Роль глутамату та пролінвмісних ди- та трипептидів у регуляції морфо-функціонального стану шлунка

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

РОЛЬ ГЛУТАМАТУ ТА ПРОЛІНВМІСНИХ ДИ- ТА ТРИПЕПТИДІВ У РЕГУЛЯЦІЇ МОРФО-ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ШЛУНКА

ФАЛАЛЄЄВА Тетяна Михайлівна

Київ - 2011

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні 20 років природні катаклізми, популяційний тиск техногенних факторів, формування лікарської залежності населення і, як наслідок, зниження показників норми імунітету у здорових людей призводять до збільшення числа захворювань різних систем організму, в тому числі і шлунково-кишкового тракту [Ивашкин В.Т., 1995, 2002; Передерий В.Г., 2002; Ali T., 2009; Methy N., 2009, 2010; Kozarek R.A., 2010; Reveiz L., 2010]. На сьогодні в Україні 40 - 50% населення і 10 - 15% дитячого дорослого мають проблеми з травним трактом і надмірну масу тіла [МОЗ України, 2009]. Основними причинами, що призводять до даних проблем зі здоров'ям, є низький рівень фізичної активності, особливості харчової поведінки, зростання в раціоні жирних, висококалорійних продуктів і легкозасвоюваних вуглеводів, а також широке і безконтрольне використання в харчовій промисловості та в мережі підприємств громадського харчування (їдальні, кафе, ресторани) харчових добавок, перш за все, глутамату натрію [Garcia O.J.C., 1996; Geha R., 2000; Williams A.N., 2009].

Глутамат натрію (Е 621) - найрозповсюдженіша харчова добавка (посилювач смаку). Важко знайти консерви, напівфабрикати або готові продукти, вироблені промисловим шляхом, в яких не було б глутамату натрію. У ресторанах швидкого харчування без посилювача смаку не обходиться майже ні один рецепт. При цьому допустимі норми можуть бути значно завищені, що призводить до захворювань травного тракту. Лікарі такі захворювання об'єднали терміном „синдром китайського ресторану”, симптомами якого є різкий біль у шлунку та грудях, почервоніння обличчя, підвищена температура тіла та ін. [Garcнa O.J.C., 1996; Yang W.H., 1997; Woessner K.M., 1999; Walker R., 1999, 2000; Williams A.N., 2009]. Механізм виникнення цих хвороб досліджений недостатньо, що потребує детального вивчення цього питання.

На сьогодні залишається дискусійним питання про участь глутамату натрію в ожирінні більшості людей, які зловживають їжею в ресторанах швидкого харчування. Частина вчених вважає, що дана харчова добавка викликає порушення обміну речовин та підвищення маси тіла [He K., 2008; Luz J., 2009; Lobato N.S., 2010], проте існує думка, що вживання глутамату натрію, навіть у великих дозах не шкодить організму людини [Shi Z., 2010; Samuels A., 2010].

Таким чином, актуальною проблемою сучасної фізіології травлення, дієтології та гастроентерології є всебічне вивчення впливу глутамату натрію на організм людини, перш за все, на секреторну функцію шлунка, так як шлунок є найбільш вразливим відділом травного тракту, в який попадає їжа багата на глутамат натрію та глутамінову кислоту.

Аналіз літератури свідчить про обмеженість та протиречивість даних про вплив глутамату на шлункову секрецію кислоти (ШСК). Дані літератури не дають вичерпної відповіді на запитання через які підтипи іонотропних глутаматних рецепторів (NMDA, АМРА та каїнатні) центральної та периферичної локалізації глутамат натрію впливає на ШСК [Slygin G.K., 1990, 1991; Tsai W., 1994; Khropycheva R., 2009]. По-перше, це пов'язано з порівнянням результатів, одержаних в різних умовах експериментів (in vitro, in vivo, in situ), а по-друге, зі застосуванням, як агоністів іонотропних глутаматних рецепторів, так і їх блокаторів [White R.L.,1991; Namiki T., 1993; Tsai L.H., 1999; Garcia-Zaragoza E., 2000; Yang H. et al., 2000; Tebbe J.J., 2001; Tsuchiya S., 2001; Garcia-Zaragoza E., 2003; Tsai L.H., 2004, 2005]. Зважаючи на те, що екзогенно введені агоністи в дозах, що значно перевищують фізіологічні значення, можуть спричиняти фармакологічні ефекти, відмінні від фізіологічних, виникає потреба порівняти вплив екзогенно введеного глутамату та вплив ендогенного глутамату на ШСК.

Так як агоністи та антагоністи іонотропних глутаматних рецепторів широко застосовуються при лікуванні різних нейродегенеративних захворювань [Bowie D., 2008; Nakanishi Y., 2008; Dong X.X., 2009; Andrй V.M.,2010; Hamed S.A., 2010; Seeck M., 2010; Wu T.Y., 2010; Bustillo J.R., 2011], знання їх впливу на ШСК дозволить не тільки розширити наші уявлення про механізми регуляції ШСК, а також дозволить розробити індивідуальний підхід до застосування препаратів з урахуванням стану секреторного апарату шлунка.

Як відомо, розлад регуляторних механізмів, що тримають під своїм контролем продукцію соляної кислоти в шлунку, призводить до розвитку патологічних станів в шлунку як у випадку надмірної продукції кислоти, так і при зниженні активності секреторних залоз. Гіперсекреторні стани часто стають причиною ульцерогенезу, тоді як гіпосекреторні стани, призводячи до гіпергастринемії, підвищують ризик переродження тканин шлунка [Ивашкин В.Т., 1995, 2002; Smoot D.T., 2001; Передерий В.Г., 2002; Ramsoekh D., 2005; Hagymбsi K., 2010; Holle G.E., 2010; Pilotto A., 2010; Sung J.J., 2010]. Проблема порушення регуляції продукції соляної кислоти шлунком до цього часу залишається нерозв'язаною.

Широка поширеність виразкової хвороби з постійною загрозою ускладнень та відсутність ефективних засобів профілактики рецидивів виразки вимагають пошуку нетоксичних профілактичних антивиразкових засобів природного походження. Адже для профілактики рецидивів виразкової хвороби не використовують препарати, які включені в стандартні схеми лікування виразки (Н₂-блокатори, блокатори Н⁺/К⁺ - АТФази та ін.). Нашу увагу привернули гліпроліни, яким в останній час надається важлива роль у формуванні захисних реакцій в проксимальному відділі травного тракту [Ашмарин И.П., 2002, 2007, 2008]. У зв'язку зі встановленими на різних експериментальних моделях виразкоутворення їх цитопротекторних властивостей, відкривається перспектива розробки на основі простих пептидів, що складаються з гліцину (Глі) і проліну (Про), природних гастропротекторів. Проте така розробка неможлива без з'ясування механізмів цитопротективної дії гліпролінів.

