Мікроорганізми як фактор гомеостазу техногенно порушених екосистем Верхнього Потисся

Забруднені води не відповідали нормативним показникам колі-титру (100-120 мл) і, відповідно, колі-індексу (8-9). В цілому, за результатами мікробіологічного аналізу вод р. Тиса після її техногенного забруднення ВМ встановлено, що гомеостаз річкової мікрофлори має тенденцію до відновлення до рівня фонових показників протягом одного місяця. Відносно швидка здатність річок до самоочищення зумовлена насамперед високою динамічністю діючих тут факторів навколишнього середовища (Сухарєв…, 2004). Встановлена нами закономірність спостерігалась лише за умови нетривалого (як значного, так і незначного) підвищення вмісту ВМ у річковій воді. За умови ж перманентного забруднення води відновлення мікрофлори не відбувалось. Найбільш загрозливим було виявлення умовно-патогенних коліформних бактерій у титрах 108-109, особливо у зразках, взятих у створі м. Рахів (Тиса), смт Вашарошномень (Тиса) і смт Ченгер (Тиса і Самош). З мікробіологічної точки зору така вода відноситься до полісапробної зони. Із відібраних зразків води р. Тиса та р. Самош нами було ізольовано стійкі до дії ВМ штами бактеріальних культур. Подальше вивчення їх властивостей є необхідною умовою з'ясування їх придатності для практичного використання як біоіндикаторів та біодеструкторів. На підставі порівняння видового складу мікрофлори р. Самош, верхньої (м. Рахів, смт Мілота) та середньої течії р. Тиса (смт Вашарошномень, смт Домбрад) нами встановлено, що деякі мікроорганізми потрапляють у Тису саме через її притоки (і насамперед Самош). Високий вміст у ній дріжджів вочевидь пояснюється роллю останніх, як споживачів органічних забруднювальних речовин.

Результати бактеріологічного обстеження стічних вод ЛХК. Було виявлено, що аеробна мікрофлора забруднених переважно фенолами стічних вод Перечинського лісохімкомбінату представлена незначною кількістю видів, серед яких домінують A. hydrophila, S. aureus і E. coli. Інші виділені аероби, а саме Salmonella spp., P. fluorescens, Bacillus spp., Klebsiella spp. і P. vulgaris знаходились в значно менших титрах. Такі результати разом із відсутністю серед ізолятів цілого ряду найбільш типових сапрофітних представників водної мікрофлори вказують на значне порушення її якісного складу. Спостерігали також суттєві відхилення кількісних характеристик мікрофлори: загальне мікробне число в забрудненій воді дорівнювало 4,4·103 КУО/мл, а колі-титр - 5,1·10-4 мл, що критично перевищувало гранично допустимий рівень для питної води.

Трансформація мікрофлори повітря. Мікробіологічний аналіз обстежуваних територій показав, що кількісний та якісний склад мікроорганізмів у повітрі значною мірою залежить від висоти забору проби над поверхнею ґрунту. Зокрема, порівнюючи значення ЗМЧ мікроскопічних грибів у пробах, відібраних на відстані 0,5, 1, 1,5, 2 та 2,5 м від поверхні ґрунту, можна зробити висновок про максимальну персистенцію мікроорганізмів у найнижчій та найвищій точках обстеження. Загальна кількість мікроскопічних грибів в атмосферному шарі безпосередньо над поверхнею ґрунту в еталонних екосистемах становить близько 9,0·102-1,05·103 КУО/м3 і в цілому має незначну тенденцію до зменшення із збільшенням висоти. На забруднених територіях кількість мікроскопічних грибів у повітрі дещо вища і становить (1,25-1,4)·103 КУО/м3 на висоті 0,5 м та (1,1-1,2)·103 КУО/м3 на віддалі 2,5 м від поверхні ґрунту.

Одержані нами in situ дані про консорціуми мікроорганізмів в ґрунті, воді і повітрі тестованого регіону є цінними в плані розробки методів експрес-діагностики зазначених полютантів та відновлення гомеостазу порушених екосистем.

РОЗДІЛ 5. НАКОПИЧЕННЯ, ЛОКАЛІЗАЦІЯ ТА МІГРАЦІЯ ВМ В ТРОФІЧНИХ ЛАНЦЮГАХ

Змінені мікробні угруповання техногенно порушених екосистем певною мірою зумовлюють наступну міграцію полютантів у трофічних ланцюгах, у тому числі їх надходження в рослини. Відповідно, дослідження рівнів накопичення і місць локалізації у рослинах найбільш типових для регіону обстеження забруднювальних речовин - ВМ - є безперечно актуальним, особливо за умов поліелементного забруднення. Встановлення ж за таких умов основних тенденцій трансформації рослинних угруповань корисне в плані пошуку рослин-біоіндикаторів та гіперакумуляторів ВМ.

