Мікроорганізми як фактор гомеостазу техногенно порушених екосистем Верхнього Потисся

Стефурак Василь Петрович,

професор кафедри медичної біології і генетики

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук, професор,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України,

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Будь-яка екосистема під впливом зовнішніх факторів перебуває в змінному, динамічному стані, який зазвичай несуттєво відхиляється від певного стабільного, основного стану. Така відносна сталість екосистем зумовлена процесами саморегуляції, які і формують гомеостаз - механізм, що підтримує і забезпечує їх рівновагу. Гомеостаз реалізується в межах широкого діапазону зовнішніх впливів на складні системи. Проте на даний час все більше природних екосистем піддаються закритичним навантаженням, спричиненим, у першу чергу, виробничою діяльністю людини. Тому актуальною проблемою сьогодення є пошук ефективних засобів збереження та корегування гомеостазу за умов антропогенного тиску на екосистеми. Не менш актуальним є пошук ефективних засобів нівелювання впливу виведених із рівноваги екосистем на здоров'я людини. Обидві проблеми мають вирішуватися з врахуванням особливостей конкретної екосистеми, її стану та специфічності антропогенного впливу. При цьому слід застосовувати всі можливі інструменти і підходи, серед яких одним із найперспективніших є мікробіота техногенно порушених екосистем. Типовим для Верхнього Потисся (Закарпатська область, Україна) і регіону Берег (Угорщина) є критичне забруднення басейну ріки Тиса продуктами аварійних викидів гірничовидобувних підприємств Румунії і відходами діючих деревообробних підприємств (Ковальчук та ін., 2001). Подібні забруднення йонами важких металів (ВМ), ціанідами, радіонуклідами, пестицидами, фенолами, оксидами азоту, нітратами визначають сучасний стан багатьох екосистем (Голубець, 2000; Головатый, 2002; Ketcha Mbadcam et al., 2009), а головна небезпека для біосфери в цьому випадку зумовлена здатністю зазначених токсикантів до акумуляції в живих організмах (Гирис, Головатый, Позывайло, 2001). Мігруючи трофічними ланцюгами, забруднювальні речовини накопичуються і в організмі людини, що спричиняє порушення багатьох метаболічних процесів (Микроэлементозы…, 1991), чинить мутагенну, канцерогенну та ембріотоксичну дію (Длин, Османов, 1997), негативно впливає на імунний статус людського організму (Сердюк та ін., 2000). Визначальна роль мікроорганізмів у процесах формування і підтримки гомеостазу таких контамінованих полютантами екосистем відкриває можливість цілеспрямованого використання представників типової мікрофлори ґрунту, води, повітря, рослин у процесах їх відновлення. Наявні також переконливі свідчення перспективності застосування бактерій, особливо представників нормальної мікрофлори тварин і людини, для захисту організму від впливу шкідливих факторів забрудненого довкілля (Delia et al., 2002; Jandu et al., 2009). Інтенсивно вивчаються молекулярно-клітинні механізми, які лежать в основі взаємодій мікроорганізм-макроорганізм (Sherman, Ossa, Johnson-Henry, 2009). Більшість принципових екологічних і медико-біологічних питань такого плану у регіоні досліджень залишаються відкритими, що свідчить про актуальність вирішення типових проблем Верхнього Потисся шляхом розробки й використання бактеріальних препаратів, які сприяють регулюванню гомеостазу як порушених полютантами природних наземних і водних екосистем, так і організму людини та тварин. Такі дослідження становлять науковий і практичний інтерес для мікробіології, екології та імунології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана протягом 1994-2009 рр. у відповідності до затверджених тематичних планів наукових досліджень Ужгородського національного університету і, зокрема, кафедри мікробіології, вірусології та імунології з курсом інфекційних хвороб медичного факультету. В роботу ввійшли результати, одержані при виконанні держбюджетних, господарсько-договірних тем, вітчизняних і міжнародних науково-дослідних робіт (всього 14), де автор був відповідальним виконавцем (3 теми) або науковим керівником (11 тем та проектів): 1) 1994-1996 рр., “Дослідження характеру і механізмів дії штамів Bacillus subtilis, перспективних для створення бактеріальних препаратів на рослинні і тваринні організми”, номер державної реєстрації роботи 0194U038516; 2) 1997-1999 рр., “Розробка кормової добавки комбінованого призначення для ветеринарії шляхом селекції господарсько-цінних мікроорганізмів роду Bacillus”, номер державної реєстрації роботи 0198U003132; 3) 2000-2002 рр., “Конструювання бактеріальних біопротекторів і вивчення принципової можливості їх використання для очистки ґрунтів від різноманітних промислових забруднень”, номер державної реєстрації роботи 0100U005354; 4) 2000-2002 рр., “Вивчення впливу застосування деяких еубіотиків на стан тиреоїдно-гіпофізарної системи макроорганізму”, номер державної реєстрації роботи 0100V005360; 5) 2003-2005 рр., “Розробка нових комплексних екологічно безпечних систем для очистки стічних вод від хімічних та бактеріологічних забруднень”, номер державної реєстрації роботи 0103U001710; 6) 2006-2008 рр., “Бактерії-коменсали для профілактики і терапії нозокоміальної інфекції людини”, номер державної реєстрації роботи 0105U009079; 7) 2003-2004 рр., міжнародний білатеральний урядовий українсько-угорський проект “Вивчення мобілізації, акумуляції, поширення і біоремедіації важких металів у забруднених екосистемах верхнього басейну ріки Тиса”, номер державної реєстрації роботи 0103U007901; 8) 2005-2006 рр., українсько-угорський проект “Розробка системи моніторингових досліджень стану забруднення довкілля прикордонних територій регіону Берег”, PILOT, реєстраційний номер HU 2003/004-347-05-02-02; 9) 2004-2007 рр., господарський договір № 1-2004 “Організація виробництва і авторський контроль за напрацюванням біопрепарату “Моноспорин-ПК”, номер державної реєстрації роботи 0104U010121; 10) 2007 р., ДФФД “Взаємодія організму людини і бактерій - механізми регуляції мукозної імунної відповіді коменсалами слизових оболонок”, номер державної реєстрації роботи 0107U008933; 11) 2007-2008 рр., урядовий українсько-угорський проект “Нозокоміальні інфекції населення в українсько-угорських прикордонних територіях: сучасний стан і ефективні шляхи їх профілактики”, реєстраційний номер проекту 0107U007971 та інші.

Мета роботи. Метою досліджень є визначення основних закономірностей участі мікроорганізмів у забезпеченні гомеостазу техногенно порушених екосистем Верхнього Потисся і обґрунтування наукового підходу до створення бактеріальних препаратів вибіркової дії, призначених для вирішення типових екологічних задач територій, забруднених ВМ та органічними ксенобіотиками.

Основні завдання досліджень

1. Провести фізико-хімічний, біохімічний та бактеріологічний моніторинг стану трансформованих екосистем Закарпаття (Україна) та регіону Берег (Угорщина). Визначити динаміку рівнів забруднення ґрунтів і поверхневих вод ВМ та іншими токсикантами. З'ясувати характерні шляхи міграції і локалізації йонів ВМ в ланці “ґрунт - рослинна продукція - тваринна продукція”.

2. Вивчити основні закономірності змін бактеріальних ценозів притисянських екосистем, забруднених ВМ, ціанідами і фенолами. Ізолювати та ідентифікувати персистуючі in situ бактеріальні штами, найбільш адаптовані до зазначених полютантів; здійснити скринінг штамів, перспективних для біоіндикації і знешкодження негативного впливу солей ВМ, фенолів і ціанідів.

3. Вивчити резистентність відібраних бактерій до ряду полютантів та дослідити ефективність бактеріальної біодеструкції останніх. Запропонувати нові комплексні підходи і методи знешкодження типових для регіону досліджень забруднювальних речовин.

4. Провести бактеріологічне обстеження пацієнтів неінфекційних клінік в регіоні досліджень для з'ясування видового складу типових умовно-патогенних бактерій. Провести скринінг штамів нормальної мікрофлори кишечника людини і тварин, перспективних для конструювання альтернативних до антибіотиків бактеріальних препаратів, активних щодо ізольованих збудників опортуністичних інфекцій.

5. Науково обґрунтувати можливість використання відібраних бактеріальних культур як основи монокомпонентних і комплексних бактеріальних препаратів специфічної (спрямованої) дії. Дослідити вплив штаму Bacillus subtilis 090 - активної основи біопрепарату “Моноспорин-ПК” на функціональну активність гіпофізарно-тиреоїдної та імунної систем організму. Впровадити біопрепарат у ветеринарну практику та дати оцінку ефективності його профілактичного і терапевтичного застосування в виробничих умовах.

6. Дослідити клітинно-молекулярні механізми імуномодуляторної активності вибраних представників нормальної і коменсальної мікрофлори господаря, запропонованих для розробки нових бактеріальних препаратів; визначити їх роль у виникненні, розвитку, забезпеченні та регуляції локальної (в назальній та кишковій асоційованих лімфоїдних тканинах) імунної відповіді макроорганізму (вродженої і набутої, загальної і специфічної, гуморальної і клітинної).

7. Обґрунтувати концептуальні критерії доцільності та меж застосування бактеріальних індикаторів і протекторів.

Об'єкт дослідження - процеси формування гомеостазу і механізми функціонування складних систем за умови їх техногенного забруднення.

Предмет дослідження - закономірності участі мікробіоти ґрунту і води у процесах підтримки гомеостазу техногенно порушених екосистем; можливість використання представників нормальної мікрофлори організму людини і тварин для створення біопрепаратів вибіркової дії.

Методи дослідження - фізико-хімічні, біохімічні, бактеріологічні, мікробіологічні, молекулярно-біологічні, імунологічні, електронно-мікроскопічні, статистичні; загальновизнані, а також запропоновані нами методи і моделі. екосистема гомеостаз препарат ксенобіотик

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено тривалий фізико-хімічний, біохімічний та бактеріологічний моніторинг стану ґрунтів і водного басейну верхів'я ріки Тиса, включаючи регіон Берег (Угорщина). Показано, що для даних екосистем, забруднених аварійними викидами гірничорудних підприємств Румунії, характерною особливістю є інтенсивна міграція йонів ВМ в ланці “ґрунт - рослинна продукція - тваринна продукція” з максимальними рівнями їх акумуляції в локалітетах, віддалених від джерела забруднення. Визначено транслокаційні коефіцієнти і коефіцієнти переходу міді і свинцю з ґрунтів у корми і потім у молоко корів різних районів Закарпаття; досліджено рівні накопичення йонів ВМ та їх локалізацію у тканинах вищих рослин. Встановлено, що між рівнем інвертазної і дегідрогеназної активностей ґрунтів регіону і валовим вмістом цинку, міді, свинцю, марганцю у них існує обернено пропорційний кореляційний зв'язок. Показано, що основні тенденції впливу токсичних йонів ВМ на мікробні угруповання ґрунтів і води притисянських територій України та Угорщини полягають у повному пригніченні мікроорганізмів одразу після забруднення і поступовому, але неповному відновленні їхнього складу та зростанні відносної кількості умовно-патогенних бактерій (УПБ) в новосформованих ценозах.

Досліджено стійкість мікроорганізмів до типових для досліджуваного регіону полютантів: йонів ВМ, ціанідів і фенолів. Вперше запропоновано використовувати Acinetobacter spp. як біоіндикатор поліелементного забруднення ґрунтів йонами ВМ, сапрофітні бактерії роду Klebsiella - для деструкції тіоціанатів, а штам AF01 (ІМВ В-7102) Aeromonas hydrophila - для очистки промислових стічних вод від фенолів. З останнього штаму виділено плазмідну ДНК, побудовано її фізичну карту і визначено фрагмент, який може відповідати за резистентність і здатність штаму до утилізації фенолу.

На клітинно-молекулярному рівні показано, що коменсальна мікрофлора макроорганізму відіграє визначальну і специфічну роль у виникненні, розвитку, підтриманні та регулюванні локальної імунної відповіді (вродженої і набутої, загальної і специфічної, гуморальної і клітинної), зокрема: 1. Обґрунтовано і запропоновано нову модель для відтворення гемофільної інфекції шляхом оральної інокуляції стерильних та звичайних scid мишей мутантними за наявністю/відсутністю фосфорилхоліну штамами Haemophilus influenzae. На даній моделі вперше показано як можливість специфічної активації В1 клітин через їх В клітинний рецептор (BCR) Т-незалежним антигеном типу 1 - бактеріальним фосфорилхоліном (ФХ) H. influenzae, так і здатність цих клітин до місцевого (в назально-асоційованій лімфоїдній тканині, НАЛТ) утворення специфічного IgAs. На класичній моделі продемонстровано слабку специфічність локальної імунної відповіді (в кишково-асоційованій лімфоїдній тканині, КАЛТ) до 1-6 a-декстрану L. salivarius ASF 361. 2. Досліджено нові клітинні і гуморальні механізми залежності проникності слизових оболонок організму від структурних особливостей бактерій-коменсалів, а саме: а) визначено участь секреторного IgAs та Reg III b/g (КАЛТ) і SP-D (НАЛТ) у підтриманні гомеостазу слизових поверхонь шляхом регулювання запальних процесів, які індукуються специфічно; б) доведено, що до клітин, які приймають участь у захисті слизових оболонок організму господаря, належать інтраепітеліальні нормальні кілери (НК) кишечника (особливо тонкого) та бронхо-легеневі і альвеолярні макрофаги (їх кількість збільшується при комбінованих імунодефіцитних станах та у випадку дефіциту імуноглобуліну А); в) встановлено відмінності у продукції цитокінів та експресії регуляторних генів дендритними клітинами (ДК) периферійної крові людини внаслідок їх активації in vitro різними бактеріальними антигенами;

г) вивчено специфічну локальну гуморальну імунну відповідь організму на дію деяких коменсальних бактерій та їх антигенів, у тому числі Т-залежних (ТЗ), Т-незалежних типу 1 і Т-незалежних типу 2 (ТН-1 і ТН-2); д) відібрано бактеріальні штами та їх антигени, що є найбільш перспективними для конструювання біопрепаратів і оральних таргетних вакцин.

Обґрунтовано нові можливості застосування створеного нами біопрепарату “Моноспорин-ПК” для корекції функціональної активності щитовидної залози лабораторних і сільськогосподарських тварин за гіпотиреоїдних умов.

Визначено, що серед УПБ, які циркулюють в обстежених відділеннях обласної клінічної лікарні (ОКЛ) регіону досліджень, домінують метицилін-резистентні Staphylococcus aureus (MRSA), S. aureus, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter cloaceae, Acinetobacter baumannii і Pseudomonas aeruginosa. З представників нормальної (Lactobacillus, Escherichia, Morganella, Enterococcus) і транзиторної (Bacillus) мікрофлори кишечника людини і тварин відібрано перспективні штами для конструювання на їх основі монокомпонентних і комплексних біопрепаратів для профілактики і терапії опортуністичних інфекцій, збудниками яких є означені патогени. У відібраних штамів бацил, лактобацил і ентерококів виявлено селективну антибактеріальну активність щодо ізольованих клінічних культур K. oxytoca, E. cloaceae, S. aureus і A. baumannii. Розвинута в роботі концепція обмеженого й вибіркового використання біопрепаратів дозволяє корегувати розробку загальних підходів до моніторингу екосистем та альтернативних до антибіотикотерапії методів профілактичної медицини.

Практичне значення отриманих результатів. У результаті проведеної роботи запропоновано і застосовано бактеріальні індикатори, деструктори і протектори для вирішення типових екологічних задач забруднених йонами ВМ, ціанідами і фенолами екосистем, зокрема заплавних екосистем Верхнього Потисся.

Розроблено новий, адаптований до місцевих умов комплексний метод очистки промислових стічних вод від фенолу з використанням виділеного нами штаму AF01 (ІМВ В-7102) A. hydrophila та цеолітової (клиноптилолітової) матриці.

