Біотехнологічні аспекти створення іммобілізованих на полімерних носіях біологічно активних білкових речовин

Використовуючи кінетичні параметри ПОХ-каталізу (Vmax, Km-1), структурні дескриптори, що описують форму молекули фенолу (моменти інерції), електронну структуру (EHOMO, ELUMO, парціальний заряд фенольного атому кисню, сумарну електронегативність атомів), дипольний момент і ліпофільність, і метод часткових найменших квадратів (PLS), проведено аналіз кількісного зв'язку (QSPR) структура/реакційна здатність фенолів. Для величин Km-1 і Vmax отримані рівняння:

Km-1 = 22,5 - 80,2q0 +0,037 Iz +1,57µ - 0,089 EN-0,091 Iy/Iz +15,81 Ix/Iz, (R2 = 0,96; Q2 = 0,90; S = 0,52; n = 6, n - число структурних параметрів);

Vmax = - 0,18 - 0,043 µ + 0,0047 EN - 1,60 q0 - 0,016 Log P- 0,023 ДE, (R2 = 0,92; Q2 = 0,85; S = 0,02; n = 5);

де Ix, Iy, Iz - моменти інерції вздовж координатних осей, м - дипольний момент, EN - сума електронегативностей атомів, qO - заряд на фенольному атомі кисню, Log P - ліпофільність, м - дипольний момент, Е = EHOMO - ELUMO).

Обчислені внески дескрипторів у зміну досліджуваних властивостей: для моделі за Km: характеристики електронної структури - 66 %, параметри форми - 34 %, а для Vmax - внесок у зміну параметрів електронної структури зростає до 83 % (рис. 25).

З метою аналізу прогностичних можливостей PLS моделей досліджені "області компетентності" (ОК) у просторі латентних змінних T1-T2, обчислених при побудові PLS-рівняння. Прогноз для нових молекул надійніший при їх розташуванні в областях простору структурних ознак, близьких до аналогічних областей молекул навчальної вибірки (на відстані R +3 у від центру). Т.ч., знайдені характеристики фенольних субстратів, що визначають їх реакційну здатність у реакції ПОХ-окиснення. Отримані QSAR і PLS QSPR моделі дозволяють з достатньою впевненістю прогнозувати Y, Km і Vmax нових фенольних субстратів. Аналіз ОК дає можливість оцінити надійність прогнозу в конкретному випадку.

Для отримання стабільних біокаталізаторів багаторазового використання в реакціях дефенолізації розроблені методи нековалентної і ковалентної іммобілізації ПОХ з використанням нових доступних носіїв.

Вітчизняного виробництва карагінан з чорноморської водорості Phyllophora nervosa (належить до групи к-карагінану), характеризується відсутністю токсичності, власною біологічною активністю, гелеутворюючими властивостями, можливістю модифікації; гідратцеллюлозна мембрана «Діацелл» (напівпроникна плівка з розміром пор 0,4 мкм), має добрі розділяючі властивості, механічну міцність у водних середовищах, стійкість до різних значень рН.

Запропонований підхід нековалентного зв'язування з носієм (утворення комплексів при мольних відношеннях <1:2) з додатковим включенням в сітку зшитого іонами Са2+ полімеру дозволив отримати іммобілізований препарат Пох з ~ 95 % збереженням вихідної активності (при вмісті 0,6 ч 0,8 мг Пох/мг носія), значно розширеним рН-профілем активності іммобілізованого ферменту (3,0-10,0), у порівнянні з вільним (4,0, 6,0-7,5), розширеним термопрофілем активності іммобілізованої Пох в область низьких температур (рис. 26 а, б), підвищеною термостабільністю (в 38,6 рази у порівнянні з вільним ферментом), стійкістю при зберіганні протягом 1 року, в технологічній гранульованій формі.

Проведені кінетичні дослідження показали збільшення значень Km іммобілізованої Пох в 2,5 рази по Н2О2 (1,01 мМ) і зменшення значень Vmах реакції в 1,5 рази в порівнянні з Km і Vmах вільної (0,43 мМ і 0,09 мМ/мг білка за хв, відповідно), що обумовлено зменшенням спорідненості ферменту до Н2О2 (Dunford H.B., 1991), а також утрудненою дифузією продуктів реакції з носія. Іммобілізований фермент каталізував окиснення досліджуваних фенолів у реакторі періодичної дії в 1,3-2,6 рази ефективніше в порівнянні з вільним (табл. 8) з кратністю використання 5-7 раз.

Запропоновано підхід до стабілізації Пох, що полягає у фізичному способі її іммобілізації з використанням мембрани «Діацелл» (відділення водного розчину ензиму від водного розчину субстрату напівпроникною мембраною, яка пропускає молекули субстратів, але непроникна для молекул ферменту). Додавання в розчин, що містить фенол, о-, м-, п-хлорфеноли, іонів Са2+ і Mg2+ (1,0 Мм) (активаторів Пох), дозволяє збільшити ефективність видалення фенолів на ? 10-20 %, кратність використання біокаталізатору до 7-10 раз; введення в мембрану з ферментом БСА, ПВП і ПЕГ приводить до збільшення кратності використання Пох до 7, 16 і 20 раз, відповідно (рис. 27).