Гліпроліни віднесені до природних гастропротекторів у зв'язку з тим, що гліпролін Про-Глі-Про є фрагментом колагену і еластину та справляє виражений профілактичний і лікувальний вплив на ерозивно-виразкові ураження слизової оболонки шлунка (СОШ), викликані етанолом, стресом, індометацином, оцтовою кислотою та іншими ульцерогенними чинниками і постійно присутні в тканині СОШ [Самонина Г.Е., 2001; Жуйкова С.Е., 2003; Бакаєва З.В., 2004, 2005; Zolotarev Iu.A., 2006; Бакаєва З.В., 2008, Самонина Г.Е., 2008]. Не дивлячись на встановлену феноменологію дії гліпролінів, механізм їх антивиразкового впливу з'ясований не до кінця. Насамперед це стосується впливу пролінвмісних пептидів на секреторну функцію шлунка, порушення якої є однією з головних ланок патогенезу виразкової хвороби.

Таким чином, актуальність обраного наукового напрямку обумовлена комплексним підходом до розкриття механізмів регуляції секреторної функції шлунка за участю глутамату і пролінвмісних пептидів та їх участі в патогенезі та профілактиці виразкової хвороби шлунка.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану наукових досліджень Київського національного університету імені Тараса Шевченка і є фрагментом наукових тем ННЦ «Інститут біології»: "Дослідження механізмів функціонування органів травного тракту та методів їх корекції" (2006-2010 рр., № теми 06БФ036-03, № держреєстрації 0106U005755) та “Механізми реалізації адаптаційно - компенсаторних реакцій організму за умов розвитку різних патологій” (2011-2015 рр., № 11БФ036-01, № держреєстрації 0111U004648).

Дисертантка була науковим керівником договірної науково-дослідної роботи "Дослідження впливу глутамату натрію на структурно-функціональний стан органів травлення" (2009 р., № теми 09ДП036-04, № держреєстрації 0109U005191).

Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні Вченої ради біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, протокол № 7 від 16 лютого 2010 року, уточнена протокол № 9 від 19 квітня 2011 року.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідити вплив глутамату та пролінвмісних ди- та трипептидів на морфо-функціональний стан шлунка.

Відповідно до мети перед нами були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити роль центральних та периферичних іонотропних глутаматних рецепторів NМDА (N-метил-D-аспартат)-підтипу у регуляції ШСК у щурів.

2. Встановити роль центральних та периферичних іонотропних глутаматних рецепторів каїнатного-підтипу у регуляції ШСК у щурів.

3. З'ясувати роль центральних та периферичних іонотропних глутаматних рецепторів AMРA (2-аміно-3-гідрокси-5-метилізоксазол-4-іл пропіонова кислота)-підтипу у регуляції ШСК у щурів.

4. Дослідити вплив одноразового системного введення глутамату натрію на базальну ШСК у щурів.

5. Вивчити вплив 10-, 20- та 30-ти денного введення глутамату натрію на базальну секрецію соляної кислоти, масу тіла та морфологію СОШ щурів. З'ясувати вплив 30-ти денного введення глутамату натрію на стійкість СОШ щурів до дії стресу.

6. Вивчити вплив одноразового системного введення гліпролінів на базальну і стимульовану ШСК у щурів.

7. Дослідити вплив пролінвмісних пептидів на розвиток уражень в СОШ щурів, викликаних стресом та етанолом, та стан про- та антиоксидантної системи в СОШ.

8. Провести морфологічний і лектиногістохімічний аналіз СОШ щурів в умовах розвитку ерозивно-виразкових уражень до і після дії гліпролінів.

9. Дослідити вплив пролінвмісних пептидів на базальну ШСК, масу тіла та морфологію СОШ щурів в умовах тривалого введення глутамату натрію.

Об'єкт дослідження - механізми регуляції гомеостазу СОШ.

Предмет дослідження - рівень секреції соляної кислоти в шлунку, вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) та активність ферментів антиоксидантного захисту в СОШ, вміст аніонів нітриту (NO₂^-) в плазмі крові, структурно-морфологічний стан СОШ, маса тіла.

Методи дослідження. Досліджували базальну та стимульовану секрецію соляної кислоти у щурів методом перфузії ізольованого шлунка за Гхошем та Шільдом [Ghosh M.H., 1958]. Було проведено фармакологічний аналіз впливу глутамату та пролінвмісних пептидів на секреторну функцію шлунка. Ерозивно-виразкові ураження викликали методом іммобілізаційного водоімерсійного стресу [Takagi K., 1968] та введенням етанолу [Бакаева З.В., 2004]. Визначали вміст дієнових кон'югатів за ультрафіолетовим (УФ) - поглинанням гептанових екстрактів [Гаврилов В.Б., 1988], Шиффових основ флуориметричним методом [Колесова О.Е., 1984], тіобарбітурової кислоти (ТБК) - активних продуктів спектрофотометричним методом [Тимирбулатов Р.А., 1981]. Ферментативну активність супероксиддисмутази [Чевари С.И., 1985] і каталази [Королюк М.А., 1998] визначали спектрофотометричним методом. Вміст NO₂^- в плазмі крові визначали за допомогою реактиву Грісса [Green L.C., 1982]. Стан СОШ оцінювали за допогою гістоморфологічних [Лилли Р., 1969] та лектиногістохімічних методів [Луцик А.Д., 1989; Антонюк В.О., 2005].

Наукова новизна одержаних результатів. Проведені дослідження дозволили доповнити та розвинути загальнобіологічні положення механізмів регуляції секреторної функції шлунка за участю глутамату і пролінвмісних пептидів. Розроблена концепція універсального механізму цитопротекції, який реалізується за допомогою продуктів розпаду колагену - пролінвмісних пептидів, що постійно присутні в тканині СОШ та дія яких не потребує часу на активацію.

Вперше встановлена ефективна доза харчової добавки глутамату натрію при одноразовому введенні (240 мг/кг, відповідає 16,8 г / середньостатистичну людину), що стимулює базальну ШСК у щурів. Стимулюючий ефект глутамату натрію на базальну ШСК усувався ваготомією. Після ваготомії спостерігалася реверсія ефекту на пригнічення шлункової секреції. Тобто, глутамат натрію в дозі 240 мг/кг справляє як сильний стимулюючий, так і певний гальмівний вплив на базальну ШСК.

Вперше комплексно досліджено участь всіх підтипів іонотропних глутаматних рецепторів у регуляції як базальної, так і стимульованої різними секретагогами ШСК. За допомогою фармакологічного аналізу та хірургічної денервації шлунка встановлена різнонаправлена роль центральних та периферичних іонотропних глутаматних рецепторів: збудження центральних глутаматних рецепторів (NМDА- та каїнатного-підтипів) викликає посилення ШСК; напроти, збудження периферичних глутаматних рецепторів каїнатного-підтипу викликає гальмування секреції соляної кислоти. Глутаматні рецептори АМРА-підтипу не залучені у регуляцію ШСК. Даний аналіз ролі підтипів глутаматних рецепторів центральної і периферичної локалізації дозволяє стверджувати, що відсутність ефекту глутамату натрію в дозах 15, 30, 60, 120, 480, 960 мг/кг на базальну ШСК є результатом сумації двох різнонаправлених ефектів - стимулюючого та гальмівного.

Вперше показано, що тривале введення глутамату натрію призводило до порушення морфо-функціонального стану шлунка: гіперсекреції соляної кислоти, розвитку ерозивно-виразкових уражень СОШ, морфологічних змін слизової, а також до розвитку ожиріння. Вказані патологічні зміни не розвивалися за умов одночасного введення глутамату та пролінвмісних пептидів.

Вперше встановлено, що гліпроліни (Про-Глі-Про та Глі-Про) гальмували ШСК, стимульовану карбахоліном, гістаміном та пентагастрином у щурів. Ваготомія повністю усувала гальмівний вплив Про-Глі-Про та Глі-Про на ШСК, стимульовану карбахоліном, та послаблювала їх дію на базальну, гістамінову та пентагастринову секрецію, що є свідченням залежності ефектів від тонічних впливів з ЦНС, які передаються по блукаючих нервах. Про-Глі не впливав на стимульовану карбахоліном, гістаміном та пентагастрином ШСК у щурів.

Вперше показано, що одним з механізмів впливу гліпролінів на ШСК є стимуляція виділення оксиду азоту (NO), який призводить до гальмування базальної і стимульованої секреції.

Вперше з'ясовано, що механізм профілактичної дії гліпролінів на розвиток уражень в СОШ різного ґенезу полягає не тільки в стимуляції виділення NO та покращенні кровопостачання СОШ, але і в нормалізації про- і антиоксидантного балансу загальної фракції клітин слизової та в стабілізації глікопротеїнового складу в тканинах СОШ.

Практичне значення отриманих результатів. Проведені дослідження мають важливе практичне значення, так як, по-перше, агоністи і антагоністи глутаматних рецепторів широко використовуються у клініці при різних нейродегенеративних захворюваннях, знання їх впливу на ШСК дозволить використовувати дані речовини з урахуванням їх впливу на секреторну активність шлунка, по-друге, агоніст глутаматних рецепторів глутамат натрію (Е 621), найрозповсюдженіша харчова добавка (посилювач смаку), може викликати не тільки „синдром китайського ресторану”, але і ерoзивно-виразкові ураження та ожиріння, що встановлено в нашій роботі. З урахуванням впливу глутамату натрію на секреторний потенціал шлунку, стан СОШ та зміни маси тіла максимальні добові дози харчової добавки мають бути переглянуті.

Гліпроліни можуть бути рекомендовані як засіб профілактики негативного впливу даної харчової добавки на СОШ та масу тіла, що є надзвичайно важливим в наш час з огляду на те, що вживання даної харчової добавки людьми часто надмірне та неконтрольоване та є причиною серйозних порушень гомеостазу організму, які встановлені в нашій роботі (гіперсекреція соляної кислоти, ураження та деструктивні зміни СОШ, розвиток ожиріння).

Враховуючи ендогенне походження пролінвмісних пептидів, а також встановлений в даній роботі їх вплив на морфо-функціональний стан шлунка, можна за рахунок цих пептидів розширити спектр відомих факторів захисту (захисний слизовий бар'єр, адекватна мікроциркуляція, активна регенерація), що протистоять в природних умовах чинникам агресії (кислотно-пептичний фактор, стрес, тощо). Зменшення утворення пролінвмісних пептидів буде призводити до збільшення секреції кислоти і, як наслідок, ризику виразкоутворення.

Результати дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес факультету післядипломної освіти лікарів Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова; кафедри фізіології людини і тварин ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка; кафедри біологічної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького; кафедри загальної хірургії № 1 Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконано весь обсяг експериментальних досліджень в НДЛ "Фармакології і експериментальної патології" Відділення біологічних і біомедичних технологій ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Дисертантом самостійно визначені мета і задачі наукового дослідження, проаналізовано актуальність і ступінь дослідженості тематики роботи, розроблено методичні підходи і дослідницьку програму роботи, опрацьовано моделі, згідно з якими виконані експериментальні дослідження, підібрана та проаналізована наукова література за темою дисертації. Автор власноруч здійснила обробку отриманих даних стосовно репрезентативності виявлених в організмі змін, розкриття їх механізмів за допомогою комплексу фізіологічних, морфологічних, біохімічних показників. Автор самостійно провела статистичне опрацювання одержаних результатів. Написання всіх розділів дисертації, аналіз і теоретичне узагальнення результатів, визначення наукової новизни належать особисто автору. Основний матеріал опублікованих праць був одержаний здобувачем.