Створений нами біопрепарат “Моноспорин-ПК” зареєстровано в Державному науково-дослідному контрольному інституті ветеринарних препаратів і кормових добавок України. Налагоджено серійне виробництво даного біопрепарату і впроваджено його у ветеринарну практику (АР Крим, Україна). Доведено економічну доцільність застосування “Моноспорину-ПК” при вирощуванні молодняку сільськогосподарських тварин і птиці для одержання ветеринарної продукції, що не містить антибіотиків. Запропоновано і апробовано схему його призначення у поєднанні з традиційними і обов'язковими щепленнями супроти вірусних інфекцій.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу сплановано і виконано автором особисто. Здобувач - одноосібний автор центрального положення дисертації про ключову роль мікробіоти у забезпеченні гомеостазу техногенно порушених екосистем Верхнього Потисся. Автором науково обґрунтовано новий підхід до конструювання і впровадження бактеріальних препаратів вибіркової дії, призначених для вирішення типових екологічних задач зазначених екосистем. Автором особисто виконано аналіз фахової літератури, отримано і інтерпретовано результати досліджень, здійснено їх статистичну обробку, написано і оформлено роботу, сформульовано висновки, підготовлено наукові статті до друку. Планування екологічних напрямів роботи та узагальнення одержаних результатів здійснено за участю наукового консультанта д.б.н., проф. В. П. Стефурака. Частину роботи, пов'язану з фундаментальними дослідженнями особливостей імунної відповіді слизових оболонок організму на їх експериментальну колонізацію обраними бактеріями-коменсалами автором виконано особисто в Університеті Пенсільванії (США) за консультативної допомоги проф. Дж. Сібри , за що автор йому глибоко вдячна. На стерильних, гнотобіонтних, трансгенних, нокаутних і реконституйованих мишах автор самостійно з'ясувала головні молекулярно-клітинні механізми, що визначають імуномодуляторну дію бактерій-коменсалів та лежать в основі складних процесів їхньої взаємодії із слизовими оболонками організму.

Роботи по моніторингу довкілля проведено сумісно з к.б.н. А. В. Колесник і к.б.н. О. Б. Колесник (біологічний факультет УжНУ), І. І. Чонкою (хімічний факультет УжНУ), к.б.н. Н. Д. Романюк (кафедра фізіології та екології рослин Львівського національного університету ім. Івана Франка, к.б.н. В. І. Козловським (відділ екосистемології Інституту екології Карпат НАНУ) та проф. Ш. Балажі (Інститут Біології, Угорщина). Сумісно з старшим викладачем І. І. Чонкою ізольовано, іденти-

фіковано, вивчено біологічні властивості та депоновано штам A. hydrophila. Виділення плазміди

A. hydrophila, її рестрикційний аналіз та побудову фізичної карти здійснено сумісно з групою проф.

В. О. Федоренко (кафедра генетики та біотехнології Львівського національного університету ім. Івана Франка) та член-кор. НАНУ Б. П. Мацелюхом (відділ генетики мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАНУ). Профіль секретованих цитокінів та зростання рівнів експресії регуляторних генів ДК, одержаних із моноцитів периферійної крові людини і активованих in vitro шляхом їх експозиції з антигенами відібраних коменсальних бактерій, визначено сумісно з проф. Є. Райноволгій в Інституті імунології Університету Дебрецену (Угорщина). Дослідження спектрів циркулюючих умовно-патогенних бактерій в тестованих клінічних відділеннях виконані сумісно з старшим викладачем А. Кульою, доктором Ю. Сабо та проф. І. Калапошем із університету Дебрецену (Угорщина). Отримані результати обговорені та опубліковані у спільних працях.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи викладено на ІІ(ІХ)-ІІІ(Х) та ХІІ з'їздах товариства мікробіологів України (Чернігів, 2000; Одеса, 2004; Ужгород, 2009); міжнародній конференції “Environmental microbiology” (Ніредьгаза-Нансі, 1996, Угорщина-Франція); міжнародному регіональному семінарі “Environment Protection: Modern Studies in Ecology and Microbiology” (Ужгород, 1997); міжнародному конгресі “Role of flora and microflora in the management of the industrial pollutions” (Ніредьгаза-Нансі, 1998, Угорщина); циклі тематичних симпозіумів “Pathways and Consequences of the Dissemination of pollutants in the biosphere” (Прага, Чеська Республіка, 1998, 1999; Ніредьгаза, 2000, Угорщина); 13-му Міжнародному конгресі Угорського товариства мікробіологів (Будапешт, 1999, Угорщина); міжнародній конференції “The Prospect of Probiotics in prevention and therapy of Diseases of Young” (Високі Татри, 2000, Словацька Республіка); міжнародній нараді “Practical Solution for Managing Optimum C and N in Agricultural Soils” (Прага, 2001, Чеська Республіка); міжнародній науково-практичній школі для молодих вчених і спеціалістів “Natural Ecosystems of the Carpathian Mountains under Conditions of Intensive Anthropogenic Impact” (Ужгород, 2001); міжнародній науковій конференції “Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів” (Одеса, 2001); 9-му симпозіумі фітологів “Heavy Metals and Plants: from ecosystems to biomolecules” (Філадельфія, 2002, США); щорічних 30, 31 і 32 Середньо-Атлантичних імунологічних з'їздах (Вест Вірджинія, 2002; Меріленд, 2003; Нью-Джерсі, 2004; США); 12-му Всесвітньому конгресі імунологів і конференції FOCIS (Монреаль, 2004, Канада); на 1-му Центральноєвропейському форумі з мікробіології (Будапешт, 2005, Угорщина); щорічній Міжнародній науковій конференції “microCAD” (Мішкольц, 2006, 2007, 2008, 2009, Угорщина); міжнародній конференції Американської асоціації імунологів (Бостон, 2006, США); 7-й імуно-

логічній конференції (EFFIS, Високі Татри, 2006, Словацька Республіка); міжнародній науковій конференції “Мікробні біотехнології” (Одеса, 2006); 87-й міжнародній конференції наукових працівників із захворювань тварин (CRWAD, Чикаго, 2006, США); 13-му міжнародному конгресі з мукозної імунології (Токіо, 2007, Японія); міжнародному симпозіумі гастроентерологічних захворювань (Сеул, 2007, Корея); конгресі “Анаероби” (Каліфорнія, 2008, США); 13-му міжнародному конгресі інфекційних захворювань (Куала Лумпур, 2008, Малайзія); 3-й міжнародній конференції “Probiotics for the 3rd Millennium” (Високі Татри, 2008, Словацька Республіка); щорічних наукових конференціях професорсько-викладацького колективу УжНУ.