Таблиця 8

Окиснення фенолів, що каталізується іммобілізованою у філофорин ПОХ

[субстрат]:[Н2О2] = 1:1; активність ПОХ 0,020-2,5 од/см3; t = 20 оС; рН 7,0; ф =1 год

У результаті ковалентної іммобілізації Пох отримано біокаталізатор з кількісним зв'язуванням білка, збереженням 88 % активності (масове відношення фермент: носій 0,2: 1), розширеними рН- і термопрофілями активності, збільшеними рН- і термостабільністю, стійкий при зберіганні (1,5 року ). Стабілізаційні ефекти обумовлені утворенням міцного з'єднання Пох з мембраною, що зменшує конформаційну рухливість білка, сприяючи збереженню високої каталітичної активності іммобілізованої Пох в органічних розчинниках: у середовищі етанолу, метанолу та ацетону іммобілізований фермент в 10-20 раз перевершував за активністю вільний (рис. 28).

Іммобілізований препарат каталізував окиснення фенолу, п-крезолу, п-хлорфенолів в широкому діапазоні концентрацій (0,25-200 мМ) в 1,4-6,7 раз ефективніше в порівнянні з вільним ферментом з утворенням полімерних продуктів окиснення, що адсорбуються на поверхні гідратцелюлозної мембрани; кратність використання біокаталізатору в реакції окиснення фенолу становила 22 рази, причому протягом 7 циклів застосування фермент зберігав 100 % активність (рис. 29).

Розроблений метод видалення фенолів, що каталізується частково очищеною Пох, включеною в мембрану «Діацелл», успішно апробовано на стічних водах ЗАТ «ТеплоСервіс».

У восьмому розділі «Аналіз і узагальнення результатів» систематизовані, детально обговорені та викладені основні результати роботи.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вирішена важлива наукова проблема розробки нових біотехнологічних підходів щодо підвищення біохімічної активності і стабілізації біологічно активних речовин (гідролітичних та окиснювально-відновлювального ферментів, білків, алергенів) шляхом їх іммобілізації на полімерних носіях. Розроблено наукові основи створення перспективних препаратів для терапії ран і опіків, замісної терапії недостатності травлення, діагностики алергічних захворювань, біокаталізатори багаторазового використання для окиснення фенольних полютантів з метою їх елімінування з розчинів і стічних вод.

1. Встановлено механізм іммобілізації альбумінів, гідролітичних ферментів (лізоциму, папаїну) в полівініловий спирт, який полягає в утворенні асоціатів білок:носій і механічному включенні у полімер. В результаті реалізації цього механізму в розроблених умовах отримано очні лікарські плівки з іммобілізованою «Стерилазою», сироватковим альбуміном людини, сумісно іммобілізованими папаїном і сечовиною, полімерні плівки з включеними алергенами хатнього пилу і білка курячого яйця. Отримані високоактивні препарати з кількісним зв'язуванням білка, пролонгованої дії, стабільні при зберіганні протягом 1-1,5 року.

2. Показано, що очні лікарські плівки з сироватковим альбуміном людини при концентрації білка в 100 разів нижче такої в розчині, мають високу поглинаючу здатність до кислот і лугів, що перспективно для сорбційної терапії опіків очей. Дозований ефект (50-500 PNU) включення алергенів білка курячого яйця і хатнього пилу у плівки полівінілового спирту передбачає розробку інтраназального способу їх введення для діагностики та специфічної імунотерапії алергічних захворювань. Проведено медико-біологічні випробування очних лікарських плівок з папаїном і сечовиною, які показали перспективність їх використання в терапії опіків очей.

3. Встановлено, що метод нековалентної іммобілізації в полівініловий спирт, модифікований бурою, дозволяє отримувати препарати альбумінів, алергенів з посиленням пролонгування, залежним від концентрації модифікатора. Використання цього методу для стабілізації біологічно активних речовин із закріпленням на марлі (ЛФК «Стерилаза»), активованому вуглецевому волокнистому матеріалі (ліпази різного походження) сприяло розробці іммобілізованих високоактивних препаратів (85,7 - 93,5% збереження вихідної літичної і ліполітичної активностей), пролонгованої дії, стабільних в умовах вмісту рани, шлункового соку, при зберіганні впродовж 1,5 років. Отримані препарати є перспективними для використання в терапії ран і опіків, замісної терапії недостатності травлення.

4. Виявлено, що іммобілізація ферментів в модифікований золем полікремнієвої кислоти полі-N-вінілпіролідон сприяє отриманню перспективних ранових водонерозчинних гідрогелевих покриттів з лізоцимом, лужною протеазою і трипсином, з високими виходами по активності (75,6-100 %), стійкістю при зберіганні та г-стерилізації, пролонгованої дії (24 год). Дослідження відношень матриця-фермент, кінетичних параметрів гідролізу субстрату вільним і іммобілізованим ферментом, встановлення дозозалежного ефекту при г-опроміненні, надає можливість оптимізації дози і, відповідно, протеолітичної активності іммобілізованого препарату.

5. Встановлено, що комплексоутворення з полі-N-вінілкапролактамом та адсорбція аеросилом дозволяє отримати іммобілізовані препарати алергенів з високим ступенем зв'язування білка і фенолу з полі-N-вінілкапролактамом, селективністю адсорбції білка аеросилом, стабільні при зберіганні, пролонгованої дії в середовищах, що моделюють значення рН шлунка і кишечника, перспективні для перорального застосування в алергології.

6. Наявність протеолітичної активності білкових фракцій протеази С як в кислому (рН 4,9), так і в лужному (рН 8,9) середовищах дозволило вперше на основі природного біогелю «Ламідан» отримати текстильне покриття з іммобілізованим ферментом, з високим ступенем збереження протеолітичної активності (95,9 %), пролонгованої дії, тривалого строку зберігання (1,5 роки) для потенційного застосування в терапії ран і опіків.

7. Дослідження кінетики гідролізу казеїну протеазами рослинного, тваринного і мікробного походження показало істотне (? 50 %) субстратне інгібування протеолітичної активності папаїну, трипсину і лужної протеази, що дозволяє рекомендувати для більш точного визначення казеїнолітичної активності використання 0,35 - 0,9 % розчину субстрату.

8. Розроблено технологічні схеми отримання іммобілізованих препаратів ЛФК «Стерилаза», папаїну, сумісно іммобілізованого з сечовиною, що включають стадії іммобілізації, висушування, пакування, стерилізації г-опроміненням. Встановлено відсутність офтальмотоксичності очних лікарських плівок з папаїном і сечовиною, розроблені проекти аналітичної нормативної документації на іммобілізовані лужну протеазу і папаїн, сумісно іммобілізований з сечовиною.

9. Запропоновано модифікацію методу Баха, яка сприяє виділенню частково очищеного препарату пероксидази з коренів хрону з активністю, порівняною з фірмовим P8-125-SKU, Sigma, 2006 і розроблена технологічна схема його отримання. Оптимізовано умови окиснення фенолу, о-, м-, п-хлорфенолів, що каталізується частково очищеною пероксидазою. Показано стабілізуючу дію іонів Са2+, Mg2+, синтетичних полімерів (ПВП, ПЕГ-6000) і БСА на активність пероксидази, що дозволяє збільшити ступінь біоконверсії досліджуваних фенольних полютантів на 10-22 %. Показано, що даний метод дозволяє трансформувати різні похідні фенолу в концентраціях 0,1-1,0 мМ зі ступенем ефективності 28-100 %, що залежить від природи субстрату, замісників та їх розташування в бензольному кільці.

10. Методами QSAR/QSPR аналізу отримано статистичні моделі, які дозволяють з достатньою надійністю прогнозувати ступінь біоконверсії і швидкість окиснення нових фенольних субстратів пероксидази.

11. Іммобілізація пероксидази методом включення в карагінан з чорноморської водорості Phyllophora nervosa, фізичної іммобілізації та хімічного зв'язування з гідратцелюлозною мембраною "Діацелл" дозволила отримати високоактивні іммобілізовані препарати, стабільні при зберіганні (до 1,5 років) багаторазового використання (карагінан - до 7 разів, мембрана - до 22 раз) в реакціях окиснення фенолів як у водних, так і в органічних середовищах. Метод включення пероксидази в гідратцелюлозну мембрану успішно апробований для елімінації фенольних полютантів (конверсія фенолу - 94,5 %, о-, п-крезолів - 100 %) на стічних водах ЗАТ «ТеплоСервіс».

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Для створення високоефективних стабільних препаратів пролонгованої дії для потенційного використання в медицині перспективно використання нековалентного зв'язування гідролітичних ферментів, у тому числі мікробного походження і альбумінів з полімерними носіями, або їх модифікованими формами;

2. Для розробки біокаталізаторів багаторазової дії окиснення фенольних полютантів з метою їх елімінування з водних розчинів і стічних вод доцільне застосування методів фізичної іммобілізації і ковалентного зв'язування з полімерною матрицею виділеного препарату пероксидази хрону.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Романовская И.И. Иммобилизация аллергенов белка куриного яйца и домашней пыли / И.И. Романовская, Т.И. Давиденко // Доп. НАН України. -- 2000. -- № 1. -- С. 160-164.

Давиденко Т.И. Литическая активность иммобилизованной стерилазы (литического ферментного комплекса Streptomyces resifensis var. lyticus) / Т.И. Давиденко, И.И. Романовская, М.А. Чуманова [и др.] // Хим.-фарм. журн. -- 2001. -- Т. 35, № 10. -- С. 14-17.

Романовская И.И. Иммобилизация аллергенов на полимерных носителях / И.И. Романовская, Т.И. Давиденко // Вісник ОНУ. Хімія. -- 2001. -- Т. 6, № 5. -- С. 146-151.

Романовская И.И. Включение аллергенов пыльцы ржи и белка куриного яйца в поли-N-винилкапролактам / И.И. Романовская, Т.И. Давиденко, И. Арбид [и др.] // Фізіологічно-активні речовини. -- 2002. -- Т. 34, № 2. -- С. 87-90.