Обговорення результатів досліджень та формулювання висновків здійснено за участю наукового консультанта. Дослідження механізмів впливу гліпролінів на морфо-функціональний стан шлунка здобувач виконала за консультативною допомогою д. біол. н., проф., провідн. наук. співроб. кафедри фізіології людини та тварин біологічного факультету Державного навчально-наукового закладу Московського державного університету імені М.В.Ломоносова (Москва, Росія) Самоніної Г.Ю. Гліпроліни (Про-Глі-Про, Глі-Про і Про-Глі) були люб'язно надані лабораторією регуляторних пептидів Інституту молекулярної генетики РАН (Москва, Росія) (синтез здійснювала cт. наук. співр., к. біол. н. Андрєєва Л.А.). Синтез блокаторів іонотропних глутаматних рецепторів (ІЕМ 1751, аркаїн, пірилен) здійснював д. біол. н. Гміро В.Є. (Інститут експериментальної медицини РАМН, відділ нейрофармакології, Санкт- Петербург, Росія). Дослідження ролі центральних та периферичних іонoтропних глутаматних рецепторів у регуляції ШСК у щурів проведено за участю к. біол. н., мол. наук. співр. сектору «Цитофізіологія» Відділення біологічних і біомедичних технологій ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка Дзюбенко Н.В. Автор висловлює глибоку вдячність колегам за допомогу в проведенні досліджень, співучасть яких у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на: 8-мій Міжнародній конференції “Інформотерапія: теоретичні аспекти і практичне застосування” (Київ, Україна, 2002); 1-шій Міжнародній конференції „Нейрогуморальні та клітинні регуляторні механізми травних процесів” (Львів, Україна, 2003); 7-мій Міжнародній конференції студентів медицини (Краків, Польща, 2003); 2-гій Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів "Молодь і поступ біології" (Львів, Україна, 2006); Спільній зустрічі Словацького фізіологічного товариства та Федерації європейських фізіологічних товариств (Братислава, Словаччина, 2007); 3-тій Міжнародній конференції “Нейрогуморальні та клітинні регуляторні механізми травних процесів” (Львів, Україна, 2007); 5-му Міжнародному науковому симпозіумі з клітинного / тканинного ураження та цитопротекції/органопротекції (Ялта, Україна, 2008); Науково-практичній конференції «Біологічно активні речовини: фундаментальні і прикладні питання отримання і застосування» (Новий Світ, Крим, Україна, 2009); Науковій конференції «Системна організація психофізіологічних та вегетативних функцій» (Луцьк, Україна, 2009); Науково-практичному симпозіумі «Захворювання органів травлення: новації діагностики та лікування» (Вінниця, Україна, 2009); Українському фізіологічному з'їзді (Одеса, Україна, 2010); 14-му Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, Україна, 2010); 13-му конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Львів, Україна, 2010); 18-му об'єднаному європейському гастроентерологічному тижні (Барселона, Іспанія, 2010); 5-тій Міжнародній науковій конференції, присвяченій 100-річчю від дня народження професора Павла Дмитровича Харченка та 65-річчю НДІ фізіології імені академіка Петра Богача «Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології» (Київ, Україна, 2010); 15-му Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, Україна, 2011); 7-мій Міжнародній науковій конференції «Молодь та поступ біології» (Львів, Україна, 2011); 45-тій щорічній науковій конференції Європейського товариства з клінічних досліджень (Кріт, Греція, 2011); 18-тій Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів та молодих вчених «Ломоносов» (Москва, Росія, 2011).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 43 наукові праці, у тому числі: 1 монографія, 23 статті, 7 з яких в англомовних журналах, 19 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, розділу огляду літератури, розділу матеріали і методи досліджень, 3-х розділів з викладом результатів власних досліджень, аналізу і узагальненню результатів, практичних рекомендацій, висновків, списку використаних джерел, який складається із 600 найменувань, в тому числі 488 іноземних авторів, та додатків. Матеріали дисертаційної роботи викладені на 344 сторінках (основна частина 250 сторінок). Робота ілюстрована 25 таблицями, 69 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

глутамат шлунок рецептор іонотропний

Матеріали і методи досліджень

Робота виконана на 1633 білих статевозрілих нелінійних щурах масою 145-230 г., які утримувались в умовах акредитованого віварію ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка згідно зі "Стандартними правилами по упорядкуванню, устаткуванню та утриманню експериментальних біологічних клінік (віваріїв)" з дотриманням загальних принципів біоетики у відповідності до Хельсінської декларації [Всесвітня медична асамблея, 1964], Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей [Страсбург, 1986], Декларації принципів толерантності [28 сесія ЮНЕСКО, 1995], Універсальної декларації по біоетиці та правах людини [ООН, 1997], норм Конвенції про захист прав людини у зв'язку з впровадженням нових біомедичних технологій, прийнятою у 1997 році у м. Ов'єдо (Іспанія) та підписаного Верховною Радою України у 2002 році, Закону України № 3447 ІV “Про захист тварин від жорстокого поводження” [Покровский В.И., 1997; Мальцев В.И., 2001]. Тварини отримували стандартний корм для гризунів та дехлоровану водопровідну воду. За добу до початку експерименту щури не отримували їжі, але мали вільний доступ до води. Прилади, що використовувалися для наукових досліджень, підлягали метрологічному контролю. Після завершення дослідів щурів умертвляли за допомогою летальної дози уретану (3 г/кг (внутрішньоочеревинно (в/о)) [Cao Y., 2007].

Досліджували вплив одноразового системного введення глутамату натрію (Китай) в дозах 15, 30, 60, 120, 240, 480, 960, 1920 мг/кг (в/о) на ШСК. Також вивчали вплив харчової добавки глутамату натрію (Китай) в дозах 15 та 30 мг/кг (1 раз на добу, перорально), що відповідало 1 та 2 г / середньостатистичну людину. Глутамат натрію розчиняли у 0,5 мл води.

У роботі використані пролінвмісні пептиди, синтезовані в лабораторії регуляторних пептидів Інституту молекулярної генетики РАН (Москва, Росія). Про-Глі-Про, Глі-Про, Про-Глі застосовувались в дозі 3,7 мкмоль/кг, розчинені в 0,5 мл фізіологічного розчину [Жуйкова С.Е., 2003; Бакаєва З.В., 2004, 2008]. Щурам контрольних груп замість досліджуваних речовин вводили плацебо, а саме 0,5 мл питної водопровідної дехлорованої води кімнатної температури.

В якості блокаторів іонотропних глутаматних рецепторів були використані наступні речовини:

1. ІЕМ 1751 - блокатор AMPA/каїнатних іонотропних глутаматних рецепторів в дозах 2,5 та 5 мг/кг, в/о (Інститут експериментальної медицини, Санкт- Петербург, Росія) [Гмиро В.Е., 2000];

2. GYKI-52466 - блокатор AMPA - підтипу іонотропних глутаматних рецепторів в дозі 3 мг/кг, в/о (Sigma-ALDRICH, Inc., USA) [Ouardouz M., 1994];

3. дизоцилпін малеат - блокатор іонного каналу глутаматних рецепторів NМDА - підтипу в дозі 0,1 мг/кг, в/о (Sigma-ALDRICH, Inc., USA) [Bienkowski P., 1998];

4. аркаїн - блокатор поліамінного сайту глутаматних рецепторів NМDА - підтипу в дозі 10 мг/кг, в/о (Інститут експериментальної медицини, Санкт-Петербург, Росія) [Гмиро В.Е., 2000];

5. пірилен - блокатор фенілциклідинового сайту зв'язування NМDА - підтипу іонотропних глутаматних рецепторів в дозі 0,4 мг/кг, в/о (Інститут експериментальної медицини Санкт- Петербург, Росія) [Гмиро В.Е., 2000].

6. L-701,324 - блокатор гліцинового сайту глутаматних рецепторів NМDА - підтипу в дозі 2,5 мг/кг, в/о (Sigma-ALDRICH, Inc., USA) [Koneczny J., 1999].

Методика дослідження шлункової секреції кислоти. Дослідження ШСК у щурів проводили в умовах гострого експерименту методом перфузії ізольованого шлунка за Гхошем та Шільдом [Ghosh M.H., 1958; Tsuchiya S., 2001; Скляров О.Я., 2007]. Щурів наркотизували уретаном в дозі 1,1 г/кг ваги, в/о (Sigma Chemichal Co, USA) [Kato S., 1998; Norlen P., 2000].

Дослідження проведені на двох групах щурів: І - щури з інтактною нервовою системою, ІІ - щури, яким була виконана операція стовбурової ваготомії з метою виключення центральних холінергічних впливів на обкладові клітини шлунка.

В якості стимуляторів ШСК були використані:

- неселективний агоніст ацетилхолінових рецепторів карбахолін в дозі 0,001 мг/кг, в/о (Sigma Chemichal Co, USA) [Beregova T., 2003];

- неселективний агоніст гістамінових рецепторів гістаміну дигідрохлорид в дозі 3 мг/кг, в/о (Sigma Chemichal Co, USA) [Takeuchi K., 1988];

- агоніст гастринових/ССК₂ рецепторів пентагастрин в дозі 0,026 мг/кг (Sigma Chemical Co, USA) [Rafsanjani F.N., 2007].

- нейтральний людський монокомпонентний інсулін АКТРАПІД МС в дозі 1,2 од/кг, в/о [Axelson J., 1987];

- 2-дезокси-D-глюкоза в дозі 200 мг/кг, в/о (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA) [Matsumoto J., 1992].

Упродовж стимулюючої дії карбаболіну, гістаміну, пентагастрину (120 хв) та інсуліну і 2-дезокси-D-глюкози (150 хв) в 10-ти хвилинних пробах перфузату визначали кислотність та обраховували дебіт соляної кислоти у мкмоль, що виділялась в кожній пробі та за весь дослід. Дослідження базальної ШСК тривали 120 хв.

Стимулятори ШСК вводили на фоні базальної секреції через 30-60 хвилин після початку експерименту. При цьому обов'язковим було наявність стабільної секреції соляної кислоти з рН в межах 4,8 - 6,7. При дослідженні впливу блокаторів глутаматних рецепторів на ШСК, стимульовану інсуліном та 2-дезокси-D-глюкозою, препарати вводили через 90 хвилин після введення даних стимуляторів, що обумовлено тривалістю латентної дії інсуліну та 2-дезокси-D-глюкози, яка складає 90 хвилин [Jonsons J.W., 1987].

Методика викликання стресових та етанолових уражень СОШ. Стресові ураження СОШ викликали широко розповсюдженим методом імобілізаційного водоімерсійного стресу [Takagi K., 1968; Uramoto H., 1990]. Також ураження СОШ у щурів викликали внутрішньошлунковим введенням 5 мл/кг ваги 96^о етилового спирту [Schimdt K.M., 1971; Jбvor T., 1984; Жуйкова С.Е., 2003].

Макроскопічний аналіз СОШ. Для аналізу структурних змін в СОШ, викликаних ульцерогенними чиниками, тварин умертвляли та видаляли шлунок, розрізали його по малій кривизні, вивертали слизовою назовні та ретельно промивали фізіологічним розчином. Після чого на гастроскопі при трансілюмінаційному освітленні за допомогою лупи (х4) підраховували кількість та площу виразок, довжину ерозій в середньому на один шлунок в кожній групі щурів та фотографували.

Диференційно оцінювали 4 види уражень шлунка: 1) виразки - глибокі порожнини з захопленням слизової і м`язової оболонок; 2) ерозії - неглибокі довгасті ураження різної довжини у вигляді тріщин; 3) масивні крововиливи овальної форми діаметром 2-3 мм та більше; 4) точкові крововиливи - діаметром до 1 мм.

Морфологічні дослідження. Шлунок фіксували в 10% нейтральному формаліні та заливали в парафін. Парафінові зрізи товщиною 5-7 мкм виготовляли на роторному мікротомі, фарбували гематоксиліном та еозином за Бьомером [Лилли Р., 1969]. Гістологічні препарати аналізували при збільшенні мікроскопа х100. Кольорові мікрофотографії отримували за допомогою цифрової фотокамери Olympus C-5050 Zoom та мікроскопа Olympus BX-41 (Olympus Europe GmbH, Японія).

Оцінку вуглеводних компонентів глікопротеїнових рецепторів СОШ проводили напівкількісним методом з використанням лектинів різної вуглеводної специфічності мічених пероксидазою [Луцик А.Д., 1989]. Підбір панелі лектинів був здійсненний з урахуванням їхніх відмінностей у вуглеводній специфічності з метою більш точної та повної ідентифікації вуглеводних компонентів глікопротеїнових рецепторів СОШ: лектин золотого дощу (LABA), специфічний до бLFuc; лектин насіння сої (SBA), специфічний до бNAcDGal; лектин зародків пшениці (WGA), специфічний до NAcDGlc>NAcNeu; лектин насіння арахісу (PNA), специфічний до ЯDGal; лектин кори бузини чорної (SNA), специфічний до Neu5Ac/2>6Gal; лектин виноградного слимака (HPA), специфічний до NAcбDGal, лектин насіння рицини звичайної (RCA), специфічний до ЯDGal>вDGalNAc (НДЛ „Лектинотест”, м. Львів). Активність пероксидази і, відповідно, локалізацію зв'язування лектину з глікокон'югатами визначали за коричневим продуктом окислювальної полімеризації 3,3 - диамінобензидину. Інтенсивність лектин-рецепторної реакції оцінювали напівкількісним методом („-“ - слабка реакція; „+-” - гетерогенність зв'язування; „+”- помірна реакція; „++”- сильна реакція; „+++” - дуже сильна реакція) за забарвленням препаратів.

Біохімічні дослідження. В гомогенаті СОШ визначали вміст дієнових кон'югатів за УФ-поглинанням гептанових екстрактів [Гаврилов В.Б., 1988], Шиффових основ флуориметричним методом [Колесова О.Е., 1984], ТБК-активних продуктів спектрофотометричним методом [Орехович В.Н., 1977]. Активність ферментів антиоксидантного захисту супероксиддисмутази [Чевари С., 1985] і каталази [Королюк М.А., 1988] визначали спектрофотометричним методом.