Вміст ВМ у рослинах. Для характеристики біогеохімічних особливостей накопичення рослинами ВМ доцільно, на нашу думку, використовувати не лише показник валового вмісту металу, а й коефіцієнт біотичного поглинання Кб (відношення вмісту металу у золі рослини до його вмісту у ґрунті). Останній відображає біогеохімічну активність рослин у кругообігу хімічного елементу в екосистемі (Перельман, 1989; Добровольский, 1997; Алексеенко, 2000). Через слабку диференціацію ґрунтового профілю ми розраховували Кб для трав'янистих і деревних рослин за середнім вмістом металу відповідно в гумусовому горизонті і ґрунтовому розрізі в цілому.

Забрудненість ґрунтів позначилася на елементному складі флори. Порівняння вмісту ВМ у рослинах-едифікаторах (роди Salix, Populus, Fraxinus) з досліджуваних ділянок поблизу смт Домбрад (забруднена територія) та смт Мілота й м. Тячів (відносно чисті території) показало пряму залежність вмісту Pb, Cd, Zn у рослинах і ґрунтах. Порівнюючи вміст ВМ у рослинах суходолу з кларковими значеннями, можна відзначити, що лише концентрації Mn і Cd помітно відрізнялись від кларкових (вони були нижчими і вищими за кларк відповідно). Підвищений вміст Zn і Pb було виявлено лише у деяких видів рослин. Серед досліджених видів флори представники родів Populus та, особливо, Salix виділялись, як концентратори Cd і Zn. Вміст зазначених елементів у листках цих рослин на 1-2 порядки перевищував аналогічні показники інших видів. Накопичувачами Pb виявилися представники Partenocissus tricuspidata, Lycopus europaeus, Equisetum arvense, Capsella bursa-pastoris і роду Calamagrostis. Вміст свинцю в них був у 4-10 разів вищим, ніж у інших рослин. Вміст Cu, Mn, Fe у більшості рослин досліджуваної території знаходився приблизно на одному рівні.

Розподіл ВМ у тканинах рослин. Поєднуючи дані атомно-абсорбційного і гістохімічного аналізів визначили види трав'янистих рослин, що характеризуються високим ступенем акумулювання ВМ і здатністю до ксилемного транспортування металів. Це Achillea millefolium L, Vicia cracca L., Eqiusetum arvense L., Galium sp., Helianthus subcanescens (Gray) E.E. Wats., Dryopteris filix-mas (L.) Schott., Lotus corniculatus L., Lusimachia vulgaris L., Plantago major L., Prunella vulgaris L., Solidago virgaurea L., Stenactis annua (L.) Nul., Tanacetum vulgare L., Taraxacum officinale Webb, ex Wigg., Tussilago farfara L., Xanthium spinosum L., Ambrosia sp. та деревні породи: Populus nigra L., Salix sp. [S. alba, S. caprea, S. viminalis], Swida sanguinea (L.) Opiz. У названих видів рослин забарвлені метал-дитизонатні комплекси виявлено в епідермі, гіподермі, хлоренхімі, вторинних елементах ксилеми, серцевинній паренхімі. Деякі види рослин, наприклад Helianthus subcanescens, містили комплекси ВМ всередині цитоплазми ксилеми і епідермальних тканин. У цього ж виду забарвлені метал-дитизонатні комплекси виявлено в трихомах. Для рослин з істотною біомасою ми одержали такі кількісні дані про здатність акумулювати ВМ: Helianthus subcanescens нагромаджує Cu (28,3 мг/кг сухої речовини), Cd (1,26-2,26 мг/кг), Zn (102,7 мг/кг), Pb (5,5 мг/кг), Solidago virgaurea - Cd (1,29-4,09 мг/кг), Pb (5,0-7,7 мг/кг), Tanacetum vulgare - Cd (1,01-8,72 мг/кг), Pb (2,6-6,4 мг/кг). Серед рослин з незначною біомасою ми виявили такі ефективні акумулятори ВМ: Lotus corniculatus (Cd, Pb), Lusimachia sp. (Cu, Cd, Zn, Mn, Pb), Plantago major (Pb), Eqiusetum arvense (Cd), Taraxacum officinale, Tussilago farfara, Xanthium spinosum, Ambrosia sp., Artemisia sp. Їх у перспективі реально використовувати для розширення потенційних ресурсів фіторемедіації, здійснивши скринінг і відбір необхідних генів, що забезпечують стійкість цих видів до дії ВМ. Деякі з вказаних видів можна використовувати з метою пасивного моніторингу забруднення навколишнього середовища в ролі біоіндикаторів. Вже є дані про таке застосування Taraxacum officinale, Artemisia vulgaris та Plantago media (Безсонова, 1991). Нами встановлено, що накопичення ВМ у вегетативних органах вищих рослин за умов поліелементного забруднення ґрунтів є взаємозалежним. Виявлено такі плеяди: Zn-Cd, з тісним кореляційним зв'язком між елементами (r = 0,84), та Cu-Pb-Fe, із середнім рівнем взаємозв'язку (r = 0,41). Кожний із цих зв'язків носить лінійний характер. Завдяки великому об'єму вибірки, достовірність регресійних моделей досить висока, похибка не перевищує 0,2% (p<0,002). Для візуалізації цих результатів і полегшення оцінки подібності емпіричних розподілів кожної змінної ми побудували відповідні квантиль-квантиль діаграми розсіювання (рис. 4).

Видно, що при такому способі представлення статистичних даних про досліджувані пари змінних Zn-Cd, Cu-Pb, Cu-Fe і Pb-Fe, точки щільно розміщуються на лініях регресії, тобто змінні в досліджуваних парах мають однакові розподіли. Квантиль-квантиль діаграми дозволяють також уточнити типи ліній регресії. Для пари Zn-Cd регресія лінійна, для Pb-Fe - апроксимується поліномом, а для Cu-Pb і Cu-Fe - експонентою.

Міграція ВМ. Для характеристики інтенсивності перебігу процесу міграції ВМ користуються коефіцієнтами їх переходу в тканини та органи тварин, або/чи продукти сільськогосподарського виробництва. В цілому транслокаційний перехід ВМ у системі ґрунт-рослина-тварина є досить інтенсивним, однак залежить від цілого ряду факторів (Головатый, 2002). Коефіцієнт переходу ВМ з ґрунту у траву за результатами 2000 р. становив для свинцю 0,4-22,1%, міді - 14,4-45,0%. У 2001 р. відмічено збільшення цього показника в межах 5,6-64,8% та 14,9-79,9% відповідно. У системі трава-молоко коефіцієнт переходу для свинцю у 2000 р. дорівнював 0,7-10,1%, для міді - 7,4-51,1%, у 2001 р. - відповідно 1,8-8,9% та 8,5-34,8%. Згідно визначених нами коефіцієнтів переходу ВМ у ланці ґрунт-молоко встановлено, що за період 2000-2001 рр. міграція свинцю із ґрунту у молоко зросла від 0,06-0,47% до 0,29-0,97%. Рівень транслокаційного переходу міді змінювався більш суттєво, але не так однозначно. Так, коефіцієнт переходу міді, розрахований за результатами аналізу проб урочища Мочкофізеш с. Вишково, протягом періоду обстеження зменшився майже у 4 рази, а в господарствах “Вишково” та “Прикордонник” - збільшився втричі. Загалом коефіцієнт переходу міді в системі ґрунт-молоко знаходився в межах 3,15-18,8%. Очевидно, що зменшення валової кількості свинцю та міді у ґрунтах за досліджуваний період зумовлене переходом цих ВМ у рухомі форми, які краще засвоюються рослинами.

РОЗДІЛ 6. МІКРООРГАНІЗМИ І РОСЛИНИ У ПРОЦЕСАХ РЕГУЛЯЦІЇ ГОМЕОСТАЗУ ПОРУШЕНИХ ЕКОСИСТЕМ ВЕРХНЬОГО ПОТИССЯ

Пошук судинних рослин-індикаторів важких металів. Застосовані нами методи однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) достовірно вказують на існування родин рослин, що нагромаджують найбільшу кількість того чи іншого ВМ за умов поліелементного забруднення середовища. На підставі одержаних даних ми пропонуємо використовувати для фітоіндикації та фіторемедіації постраждалих від комплексного забруднення ВМ заплавних притисянських екосистем рослини таких родин: Ranunculaceae, Primulaceae та Malvaceae (як акумулятори Cu), Hederaceae і Ranunculaceae (Pb), Salicaceae, Primulaceae та Crassulaceae (Zn), Salicaceae, Primulaceae, Celastraceae і Crassulaceae (Cd), Juncaceae (Mn) та Primulaceae і Crassulaceae (Fe). Виявлені нами закономірності накопичення ВМ рослинами заплавних екосистем притисянських територій обґрунтовують вибір ефективної для регіону технології фіторемедіації ґрунтів із використанням верб. Вона вже застосовується на угорській частині досліджуваної території, де розпочато формування лісонасаджень з Salix viminalis L. var. “gigantea” (“енергетичної” верби). Річний приріст Salix viminalis L. var. “gigantea” становить 20-40 т/га, вона невибаглива до ґрунту, але потребує сприятливого водного режиму. Згідно наведених вище даних деревні насадження - у нашому випадку вербові ліси - мають бути особливо ефективними в плані очищення (фітоекстракції та фітодеградації) поліелементно забруднених ґрунтів від Cd і Zn. Було встановлено, що серед досліджуваних видів верб (Salix dasyclados, S. smithiana, S. viminalis) та тополь (Populus nigra, P. maximowiczii) найбільшу кількість Cd і Zn акумулюють саме “енергетичнї” верби, про що свідчать дані замірів проб, відібраних на заплавних територіях Верхнього Потисся, із так званих модельних “зон ремедіації”).

Токсична дія солей важких металів на окремі види Rhizobium spp. в експериментах in vitro. Факт негативного впливу ВМ на перебіг процесів нітрифікації і азотфіксації ґрунтів є добре відомим (Клевенская, 1985; Вергунов, 1997). Саме фіксація атмосферного азоту виділяється унікальною чутливістю до присутності у ґрунті різних токсикантів і є надзвичайно інформативним показником наявності ВМ. І все ж серед бактерій, перспективних для біоремедіації ґрунтів, особливе місце належить стійким до ряду стресових факторів ізолятам Rhizobium loti. Поширення останніх, їх сезонна варіабельність та нітрогеназна активність інтенсивно вивчаються з метою виділення та використання штамів, найбільш резистентних та ефективних для інокуляції ґрунтів (Baraibar et al., 1999). Нами досліджено закономірності впливу солей Сu, Ni, Co, Sr, Cs на Rh. meliloti 425a, Rh. loti 1801, Rh. leguminosarum 250a в умовах in vitro. За зменшенням токсичної дії на тест-штами ризобій досліджувані ВМ можна розташувати в такий ряд: мідь > нікель > кобальт > цезій > стронцій. Rh. loti штам 1801 характеризувався найбільшою стійкістю серед усіх досліджуваних бульбочкових бактерій-симбіонтів до нітратів кобальту, нікелю та стронцію. Cульфат міді володів високою токсичністю як по відношенню до даного виду мікроорганізмів, так і щодо двох інших, хоч ріст культур ще спостерігали при концентрації солі 30 г/л (12 г/л Cu2+). Rh. leguminosarum штам 250а характеризувався толерантністю лише до солі цезію (в концентрації 10 г/л, 7 г/л йонів Cs+), причому Co+2 та Cu+2 справляли летальну дію на зазначений штам вже при незначних дозах в поживному середовищі. Rh. meliloti штам 425а займав проміжне положення за рівнем чутливості до дії йонів токсичних металів (Со2+, Сu2+ та Ni2+), оскільки був резистентним лише при їх низьких концентраціях у поживному середовищі.

Деструкція тіоціанатів умовно-патогенними та сапрофітними бактеріями роду Klebsiella. До складу стічних вод входять, зокрема, роданіди (тіоціанати), що перебувають у формі вільних йонів і мають загальну формулу R-SCN, де R - одновалентний метал (Юровская, 1984). Серед існуючих способів очистки стічних вод за економічністю та екологічною нешкідливістю виділяються біологічні методи (Гвоздяк, 1982; Иллялетдинов, Алиева, 1990; Удод, 1994). Вивчена нами динаміка процесів розкладу калію роданистого сапрофітною культурою K. terrigena 80-08 показала, що протягом перших 24-36 годин концентрація токсичної речовини фактично не змінюється (внесена концентрація КСNS дорівнювала 225 мг/л). Починаючи із 2-ї доби експерименту концентрація тіоціанатів різко зменшувалась майже до їх повної утилізації у мінімальному поживному середовищі, близькому до умов природного забруднення (середовище без глюкози). Збільшення титру інокулянту сприяло зростанню швидкості деструкції роданідів у середовищі, особливо через 72 год. після початку експерименту. Процес деструкції роданідів сапрофітними і умовно-патогенними бактеріями роду Klebsiella відбувався найактивніше при t = 20-22 0С та 30-32 0С. Виявлено, що збільшення концентрації хлориду натрію в середовищі (до 10 та 15 г/л) створює несприятливі умови для росту мікроорганізмів і, відповідно, для деструкції роданідів сапрофітними і умовно-патогенними бактеріями роду Klebsiella. Оптимальним для утилізації тіоціанатів даними штамами клебсієл є нейтральне значення рН (рівне 7).

Генетична детермінованість стійкості бактеріальних ізолятів до різних полютантів. Встановлення механізмів стійкості мікроорганізмів до полютантів є важливим в плані з'ясування можливості використання даних штамів для біоіндикації забруднень, у тому числі ВМ, та для розробки методів біологічної ремедіації. Плазмідну зумовленість стійкості до різних типів промислових забруднень визначали у 7 бактеріальних культур, у тому числі E. сoli, A. hydrophila, Klebsiella spp., B. subtilis, Citrobacter diversus, Kurthia spp. Їх виділили з найбільш забруднених місць Верхнього Потисся, що піддавались впливу різних забруднювальних речовин, у тому числі солей ВМ (переважно Zn+2, Pb+2, Cu+2), фенолів, ацетатів, сульфатів і сульфідів. Із усіх досліджуваних культур плазмідну ДНК виявили у таких штамів бактерій: C. diversus, E. coli, A. hydrophila та Rh. loti 1801. Найбільшу за розмірами плазміду pAR виділили з A. hydrophila (? 4,3-4,4 т.п.н.). В даній плазміді не виявлено сайтів впізнавання для EcoRV. По одному сайту рестрикції знайдено для PstI і ScaI, по два сайти - для BamHI, HindIII і EcoRI. Ці три останні ендонуклеази розділяють pAR приблизно на два однакові фрагменти - 2.1 і 2.3 т.п.н. Порівняльний аналіз антибіотикочутливості A. hydrophila і типового штаму E. coli DH5a показав наявність резистентності до карбеніциліну та ампіциліну лише у першого із них. В результаті трансформації pAR A. hydrophila в антибіотикочутливий штам E. coli DH5a, нами отримано ампіцилін- та карбеніцилін-стійкі клони E. coli DH5a. Відомо, що сайт для ендонуклеази ScaI звичайно присутній в гені бета-лактамази, який і забезпечує стійкість бактерій до ампіциліну. Згідно відомих рестрикційних карт цього гену (карти плазміди pBR322, або інших подібних плазмід, з яких конструювали вектори pUC18/19, pBluescriptIIKS) можна передбачати подібну локалізацію цього сайту і в pAR, тобто у гені ?-лактамази bla, який відповідає за стійкість бактерій до ампіциліну. Отже, ділянка плазмідної ДНК близько 1,3-1,5 т.п.н. може нести інформацію за функціонування гену ампіцилінрезистентності та відповідати за ініціацію реплікації. Подвійна рестриктаза HindIII-PstI розділяє рAR на 3 фрагменти розмірами приблизно 0,6; 1,7 і 2,1 т.п.н. Тобто, сайт впізнавання для HindIII розташований на 600 т.п.н. ліворуч або праворуч сайту впізнавання для рестриктази PstI. За допомогою BamHI-PstI та EcoRI-PstI також утворюються три фрагменти (? 0,5; 1,8 та 2,1 т.п.н.). Отже, сайт впізнавання для BamHI розташований на 500 т.п.н. ліворуч або праворуч сайту впізнавання для рестриктази PstI. На основі зазначеного рестрикційного аналізу побудовано орієнтовну фізичну карту плазміди pAR. Згідно нашого припущення близько 3 т.п.н. в pAR можуть зумовлювати резистентність даного штаму до фенольного забруднення середовища.

Мікробіологічна індикація в умовах забруднених притисянських екосистем. Виходячи із аналізу одержаних даних, ми запропонували таку схему мікробіологічної експрес-діагностики ґрунтів досліджуваних екосистем: 1) використання бактерій Acinetobacter spp. у кількості 1% від ЗМЧ, як біоіндикатора поліелементного забруднення ґрунтів солями ВМ; 2) облік числа пігментних аеробних мікроорганізмів родів Flavobacterium та Xanthomonas для ідентифікації критичного рівня поліелементного забруднення ґрунтів; 3) детекція високих титрів, стійких до дії токсикантів мікроорганізмів Bacillus (до 45% від загальної кількості хемоорганотрофів) і Pseudomonas (до 10%) для оцінки рівня підвищеного техногенного навантаження; 4) визначення титрів умовно-патогенних бактерій і, насамперед, ентеробактерій (до 35% від загального числа хемоорганотрофів) для фіксації початку відновлення екосистеми та встановлення нового мікробного гомеостазу з іншим співвідношенням чисельності домінуючих еколого-трофічних груп мікроорганізмів; 5) фіксація зменшення кількості бацил (за рахунок реадаптації пігментних та ризобіальних видів) та збільшення чисельності мікро- і актиноміцетів для виявлення активації та відносної результативності процесів самоочищення ґрунтів. Імовірно, що дієвість цієї схеми може бути обмежена специфікою поліелементно-забруднених ВМ едафотопів екосистем Верхнього Потисся.

Біоремедіація стічних вод: модельний експеримент. Запропонований нами спосіб комплексної очистки промислових стічних вод від забруднювальних речовин різної при-роди, у тому числі фенолів, базується на використанні штаму A. hydrophila ІМВ В-7102, як бактеріального компоненту біофільтру з цеолітовою основою - сокирницьким клиноптилолітом. Нами показано, що сокирницький клиноптилоліт характеризується значною фільтруючою та сорбційною здатністю стосовно йонів калію, натрію, кальцію, магнію, гідрокарбонатів, хлоридів, сульфатів, ацетатів, а також здатний повністю усувати сірководень із забрудненої води. Одержані експериментальні дані виявили найбільшу ефективність очистки води при використанні клиноптилолітових фракцій 1-3 мм (К2) і 5-7 мм (К6). Результати бактеріологічного аналізу забрудненої води після її очистки клиноптилолітом зазначених фракцій свідчать про високий поглинаючий рівень даного сорбенту щодо цілого ряду патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів. Найкраще ним утилізуються представники родів Salmonella і Pseudomonas, слабше - Klebsiella spp., E. coli і Staphylococcus spp. і практично не поглинаються P. vulgaris. Фракція К6 адсорбує переважно Salmonella spp. і E. coli. З усіх фракцій цеоліту у проби води надходили спорові аеробні бактерії роду Bacillus.

Для встановлення можливості використання штаму A. hydrophila ІМВ В-7102 як біоіндикатора та біодеструктора такого типу забруднень було вивчено його здатність утилізувати феноли. Визначення біодеструктивного потенціалу цього штаму показало, що він забезпечує розщеплення 84,8% фенолу (при внесеній кількості 400 мг на 1 л мінімізованого середовища) уже через 72 години культивування за умов, максимально наближених до природних. Це доводить перспективність застосування виділеного нами штаму ІМВ В-7102 A. hydrophila як активного біодеструктора зазначених ксенобіотиків.

РОЗДІЛ 7. ЕФЕКТИВНІСТЬ БІОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ КОМПЛЕКСНОЇ ДІЇ В УМОВАХ ПОРУШЕНИХ ЕКОСИСТЕМ

Для одержання типових представників УПБ з метою їх наступного використання як тест-культур для оцінки дієвості новостворюваних біопрепаратів нами у 2007-2008 рр. проведено мікробіологічне обстеження окремих відділень українських і угорських неінфекційних лікарень, розміщених в регіоні досліджень. Серед ізольованих нами УПБ в українській клініці переважали K. pneumoniae, K. oxytoca, E. cloaceae, E. coli, P. mirabilis, A. baumannii, P. aeruginosa, S. hominis, S. aureus, в т.ч. MRSA, в меншій кількості виділялись коагулазонегативні стафілококи: S. haemoliticus і S. epidermidis та стрептококи. Дослідження стійкості ізольованих УПБ до антибіотиків показало, що штами K. pneumoniae, K. oxytoca, E. cloaceae і E. coli були резистентними до дії тетрацикліну, моксифлоксацину, левофлоксацину, ципрофлоксацину, цефураксиму, цефотаксиму, цефамандолу, цефалексину, азитроміцину, ампіциліну і амоксициліну. Клінічні ізоляти S. aureus теж виявляли стійкість до досліджуваних антибіотиків, тоді як штами коагулазонегативних стафілококів були чутливими до моксифлоксацину, амоксициліну, цефалексину і цефамандолу. Помірну резистентність до ванкоміцину виявлено у 57% штамів S. hominis. У грамнегативних антибіотикорезистентних штамів за допомогою тестів розширеного спектру ?-лактамази встановлювали наявність генів резистентності до цефалоспоринів останнього покоління, а саме: цефотаксиму (CTX), цефтазидиму (CAZ), цефподоксиму (CPD), азтреонаму (ATM) і цефтріаксону (CRO), взятих у концентраціях 10 і 30 мкг. Затримка росту культури ??5 мм навіть одним із них вказує на імовірну здатність штаму зумовлювати нозокоміальну інфекцію. Позитивні результати ESBL-тестів було одержано для штамів K. pneumoniae і E. cloacae із гастроентерологічного відділення, штамів A. baumannii і P. mirabilis із хірургічного відділення і штамів K. pneumoniae із ЛОР відділення. У штамів K. pneumoniae позитивними були ТЕМ-1 і CTX-M ESBL-проби, у E. cloacae - SHV-ESBL, CTX-M, у P. mirabilis - лише CTX-M, а у A. baumannii - PER-1. У штамів P. aeruginosa, не дивлячись на їх 100 % стійкість до антибіотиків, результати ESBL-тестів виявились негативними. Кардинальною відмінністю обстежених угорських відділень від українських була менша циркуляція в них представників родини Enterobacteriaceae та більша чутливість до антибіотиків ізольованих бактерій. Штами K. pneumoniae,

K. oxytoca, E. cloaceae, P. aeruginosa, P. mirabilis, E. coli (O111), A. baumannii, S. aureus і MRSA, одержані нами при мікробіологічному обстеженні клінік, а також ветеринарних господарств, були використані як тест-культури УПБ для досліджень, спрямованих на розробку бактеріологічних препаратів проти основних збудників опортуністичних інфекцій. Такі препарати мали б поєднувати виразну антагоністичну активність щодо УПБ із імуномодуляторними властивостями, точніше здатністю до спрямованої модуляції локальної імунної відповіді організму господаря. Ясно, що бактеріальну основу цих препаратів мають становити представники нормальної і/чи коменсальної мікрофлори людини і тварин. Тому для проведення зазначених досліджень нами було обрано ізольовані із вмісту кишечника людей і тварин штами E. coli 058, L. salivarius NVw, L. acidophilus 0-08, E. faecalis M4 II 1 і B. subtilis 090, 8031, 09/7/9 BP із специфічною антагоністичною активністю, а також представники коменсальної мікрофлори мишей із виразними імуномодуляторними властивостями, а саме штам M. morganii (Logan et al., 1991) і Schaedler's E.coli O83:K24:H31 (Schaedler, Dubos, Costello, 1965; Schaedler, Orcutt, 1983).

Антагоністична активність перспективних штамів щодо умовно-патогенних мікроорганізмів. Нами із різних джерел ізольовано та ідентифіковано штами B. subtilis із селективною антибактеріальною активністю. Показано, що штам B. subtilis 091 виявляє помірну протипсевдомонадну дію, штам 092 (1119) - антисклеромну, штам 090 є основою розробленого нами монокомпонентного ветеринарного біопрепарату “Моноспорин-ПК”, штам 09/7/9 є антагоністом до MRSA, а штам 8031 має здатність нейтралізувати мікотоксини. Штам E. faecalis М ІІ 4 1, ізольований нами із вмісту кишечника людини, за умов сумісного культивування виявив антибактеріальну активність щодо K. oxytoca та E. cloaceae. Інший ізолят кишечника людини - L. salivarius NVw - показав здатність пригнічувати S. aureus, однак не MRSA. До перспективних антагоністів A. baumannii слід віднести штам E. coli 058 (представник нормальної мікрофлори людини), який зумовлював відмирання вказаної тест-культури, тоді як штам Schaedler's E.coli (представник коменсальної мікрофлори мишей) не виявляв антибактеріальної дії щодо жодного із штамів УПБ. Таку антагоністичну активність відібраних нами штамів бактерій можна вважати вибірковою. Серед досліджених нами представників нормальної чи коменсальної мікрофлори не виявлено антагоністів щодо клінічних ізолятів K. pneumoniae, P. mirabilis і E. coli.

Результати досліджень сумісного культивування відібраних антагоністів і коменсалів демонструють можливість відносно стабільного (до 10-ти діб включно) співіснування усіх неспороутворюючих штамів бактерій за умови кількісного переважання у середовищі ешерихій та лактобацил над морганелами та ентерококами. Внесення штамів B. subtilis у середовище прискорює його виснаження і призводить до швидшого відмирання штамів ентерококів і морганел.

Ефективність впровадження пробіотичного препарату Моноспорин-ПК. Моноспорин-ПК (протиклебсієльозний) - монокомпонентний пробіотичний препарат з виразними імуномодуляторними властивостями, сконструйований нами на основі штаму B. subtilis 090 (ВКПМ № В-5225), ізольованого із кишечника здорового теляти. Даний біопрепарат розроблений і випускається у гельподібній та ліофільно-висушеній формах і характеризується антагоністичною активністю щодо УПБ родів Klebsiella spp., Escherichia spp., Salmonella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus agalactiae. Використання Моноспорину-ПК для вирощування яєчного птаха (“Южная Холдінг”) з профілактичною метою без допомоги антибіотиків дозволило одержати прирости ваги і підвищити схоронність племінної птиці на рівні ? 10% відносно аналогічних показників контрольної групи (вжито Енроксил) при втричі менших затратах на їх утримання. Яйценосність птиці в результаті застосування Моноспорину-ПК перевищувала контрольну на 8-11%. Вирощування бройлерів (“Птахівник”) з випоюванням їм Моноспорину-ПК (табл. 1) показало, що в дослідній групі порівняно з контрольною (вжито Ексанель) знижувались затрати кормів на 4,4% і зростав приріст ваги на 7,1%.

В остаточному підсумку це забезпечило підвищення продуктивності виробництва м'яса бройлерів з одиниці площі до 3,9 кг/м2.

Високу економічну ефективність використання Моноспорину-ПК спостерігали і при вирощуванні поросят на ТзОВ “Агропромислова компанія” і ЗАТ “Фрідом Фарм Інтернешнл”. Уже в перші 30 днів відзначали збільшення схоронності дослідних тварин на 1% і прирости ваги на 0,7 кг у порівнянні з контрольною групою, що одержувала антибіотик. Обидва показники істотно поліпшувалися при 60-денному періоді такого вирощування поросят-сисунців і дорівнювали відповідно 3,3 % і 1,2 кг. При цьому витрати на утримання тварин зменшувалися вдвічі. Результати застосування Моноспорину-ПК у виробничих умовах замість антибіотиків свідчать про його високу протективну та економічну ефективність, що є важливим в плані одержання якісних та екологічно чистих продуктів тваринництва.

Корекція стану гіпофізарно-тиреоїдної системи за допомогою Моноспорину-ПК. Відомий факт надзвичайно тісного взаємозв'язку функціонування імунної та тиреоїдної систем людини (Kelley, 1988; Чуднер, Нигматулин, 1989) свідчить про можливість регулювання гіпофізарно-тиреоїдного стану організму через корекцію його імунної відповіді. Нами показано, що пероральне введення Моноспорину-ПК забезпечує ефективну терапію модельного гіпотиреоїдного стану лабораторних тварин. У сироватці крові здорових кролів, що одержували Моноспорин-ПК, спостерігали достовірне зростання титрів IgM і IgG, тенденцію до збільшення концентрації IgА,

а також зменшення кількості малих і середніх циркулюючих імунних комплексів, що є проявом типової для пробіотиків імуномодуляторної дії на організм теплокровних. Вміст трийодтироніну (Т3) у сироватці крові інтактних тварин становив 1,08±0,07 нмоль/л, а тироксину (Т4) - 134,60±6,63 нмоль/л. У стані гіпотиреозу у тварин відмічали різке пригнічення секреції тиреоїдних гормонів: рівень Т3 у сироватці крові знижувався на 62,96%, а Т4 - на 80,82% (р<0,001). Застосування Моноспорину-ПК для корекції гіпотиреоїдного стану кролів зумовлювало достовірне зростання рівня обох гормонів, Т3 - до 0,66±0,06 нмоль/л, Т4 - до 50,75±2,09 нмоль/л (р<0,001). Нами встановлено обернену кореляцію між концентраціями тиреоїдних гормонів і IgM та помірну пряму кореляцію між титрами Т3 і IgG. Показано, що гіпотиреоїдний стан зумовлює суттєве зниження рівня загального білка та ?-глобуліну у сироватці крові. Моноспорин-ПК, навпаки, характеризується здатністю до стимуляції процесів біосинтезу білка та нормалізації рівня ?-глобулінової фракції. Введення пробіотику здоровим тваринам призводило до зменшення рівня холестерину та зростання вмісту альбумінової фракції у сироватці крові. Таку ж здатність Моноспорину-ПК корегувати порушення функціонування ендокринної, імунної та видільної систем за умов модельного гіпоти-

реозу виявлено і в дослідах на морських свинках. Встановлено здатність біопрепарату відновлювати рівень ТТГ, підвищувати концентрації Т3 (у 1,8 разів) і Т4 (у 4,54 рази), збільшувати рівні загального білка та нормалізувати вміст a1-, a2-, b---і--g-глобулінових фракцій. Профілактичне застосування Моноспорину-ПК створює умови для адекватної мобілізації щитовидної залози сільськогосподарських тварин і птиці.

РОЗДІЛ 8. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ МЕХАНІЗМИ ВЗАЄМОДІЇ КОМЕНСАЛЬНОