Біотехнологічні аспекти створення іммобілізованих на полімерних носіях біологічно активних білкових речовин

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ І.І. МЕЧНИКОВА

УДК 547.56:577.151.4:577.152.1

БІОТЕХНОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ СТВОРЕННЯ ІММОБІЛІЗОВАНИХ НА ПОЛІМЕРНИХ НОСІЯХ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ БІЛКОВИХ РЕЧОВИН

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

РОМАНОВСЬКА ІРИНА ІГОРІВНА

Одеса - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України

Науковий консультант:	академік НАН України доктор хімічних наук, професор, Андронаті Сергій Андрійович, Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, директор, завідувач відділу медичної хімії
Офіційні опоненти:	доктор біологічних наук, професор, Варбанець Людмила Дмитріївна, Інститут мікробіології та вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів
	доктор біологічних наук, чл.-кор. УААН, професор Левицький Анатолій Павлович, Державна установа «Інститут стоматології НАМН України», заступник директора з наукової роботи доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Гриненко Тетяна Вікторівна, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна завідувач відділу хімії і біохімії ферментів

Захист відбудеться 30 вересня 2011 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06 в Одеському національному університеті імені І.І. Мечникова, за адресою: 65058, м. Одеса, пров. Шампанський, 2 (біологічний факультет), ауд. 27.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за адресою: 65082, м. Одеса, вул. Преображенська, 24.

Автореферат розісланий 26 серпня.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06

доктор біологічних наук, професор Т.О. Філіпова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В даний час щорічний приріст cвiтового ринку біотехнологічної продукції становить 7-10 % [Варфоломеев С.Д., 2011]. Використання біотехнологічних розробок дозволяє вирішувати багато проблем діагностики та лікування ряду важких захворювань, підвищення якості питної води, видалення небезпечних для людини і навколишнього середовища відходів, у тому числі фенольних полютантів. Встановлено, що недоліки функціонування широкого кола біологічно активних речовин (БАР) можуть бути усунені при їх використанні у вигляді сполук з різними матрицями, в т.ч. полімерами природного та синтетичного походження [Штильман М.И., 2006], тому створення іммобілізованих на полімерних носіях біологічно активних речовин є актуальним завданням медичної біотехнології і біоорганічної хімії. Для отримання їх стабілізованих форм, в залежності від цілей призначення, застосовують 2 основних підходи: нековалентне приєднання та хімічне зв'язування [Давиденко Т.И., 2003]. Іммобілізація БАР (гідролітичних ферментів, білків, алергенів) методами невалентного зв'язування з високомолекулярними сполуками, шляхом їх включення, комплексоутворення або адсорбції у меншій мірі супроводжується порушенням їх структури, дозволяючи конструювати нові стабільні, активні препарати пролонгованої дії, спрямованого вектора всмоктування, розробляти альтернативні шляхи введення в організм для створення потенційних засобів для лікування ран і опіків, замісної терапії недостатності травлення, діагностики та лікування алергічних захворювань. Крім того, з огляду на можливість модифікації полімерної матриці, можна сформувати iммобілізовані форми БАР з посиленням пролонгованої дії.

Актуальність роботи визначається також задачами розробки нових перспективних ферментативних методів елімінування високотоксичних фенольних полютантів з водних середовищ на основі іммобілізованого на полімерних матрицях окиснювально-відновлювального ферменту - пероксидази, виділеної з коренів хрону, методами невалентної та хімічної взаємодій. Останній метод забезпечує надійне, міцне зв'язування ферменту з можливістю стабілізації в органічних розчинниках і збільшення багаторазовості використання у водному середовищі.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась відповідно до плану науково-дослідних робіт у відділі фізико-хімічних основ біотехнології та лабораторії фізико-хімічних основ біотехнології відділу медичної хімії Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України в рамках тем: «Розробка методів іммобілізації літичного ферментного препарату ««Стерилаза»», вивчення властивостей іммобілізованих препаратів і можливостей їх практичного використання» (1995-1996 рр., № держ. реєстрації 0195U020552), «Розробка пролонгованих форм алергенів» (1997 - 1998 рр., № держ. реєстрації 0197U008692), «Розробка фізико-хімічних принципів створення пролонгованих форм біологічно активних сполук на основі протеолітичних і літичних ферментів» (1999-2001 рр., № держ. реєстрації 0100U001144), «Вивчення фізико-хімічних особливостей пероксидазного окиснення фенольних сполук»(2001-2002 рр., № держ. реєстрації 0101U001080), «Дослідження фізико-хімічних, медико-біологічних особливостей іммобілізації ліполітичних ферментів і розробка методів іммобілізації» (2002-2004 рр., № держ. реєстрації 0102U001463), де здобувач був відповідальним виконавцем. В темах «Дослідження фізико-хімічних особливостей іммобілізованих білків, ферментів, алергенів в полімерні плівкові матеріали і їх медико-біологічних особливостей як нових потенційних лікарських і діагностичних засобів» (2005-2007 рр., № держ. реєстрації 0105U002632), «Дослідження фізико-хімічних властивостей вільних і іммобілізованих оксидоредуктаз і гідролаз в реакціях окиснення фенолів, ароматичних амінів, гідролізу та синтезу складних ефірів 1,4-бенздіазепін-2-онів» (2008 - 2010 рр., № держ. реєстрації 0108U001004) здобувач був науковим керівником.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи -- створення наукових основ отримання іммобілізованих біологічно активних білкових речовин, перспективних як діагностичних і лікарських засобів і біокаталізаторів окиснення фенольних полютантів для їх елімінування.

Згідно поставленої мети основними завданнями роботи були наступні:

1. розробити теоретичні фундаментальні біотехнологічні підходи і методи стабілізації БАР (альбумінів, літичного ферментного комплексу і лізоциму, протеолітичних, ліполітичних ферментів, алергенів) пролонгованої дії і біокаталізаторів багаторазового використання на основі пероксидази хрону (пох) шляхом їх іммобілізації на полімерних матрицях;

2. виявити закономірності іммобілізації білкових препаратів на природних і синтетичних полімерних носіях, кінетичні особливості функціонування протеолітичних ферментів різного походження у вільній та іммобілізованих формах;

3. розробити способи іммобілізації гідролітичних ферментів (лізоциму та літичного ферментного комплексу (ЛФК), протеолітичних ферментів), вивчити фізико-хімічні особливості функціонування і медико-біологічні властивості одержаних препаратів як потенційних засобів для терапії ран та опіків;

4. розробити лабораторні регламенти отримання іммобілізованого ЛФК «Стерилаза», очних лікарських плівок (ОЛП) з сумісно іммобілізованими папаїном і сечовиною, проекти аналітичної нормативної документації (АНД) на гідрогелеві ранові покриття з лужною протеазою і ОЛП з папаїном і сечовиною, вивчити їх гостру офтальмотоксичність;

5. модифікувати метод іммобілізації ліпаз, що дозволяє стабілізувати їх активність у кислих середовищах;

6. запропонувати підходи для стабілізації комерційних білкових алергенів та отримати іммобілізовані препарати для потенційного перорального і інтраназального способів введення;

7. модифікувати метод виділення ПОХ та дослідити особливості її фракційно-білкового складу, біохімічні властивості порівняно з комерційним препаратом;

8. розробити умови пероксидазного окиснення фенольних сполук, дослідити ступінь біоконверсії і кінетичні параметри окиснення ряду фенольних полютантів;

9. дослідити вплив структури фенольних сполук на ступінь їх біоконверсії та кінетичні параметри (Km, Vmax) в реакціях пероксидазного окиснення методами QSAR / QSPR аналізу;

10. розробити способи іммобілізації Пох з використанням карагінану з чорноморської водорості Phyllophora nervosa і гідратцелюлозної мембрани для отримання стабільних біокаталізаторів багаторазового використання в пероксидазному каталізі;

11. здійснити апробацію препарату Пох, включеного в мембрану, для дефенолізації реальних стічних вод.

Об'єкт дослідження - біотехнології іммобілізації біологічно активних речовин на полімерних носіях.

Предмет дослідження - фізико-хімічні механізми та розробка способів ефективного використання іммобілізованих на полімерних носіях біологічно активних білкових речовин.

Методи дослідження - комплекс біохімічних, фізико-хімічних методів (УФ-, ІЧ-спектроскопія, мас-спектрометрія, електрофорез в ПААГ, віскозиметрія) - для дослідження функціонування вільних та іммобілізованих БАР; морфологічних - для оцінки ефективності розроблених препаратів у терапії опіків очей та дослідження гострої офтальмотоксичності; методів регресійного аналізу, часткових найменших квадратів (PLS) - для побудови залежності структура - властивість / реакційна здатність (QSAR / QSPR); технологічних - для розробки регламентів, проектів АНД, апробації іммобілізованої Пох в реакторі періодичної дії.

Наукова новизна отриманих результатів. Розроблено наукові основи створення іммобілізованих білкових БАР шляхом регулювання складу, активності, стабільності і пролонгування їх комплексів з розчинними і нерозчинними полімерними матеріалами за рахунок міжмолекулярних нековалентних взаємодій, механічного включення, ковалентного зв'язування.

Вперше запропоновано концепцію поведінки білкових макромолекул в розчинах полімерів при іммобілізації методом нековалентного зв'язування.

Встановлено характеристики фракційно-білкового складу та активності ферментних препаратів (лужної протеази, протеази С, виділеної Пох) і комерційних препаратів алергенів (АБКЯ, АХП).

Визначено підходи для стабілізації і пролонгування комерційних білкових алергенів шляхом їх іммобілізації в ПВК, ПВС, аеросил.

Виявлено субстратне інгібування реакції гідролізу казеїну, що каталізується вільними і іммобілізованими папаїном, лужною протеазою, трипсином при визначенні протеолітичної активності ферментів.

Розроблено принципи сумісної іммобілізації БАР, використання яких дозволяє отримувати полімерні матеріали комбінованої біологічної дії зі збільшеною літичною активністю.

Виявлено радіопротекторну дію полімера-носія (модифікованого ПВП) по відношенню до іммобілізованих лізоциму і лужної протеази, показано дозозалежний ефект г-опромінення щодо збереження літичної і протеолітичної активностей ферментів при їх стерилізації.

На основі проведених досліджень біоконверсії фенолів і кінетики пероксидазного каталізу, вперше проведено QSAR/QSPR аналіз з використанням розширеного набору структурних дескрипторів фенольних сполук, що дозволяє з високим ступенем вірогідності прогнозувати ступінь і швидкість біоконверсії нових субстратів ПОХ.

Запропоновано біотехнологічні методи стабілізації пероксидази з використанням карагінану з чорноморської водорості Phyllophora nervosa, гідратцеллюлозної мембрани «Діацелл» для створення біокаталізаторів багаторазового використання в пероксидазному каталізі.

На підставі комплексу медико-біологічних і екологічних досліджень показано ефективність і перспективність застосування іммобілізованого на марлі за допомогою ПВС, зшитого бурою, ЛФК для антибактеріальної терапії; ОЛП з іммобілізованими в ПВС стерилазою, САЛ, сумісно іммобілізованих папаїну і сечовини в сорбційній та ферментативній терапії опіків рогівки очей кролів; пероксидази хрону, включеної в мембрану «Діацелл» для видалення фенолів зі стічних вод.

Практичне значення отриманих результатів. Визначено шляхи цілеспрямованого отримання іммобілізованих форм БАР, перспективних для використання в різних областях медицини і елімінації високотоксичних фенольних полютантів з водних розчинів, органічних середовищ, стічних вод.

Вперше отримано іммобілізовані високоактивні стабільні препарати БАР пролонгованої дії у формі ОЛП (ЛФК «Стерилаза», САЛ, папаїн з сечовиною), текстильних (ЛФК «Стерилаза», протеаза С з Аcremonium chrysogenum), полімерних гідрогелевих нерозчинних покриттів (трипсин, лужна протеаза з Bacillus subtilis), перспективні для використання в терапії ран і опіків.

Створені нові вугільні матеріали (іммобілізовані ліпази Penicillium solitum, Pseudomonas sp., свиняча панкреатична) для замісної терапії недостатності травлення, мікронізовані порошки і плівки (іммобілізовані АБКЯ, АПЖ, АХП), які перспективні для перорального і інтраназального способів введення в діагностиці та лікуванні алергічних захворювань, гранули і мембрани (іммобілізована пох) для застосування у пероксидазному каталізі.

Модифіковано метод визначення протеолітичної активності протеаз рослинного, мікробного та тваринного походження за казеїном шляхом виключення їх інгібування субстратом, що дозволяє збільшити точність методу і підвищити його економічність, знизивши концентрацію субстрату.

Встановлено відсутність місцевоподразнючої, сенсибілізуючої та токсичної дії ОЛП з папаїном і сечовиною; розроблено проекти аналітичної нормативної документації на препарати, перспективні для терапії ран і опіків (ОЛП з іммобілізованими в ПВС папаїном і сечовиною, вперше розроблено гідрогелеве полімерне покриття на основі полі-N-вінілпіролідону, модифікованого золем полікремнієвої кислоти з іммобілізованою лужною протеазою).

Розроблено технології іммобілізації на марлі за допомогою зшитого бурою ПВС ЛФК «Стерилаза», перспективної для усунення мікробної контамінації рани, в ПВС папаїну і сечовини для лікування опіків очей.

Модифіковано метод виділення ПОХ, що дозволяє отримувати частково очищений ферментний препарат, наближений за властивостями до комерційного препарату ПОХ («Sigma», США).

Розроблені умови ефективного каталізу окиснення ряду похідних фенолу за допомогою виділеного препарату ПОХ з утворенням нерозчинних у воді і органічних розчинниках полімерних осадів, що перспективно для елімінування фенольних полютантів з розчинів і стічних вод.

Отримані методами QSAR і PLS QSPR статистичні моделі дозволяють з достатньою надійністю прогнозувати ступінь біоконверсії та кінетичні параметри (Km, Vmax) окиснення фенольних сполук, для яких відсутня відповідна експериментальна інформація.

Запропонований ферментативний метод видалення фенолів апробовано на стічних водах Одеського ЗАТ «ТеплоСервіс».

Практична значимість підтверджена 9 патентами України на корисну модель і 2 патентами на винахід.

Наукові і науково-практичні результати дисертаційної роботи впроваджені в навчальному процесі на кафедрі фармацевтичної хімії Одеського національного університету імені І.І. Мечникова, кафедрі органічних і фармацевтичних технологій Одеського національного політехнічного університету, кафедрі фтизіатрії Вінницького національного медичного університету імені М.І. Пирогова, кафедрі екології харчових продуктів і виробництв Одеської національної академії харчових технологій.

Особистий внесок автора полягає у формулюванні основних концепцій і теми дисертації, обґрунтуванні ідей, підходів і методів, плануванні та постановці завдань, виборі об'єктів досліджень, проведенні аналітичних і експериментальних досліджень, інтерпретації результатів експериментів. В опублікованих роботах автору належать наукове обгрунтування теоретичних положень, проведення експериментів і аналіз результатів досліджень, складання описів і формул винаходів. Розробка методів іммобілізації протеолітичних ферментів, пероксидази хрону і дослідження фізико-хімічних особливостей функціонування одержаних препаратів проведена спільно з к.б.н О.В. Осійчук, к.б.н. С.С. Декіною, у яких здобувач був науковим керівником дисертаційних робіт. Електрофоретичні дослідження проведені на кафедрі генетики біологічного факультету ОНУ імені І.І. Мечникова спільно з к.б.н., доц. Топтіковим В.А. Медико-біологічні дослідження іммобілізованих препаратів проведені в Одеському державному медичному університеті, Інституті очних хвороб і тканинної терапії імені В.П. Філатова спільно з зав. каф. оториноларингології д.м.н., проф. Пухликом С.М.; д.м.н., с.н.с. Чалановою Р.І. Дослідження гострої токсичності ОЛП з папаїном і сечовиною проведені в Інституті очних хвороб і тканинної терапії імені В.П. Філатова спільно з зав. лаб. фармакології і тканинної терапії, д.м.н., проф. Сотниковою О.П.

QSAR аналіз впливу структури фенольних сполук на ступінь їх ферментативної конверсії та QSPR аналіз реакційної здатності субстратів ПОХ проведені спільно з зав. лаб. теоретичної хімії, д.х.н., проф. Кузьміним В.Є. Особистий внесок автора підтверджується представленими документами та науковими публікаціями.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 32 наукові статті, 11 патентів та тези 28 доповідей українських і міжнародних наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури (розділ 1), матеріалів і методів експерименту (розділ 2), результатів, їх обговорення та узагальнення (розділи 3, 4, 5, 6, 7, 8), висновків, списку цитованої літератури (357 джерел) і 6 додатків. Робота викладена на 299 сторінках комп'ютерного тексту, містить 75 таблиць і 99 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, представлено загальну характеристику роботи, сформульовані мета і задачі досліджень, наукова новизна і практичне значення отриманих результатів.

У першому розділі «Іммобілізовані на полімерних носіях БАР в медичній та екологічній біотехнології (огляд літератури)» розглянуто сучасні проблеми, пов'язані зі створенням іммобілізованих БАР для терапії ран і опіків, офтальмології та алергології, для елімінування фенольних полютантів з розчинів і стічних вод.

Підсумовуючи представлені дані літератури, можна стверджувати, що розвиток досліджень в області стабілізації БАР шляхом їх закріплення на полімерних носіях природного та синтетичного походження методами нековалентних взаємодій, ковалентної зшивки з носієм, вивчення умов і механізмів іммобілізації, можуть виявити значні резерви, як у збереженні активності та кількісного вмісту БАР, так і у збільшенні ефективності їх застосування.

Огляд робіт з іммобілізації БАР показав перспективність розробки нових біотехнологічних підходів для створення стабільних, закріплених на носії форм пролонгованої дії, перспективних для використання в медицині (іммобілізовані гідролітичні ферменти, білкові препарати, алергени), в екології (для елімінування фенольних полютантів за допомогою біокаталізаторів багаторазової дії на основі іммобілізованого окиснювально-відновлювального ферменту пероксидази хрону).

У другому розділі «Матеріали і методи дослідження» наведено методики проведення експериментальних і теоретичних досліджень за темою дисертації. У роботі використовували бичачий сироватковий альбумін (БСА), овальбумін (ОА), ліпазу cвинячу панкреатичну («Sigma»), сироватковий альбумін людини (САЛ) (ДП «Біофарма»), лізоцим білка курячого яйця (ЛІЗ) («ApplyChem»), літичний ферментний комплекс Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 (ЛФК «Стерилаза»), ліпазу Penicillium solitum (солізим), ліпазу Pseudomonas sp., лужну протеазу Вacillus subtilis, протеазу С Аcremonium chrysogenum (ДП «Ензим»), папаїн, трипсин («Merck»), алергени білка курячого яйця (АБКЯ), хатнього пилу (АХП), пилку берези (АПБ) і жита (АПЖ) (ТОВ «Імунолог»), пероксидазу хрону (ПОХ) («Sigma»), полівініловий спирт (ПВС) («Хімреактив»), поліетиленгліколі (ПЕГ) («Merсk»), активований вуглецево-волокнистий матеріал (АВВМ) (Інститут проблем матеріалознавства НАН України), аеросил А-380 (Інститут хімії поверхні НАН України), карагінан з Phyllophora nervosа (ДП Одеського центру ЮГНІРО), альгінат натрію («Sigma»), ламідан з Laminaria japonica Aresch (ТОВ «Ламідан»), полі-N-вінілпіролідон (ПВП), полі-N-вінілкапролактам (ПВК) (Московська державна академія тонкої хімічної технології імені М.В. Ломоносова ).

Білок визначали методами Лоурі-Хартрі [Hartree E.F., 1972], Брадфорда [Bradford M., 1976], прямої спектрофотометрії [Асатиани В.С., 1965]. Літичну активність визначали турбідиметрично [Килочек Т.П., 1990], протеолітичну-методом Ансона [Полыгалина Г.В. и др., 2003], ліполітичну - за [Грачева И.М. и др., 1982], активність ПОХ за [Михлин Д.М., 1956]. Сечовину визначали за Мишоном і Арно [Асатиани В.С., 1965], феноли - 4-аміноантипіриновим, фенантроліновим методами [Коренман И.М., 1975]. ПОХ виділяли за модифікованим нами методом [Бах А.Н., 1956]: використовували для виділення баластних білків менший об'єм етанолу (Vекстракту: Vетанолу = 1:2 замість 1:3) і вводили на заключному етапі 2 стадії діалізу проти Na-фосфатного буферного розчину (рН 7,0, t 4 є С, ф 4 год).

Електрофорез білкових препаратів проводили в 15 % ПААГ згідно [Духин С.С. и др., 1976]. Молекулярні маси досліджуваних білків розраховували за калібрувальною кривою «відносна електрофоретична рухливість/lg молекулярної маси (кДа)», побудованої з використанням наступних маркерних білків: цитохром с (13 кДа), лізоцим (14,4 кДа), міоглобін (18 кДа), овальбумін (40 кДа), бичачий сироватковий альбумін (67 кДа).

Іммобілізацію білків у гель модифікованого бурою ПВС проводили, додаючи до 3,6 см3 10 % розчину ПВС розчин білка (80 мг БСА, ОА, САЛ), або 2,83 см3 препарату алергенів, що містять 0,6 мг білка/см3, суміш перемішували і додавали розчин бури (0,5 %, 1 %, 1,5 % і 2 % по відношенню до ПВС). Іммобілізацію білкових препаратів в 10 % ПВС проводили аналогічно, введенням їх розрахованих кількостей (до папаїну додавали сечовину) в розчин носія з подальшим формуванням плівок і г-стерилізацією (5-20 кГр).

Динаміку виходу білків з іммобілізованих препаратів досліджували, визначаючи їх кількість у водному розчині (10 см3, 37 °С) протягом 10, 20, 30, 40, 60 хв і більше.

Модифікацію ПВП проводили змішуванням 7,7 % водного розчину ПВП, 75 мг лимонної кислоти, 1 см3 триетиленгліколю або гліцерину, 0,3 см3 25 % розчину аміаку, 3 см3 25,5 % золю полікремнієвої кислоти (ПКК).

Іммобілізацію ліпаз в ПВС, зшитий бурою, проводили імпрегнацією зразків АВВМ 2 % розчином бури, висушуванням (20 °С), введенням розчинених у 3,5 % ПВС ферментів. Препарати зберігали при 4 °С.

Включення алергенів у ПВК проводили, додаючи до 1-3 см3 розчину алергену 0,25-1 см3 8 % розчину ПВК (42 °С, 20 хв), фільтрували, промивали гранули розчином 0,01 М Na-фосфатного буферу, рН 7,2. Зв'язування білка і фенолу визначали за різницею їх вмісту у вихідному препараті і надосадовій рідині після включення.

Адсорбцію алергенів аеросилом проводили в статичному режимі: 4 см3 розчину алергену (рН 7,2) з вмістом білка 50-2000 мкг перемішували з наважкою аеросилу при tкімн. на струшувачі до встановлення рівноваги. Незв'язаний білок і фенол видаляли промиванням зразків.

Іммобілізацію Пох (1,7 см3, активність 0,1 од/см3) у карагінан (5 % розчин) проводили при перемішуванні (40-42 °С), з подальшим зміцненням гранул 20 % розчином CaCl2 (2-4 °С). Іммобілізацію ПОХ на мембрані «Діацелл» здійснювали перйодатним методом з подальшим відновленням боргідридом натрію [Туркова Я., 1980].

Залежність активності ферментів від рН і температури визначали у буферних розчинах (рН 3,0-10,0), при температурі 10 - 90 С, відповідно. рН-стабільність і термостабільність ферментів визначали при рН 5,5 і 60-80 °С, відповідно, протягом 180 хв.

Кінетику гідролізу субстратів вільними і іммобілізованими ферментами досліджували за початковими швидкостями з лінеаризацією даних у координатах Хейнса, Лайнуівера-Берка, розрахунковим методом [Корниш-Боуден Э., 1979].

Визначення кратності використання іммобілізованих препаратів Пох проводили в реакторі періодичної дії в 10 см3 Na-фосфатного буферного розчину (0,016 мМ, рН 7,0) з 1,0 мМ фенольної сполуки і 1,0 мМ Н2О2. Кратність досліджували до досягнення 50 % конверсії полютантів.

Вимірювання в'язкості проводили віскозиметром Оствальда за [Бартеньев Г.М., Френкель С.Я., 1990]. Сорбційну ємність ОЛП з САЛ вивчали за [Басов Г.Г., 1987].

Моделювання тяжкого опіку рогівки очей кролів проводили за [Непомнящая В.М., 1987]. Експерименти з тваринами здійснювали згідно Закону України № 3447-IV «Про захист тварин від жорстокого поводження» з використанням епібульбарної анестезії.

Розрахунки енергій граничних орбіталей фенолів проводили методом PM3 за допомогою trial-версії програми HyperChem 6.0 [http://www.hyper.com]. Параметри, що відображають електронну структуру молекули, розраховані з використанням методу вирівнювання електронегативності [Jolly W.L, Perry W.B.J, 1973].

Експериментальні дані оброблені методами варіаційної статистики. Число експериментів в серіях досліджень становило 6-10.

Коефіцієнти лінійної кореляції перевищували 99 %, для QSAR/QSPR-досліджень становили 96-97 %.

У третьому розділі «Розробка підходів і напрямів для іммобілізації БАР» запропонована стратегія досліджень для створення іммобілізованих БАР, вивчені особливості взаємодії білкових молекул з ПВС і його модифікованої бурою формою, кінетичні параметри реакції гідролізу казеїну, що каталізується протеолітичними ферментами різного походження.

При створенні потенційних діагностичних і лікарських засобів на основі іммобілізованих білків, ферментів, алергенів, біокаталізаторів окиснення фенольних полютантів у відповідності з основними напрямками роботи запропонована наступна стратегія досліджень (рис. 1).

Об'єктами досліджень були вибрані доступні, економічні, у ряді випадків медичні препарати, гідролітичні ферменти різного походження: літичні, протеолітичні, ліполітичні; окиснювально-відновлювальний, білки, алергени з відмінними біологічними властивостями, перспективні для використання як у медицині, так і з екологічною метою.

В результаті досліджень розроблено методи іммобілізації БАР з використанням полімерних матриць і їх модифікованих форм (рис. 2), що дозволяють стабілізувати і пролонгувати БАР, створювати їх різні форми в залежності від способу введення і мети призначення шляхом нековалентних взаємодій; багаторазово використовувати БАР у біокаталізі (нековалентні взаємодії, ковалентне зшивання з носієм).

Оскільки для іммобілізації БАР в роботі широко використовується ПВС, і ПВС, модифікований бурою, запропонований підхід для вивчення взаємодії білкової молекули (БСА, ОА, САЛ, папаїн, лізоцим) з даними носіями, що полягає в поєднанні методів віскозиметрії та мольних відношень.

Про можливість утворення неспецифічних комплексів білкових молекул з полімерними носіями свідчать дані ряду досліджень [Топчиева И.Н. и др, 1998; Юданова Т.Н., 2006].

Зменшення значень кінематичної в'язкості розчинів ПВС, ПВС, модифікованого бурою, при додаванні білків і ферментів на 7-12 %, свідчить про компактизацію білкової молекули внаслідок утворення асоціатів білок-полімер, білок-полімер-бура. Визначено мольні відношення білок (фермент): ПВС: для БСА: ПВС - 1:2,5; ОА: ПВС - 1: 1,3; САЛ: ПВС - 1:4, папаїн: ПВС - 1:1,2;

В результаті досліджень отримані полімерні плівки з кількісним включенням у ПВС ОА, БСА, САЛ, з пролонгованим і посиленим пролонгованим вивільненням (10 - 120 хв), в залежності від концентрації бури (0,5-2 %) і природи білка. Утворення водневих зв'язків ПВС-білок доведено методом ІЧ-спектроскопії (відмічено зменшення інтенсивності смуг поглинання вільних ОН-груп в області 3200 - 3500 см-1) та підтверджено даними літератури [Юданова Т.Н., 2004].

При використанні протеолітичних ферментів для досягнення необхідного ефекту точність методу визначення активності, вибір дози, швидкість реакції мають першорядне значення. Об'єктами дослідження були протеолітичні ферменти різного походження. Виявлено інгібування субстратом швидкості реакції гідролізу казеїну при визначенні протеолітичної активності досліджуваних ферментів, kін.. для папаїну, трипсину і лужної протеази становили, відповідно, 12,5; 12,5; 5,9 г/дм3, Sопт. - 4,6; 3, 1; 1,8 г/дм3), на підставі яких рекомендовано використання менших концентрацій казеїну (0,35-0,9 %).

У четвертому розділі «Іммобілізація гідролітичних ферментів і білків з метою створення потенційних препаратів для терапії ран і опіків» розроблені методи іммобілізації БАР, вивчено фізико-хімічні та медико-біологічні особливості їх функціонування, розроблені технологічні схеми отримання, складена науково-технічна документація.

Вибір ЛФК Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 («Стерилаза») для іммобілізації зумовлений здатністю складного комплексу бактеріо- і дріжджолітичних ферментів (п'ять ферментних фракцій, у т.ч. літичні ендопептидази і глікозидази) лізувати клітинні стінки багатьох мікроорганізмів, значущих в практичному відношенні, стійких до дії лізоциму, розщеплюючи Я- 1 > 3, Я -1 > 4, Я -1 > 6 глікозидні зв'язки.

Виявлену стабілізацію ЛФК 10 % розчинами гідрофільних полімерів: ПВС, ПЕО-400, ПВП, ПЕГі при зберіганні і після г-опромінення вдалося підвищити додатковим введенням 10 % сечовини та гліцерину на 15-21 %. Кількісне збереження літичної активності стерилази (10 мг/см3) в розчинах 10 % ПЕО-400 під дією лазерного опромінення (ГН-, УФ - лазери, ф 60-600 с) перспективне для лікування зовнішніх отитів.

Розроблено метод іммобілізації ЛФК на марлі за допомогою ПВС, зшитого бурою, отриманий препарат з високим збереженням активності (85, 7 %), стабільний до стерилізації г-опроміненням (15 кГр), при зберіганні (1,5 року). Значення рН- (6,4) і термооптимумів (55 °С) активності вільного та іммобілізованого препаратів не змінюються, Кm реакції лізису бактеріальних клітин близькі, Vmax іммобілізованого препарату зменшується в 1,5 рази, що зумовлено конформаційними змінами фракцій ЛФК.

Літична активність іммобілізованої стерилази при рН 5,5, що відповідає вмісту рани, перевищувала таку вільної; виявлено збільшення термостабільності іммобілізованого препарату: константи термоінактивації вільного і іммобілізованого ЛФК становили, відповідно, 1,01·10-3 і 0,79 10-3 хв-1.

В експериментах in vitro, на ряді клінічних штамів, виділених у 30 хворих зовнішнім отитом з ураженням слизової оболонки і шкіри, стійких до більшості антибіотиків та антисептичних засобів, встановлено, що вільна і іммобілізована «Стерилаза» має більш широкий спектр дії в порівнянні з лізоцимом, лізуючи клітини як грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів, так і дріжджів (табл. 1).

Таблиця 1

Літична дія ферментних препаратів на тест-культури

Тест-культура	Активність, %
	«Стерилаза»	лізоцим
Pseudomonas aeruginosa	74,8	0
Proteus vulgaris	86,9	0
Streptococcus aureus	100,0	0
Escherichia coli	62,6	14
Enterococcus faecium	49,5	0

На препарат «Іммобілізована «Стерилаза»» складено лабораторний регламент, технологічні схеми його отримання представлені на рис. 5 а, б.

Відомо, що ранові покриття третього покоління представлені гідрогелевими полімерними матеріалами [Юданова Т.Н. и др., 2006]. Для їх отримання використовували розроблену нову матрицю на основі ПВП, модифікованого золем ПКК -органо-неорганічний гібрид- продукт об'єднання кремнійвмісної речовини і високомолекулярного ПВП в цілісну структуру (рис. 2). Модифікація носія відбувається шляхом утворення водневих зв'язків між киснем карбонільних груп лактамного кільця ПВП і воднем силанольних груп золя ПКК. Отриманий матеріал еластичний, біосумісний, має пористість, паропроникність, не розчиняється у фізіологічних рідинах. Об'єктами іммобілізації були обрані лізоцим, трипсин та лужна протеаза Bacillus subtilis 72. Лужна протеаза (М.м. 20 кДа, рН оптимум 9,0-10,0, температурний оптимум 40-50 єС) є гомогенним препаратом: проведений нативний електрофорез показав наявність ферментативної активності білків основного характеру (рис. 6). Переважна кількість білка (99,22 %) і протеїназна активність (100,0 %) знаходяться в зоні з електрофоретичною рухливістю Rf 0,33-0,40.

У результаті іммобілізації лізоциму, трипсину і лужної протеази в модифіковану матрицю, отримані гідрогелеві полімерні, еластичні плівкові покриття з кількісним включенням білка, 80, 75 і 100 % збереженням вихідних активностей, відповідно, стабільні до стерилізації г-опроміненням, при зберіганні протягом 1 року.

Показано розширення рН-оптимуму активності лізоциму в область кислих і лужних значень рН (на 0,5-1 од.), розширення рН профілю активності трипсину в область кислих значень на 3-4 од. (рис. 8 а) і його деформація у лужної протеази (рН-оптимум зсунутий на 2,5-3 од. в область кислих значень), обумовленого впливом лужного рН носія. Отримані препарати стабільні при рН 5,5, що дозволяє застосовувати їх в умовах вмісту рани. Температурний оптимум іммобілізованих лізоциму і лужної протеази не зазнає змін, трипсину - розширюється з 37 єС до 30-50 є С (рис. 8 б), що можна пояснити стабілізуючим ефектом полімерної матриці, що ускладнює теплові конформаційні переходи білкової молекули.

Про стабілізацію іммобілізованих препаратів свідчить дворазове зменшення констант термоінактівації для лізоциму та трипсину і 32,5-разове - для лужної протеази.

При сумісній іммобілізації лізоциму і протеаз в модифікований ПВП відзначили значне підвищення літичної активності, зростаючої зі збільшенням масового відношення протеаза: лізоцим, яке становило 150 % при іммобілізації з лужною протеазою і 169 % з протеазою С (рис. 9), при цьому активність протеаз залишається на високому рівні (80 %). Подібні результати можуть бути обумовлені специфічністю використовуваних протеаз мікробного походження до пептидних субодиниць пептидоглікану стінок клітин бактерій [Давиденко Т.И. и др., 1990].

Показано, що Кm іммобілізованих протеолітичних ферментів зменшується (табл. 2) внаслідок зростання в умовах гетерогенного каталізу спорідненості ферменту до субстрату, утворення більш міцного фермент-субстратного комплексу зі зменшенням швидкості його розпаду і, оскільки ця стадія є лімітуючою, відповідно, знижується швидкість всього процесу. Зменшення Vmax обумовлено також дифузійними обмеженнями матриці. Обчислені Soпт. і Voпт. характеризують концентрацію субстрату та швидкість реакції в умовах мінімального прояву виявленого інгібування субстратом. На препарат «Лужна протеаза іммобілізована» розроблено проект АНД.

Таблиця 2

Кінетичні параметри реакції гідролізу казеїну протеазами

Фермент	Кm, г/дм3	Vmax, мкмоль/г за хв	Кi, г/дм3	Sопт. , г/дм3	Vопт, мкмоль/г за хв
трипсин вільний	0,67	608,60	12,50	3,10	458,25
трипсин іммобіліз.	0,24	72,68	1,44	1,00	72,68
луж. протеаза вільна	0,57	193,54	5,98	1,85	147,51
луж. протеаза іммобіліз.	0,12	127,81	4,47	0,74	109,70

Оскільки для протиранових препаратів сорбційного типу триває пошук носіїв, які доповнюють або підсилюють ранозагоювальну дію, для створення такого вперше використали доступний, що ефективно регенерує рани і опіки різного ступеня тяжкості та етіології, біогель Ламідан з Laminaria japonica Aresch. Основу матриці становить альгінат натрію (35 %); препарат містить поліненасичені ЖК, вітаміни, мікроелементи. При іммобілізації протеаз, що застосовуються в лікуванні ран і опіків показано, що тільки протеаза С практично повністю зберігала протеолітичну активність (рис. 10). Втрата такої в ході іммобілізації інших ферментів може бути обумовлена інактивуючою дією ламідану, внаслідок наявності великої іонної сили гелю.

Висока активність протеази С, що зберігається в широкому діапазоні масових відношень носій: фермент (1:1-0,04), дозволяє варіювати її вміст у препараті. Значне зменшення в'язкості полімеру при додаванні ферменту може свідчити про утворення білкового асоціату альгінат-білок, при цьому відбувається компактизація молекул за рахунок іонних взаємодій.

Вивчення фракційно-білкового складу препарату дозволило виявити 13 білкових фракцій в діапазоні М.м. від <10 до 43 кДа: М. м. основних білків: 10 - 16 кДа (? 50 %), 19 - 20 кДа (? 20 %) і 24 - 43 кДа (? 30 %) (рис. 11 а). Показано, що 65 % білка препарату має протеолітичну активність (рис. 11 б). Найбільш висока активність (43,10 %) визначена для фракції № 2 (2,36 % всього білка). Препарат містить активні білки як кислого, так і основного характеру.

Іммобілізований препарат протеази С закріпили на тканинній основі і отримали текстильні покриття з протеолітичною активністю 475 од/г, стабільні при зберіганні протягом 1,5 років.

Іммобілізована протеаза С - препарат пролонгованої дії (рис. 12), в основі якого лежать процеси набрякання і розчинення полімеру, десорбція його і ферменту і масоперенос протеази в зовнішнє середовище (рану).

Опіки очей є значною медико-соціальною проблемою (~ 30 % загального травматизму), супроводжуючись ураженням рогівки, повік, кон'юнктиви. У зв'язку з цим розроблено підходи до лікування важких опіків рогівки очей кролів з використанням ОЛП: антибактеріальної терапії, сорбційної терапії з наступною ферментативною обробкою. Для антибактеріальної терапії розроблені ОЛП з іммобілізованою в ПВС ЛФК стерилазою (267510 ± 80,4 од/г препарату), що дозволяють зменшити вираженість запальних процесів переднього відділу ока: інтенсивність набряку повік і рогівки, гіперемію кон'юнктиви в 1,5 рази. Визначено 2-х-кратне зменшення гнійних виділень (табл. 3).

Таблиця 3

Динаміка основних симптомів опікової хвороби рогівки очей кролів при використанні ОЛП з стерилазою

Симптом	Час, діб
	Контрольна група	Основна группа
Запалення	6,5 ± 0,3	4,0 ± 0,2*
Гнійні виділення	6,5 ± 0,3	3,2 ± 0,1*

Примітка: * - різниця вірогідна у порівнянні з контролем

Для сорбційної терапії розробили ОЛП з іммобілізованим САЛ, враховуючи його широке застосування в медицині як дезінтоксикаційного препарату. У результаті іммобілізації шляхом комплексоутворення отримані ОЛП пролонгованої дії з кількісним включенням білка в межах мольних відношень білок: матриця 1:4,5 - 1:11,3, стабільні при зберіганні протягом 1 року. Вивчення сорбції кислот і лугів показало поглинання ОЛП більшої частини речовин в перші хвилини контакту (рис. 13, 14). Механізм взаємодії полягає в зв'язуванні протонів кислоти або гідроксид-іонів лугу з карбоксильними та аміногрупами білка.

Виявлено, що ознаки запалення рогівки очей дослідної групи кролів зникали у 1,5 рази швидше, ніж у контрольній, при цьому ОЛП з САЛ чинили аналогічну розчину білка дію при концентрації САЛ, у 100 разів меншою.

Папаїн - препарат вибору в офтальмології, внаслідок специфічності, відсутності алергізуючої дії, економічності [Зузук Б.М., 2001]; його ефективність підвищується при додаванні сечовини, що призводить до розриву водневих зв'язків білка, дезагрегації струпу, що забезпечує більшу доступність пептидних зв'язків для папаїну. Застосування розчинів папаїну та сечовини супроводжується швидкою інактивацією ферменту, різкою болісною дією, складністю дозування, що викликає необхідність їх сумісної іммобілізаціі. При іммобілізаціі папаїну та сечовини в ПВС фермент, утворюючи комплекс з носієм, зберігає високу активність в межах мольних відношень (1:5,4-1:38,3), сечовина механічно включається в структуру полімеру, що підтверджується даними віскозиметрії, УФ-спектроскопії. У результаті іммобілізації отримані ОЛП пролонгованої дії, з протеолітичною активністю 389 од/г, вмістом папаїну та сечовини 2 і 1,5 мг у плівці, відповідно, стійкі при зберіганні (1 рік). Іммобілізований препарат стабілізовано в області кислих і лужних значень рН (3,5-9,5) (рис. 14 а); розширення термооптимуму (рис. 14 б), зниження значень констант термоінактівації в 4 рази, свідчать про підвищення стійкості препарату до дії високих температур.

Вивчення кінетики гідролізу казеїну іммобілізованим папаїном (табл. 4) показало зменшення Кm і Vmax, що обумовлено змінами спорідненості ферменту в матриці до субстрату і наявністю дифузійних обмежень. Як і у випадку вільного ферменту, спостерігали інгібування субстратом.

Таблиця 4

Кинетичні параметри гідролізу казеїну папаїном

Папаїн	Кm, г/дм3	Vmax, мкмоль/г за хв	kин., г/дм3	Sопт., г/дм3	Vопт., мкмоль/г за хв
Вільний	1,724	730,6	12,5	4,6	295,0
Іммобілізований	0,212	161,3	0,57	0,348	100,3

Використання ОЛП на моделях лужних опіків рогівки очей кролів приводить до повного площинного відторгнення щільної, некротично зміненої ділянки рогівки через 45 хв дії, дозволяючи приступити до невідкладної кератопластики (рис. 16 а, б). Вивчено гостру офтальмотоксичність ОЛП, що показала офтальмонешкідливість препарату. Складені лабораторний регламент (технологічна схема отримання іммобілізованого папаїну представлена на рис. 17) і проект АНД.

У п'ятому розділі «Іммобілізація ліпази Penicillium solitum» з метою підвищення стабільності та стійкості в кислому середовищі шлункового соку створеного в ФХІ ім. А.В. Богатського НАН України препарату «Енсоферм» для замісної терапії недостатності травлення (ліпаза P. solitum, закріплена на АВВМ), розроблено метод іммобілізації ліпаз різного походження на АВВМ за допомогою ПВС, зшитого бурого, з додатковим покриттям ентеросолюбальною плівкою. Вивчено фізико-хімічні особливості функціонування одержаних препаратів.

Ліпаза P. solitum (діюча основа ЛЗ солізиму) - глікопротеїд з вмістом вуглеводів до 10 %, з М.м. 30 кДа, оптимум рН 7,0, t 37 єС, активністю 2360 од/мг білка. Вибір носія обумовлений його використанням в ентеросорбції і гемосорбції [Давиденко Т.И., 2003] внаслідок високих адсорбційних характеристик, розвиненої пористості в поєднанні з достатньою проникністю для ферментів та субстратів, хімічною та біологічною інертністю. Показано, що сумарний об'єм пор АВВМ (Vs 0,253-1,936 см3/г, характеристичні розміри мезопор 15-200 нм, мікропор <0,6 нм), чинить помітний вплив на активність іммобілізованої ліпази. Максимальна активність (<90%) спостерігається при закріпленні ферменту на АВВМ з Vs 0,41-1,3 см3/г. Вивчення впливу масових відношень фермент: носій на активність ліпази, іммобілізованої на АВВМ з використанням ПВС і бури, показало, що в діапазоні 1:30-1:60 досягається її максимальне збереження (рис. 18).

рН-і термопрофілі активності іммобілізованої ліпази розширені в область кислих значень рН (4,0-6,0), низьких і високих температур (20-60 єС), препарат має високу рН-стабільність (рис 19 а, б).

Вивчення десорбції іммобілізованої ліпази (модуль десорбції 10) виявило, що після інкубації протягом 6 год при рН 5,6, 8,0, в розчині визначається 83,3 % і 70,6 % початкової активності, відповідно. Розроблений метод апробовано з використанням ліпаз Pseudomonas sр.; свинячої панкреатичної. Отримані результати, дослідження реологічних характеристик розчинів ПВС, ПВС з ферментом, ПВС з ферментом і бурою свідчать про стабілізацію ліпази за рахунок утворення водневих зв'язків між макромолекулами ПВС і ферменту, утворення комплексу ПВС-фермент-бура, зниження конформаційної рухливості глобули білка, іммобілізованого в структуру зшитого полімеру і в пори АВВМ. Розроблений спосіб іммобілізації ліпази на АВВМ «Дніпро-МП» дозволяє при використанні матриці з сумарним об'ємом пор 0,41-1,3 см3/г, регулюючи співвідношення фермент: матриця (1:30-1:60), одержувати іммобілізовані препарати із заданою ліполітичною активністю (20-40 ЛО/мг препарату), з її кількісним збереженням, більш вираженою стійкістю у кислому середовищі, пролонгованою дією і стабільністю при зберіганні (1 рік).

Використання розробленого плівкового покриття на основі АФЦ для іммобілізованої на АВВМ ліпази, дозволило отримати активний (50 % збереження вихідної активності), стабільний препарат (1,5 року зберігання), що володіє підвищеною стійкістю до дії рН, характерною для шлункового соку (рН 1,35 ) (ліполітична активність на 25 % вища за таку іммобілізованого на АВВМ препарату) протягом 2 годин, що вивільняється з високим виходом ліполітичної активності в умовах рН середовища кишкового соку (рН 5,0 - 6,0).

У шостому розділі «Іммобілізація алергенів для створення потенційних діагностичних і лікарських засобів» з використанням підходу нековалентного зв'язування з носієм розроблені стабілізовані пролонговані форми алергенів, перспективні для перорального і інтраназального шляхів введення в алергології. Алергени (глікопротеїди з М.м. до 50 кДа), що застосовуються для діагностики та лікування алергічних захворювань, є водно-сольовими екстрактами вихідної алергенної сировини, стандартизовані в од. PNU (1 од. PNU відповідає 0,06 мкг білка) і стабілізовані 0,4 % фенолом. Вперше визначено фракційно-білковий склад АХП (серія 006.9), виробленого в Україні (рис.20).

При створенні іммобілізованих алергенів, перспективних для введення per os, застосували методи імпрегнації (висівки пшениці, крохмаль водорозчинний), комплексоутворення та адсорбції (ПВК, аеросил А-380), більша стабілізація досягалася з використанням останніх. Алергени білка курячого яйця і пилку жита характеризуються значною поширеністю і високою алергонебезпечністю.

ПВК - нетоксичний гідрофільний термоосаджуваний полімер, здатний до комплексоутворення за рахунок водневого зв'язку між СО-групою капролактамних ланок і ОН-групою стабілізаторів - фенолу (рис. 2), овальбуміну та ін; гранулоутворення проходить внаслідок витіснення води зі структури полімеру, що сприяє його ущільненню.

Аеросил А-380 - непористий високодисперсний кремнезем (питома поверхня 380 м2/ г, розмір часток 7 нм, основні адсорбційні центри - силанольні групи SiOH-), володіє високими адсорбційними властивостями по відношенню до білків, ферментів, екзо- та ендотоксинів, мікроорганізмів; нетоксичний; відсутність пор забезпечує швидкість протікання адсорбції [Чуйко А.А., 2003].

Отримано іммобілізовані в ПВК препарати АПЖ і АБКЯ з включенням 82,6 - 96,0 % білка, 56,0 - 85,0 % фенолу і 41,9 -50,7 % білка, і 52,0 - 76,4 % фенолу , відповідно, стабільні при 8-місячному зберіганні при 4 оС.

Вивчено співвідношення білок: носій і адсорбцію алергенів аеросилом, отримані іммобілізовані препарати зі зв'язуванням білка - 50 % і 83,7 % для АПЖ і АБКЯ, відповідно. Показано застосування як стабілізаторів ПВК менш токсичних, ніж фенол, аспірину та резорцину, селективне зв'язування білка аеросилом, пролонгованість дії (2-3 год) в середовищах, моделюючих рН шлунка (рис. 21) і кишечника.

На основі розробленого методу іммобілізації алергенів у ПВС виготовлені плівки з дозованим включенням комерційних препаратів побутових, харчових, пилкових алергенів (50-500 PNU), стабільні при зберіганні, пролонгованої дії, перспективні для діагностики алергічних захворювань (в т.ч. алергічних ринітів у дозі 200 PNU) при інтраназальному способі введення. Отримані плівкові форми алергенів надають можливість швидкого переривання контакту з алергеном для зниження ризику розвитку ускладнень, зручні для використання лікарем.

У сьомому розділі «Особливості окиснення фенолів пероксидазою хрону. Розробка біокаталізаторів багаторазової дії з використанням пероксидази хрону для елімінування фенольних полютантів» наведено модифікацію методу виділення пох, оптимізовані умови каталізу ряду фенольних полютантів, отримані біокаталізатори багаторазового використання на основі пох, іммобілізованої фізичним способом, шляхом невалентного зв'язування і ковалентної зшивки з полімерними носіями для елімінування фенольних полютантів. Методами QSAR/QSPR аналізу отримано статистичні моделі, які дозволяють з достатньою надійністю прогнозувати ступінь і швидкість трансформації нових фенольних субстратів пох. Отримання препарату ПОХ за модифікованим нами методом (рис. 22), порівняного з комерційним за молекулярно-масовим складом (рис. 23), і оксидоредуктазною активністю (100 од/мг) привело до підвищення RZ ферменту з 0,6 до 1,0, активності на 13 %.

Розроблено умови пох-окиснення фенолу, резорцину, пірокатехіну, гідрохінону, пірогалолу, о-, м-, п-хлорфенолів, 2,4,6-трихлорфенолу, пентахлорфенолу, о-, м-, п-крезолів, б-нафтолу, що приводять до максимального ступеня біоконверсії (20,4-94,1 %) в діапазоні концентрацій 0,1 -1,0 мМ при мольних відношеннях субстрат: Н2О2 1:1, [пох]: 0,01-0,2 од/см3, рН 4,0-7,5, t 20-45 °C, ф 30-60 хв. Визначено кінетичні параметри (Кm, Vmax) реакції окиснення досліджуваних фенольних полютантів (табл. 6).

Застосування стабілізаторів (САЛ, ПЕГ-6000, ПВП) привело до збільшення трансформації фенолів (фенол, о-, м-, п-хлорфеноли) у середньому на 10-17 %.

Підвищити ступінь біоконверсії полютантів (фенол, о-, м-крезоли, о-, м-, п-хлорфеноли, 2,4,6-трихлорфенол, пентахлорфенол) з 20,4-80,4 % до 60,5-100 %, вдалося, використовуючи метод соокиснення субстратів [Лебедева Е.В. и др. 1996], вперше застосувавши швидко окиснювані субстрати пох (похідні хіноліну).

Порівняльний аналіз окиснення широкого ряду фенольних сполук, що каталізується виділеною і комерційною пох, показав незначний вплив спектрального ступеня чистоти ферменту (RZ), що узгоджується з даними літератури [Wagner M., 2001].

Таблиця 6

Біоконверсія фенолів і кінетичні параметри пероксидазного каталізу

Фенольна сполука	Ступінь конверсії, %	Кm(ArROH), мМ	Кm (Н2О2), мМ	Vmax, мМ/мг білка за хв
фенол	80,4	0,413	0,652	39,3?10-3
резорцин	75,0	0,330	0,408	76,4?10-3
пірокатехін	84,3	0,320	0,360	84,3?10-3
гідрохінон	92,1	0,378	0,310	136,3?10-3
о-хлорфенол	68,1	0,172	0,380	74,9?10-6
м-хлорфенол	25,2	0,156	0,309	10,3?10-6
п-хлорфенол	71,0	0,173	0,362	23,5?10-5
б-нафтол	94,1	0,382	0,270	142,1?10-3
о-крезол	78,1	0,310	0,421	69,0?10-3
м-крезол	76,5	0,311	0,402	71,3?10-3
п-крезол	91,2	0,286	0,133	80,3?10-3
2,4,6-трихлорфенол	62,0	0,174	0,284	41,2?10-3
пентахлорфенол	20,4	0,123	0,312	31,2?10-7

У результаті пох-окиснення фенолів переважно утворюються темно-забарвлені полімерні продукти, нерозчинні у воді і органічних розчинниках, поліоксифенілени (ІЧ-спектроскопія та мас-спектрометрія).

З використанням методів QSAR/QSРR встановлено кількісний зв'язок структура фенолів/ступінь біоконверсії/реакційна здатність (Кm, Vmax) у пероксидазному каталізі. Досліджено 41 субстрат (навчальна вибірка - 13 сполук, цільовий параметр - значення ступеня біоконверсії (Y5,%) фенолів). З використанням структурних параметрів - розрахункових значень енергій вищої зайнятої (HOMO) і нижчої вакантної (LUMO) молекулярних орбіталей фенолів - методом MLR побудовано рівняння, що задовільно описує зв'язок структура/ступінь біоконверсії фенолів:

lg (Y5) = 26,4 + 1,7 E (LUMO) + 2,8 E (HOMO) (R2 = 0,86;Q2 = 0,81; S = 0,33).

Встановлено, що зниження значень енергій HOMO і LUMO фенолів призводить до зменшення їх біоконверсії (рис. 24); електроноакцепторні замісники в ароматичному ядрі істотно знижують, електронодонорні - збільшують реакційну здатність фенолів в Пох-каталізі. Прогнозовані значення ступеня біоконверсії нових фенолів підтверджені проведенням додаткових експериментів з використанням ПОХ (табл. 7).

...