Публікації. Результати дисертації опубліковані у 130 наукових роботах, з яких 1 монографія (українською і угорською), 2 глави в книгах (англійською), 67 статей, у тому числі 24 - у періодичних вітчизняних і закордонних журналах і наукових збірниках, 32 - у наукових вісниках університетів, 11 статей у наукових збірниках конференцій і 3 роботи в науково-практичних журналах, 53 - тез, опублікованих за матеріалами конференцій, 3 - патенти.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, розділу матеріалів та методів досліджень, шести розділів результатів власних досліджень, висновків та списку використаних джерел (567 найменувань, з них 326 латиницею). Дисертація викладена на 333 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстративний матеріал подано у 48 таблицях та 131 рисунку.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

В огляді літератури проаналізовано принципи і методичні підходи до моніторингу техногенно забруднених екосистем, описано типові для регіону досліджень джерела забруднення та їх вплив на здоров'я людини. Обговорено ефективність використання мікроорганізмів і рослин в процесах біо- і фіторемедіації порушених екосистем. Детально висвітлено механізми взаємодії нормальної мікрофлори з організмом господаря. На основі проведеного аналізу участі мікроорганізмів у процесах забезпечення і корекції гомеостазу порушених екосистем обґрунтовано актуальність, мету і задачі досліджень.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Моніторинг здійснювали на 13-ти відокремлених модельних локалітетах найбільш трансформованих дією ВМ екосистем Верхнього Потисся, порівнюючи їх з фоновими ділянками Рахівського і Міжгірського районів, що не зазнавали забруднень. У ході роботи проаналізовано понад 1500 проб ґрунтів, води, повітря, рослин; ізольовано і вивчено більш як 1000 бактеріальних штамів. В пробах ґрунтів загальноприйнятими методами визначали ємність катіонного обміну, кількість аморфних гідроксидів Fe+Al, гумусу та актуальну кислотність. Валовий вміст ВМ в пробах ґрунтів і рослин знаходили методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії (Гелетюк, Золотарева, 1978; Методические рекомендации…, 1981). Концентрацію міді та свинцю у пробах молока визначали полярографічно (Сырье…, 1986). Для оцінки рівнів забруднення відібраних проб води використовували: 1) показник хімічного споживання кисню - ХСК (вимірювали за КНД 211.1.4.023-95); 2) показник біохімічного споживання кисню - БСК (КНД 211.1.4.024-95; 3) вміст сульфат-йонів (КНД 211.1.4.026-95); 4) концентрацію йонів амонію (КНД 211.1.4.030-95); 5) вміст загального заліза (КНД 211.1.4.034-95); 6) концентрацію йонів К+, Na+, Mg2+, Ca2+, Cl-, CO32-, HCO32, Fe2+, Fe3+, NH4+ (Руководство…, 1995); 7) концентрацію ацетат-йонів СООН- (Гомонай та ін., 1997); 8) вміст летких фенолів (КНД 211.1.4.036-95). Концентрацію сірководню у пробах води знаходили фотометрично, локалізацію ВМ у рослинних тканинах - гістохімічно за (Серегин, Иванов, 1997). Ботанічні описи модельних локалітетів проводили згідно (Гербарное дело…, 1995), видову належність рослин встановлювали у відповідності до (Jбvorka, Csapody, 1975). Рослинні угруповання характеризували у формі, що передбачає подальшу математичну обробку первинних даних (Вальтер, 1982). Оцінку різниці вмісту ВМ в рослинному покриві досліджуваних ділянок виконували за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA). Біохімічні властивості ґрунтів притисянських заплавних екосистем характеризували за рівнями їх дегідрогеназної (Галстян, 1974) та інвертазної (Купревич, Щербакова, 1966) активностей. Виділення мікроорганізмів із різних джерел здійснювали загальноприйнятими в мікробіології методами з використанням селективних і хромогенних поживних середовищ виробництва Oxoid, Difco, bioMerieux. Ізольовані штами мікроорганізмів ідентифікували за їх біохімічними властивостями, застосовуючи класичні методи і схеми (Энтеробактерии, 1985; Инструкция..., 1999; Определитель…, 1997) у поєднанні з новітніми діагностичними автоматизованими і автоматичними тест-системами API-test 20E, 32E, 50 CHB/E, 20 NE, NH, Staph, Strep, NE і VITEK2 (Microbiological…, 1995; Robinson, Mccarter, Tetreault, 1995). За необхідності результати ідентифікації бактерій уточнювали методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР, Коваленко, Бурьяновский, Подгорский, 1996). Генетичну зумовленість стійкості виділених штамів до тих чи інших забруднень досліджували, аналізуючи ізольовані плазмідні ДНК методом лужного лізису (Лук'янчук та ін., 2000) з використанням відповідних рестриктаз. Нативну плазмідну ДНК виділяли шляхом горизонтального гель-електрофорезу. Функціональність досліджуваних плазмід вивчали, застосовуючи метод їхньої трансформації (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984). Генетичну спорідненість клінічних ізолятів встановлювали за допомогою праймерів генів резистентності до ванкоміцину (vanA, vanB, vanC, vanD, vanE) і наявності ESBL-генів у грамнегативних представників (SHV, TEM, CTX) за (Antimicrobial…, 2006; Calbo et al., 2006) та методу гель-електрофорезу в градієнті пульсуючого поля (PFGE) для грампозитивних бактерій за (Schwartz, Cantor, 1984). Виділені та ідентифіковані штами досліджували на їх чутливість

до антибіотиків дифузним методом за Бауер-Кірбі (Критерии…, 1984; Antimicrobial…, 2006) з використанням дисків виробництва фірм BioRad та OXOID у автоматичному режимі їх нанесення. Стійкість бактерій роду Rhizobium spp. до йонів ВМ досліджували in vitro, вносячи мікроорганізми у титрах 2·107 КУО/мл в живильні середовища з різними концентраціями CuSO4, Ni(NO3)2·6H2O, Co(NO3)2·6H2O, Sr(NO3)2, CsNO3 і визначаючи в динаміці кількість життєздатних клітин (КУО/мл) шляхом періодичного висіву їх десятикратних розведень на гороховий агар. Деструкційний потенціал клебсієл стосовно тіоціанатів оцінювали колориметрично (Лурье, Рыбникова, 1974; Мазор, 1986); здатність ізольованого in situ штаму A. hydrophila утилізувати феноли визначали фотометрично (Методика…, 2001; КНД 211.1.4.036-95). При розробці способу комплексної очистки промислових стічних вод із використанням зазначеного штаму A. hydrophila та природного цеоліту - клиноптилоліту різних фракцій - перевіряли різні моделі очистки води і визначали: 1) адсорбційну здатність клиноптилоліту за (Староста, Єршов, Бблог, 2000) до йонів SO42-, К+, Na+, Mg2+, Ca2+,

Cl-, CO32-, HCO32-, Fe2+, Fe3+, NH4+; ацетат-йонів СООН, Н2S та летких фенолів; 2) загальні мікробіологічні показники відібраних проб води, зокрема загальне мікробне число (ЗМЧ), колі-титр і, відповідно, колі-індекс (Яцык, 1997). При цьому проводили кількісний та якісний облік умовно-патогенних аеробних мікроорганізмів (Topley…, 1990; Microbiological…, 1995; Manual…, 1995).

Клітинно-молекулярні механізми імуномодуляторної активності бактерій-коменсалів слизових оболонок вивчали на експериментальних моделях, а саме на звичайних (ЗВЧ), вільних від бактерій (БМ), антиген-вільних (АВ) та гнотобіонтних (моно-, ди- чи поліасоційованих) лінійних мишах однакових і різних алотипів (BALB/c, ВСА, С57BL, С.В-17, В6), комбіновано-імунодефіцитних (scid), нокаутних (за продукцією IgA) та селективних із генетично-індукованою специфічністю Т-клітин (DO11.10). Тварин утримували у відокремлених Трекслер ізоляторах. Для з'ясування ролі різних субпопуляцій В і Т клітин у забезпеченні специфічної імунної відповіді щодо ТН-1 і ТН-2 бактеріальних антигенів (фосфорилхоліну H. influenzae і (1-6)-a-декстрану L. acidophilus ASF 360 та L. salivarius ASF 361) використовували трансферну перехресну модель (Kushnir et al., 2001) і розроблену нами модель гемофільної інфекції (Boyko et al., 2004). Мутантні штами ФХ+ H512 та ФХ- Н445 H. influenzae, а також згадані вже штами лактобацил використовували для попередньої колонізації реконституйованих мишей.

Клітинну складову локальної імунної відповіді визначали в назально- та кишково-асоційованих тканинах (відповідно НАЛТ і КАЛТ) шляхом кількісного аналізу і фенотипової характеристики субпопуляцій локалізованих в них імунних клітин (В1, B2, Т, НК і ДК) та рівню їх активації за допомогою відповідних маркерів (кластерів диференціації, CD: FITC, PE, Cy, APC, CrP кон'юговані anti-CD45, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD45RB, anti-CD69, anti-CD44, anti-CD19, anti-B220, anti-Asialo-GM1, anti-NK1.1, anti-IgA, anti-IgG2a, anti-IgG2b, anti-CD62, anti-CD69, anti-CD80, anti-CD86, anti-CD40, anti-CD11c, anti-PNA, anti-kappa, Pharmingen) та методу флуоресцентно-активованого сортування клітин на FACScan (BD Bioscience, Mountain Wiev, CA) з використанням для аналізу програмного забезпечення CellQuest. Якісне виявлення специфічних антитіл до певного бактеріального антигену в сироватці крові та супернатанті фрагментів тканин (Jiang et al., 2004) проводили з використанням Вестерн блоту (Sethi, Murphy, 2001). Рівень загальних та специфічних антитіл визначали методами радіоімунного аналізу (Thurnheer et al., 2003) та ELISPOTу (Kushnir et al., 2001). Профіль цитокінів, продукованих ДК (TNF-a, IL-10, IL-6, IL-8, IL-12, 1L-1b, IL-23) внаслідок їх активації шляхом часово-залежної експозиції з відібраними бактеріями-коменсалами, визначали методом ELISA. Лінію ДК людини одержували методом (Thomas, Davis, Lipsky, 1993). Виявлення продукції IFN-? інтраепітеліальними нормальними кілерами (ІЕ НК) внаслідок їх активації шляхом бактеріальної колонізації мишей здійснювали методом імуногістохімії (Keilbaugh et al., 2005). Зміни рівнів експресії аутокринного фактору Reg III b/g в різних відділах кишечника мишей, поверхневого білка SP-D в легенях і NOD1, NOD2, Nalp1, Nalp3, caspase-1, 5 ДК людини знаходили за допомогою qRT-PCR (Freeman, Walker, Vrana, 1999; Keilbaugh et al., 2005; Boyko et al., 2007).

В експериментах використовували таких представників нормальної мікрофлори: 1) вибрану флору Шедлера (Altered Schaedler flora, ASF), що включає 8 видів бактерій, а саме 2 штами лактобацил L. acidophilus (ASF 360) і L. salivarius (ASF 361), 2 аеротолерантні анаероби Bacteroides distasonis (ASF 519) і Spirochete - подібний штам (ASF 457) та 4 надчутливі до кисню (Extremely Oxygen Sensitive, EOS) фузіформні бактерії (Fusiform) ASF 356, 492, 500 і 502, які орієнтовно відносяться до групи Clostridium типу Firmicutes (із колекції Taconic, США); 2) потенційні стимулятори імунної відповіді слизових оболонок, а саме Schaedler's E. coli і M. morganii; 3) виділені нами ізоляти кишечника людини і тварин, а саме E. coli 058 (ДНКІБіШМ, 467), L. salivarius NVw (ІМВ В-7264), L. acidophilus 0-08 (ІМВ В-7265), M. morganii 1/7 (ДНКІБіШМ, 470), Enterococcus faecalis M4 II 1 (ІМВ В-7261), Bacillus subtilis B-8130 (ДНКІБіШМ, 468) і 09/7/9 BP (ІМВ В-7262). Штам 090 B. subtilis використовували як основу біопрепарату “Моноспорин-ПК”. Тест-культурами слугували штами MRSA і S. aureus, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli та Proteus mirabilis, одержані від пацієнтів різних відділень неінфекційних лікарень в регіоні досліджень і виділені від інфікованих поросят та курчат. Міжмікробні взаємовідносини штамів, перспективних для конструювання біопрепаратів вибіркової дії, та їх антибактеріальну активність щодо УПБ визначали загальноприйнятими методами.

Розроблений нами у двох лікарських формах біопрепарат “Моноспорин-ПК” використовували для вирощування птиці і поросят без призначення антибіотиків на птахофермах “Южная Холдінг”, “Птахівник” Автономної Республіки Крим та свинофермах “Агропромислова Компанія” і “Фрідом Фарм Інтернешнл”. Економічну ефективність від впровадження даного біопрепарату знаходили шляхом обліку виробничих витрат на утримання тварин, їх схоронності, приросту ваги і кінцевого виходу продукції.

Для з'ясування механізмів дії біопрепарату визначали біохімічні та імунологічні показники сироватки крові курчат і телят, проводили гістологічні дослідження внутрішніх органів поросят (світлова і електронна мікроскопія). Корегуючий вплив Моноспорину-ПК на функціональну активність щитовидної залози та імунний статус організму вивчали за умов експериментального гіпотиреозу у лабораторних тварин (щурів, кролів і морських свинок) і природної йодної недостатності у курчат, телят і поросят за рівнями тиреотропних гормонів (Т3, Т4, ТТГ) та титрами загальних антитіл (IgA, IgG, IgM) методом імуноферментного аналізу (ІФА).

Математичну обробку всіх одержаних експериментальних даних здійснювали методами варіаційної статистики, регресійного, кластерного і кореляційного аналізів (Боровиков, 2001) з використанням комп'ютерних програм STATISTICA (StatSoft, Inc.) версії 6 і Origin (OriginLab Corporation) версій 6-8.

РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ МОНІТОРИНГУ ТРАНСФОРМОВАНИХ ЕКОСИСТЕМ РЕГІОНУ ДОСЛІДЖЕНЬ: РОЗПОДІЛ ТИПОВИХ ПОЛЮТАНТІВ У ҐРУНТІ ТА ВОДІ

У заплавних едафотопах Закарпаття одразу після аварій на гірничорудних підприємствах Румунії (березень, 2000 рік) спостерігали зростання вмісту Zn, Pb, Cu та Mn до рівнів, які в рази і, навіть, на порядки перевищували гранично допустимі концентрації (ГДК) і концентрації в фонових точках (ФК) (рис. 1). Найбільші рівні Zn та Pb (з перевищенням ГДК в 23 і 7 разів відповідно) були зареєстровані у Тячівському та Хустському районах. В цілому протягом періоду досліджень (2000-2004 рр.) у цих гірських районах валовий вміст ВМ помітно зменшувався. Виняток становив Zn, підвищений рівень якого спостерігали навіть у фонових точках. Для Pb зазначена тенденція поступового зменшення концентрацій зберігалася в 2001-2002 рр., але у 2003 р. мало місце суттєве підвищення концентрації свинцю, хоч і в межах ГДК, яка в подальшому знову зменшувалась. У 2004 р. найвищі значення валового вмісту Pb реєстрували у Виноградівському районі з перевищенням, наприклад в с. Вілок, показників ГДК і ФК відповідно у 5,6 та 15 разів. Про значне поширення ВМ свідчило їх виявлення у підвищених кількостях протягом тривалого часу і у Виноградівському районі, який є низинним і найбільш віддаленим від джерел забруднення. Перевищення вмісту Cu спостерігали одразу після забруднення в Тячівському та Виноградівському районах, де концентрація сполук даного елементу в 2000 р. у 1,3 рази перевищувала ГДК і у 2-3 рази ФК. У ґрунтах Хустського району в цей час теж реєстрували збільшення вмісту Cu, однак в межах ГДК і на рівні ФК. В 2001 р. на ряді ділянок Хустського та Виноградівського районів фіксували збільшення вмісту Cu (до 40,0±1,8 і 71,0±2,2 мг/кг відповідно), тоді як у ґрунтах заплав Тячівського району кількість цього елементу вдвічі зменшилася. У 2002-2004 рр. рівень Cu у ґрунтах заплав всіх досліджуваних районів відповідав фоновим показникам. Валовий вміст Mn в досліджуваних заплавних едафотопах одразу після техногенного забруднення і паводків у 2000 р. перевищував ГДК від 2 до 3,4 разів у Тячівському та Хустському районах. Однак вже восени того ж року вміст Mn відповідав ГДК і ФК. Протягом подальшого періоду спостережень рівень даного елементу у ґрунтах коливався незначною мірою (від 191,0±6,2 до 867,0±55,4 мг/кг). Загалом була відмічена тенденція до швидкого наближення валової кількості Mn у верхньому профілі педосфери до рівня фонових показників.

Здійснений нами чотирирічний моніторинг виявив вкрай незначну кореляцію між значеннями актуальної кислотності обстежуваних ґрунтів і валовою кількістю Pb, Cu і Zn та її повну відсутність для Mn. Рівень їх накопичення у верхньому шарі педосфери залежав від гранулометричного складу ґрунту та вмісту у ньому гумусних речовин. Очевидно, що за низького вмісту гумусу (С=0,93%), відносно легкого механічного складу ґрунту (легкий або середній суглинок) переважали розчинні сполуки ВМ, які здатні включатися у біогенний обіг речовин.

Хімічний аналіз проб води р. Тиса, відібраних на території України одразу після аварії, також продемонстрував перевищення вмісту йонів міді, свинцю, цинку, марганцю та присутність ціанідів і наднормові концентрації заліза (ІІ і ІІІ). Немонотонний характер змін реєстрованих перевищень ГДК ВМ протягом 2000-2005 рр. свідчить про систематичне забруднення води відходами гірничорудних підприємств Румунії. Хімічне обстеження проб води р. Тиса і її найбільш забруднених приток на території Угорщини, проведене нами протягом 2002-2004 рр., виявило ще більш значне перманентне перевищення ГДК ВМ. Найбільшим вмістом міді характеризувались проби, відібрані поблизу смт Ченгер і смт Домбрад (перевищення ГДК у 25 і 9,5 разів відповідно), за вміс-том свинцю - смт Ченгер і смт Домбрад (відповідно 10 і 4 разів), за кількістю цинку - смт Ченгер, смт Вашарошномень і смт Домбрад (відповідно 55, 45 і 35 разів). У всіх пробах виявляли йони нікелю і кадмію, однак їх перевищення ГДК не реєстрували.

Результати проведеного нами хімічного аналізу стічних вод Перечинського лісохімкомбінату показали перевищення допустимих норм вмісту у них сульфат-йонів у 1,8 рази, йонів амонію - більше 3 разів, ацетат-йонів - 157,5 разів, фенолів - 60 разів, відмічали також вільне виділення сірководню і наявність осаду сульфідів. Концентрація йонів хлору та вміст заліза загального не перевищували нормативних показників якості поверхневих вод, однак за вмістом сірководню, фенолу, йонів К+, Na+, Ca2+, Mg2+, NH4+, SO42-, CH3COO- і рівнем ХСК ці стічні води відносили до 6 класу забрудненості (дуже брудна вода), а за загальноприйнятою мікробіологічною класифікацією належали до полісапробної зони. Їх колі-титр перевищував гранично допустиму норму на кілька порядків (0,003-0,007 мл). Високий рівень небезпеки цих вод для довкілля висунув задачу розробки адекватного способу їх очистки.

РОЗДІЛ 4. ОСНОВНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ЗМІН МІКРОБІОТИ ТЕХНОГЕННО ПОРУШЕНИХ ЕКОСИСТЕМ

Мікробні ценози притисянських заплавних екосистем, забруднених ВМ. Мікробні ценози вважаються одним із найбільш репрезентативних та достовірних показників стану ґрунтів. Нами протягом 2000-2004 рр. проведено якісну та кількісну оцінку мікробних ценозів притисянських едафотопів, за допомогою якої виявлено значні, зумовлені впливом ВМ, порушення видового та чисельного складу бактеріальних угруповань.

Результати бактеріологічного обстеження Тиси та Самошу. Поліелементне забруднення р. Тиса йонами ВМ призвело до порушення кількісного і якісного складу типової мікрофлори води. Зокрема, перевищення ГДК солей свинцю, заліза, міді, цинку, марганцю і ціанідів одразу після аварійного забруднення зумовило зміни співвідношення домінуючих видів. Кількість бактерій родів Proteus, Escherichia, Klebsiella, Micrococcus, Bacillus становила 100-105 KУО/мл; представників роду Pseudomonas - 106 КУО/мл; Cyanobacteria виявляли лише у контрольних пробах та пробах з низьким вмістом ВМ і за відсутності ціанідів. Не виявлено присутності Aspergillus, Penicillium, Mucor. Аналіз мікрофлори р. Тиса, проведений у квітні 2000 р., дозволив визначити ступінь відновлення гомеостазу водної мікробіоти через місяць після забруднення. Було показано, що загальна кількість мікроорганізмів зросла за рахунок представників таких груп бактерій (КУО/мл): K. pneumoniae (aerogenes) - до 104-105, Proteus vulgaris - 102-103, Micrococcus luteus - 104-105, Pseudomonas putida - 105, Bacillus subtilis - 105, Serratia spp. та Sarcina spp. - близько 101, Penicillium spp. - 100. Відмічено також наявність P. fluorescens, P. mirabilis, B. megaterium, B. brevis, Alcaligenes denitrificans, що може бути зумовлено поповненням водної мікрофлори ґрунтовими бактеріями внаслідок численних паводків.