. Даний факт можна пояснити гетерогенністю однієї з ліній, у створенні якої брали участь тварини, що належать до генетично віддалених популяцій великої білої породи, тоді як інші лінії могли створюватись на близькоспорідненій основі.

Рис. 4. Диференціація ліній великої білої породи за імуногенетичними маркерами

Ми спостерігаємо чітке розділення за кластерами ліній двох внутрішньопородних типів свиней УВБ-1 та УВБ-2. Один кластер утворили лінії типу УВБ-1, другий - лінії УВБ-2. Це свідчить про те, що внутрішньопородні типи великої білої породи свиней зазнали процесу дивергенції внаслідок селекційної роботи за різними напрямками продуктивності, що наклало свій відбиток на генетичну структуру популяцій, яку ми оцінювали за допомогою імуногенетичного та ДНК маркірування.

Виходячи з результатів проведеного аналізу, можемо констатувати факт утворення в процесі селекційної роботи з породою алелофондів, характерних для ліній різних внутрішньопородних типів.

Популяційно-генетичний аналіз ліній свиней великої білої породи з використанням маркерів мікросателітної ДНК. При аналізі алельного складу ліній внутрішньопородного типу УВБ-1 за мікросателітною ДНК виявлено різну кількість алелів та ефективних алелів, у різних ліній тварин внутрішньопородних типів УВБ-1 та УВБ-2. З вищезазначеного можна зробити висновок що до наявності суттєвих відмінностей між представниками ліній в межах типу. Це створює передумови для використання цієї інформації при створенні селекційних планів, плануванні оптимальних схем поєднання для генетичної консолідації ліній. Вважаємо, що слід постійно проводити генетичний моніторинг стад, з подальшим застосуванням одержаних даних в селекційній роботі. Аналіз внутрішньопородного типу УВБ-1 за частотою алелів мікросателітних локусів виявив достовірні відмінності між лініями (табл. 11).

11. Генетична структура ліній типу УВБ-1 за частотою алелів мікросателітних маркерів

Локус	Алель №	Частоти алелів в досліджених лініях
		Лафета	Свата	Драчуна	Кінга
S0005	4	0,214 *	0,000 *	0,111	0,071
S0155	2	0,571 *	0,206	0,278	0,071 *
	6	0,000	0,176	0,222 *	0,214
S0101	5	0,071	0,265 *	0,000 *	0,214
SW240	5	0,214 *	0,059	0,111	0,000 *

Примітка: * - р< 0,05, критерій Фішера

Також достовірні відмінності за частотою алелів мікросателітних локусів було виявлено в лініях внутрішньопородного типу УВБ-2 (табл. 12).

12. Генетична структура ліній типу УВБ-2 за частотою алелів мікросателітних маркерів

Локус	Алель №	Частоти алелів в досліджених лініях
		Cлавутича	Вілгаса	Драчуна	Тоомаса	Давіда	Громкого
S0155	1	0,000 *	0,000 *	0,167	0,167	0,200	0,500 */*
	2	0,400 */b	1,000 a/a/b/b/c	0,389 */b	0,667 */a	0,000 */*/*/c	0,250 a
	3	0,150	0,000*/*	0,333 *	0,167	0,600 *	0,250
	4	0,300 */*/*	0,000*	0,000*	0,000*	0,000	0,000
SW857	4	0,050	0,167	0,389 */*/*	0,000*	0,000*	0,000*

Примітка: * - р< 0,05, а, b та с - р< 0,05, р< 0,01, р< 0,001, відповідно, критерій Фішера

Як за імуногенетичними маркерами, так і за локусами мікросателітної ДНК, значно більшу кількість достовірних відмінностей за частотою алелів виявлено між лініями різних внутрішньопородних типів (табл. 13).

13. Відмінності ліній різних типів за частотою алелів мікросателітних маркерів

Система	Алель №	Частоти алелів в досліджених лініях
		тип УВБ-1	тип УВБ-2
S0155	2	Драчуна 0,278 **	Вілгаса 1,000
		Свата 0,206 ***
		Кінга 0,071 ***
	3	Драчуна 0,000	Давіда 0,600 **
SW240	3	Драчуна 0,389 **	Славутича 0,000

Примітка: **,. *** - р< 0,01 та р< 0,001 відповідно, критерій Фішера

Це підтверджує виказану раніше думку, що в процесі селекційної роботи за різними напрямками продуктивності в популяціях тварин відбуваються певні зміни щодо алельного складу як системи груп крові, так і локусів мікросателітної ДНК.

Максимальне значення дистанції Нея відмічено між лініями Лафета типу УВБ-1 та Громкого УВБ-2.

Генетичні зв'язки, ліній різних внутрішньопородних типів великої білої породи за локусами мікросателітної ДНК вказують на чітку диференціацію внутрішньопородних типів УВБ-1 та УВБ-2. При порівнянні цих результатів з даними кластерного аналізу одержаного на основі імуногенетичного типування можемо зазначити, що неспівпадіння окремих гілок дендрограми, швидше за все, викликано різною природою маркерів, залучених для нашого дослідження.

Таким чином імунологічний та МКС-аналіз демонструє генетичну відмінність типів УВБ-1 та УВБ-2, що створює передумови для використання міжтипових поєднань на внутрішньопородній основі з метою одержання гетерозисного ефекту у молодняка за відгодівельними та м'ясними якостями.

Оптимізація техніки типування тварин за локусами мікросателітної ДНК для визначення походження поросят. Для визначення походження поросят, які народилися після ембріотрансплантації, було використано метод ідентифікації, який ґрунтується на типуванні тварин за мікросателітними локусами.

Обрано три МКС-локуси з високим рівнем інформативності: SSTNFB, S0097 та SW857.

На початковому етапі визначалася інформативність мікросателітного локусу шляхом генотипування донорів і реципієнтів кожного гнізда. Якщо за мікросателітним локусом алелі генотипів пар донорів та реципієнтів співпадали, то подальші дослідження за даною системою не проводили. Найбільш інформативними виявились системи SSTNFB і S0097. За результатами ДНК-типування встановлювали або виключали трансплантаційне походження кожного з поросят. Трансплантатами вважали тих, у яких зафіксовано алелі, успадковані лише від батьків-донорів. Поросят, які за генотипом могли належати тільки реципієнтам, відносили до їх власного приплоду.

Молекулярно-генетичним аналізом 7 пар реципієнтів, 9 пар донорів пересаджуваних ембріонів та 62 поросят було визначено походження у 93,5% (58 із 62 голів) досліджених поросят. Із них 25 виявилися сингенними донорам пересаджених ембріонів і, одночасно, алогенними реципієнтам, що стало підставою віднести їх до трансплантатів. 33 поросяти із змішаних приплодів могли бути лише потомством реципієнтів. Не було встановлено походження 6,5% (4 із 62 голів) поросят; з них 3 голови із гнізда №830, для яких мікросателітні системи S0097, SSTNFB та SW857 виявилися неінформативними через співпадіння алелів мікросателітних локусів, як донорів так і реципієнтів.

Таким чином, нами розвинуто і оптимізовано техніку типування тварин за локусами мікросателітної ДНК для встановлення походження поросят. Мікросателітні локуси доцільно використовувати для підтвердження поход...