Романовская И.И. Адсорбция аллергенов пыльцы ржи и белка куриного яйца аэросилом / И.И. Романовская, Т.И. Давиденко, А. Эльсаббаг [и др.] // Хим.-фарм. журн. -- 2004. -- Т. 38, № 10. -- С. 15-17.

Давиденко Т.И. Окисление хлорфенолов с использованием пероксидазы хрена / Т.И. Давиденко, И.И. Романовская, О.В. Осейчук [и др.] // Химия и технология воды. -- 2004. -- Т.26, № 6. -- С. 582-590

Davidenko T.I. Peroxidase oxidation of phenols / T.I. Davidenko, O.V. Oseychuk, I.I. Romanovskaya [et al.] // Appl. Biochem. and Microbiol. -- 2004. -- V.40, № 6 -- Р. 542-546.

Романовская И.И. Создание кислотоустойчивой формы иммобилизованной на углеродной ткани АУВМ «Днепр-МН» липазы Penicillium solitum / И.И. Романовская, Т.И. Давиденко // Вісник ОНУ, сер. Хімія. -- 2005. -- Т. 10, № 1. -- С.72-79.

Декина С.С. Иммобилизация пероксидазы в каррагинан из Phyllophora nervosa / С.С. Декина, О.В. Осейчук, И.И. Романовская // Вісник ОНУ. -- 2005. -- Т. 10, № 9. -- С. 120-126

Романовська І.І. Фізико-хімічні дослідження іммобілізованого на гідратцелюлозній мембрані препарату пероксидази хрону / І.І. Романовська, О.В. Осійчук // Медична хімія. -- 2006. -- Т. 8, № 4. -- С. 65-69.

Романовська І.І. Іммобілізація алергенів для створення потенційних діагностичних і лікарських препаратів інтраназального способу введення / І.І. Романовська, С.М. Пухлік, Б.М. Пухлик // Одеський мед. журн. -- 2006. -- Т. 94, № 2. -- С. 25-29.

Романовская И.И. Иммобилизация липазы Penicillium solitum на углеродной ткани АУВМ «Днепр-МН» / И.И. Романовская, Г.И. Бондаренко, Т.И. Давиденко // Вісник ОНУ, сер. Хімія. -- 2006. -- Т. 11, № 2. -- С. 89-95.

Осейчук О.В. Исследование условий трансформации фенола и его монохлорзамещенных производных, катализируемое пероксидазой / О.В. Осейчук, И.И. Романовская, О.В. Севастьянов // Химия и технология воды. -- 2006. -- Т. 28, № 5. -- С. 505-512.

Романовская И.И. QSPR анализ реакционной способности субстратов пероксидазы / И.И. Романовская, В.Е. Кузьмин, О.В. Осейчук [и др.] // Вісник ОНУ, сер. Химия. -- 2006. -- Т. 11, № 5. -- С. 69-77.

Романовская И.И. Анализ влияния структуры фенольных соединений на степень их ферментативной конверсии / И.И. Романовская, Е.Н. Муратов, В.Е. Кузьмин [и др.] // Доповіді НАН України.-- 2006. -- № 9. -- С. 161-166.

Романовская И.И. Некоторые особенности кинетики гидролиза казеина папаином, трипсином и щелочной протеазой из Bacillus subtilis /
И.И. Романовская, С.С. Декина, О.В. Севастьянов // Ученые записки ТНУ, Сер. «Биология, химия». -- 2007. -- Т. 20 (59), № 2. -- С. 126-130.

Романовська І.І. Іммобілізація літичного ферментного комплексу Streptomyces recifensis var. lyticus / І.І. Романовська, І.К. Тагунова, С.М. Пухлік [та ін.] // Одеський мед. журн. -- 2007.-- Т. 99, № 1.-- С. 19-23.

Романовська І.І. Іммобілізація лізоциму в полі-N-вінілпіролідон / І.І. Романовська // Медична хімія -- 2007. -- Т. 9, № 2. -- С. 55-59.

Романовська І.І. Розробка ранового гідрогелевого покриття з іммобілізованою лужною протеазою Bacillus subtilis на основі модифікованого полі-N-вінілпіролідону / І.І. Романовська, С.С. Декіна // Досягнення біології та медицини. -- 2006. -- Т. 9, № 1. -- С. 88-91.

Романовська І.І. Іммобілізація папаїну та сечовини в полівініловий спирт / І.І. Романовська, С.С. Декіна // Медична хімія. -- 2007. -- №1. -- С. 35-40.

Романовська І.І. Електрофорез алергенів білка курячого яйця і хатнього пилу / І.І. Романовська, В.А. Топтіков // Медична хімія. -- 2007. -- Т.9, № 4. -- С. 103-107.

Романовська І.І. Розробка очних лікарських плівок з сироватковим альбуміном людини / І.І. Романовська, С.С. Декіна, Р.І. Чаланова [та ін.] // Медична хімія. -- 2008. -- Т. 10, № 1. -- С. 15-19.

Романовская И.И. Иммобилизация липазы Penicillium solitum на углеродном волокнистом материале «Днепр МН» / И.И. Романовская, Г.И. Бондаренко, Т.И. Давиденко // Хим.-фарм. журн. -- 2008. -- Т. 42, № 6. -- С. 49-51.

Романовська І.І. Ферментативні методи елімінації фенольних полютантів / І.І. Романовська, О.В. Осійчук, Ю.А. Шестеренко [та ін.] // Мікробіологія і біотехнологія. -- 2008. -- № 1(2). -- С. 72-78.

Романовська І.І. Іммобілізація протеази С в біогель ламідан / І.І. Романовська, С.С. Декіна, Н.Б. Мартинюк // Досягнення біології та медицини. -- 2009. -- Т. 14, № 2. -- С. 25-28.

Романовская И.И. Иммобилизация биологически активных веществ с целью создания потенциальных диагностических и лекарственных средств / И.И. Романовская, Т.И. Давиденко, С.С. Декина [и др.] // Журнал орг. та фарм. хімії. -- 2009. -- Т.7, вип. 3(27). -- С. 69-78.

Давиденко Т.И. Иммобилизация биологически активных веществ. Обзор /Т.И. Давиденко, И.И. Романовская, С.А. Андронати // Микробиол. и биотехнол. -- 2009. -- Т. 6, № 2. -- С. 8-22.

Романовская И.И. Иммобилизация щелочной протеазы и лизоцима в модифицированный поли-N-винилпирролидон / И.И. Романовская, С.С. Декина, И.И. Пашкин // Хим.-фарм. журн. -- 2009. -- Т. 43, № 11. -- С. 26_29.

Романовская И.И. Перспективные матрицы для иммобилизации аллергенов / И.И. Романовская // Ученые записки ТНУ. -- 2009. -- Т. 22 (61), № 2. -- С. 200-206.

Романовская И.И. Потенциальное раневое покрытие с трипсином, иммобилизованным в модифицированный поли-N-винилпирролидон // Доп. НАН України. -- 2009. -- № 9. -- С.182-187.

Romanovskaya I.I. The QSPR analysis of peroxidase substrates reactivity / I.I. Romanovskaya, V.E. Kuz'min, O.V. Oseychuk [et al] // Сhemistry & Chemical Technology. -- 2009. -- V. 3, № 4. -- Р. 255-263.

Романовська І.І. Розробка текстильного ранового покриття з протеазою С Acremonium chrysogenum / І.І. Романовська, С.С. Декіна // Мікробіологія і біотехнологія. Ї 2011. Ї № 1. Ї С. 26-33.

Пат. 8115 Україна, МПК 7С02F1/12 Спосіб доочищення стічних вод / Т.І. Давиденко, О.В. Осійчук, І І. Романовська [та ін]; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. - № u 200500560; заявл. 21.01.05; опубл. 15.07.05, Бюл. № 7.

Пат. 7861 Україна, МПК 7С12N11/00. Спосіб іммобілізації ліполітичних ферментів / Давиденко Т.І., Романовська І.І., Бондаренко Г.І.; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. -- № 20041209892; заявл. 03.12.04; опубл. 15.07.05, Бюл. № 7.

Пат. 17099 Україна, МПК (2006) С12N11/00. Спосіб іммобілізації ліполітичних ферментів /Романовська І.І., Давиденко Т.І.; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. -- № u 200602317; заявл. 02.03.06; опубл. 15.09.06, Бюл. № 9.

Пат. 17733 Україна, МПК (2006) С12N11/00 Спосіб іммобілізації пероксидази / Осійчук О.В., Романовська І.І., Севастьянов О.В.; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. -- № u 200603555; заявл. 03.04.06; опубл. 16.10.06, Бюл. № 10.

Пат. 13238 Україна, МПК(2006) A61F 9/007 Композиція інгредієнтів для очної лікарської плівки / Романовська І.І., Декіна С.С., Бондаренко Г.І. [та ін]; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. -- № u 200509628; заявл. 13.10.05; опубл. 15.03.06, Бюл. № 3.

Пат. 22088 Україна, МПК (2006) А61L15/16, А61L31/00. Ранозагоювальний засіб / Романовська І.І., Декіна С.С., Пашкін І.І., (Пашкин И.И.) RU [та ін]; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. -- № u 200612771; заявл. 04.12.06; опубл. 10.04.07, Бюл. № 4.

Пат. 26190 Україна, МПК (2006) А61F 9/007 Композиція інгредієнтів для очної лікарської плівки / Романовська І.І., Декіна С.С., Чаланова Р.І. [та ін]; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. -- № u 2007 04273; заявл. 18.04.07; опубл. 10.09.07, Бюл. № 14.

Пат. 31802 Україна, МПК(2006) С12N 11/00 Спосіб іммобілізації протеази С / Романовська І.І., Декіна С.С.; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. -- № u 2007 13120; заявл. 26.11.07; опубл. 25.04.08, Бюл. № 8.

Пат. на винахід 83786 Україна, МПК(2006) С12N11/00 Спосіб іммобілізації протеази С / Романовська І.І., Декіна С.С.; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. -- № a 2007 13084; заявл. 26.11.07; опубл. 11.08.08, Бюл. № 15.

Пат. на винахід 84507, Україна, МПК (2008) А61К38/46(2008.01), А61К31/194(2008.01), А61К31/79(2008.01), А61К9/19, А61Р17/02(2008.01) Ранозагоювальний засіб (варіанти) / Романовська І.І., Шестеренко Є.А. Пашкін І.І. [та ін]; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. -- № а 200701348; заявл. 02.07.07; опубл. 27.10.08, Бюл. № 20.

Пат. 29455 Україна, МПК (2006) С02F1/00 Спосіб очищення стічних вод від фенолів / Осійчук О.В., Романовська І.І., Декіна С.С.; заявник та власник патенту Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України. -- № u 200710973; заявл. 04.10.07; опубл. 10.01.08, Бюл. № 1.

Давиденко Т.И., Романовская И.И., Пухлик Б.М и др. Иммобилизация аллергенов: тез. доп. II Національного з'їзду фармакологів України [«Фармакологія 2001 -- крок у майбутнє»], (Дніпропетровськ, 1-4 жовтня 2001 р.) / АМНУ, МОЗУ. -- Дніпропетровськ, 2001. -- С. 70-71.

Романовская И.И., Давиденко Т.И., Пухлик С.М. Модификация аллергенов пыльцы ржи и белка куриного яйца включением в поли-N-винилкапролактам: тез. доп. науково-практичної конференції [«Раннє виявлення та лікування алергічних захворювань»], (Вінниця, 17-18 лютого 2003 р.). -- Вінниця, 2003. -- С. 36-37.

Осейчук О.В., Романовская И.И., Севастьянов О.В. Окисление фенолов, катализируемое пероксидазой, заключенной в диализную мембрану: тез. докл. Ш Всеукраинской научно-практ. конф. [«Экологическая безопасность продукции и окружающей среды - потребность общества»], (Судак, 25-28 октября 2005 г.) / Государственный комитет Украины по вопросам технического регулирования и потребительской политики, Республиканский Совет по вопросам качества и стандартизации Автономной Республики Крым. -- Научно-технический сборник «Вестник «Крымское качество». -- Вып. №3 (6). -- Судак, 2005. -- С. 138-139.

Романовская И.И. Иммобилизация литического ферментного комплекса из Str. recifensis var. lyticus: мат. Международной научной конференции [«Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии»], (Минск-Раков, 1-2 июня 2006) / Национальная академия наук Беларуси, Институт микробиологии. -- Минск, 2006. -- С. 366.

Романовская И.И. Разработка полимерных пленок и гелевых покрытий с иммобилизованными литическими ферментами и аллергенами: тез. докл. III Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием [«Биотехнология. Образование. Наука. Практика»], (Харьков, 18-20 сентября 2006) / М-во образования и науки Украины, Нац. технич. ун-т «Харьковск. политехн. институт ». -- Х.: НТУ «ХПИ», 2006. -- С. 150-151.

Романовская И.И. Иммобилизация стерилазы: тез. докл. Международной научно-практической конференции [«Наука и образование - 2006»], (Мурманск, 4-12 апреля 2006) / М-во сельского хозяйства РФ, Мурманск. гос. техн. ун-т. -- М.: Мурманск. гос. техн. ун-т, 2006. -- С. 646.

Романовская И.И., Декина С.С., Андронати С.А. и др. Иммобилизация биологически активных веществ с целью создания потенциальных диагностических и лекарственных средств: материалы докл. VII науч.-практич. сем. [«Научные основы создания лекарственных средств»], (Гурзуф, 28-30 мая 2007 г.) / НАН Украины, Координационный совет Отделения химии НАН Украины по проблеме «Научные основы создания лекарственных средств», Таврич. нац. ун-т им. В.И. Вернадского. -- С. 3-18.

Романовская И.И., Декина С.С. Разработка иммобилизованных форм белковых и протеолитических ферментных препаратов: мат. IV Московского международного конгресса [«Биотехнология: Состояние и перспективы развития»], (Москва, 15-17 марта 2007 г.) / РАН, МГУ. -- М.: «Экспо-биохим-технологии», 2007. -- C. 94.

Романовская И.И., Давиденко Т.И., Андронати С.А. Потенциальные диагностические и лекарственные средства на основе иммобилизованных биологически активных веществ: тез. доп. Всеукраїнського конгресу [«Сьогодення та майбутнє фармації»], (Харків, 16-18 квітня 2008 р.) / НФаУ. -- Х.: Вид-во НФаУ, 2008. -- С. 355.

Романовская И.И. Потенциальные раневые покрытия с протеазами микробного происхождения / И.И. Романовская, С.С. Декина // XII з'їзд Товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського, Ужгород, 25-30 травня 2009 р. -- Ужгород, 2009. -- С. 247.