Визначення вмісту NO в крові. Вміст NO в плазмі крові оцінювався через визначення концентрації кінцевих метаболітів NO - NO₂^- за допомогою реактиву Грісса [Green L.C., 1982]. Отримані реакційні суміші підлягали спектрофотометричному аналізу.

Статистична обробка результатів. Одержані результати досліджень перевіряли на нормальність розподілу за допомогою W тесту Шапіро-Вілка. Імовірність похибки першого роду б>0,05. При нормальному розподілені, порівняння вибірок проводилося за допомогою t-критерію Стьюдента для незалежних вибірок. Для ненормально розподілених вибірок застосовували непараметричний метод U-тест Манна-Уітні. Оцінювали середнє значення, стандартні помилки, достовірність відміностей. Результати наведено у вигляді М±m, n - кількість тварин в серії експериментів. Для наших даних ми приймали рівень значущості р0,05 [Гланц С., 1999].

Результати досліджень та їх обговорення

Роль центральних та периферичних іонотропних глутаматних рецепторів у регуляції ШСК. Блокада іонного каналу NМDА-рецепторів дизоцилпін малеатом (0,1 мг/кг, в/о) не впливала на базальну, гістамінову та пентагастринову ШСК, гальмувала карбахолінову ШСК на 35% (р<0,001), посилювала стимульовану інсуліном на 72% (р<0,001) та 2-дезокси-D-глюкозою на 88% (р<0,001) ШСК (рис.1). Гальмування карбахолінової ШСК усувалося ваготомією, що свідчить про те, що ендогенний глутамат при збудженні іонних каналів глутаматних рецепторів NMDA-підтипу центральної локалізації посилює ШСК, стимульовану холіноміметиком. Збудження іонотропних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу, локалізованих в глюкосенситивній зоні гіпоталамуса та на ядрах блукаючих нервів, призводить до пригнічення ШСК, стимульованої інсуліном та 2-дезокси-D-глюкозою. Очевидно, в центральній нервовій системі (ЦНС) існує субпопуляція іонотропних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу, яка при збудженні ендогенним глутаматом справляє гальмівний вплив на ШСК лише тоді, коли є не тонічне, а стимульоване збудження нейронів. NMDA-підтип іонотропних глутаматних рецепторів периферичної локалізації не залучений у регуляцію базальної та стимульованої ШСК.

Блокада гліцинового сайту (L-701324 в дозі 2,5 мг/кг, в/о) іонотропних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу центральної локалізації не змінювала показники базальної, гістамінової та пентагастринової ШСК, проте гальмувала карбахолінову секрецію на 17% (p<0,01) та стимульовану інсуліном на 34% (p<0,01) і 2-дезокси-D-глюкозою - на 43% (p<0,01) ШСК. Гальмування кабахолінової ШСК усувалося ваготомією.

Введення антагоністів поліамінного (аркаїн в дозі 10 мг/кг, в/о) та фенілциклідинового сайтів (пірилен в дозі 0,4 мг/кг, в/о) іонотропних глутаматних рецепторів NMDA-підтипу центральної та периферичної локалізації не впливало на базальну та стимульовану гістаміном і 2-дезокси-D-глюкозою ШСК. Блокада поліамінного сайта призводила до пригнічення стимульованої ШСК карбахоліном на 80% (р<0,01), пентагастрином - на 36% (р<0,01) та інсуліном - на 79 % (р<0,01). Проте, блокада фенілциклідинової ділянки NМDА-рецепторів викликала гальмування ШСК, стимульованої карбахоліном на 79% (р<0,001), пентагастрином - на 35,8% (р<0,05) та інсуліном - на 57,4 % (р<0,01). Вказані ефекти усувалися ваготомією. Отже, поліамінний, фенілциклідиновий та гліциновий сайти іонотропних глутаматних рецепторів NМDА-підтипу центральної локалізації справляють модулюючий вплив на NМDА-рецепторний комплекс, що проявляється як у стимуляції, так і у гальмуванні стимульованої секреторної активності шлунка в залежності від виду секретагога.

Рис. 1. Базальна та стимульована шлункова секреція кислоти (ШСК) у щурів з інтактною нервовою системою за умов блокади іонного каналу NМDА-підтипу іонотропних глутаматних рецепторів дизоцилпін малеатом (0,1 мг/кг, в/о): К - контроль, Д - дослід. *** - р<0,001 у порівнянні з контролем. n = 7 в кожній серії досліджень.

Найменш вивченим питанням є участь центральних та периферичних AMPA/каїнатних іонотропних глутаматних рецепторів у регуляції ШСК. Неселективний блокатор AMPA/каїнатних іонотропних глутаматних рецепторів ІЕМ 1751 гальмував базальну, стимульовану інсуліном і 2-дезокси-D-глюкозою ШСК відповідно на 44% (р<0,01), 26% (p<0,001) та 23% (p<0,001), проте посилював карбахолінову секрецію на 41% (p<0,001) (рис. 2). Стовбурова ваготомія спричиняла реверсію ефектів ІЕМ 1751, а саме спостерігалося посилення базальної ШСК на 217% (р<0,001) та стимульованої карбахоліном, гістаміном і пентагастрином відповідно на 87% (p<0,01), 81% (p<0,01) та 40% (p<0,05). Отже, збудження центральних та периферичних AMPA/каїнатних глутаматних рецепторів ендогенним глутаматом справляє різнонаправлений вплив на секрецію соляної кислоти в шлунку щурів. Активація центральних каїнатних рецепторів посилює базальну та стимульовану ШСК, а периферичних гальмує базальну та стимульовану ШСК.

Гангліоблокатор пентамін повністю усував посилюючий ефект блокатора AMPA/каїнатних іонотропних глутаматних рецепторів на базальну ШСК у ваготомованих щурів (рис. 3). Ці результати свідчать про те, що периферичні AMРA/каїнатні іонотропні глутаматні рецептори реалізують свій вплив на базальну ШСК через холінергічну нейропередачу в ентеральній нервовій системі.

Пізніше ми змогли відокремити роль AMРA- та каїнатного- підтипів іонотропних глутаматних рецепторів. Для цього ми використали антагоніст АМРА-підтипу іонотропних глутаматних рецепторів GYKI-52466 (1-(4-амінофеніл) - 4-метил - 7,8 - метилендиокси - 5Н-2,3 - бензодиазепін). Проведені дослідження показали, що АМPА-підтип іонотропних глутаматних рецепторів центральної та периферичної локалізації не залучений у регуляцію базальної та стимульованої ШСК. Таким чином, ефекти ІЕМ 1751 на ШСК є результатом блокади каїнатних рецепторів.

Отже, фармакологічний аналіз ролі центральних і периферичних іонотропних глутаматних рецепторів дозволяє однозначно стверджувати, що збудження центральних каїнатних та NMDA рецепторів ендогенним глутаматом стимулює ШСК. Також в ЦНС існує субпопуляція NMDA-рецепторів, яка при збудженні ендогенним глутаматом справляє гальмівний вплив на кислу шлункову секрецію лише тоді, коли є додаткове збудження структур мозку. Наші дані дозволяють припустити, що периферичні каїнатні іонотропні глутаматні рецептори локалізовані на пресинаптичній мембрані прегангліонарних холінергічних волокнах блукаючих нервів, а їх збудження приводить до зменшення вивільнення ацетилхоліну у синаптичну щілину (пресинаптичне гальмування) (рис. 4).

Рис. 4. Схема локалізації та участі іонотропних глутаматних рецепторів (іГлуР) у регуляції шлункової секреції кислоти (ШСК): 1 - NMDA- та каїнатний-підтипи іГлуР, активація яких посилює ШСК; 2 - АМРА-підтип іГлуР не залучений у регуляцію ШСК; 3 - NMDA-підтип іГлуР, активація яких гальмує ШСК при додатковому збудженні структур мозку (інсулін, 2-дезокси-D-глюкоза; 4 - каїнатний-підтипи іГлуР, активація якого зменшує ШСК; BDNF - нейротропний фактор росту.

Вплив глутамату натрію на морфо-функціональний стан шлунка у щурів. Більшість вчених стверджують, що тривале споживання харчової добавки глутамату натрію в дозі 1 г/день не справляє шкідливого впливу на організм людини [Walker R., 2000; Freeman M., 2006; Nakamura E., 2008; Jinap S., 2010]. Тому наші дослідження з впливу глутамату натрію на базальну ШСК у щурів ми розпочали з дози 15 мг/кг, що відповідає 1 г/середньостатистичну людину. Встановлено, що глутамат натрію в даній дозі не впливав на базальну ШСК у щурів. Збільшення дози у два (30 мг/кг), три (60 мг/кг) та чотири рази (120 мг/кг) також не справляло статистично значущих змін секреції соляної кислоти. Подальше збільшення дози глутамату натрію до 240 мг/кг призвело до збільшення базальної ШСК на 179% (p<0,001) у порівнянні з контролем, проте збільшення доз глутамату натрію до 480 та 960 мг/кг не впливало на базальну секрецію кислоти шлунком щурів. Після двобічної стовбурової ваготомії глутамат натрію гальмував базальну ШСК (рис. 5).

Тобто, глутамат натрію в дозі 240 мг/кг справляє як стимулюючий вплив через збудження центральних глутаматних рецепторів, так і гальмівний вплив на базальну ШСК через збудження периферичних глутаматних рецепторів. В умовах інтактної нервової системи переважає стимулюючий вплив, який значно більший за силою від гальмівного периферичного. Після двобічної стовбурової ваготомії, коли усуваються стимулюючі впливи, ми спостерігаємо периферичний гальмівний вплив, що проявляється у зменшенні базальної ШСК.

Підсумовуючи вищенаведене, можна заключити, що глутамат натрію не здійснює пускових впливів на шлункову секрецію поза періодом травлення, аналогічно іншим амінокислотам (гліцин, таурин) [Грінченко О.А., 2008, 2010].

Наукові дискусії щодо безпечності споживання харчової добавки глутамату натрію розпочалися у 1968 році після публікацій в англійському медичному журналі даних про те, що натрієва сіль глутамінової кислоти може бути причиною багатьох хвороб, які були об'єднані терміном „синдром китайського ресторану” [Davies N.E., 1968; Gordon M.E., 1968; Kandall S.R., 1968; Kwok R.H.M., 1968; McCaghren T.J., 1968; Schaumburg H., 1968]. Після цих публікацій впродовж 40 років, аж до сьогодні, навколо даного питання тривають жваві дискусії.

Більшість вчених стверджують, що тривале споживання даної харчової добавки в дозі 1 г/день є безпечним [Walker R., 2000; Freeman M., 2006; Nakamura E., 2008; Jinap S., 2010], а доза 3 г/день може справляти негативний вплив на організм людини [Allen D.H., 1987; Yang W.H., 1997; Geha R., 2000]. Тому, в наших дослідженнях ми вивчали вплив двох доз 1 та 2 г/день глутамату натрію на середньостатистичну людину. Так як одноразове введення глутамату натрію в указаних дозах не призводить до змін ШСК, ми вирішили перевірити наявність ефекту глутамату натрію на ШСК за умов його тривалого введення.

Встановлено, що щоденне введення глутамату натрію щурам в дозі 15 мг/кг (1 г/середньостатистичну людину) впродовж 20-ти та 30-ти днів викликало збільшення секреції соляної кислоти в середньому в два рази. Збільшення щоденної дози глутамату натрію вдвічі (30 мг/кг) справляло значно сильніший вплив на секрецію соляної кислоти в шлунку щурів. Дебіт кислоти зростав в середньому в чотири рази (рис. 6).

Отже, встановлену нами властивість глутамату натрію при систематичному споживанні патологічно надмірно збільшувати секрецію соляної кислоти в шлунку слід враховувати кожній людині при формуванні щоденного раціону, адже, в наш час глутамат натрію широко використовується в багатьох харчових виробництвах і користується великою популярністю в світі [Sano Ch., 2009], а посилення базальної секреції може бути причиною патогенезу багатьох кислотозалежних захворювань, наприклад, ерозивно-виразкових уражень СОШ.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Слід зазначити, що одноразове екзогенне введення глутамату натрію в указаних дозах не викликало уражень СОШ. Проте щоденне введення щурам глутамату натрію в дозах 15 та 30 мг/кг впродовж 20-ти та 30-ти днів викликало появу виразок та ерозій в СОШ (рис. 7). Отримані результати підтверджені морфологічними дослідженнями, в яких показано, що введення глутамату натрію щурам в дозі 15 та 30 мг/кг впродовж 20-ти та 30-ти днів призводить до витончення поверхневого шару слизу та розвитку значних деструктивних змін в СОШ.

У тварин, яким упродовж 20- та 30-днів вводили глутамат натрію, маса тіла збільшилася у 2 та 2,5 рази відповідно до дози глутамату натрію.

Тварини, яким тривало вводили глутамат натрію, піддавались дії стресу. Встановлено, що у щурів, яким вводили глутамат натрію, стрес викликав більш потужні деструктивні ураження СОШ. Площа виразок та довжина ерозій в залежності від дози збільшилася в два та чотири рази у порівнянні з групою стрес-контролю.

Вплив гліпролінів на морфо-функціональний стан шлунка у щурів. Вплив Про-Глі-Про та його метаболітів дипептидів Глі-Про та Про-Глі на шлункову секрецію кислоти. Виразкова хвороба шлунка залишається найпоширенішим захворюванням органів травлення, а в останні десятиріччя простежується тенденція до неухильного зростання кількості хворих на виразкову хворобу. Однією з причин такого зростання є порушення режиму та зміна характеру харчування, зловживання грубою й гострою їжею, неконтрольоване застосування харчових добавок, в тому числі глутамату натрію [Jinap S., 2010; Tan V.P., 2011]. У зв'язку з цим наші подальші дослідження були спрямовані на пошук нових лікарських засобів з мінімальною побічною дією для профілактики виразкової хвороби шлунка. Нашу увагу привернули пролінвмісні пептиди, які є ендогенними регуляторними пептидами та відіграють важливу роль у формуванні захисних реакцій проксимального відділу травного тракту [Ашмарін I.П., 1997, 1998, 2001, 2007].

Рис. 7. Площа виразок (I) та довжина ерозій (II) в шлунку щурів за умов тривалого введення глутамату натрію (ГН) в дозах 15 мг/кг (А) та 30 мг/кг (Б) (1 раз на добу, перорально) (M+m): 1 - 10 днів введення ГН (n=7); 2 - 20 днів введення ГН (n=7); 3 - 30 днів введення ГН (n=7). *** - p<0,001 у порівнянні з 10-ти денним введенням ГН; ### - p<0,001 у порівнянні з 20-ти денним введенням ГН.

Встановлено, що у щурів з інтактною нервовою системою трипептид Про-Глі-Про та його метаболіти дипептиди Глі-Про та Про-Глі виражено гальмували базальну ШСК у щурів відповідно на 62% (р<0,001), 59% (р<0,001) та 46% (р<0,001). Про-Глі-Про та Глі-Про також пригнічували ШСК, стимульовану карбахоліном (на 62% (р<0,001) і 40% (р<0,001)), гістаміном (на 57% (р<0,001) і 92% (р<0,001)) та пентагастрином (на 31% (р<0,05) і 25% (р<0,05)). Про-Глі виявився неефективним по відношенню до стимульованої карбахоліном, гістаміном та пентагастрином ШСК у щурів з інтактною нервовою системою.

Двобічна стовбурова ваготомія послаблювала гальмівний вплив Про-Глі-Про на 52% (p<0,01) та Про-Глі - на 22% (p<0,05) і усувала гальмівний вплив Глі-Про на базальну ШСК. Що стосується стимульованої ШСК, то ваготомія повністю усувала гальмівний вплив гліпролінів (Про-Глі-Про та Глі-Про) на ШСК, стимульовану карбахоліном. Двобічна стовбурова ваготомія зменшувала гальмівний вплив трипептиду Про-Глі-Про та дипептиду Глі-Про на гістамінову (Про-Глі-Про на 36% (p<0,05); Глі-Про - на 68,5% (p<0,001)) та пентагастринову (Про-Глі-Про - на 36,5% (p<0,05); Глі-Про - на 52% (p<0,01)) ШСК. Про-Глі, як і у щурів з інтактною нервовою системою, не впливав на стимульовану карбахоліном, гістаміном та пентагастрином ШСК у ваготомованих щурів. Підсумовуючи вищенаведене, можна стверджувати, що механізм гальмівної дії гліпролінів на базальну та стимульовану ШСК складається з двох ланок: центрального та периферичного генезу.

Раніше було показано, що Про-Глі-Про та його метаболіти Глі-Про і Про-Глі підсилюють кровотік у СОШ [Самонина Г.Е., 2001; Смирнова Е.А., 2004]. Беручи до уваги роль NO у регуляції кровотоку в СОШ і дані літератури про пригнічуючий вплив в певних дозах донорів NO і субстрату його синтезу L-аргініну на базальну та стимульовану ШСК у щурів [Kato S., 1998; Tanaka J., 2001; Ito Y., 2008], ми визначили в плазмі крові щурів метаболіт NO, NO₂^-, як показника генерації NO, до і після введення гліпролінів.

Встановлено, що всі досліджувані гліпроліни збільшували концентрацію NO₂^- в плазмі крові (рис. 8). Отже, механізм впливу пролінвмісних пептидів на секрецію соляної кислоти, по-крайній мірі частково, обумовлений стимуляцією виділення NO, що призводить до гальмування базальної і стимульованої секреції [Kato S., 1998; Tanaka J., 2001; Ito Y., 2008].

Рис. 8. Концентрація NO₂^- в плазмі крові у щурів за умов введення Про-Глі-Про, Глі-Про та Про-Глі (3,7 мкмоль/кг, в/о) (M+m): 1 - контроль (n=7); 2 - Про-Глі-Про (n=7); 3 - Глі-Про (n=7); 4 - Про-Глі (n=7). *** - р<0,001 у порівнянні з контролем.

Вплив Про-Глі-Про та його метаболітів дипептидів Глі-Про та Про-Глі на гомеостаз слизової оболонки шлунка в умовах експериментальних ерозивно-виразкових уражень, викликаних стресом та етанолом у щурів. Розвиток ерозивно-виразкових уражень в СОШ щурів, індукованих стресом та етанолом, супроводжувався інтенсифікацією процесів ПОЛ та зміною активності ферментів антиоксидантного захисту, що узгоджується з даними літератури [Shian W.M., 2000; Kwiecien S., 2008; Brzozowska I., 2009]. Пролінвмісні пептиди відновлювали оксидантно-антиоксидантний баланс загальної фракції клітин СОШ щурів. Наведені результати свідчать про участь пролінвмісних пептидів у підтримці шлункового гомеостазу.

Важливу роль у відображенні процесів внутрішньоклітинної трансформації та міжклітинної взаємодії при розвитку виразки відіграють глікокон'югати плазматичних мембран [Луцик А.Д., 1989; Игнатов В.В., 1997]. Специфічність глікокон'югатів та рівень їх експресії вивчають за допомогою методів лектиногістохімії, що дозволяють визначити особливість розподілу та наявність рецепторів лектинів, що зв'язують різні вуглеводні детермінанти. Слід відмітити, що найбільша кількість Про-Глі-Про і/або його метаболітів Глі-Про та Про-Глі накопичується в тканинах шлунка [Ашмарин И.П., 2008]. Так як гліпроліни - це родина коротких пептидів, які є фрагментами колагену та містять залишки гліцину та проліну [Ашмарин И.П., 2007], ми припустили, що вони самі безпосередньо взаємодіють з поверхневим епітелієм.