Romanovska I., Dekina S., Pashkin I., Topticov V. Potentially wound coating with alkaline protease from Bacillus subtilis immobilized on modified poly-N-vinyl pyrrolidone: 3rd Ukranian-Polish Weigl Conference [«Microbiology on Service for Human»], (Odessa, 14-17 September 2009) / Ministry of education and science of Ukraine, National Academy of Science of Ukraine, Odesa National I.I. Mechnikov University. -- О.: Редакційно-видавничий центр ОНУ ім. І.І. Мечникова, 2009. -- P. 103-104.

Чаланова Р.И., Романовская И.И., Декина С.С. Влияние человеческого сывороточного альбумина на регенерацию роговицы при ожоге: мат. науково-практичної конференції офтальмологів з міжнародною участю [«Філатовські читання»], (Одеса, 28-29 травня 2009 р.) / АМН України, Товариство офтальмологів України, ДУ «Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України». -- Одеса, 2009. -- С. 152-153.

Декина С.С, Романовская И.И. Глазные лекарственные пленки с иммобилизованными протеиновыми препаратами: мат. Х Українського біохімічного з'їзду, (Одеса, 13-17 вересня 2010 р.) / НАНУ, МОНУ, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ, ОНУ імені І.І. Мечникова, Національний університет природних ресурсів і природокористування України, FEBS. -- Укр. биохим. журн., 2010. -- № 4 (додаток 2). -- С. 10-11.

АНОТАЦІЯ

ферменти сполука фенольний окиснення

Романовська І.І. Біотехнологічні аспекти створення іммобілізованих на полімерних носіях біологічно активних білкових речовин. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 -- біотехнологія. Одеський національний університет імені І.І. Мечникова МОНМС, Одеса, 2011.

Дисертація присвячена розробці біотехнологічних підходів і методів стабілізації БАР шляхом іммобілізації на полімерних носіях природного і синтетичного походження для створення потенційних препаратів для терапії ран і опіків, замісної терапії недостатності травлення, діагностики алергічних захворювань, біокаталізаторів окиснення фенольних полютантів для елімінування з розчинів і стічних вод.

Запропоновано принципи створення високоактивних стабільних іммобілізованих препаратів альбумінів, гідролітичних ферментів, алергенів, пролонгованої дії шляхом нековалентних взаємодій з полімерними носїями і їх модифікованими формами у вигляді тканинних, нерозчинних гідрогелевих полімерних ранових покриттів, полімерних плівок, гранул, порошків для потенційного використання у медицині.

Встановлено субстратне інгібування активності папаїну, трипсину і лужної протеази; для визначення якої рекомендовано використання 0,35-0,9 % розчину казеїну.

Шляхом невалентних і ковалентної взаємодій виділеної ПОХ з полімерними матрицями розроблено високоактивні стабільні біокаталізатори багаторазової дії окиснення фенольних полютантів.

Запропоновані QSAR/QSPR-моделі, що дозволяють прогнозувати ступінь і швидкість біоконверсії нових фенольних субстратів ПОХ.

На ряд іммобілізованих препаратів розроблено лабораторні регламенти, проекти АНД, досліджено офтальмотоксичність. Метод включення ПОХ в гідратцелюлозну мембрану апробований для кількісного видалення фенолів зі стічних вод ЗАТ «ТеплоСервіс».

Ключові слова: гідролітичні ферменти, пероксидаза хрону, альбуміни, алергени, іммобілізація, полімери, діагностичні і лікувальні засоби, біокаталізатори окиснення фенольних полютантів.

АННОТАЦИЯ

Романовская И.И. Биотехнологические аспекты создания иммобилизованных на полимерных носителях биологически активных белковых веществ. -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.20 -- биотехнология. Одесский национальный университет имени И.И. Мечникова МОНМС, Одесса, 2011.

Диссертация посвящена разработке биотехнологических подходов и методов стабилизации гидролитических и окислительно-восстановительного ферментов, белков, аллергенов путем их иммобилизации на полимерных носителях для создания перспективных препаратов для терапии ран и ожогов, заместительной терапии недостаточности пищеварения, диагностики и лечения аллергических заболеваний; биокатализаторов окисления фенольных поллютантов для их элиминирования.

Предложены принципы создания стабильных иммобилизованных БАВ пролонгированного действия для использования в медицине. Установлен механизм иммобилизации альбуминов, гидролитических ферментов с ПВС, получены ГЛП с иммобилизованными ЛФК, САЧ, соиммобилизованными папаином и мочевиной, полимерные пленки с аллергенами с количественным связыванием белка, увеличенной в 1,6 раз активностью папаина, пролонгированного действия, стабильные при хранении на протяжении 1-1,5 года.

Показано, что ГЛП с САЧ обладают высокой поглощающей способностью по отношению к кислотам и щелочам, что перспективно для сорбционной терапии ожогов глаз. Дозированный эффект (50-500 PNU) включения аллергенов (АБКЯ, АДП) в пленки ПВС предполагает разработку интраназального способа введения для диагностики и СИТ аллергических заболеваний. Проведенные медико-биологические испытания ГЛП с ЛФК, папаином и мочевиной показали перспективность их использования в терапии ожогов глаз.

Установлено, что метод нековалентной иммобилизации в ПВС, модифицированный бурой, позволяет получать препараты альбуминов, аллергенов с усилением пролонгирования, зависящим от концентрации модификатора. Разработаны иммобилизованные на марле (ЛФК), АУВМ (липазы) высокоактивные препараты, пролонгированного действия, стабильные в условиях содержимого раны, желудочного сока, при хранении, перспективные для терапии ран и ожогов, заместительной терапии недостаточности пищеварения.

Разработан способ иммобилизации БАВ в поли-N-винилпирролидон, модифицированный золем ПКК; получены потенциальные раневые нерастворимые гидрогелевые покрытия с иммобилизованными лизоцимом, щелочной протеазой и трипсином, с высокими выходами по активности (75,6-100 %), устойчивостью при хранении и г-стерилизации, пролонгированного действия (24 ч).

С использованием методов комплексообразования с ПВК и адсорбции аэросилом получены иммобилизованные препараты аллергенов с высоким связыванием белка и фенола ПВК, селективностью связывания белка аэросилом, стабильные при хранении, пролонгированного действия в средах, моделирующих рН желудка и кишечника, перспективные для разработки перорального способа введения в аллергологии.

Наличие протеолитической активности белковых фракций протеазы С как в кислой (рН 4,9), так и в щелочной (рН 8,9) средах позволило впервые на основе природного биогеля «Ламидан» получить текстильное покрытие с иммобилизованным ферментом, с высокой степенью сохранения протеолитической активности (95,9 %), пролонгированного действия, длительного срока хранения (1,5 года) для потенциального применения в терапии ран и ожогов.

На основании выявленного субстратного ингибирования активности папаина, трипсина и щелочной протеазы для ее определения рекомендовано использование 0,35 - 0,9 % раствора казеина.

Разработаны технологические схемы получения иммобилизованных препаратов литических (ЛФК), протеолитических (папаин, соиммобилизованный с мочевиной), разработаны проекты АНД на иммобилизованную щелочную протеазу и папаин, соиммобилизованный с мочевиной. Исследована офтальмотоксичность ГЛП с папаином и мочевиной,

По модифицированному методу Баха выделен частично очищенный препарат ПОХ; разработана технологическая схема его получения. Оптимизированы условия окисления ряда фенольных соединений, катализируемого частично очищенной ПОХ, определены степень конверсии, изучена кинетика окисления. Показано стабилизирующее действие ионов Са2+, Mn2+, полимеров и белка на активность ПОХ. Методами QSAR/QSPR анализа получены статистические модели, прогнозирующие степень и скорость биоконверсии новых фенольных субстратов ПОХ.

Иммобилизацией ПОХ в каррагинан, включения и ковалентного связывания с мембраной «Диацелл» получены биокатализаторы с высоким сохранением активности (88 - 100 %), стабильные при хранении, многоразового использования (каррагинан - до 7 раз, мембрана - до 22 раз) для окисления фенолов. Метод заключения ПОХ в гидратцеллюлозную мембрану успешно апробирован для количественного удаления фенолов на сточных водах ЗАО «ТеплоСервис».

Ключевые слова: гидролитические ферменты, пероксидаза хрена, альбумины, аллергены, иммобилизация, полимеры, диагностические и лекарственные средства, биокатализаторы окисления фенольных поллютантов.

SUMMARY

Romanovska I.I. Biotechnological aspects of immobilized on polymeric supports biologically active proteinaceous substances creation. -- Manuscript.

Dissertation submitted for a doctor's degree in biological sciences, speciality 03.00.20 -- biotechnology. The I.I. Mechnikov's Odessa's National University, Odessa, 2011.

In the dissertation are developed biotechnological approaches and methods of biologically active substances stabilization by immobilization on natural and synthetic polymeric supports, for creation of potential preparations for wounds and burns therapy, substitutive therapy of digestion deficiency, allergic diseases diagnostics, biocatalysts of phenolic pollutants oxidation for elimination from solutions and waste waters.

The principles of highly active, stable immobilized albumines, hydrolytic enzymes, allergens, of prolonged action due to noncovalent interactions with polymeric supports and their modified forms, shaped in woven, insoluble hydrogel polymeric wound dressings, polymeric films, beads and powders for potential usage in medicine, are proposed. Due to papain, trypsin and alkaline protease activity substrate inhibition, the 0,35 - 0,90 % casein solution usage recommended.

By the nonvalence and valency interactions of isolated horseradish peroxidase with polymeric matrices the highly active stable biocatalysts of repeated usage for phenolic pollutants oxidation are developed. The QSAR/QSPR-models, which allows to predict the level and rate of new phenolic horseradish peroxidase substrates bioconversion are proposed.

For the some of immobilized preparation the laboratory regulations and analytical normative documentation proposals are compiled; ophthalmotoxicity was studied. The horseradish peroxidase entrappment method in hydrate cellulose membrane was approved for quantitative phenols removal from the company «TeploService» waste waters.

Key words: hydrolytic enzymes, horseradish peroxidase, albumins, allergens, immobilization, polymers, diagnostic and medicinal means, biocatalysts of phenolic pollutants oxidation.

Размещено на Allbest.ru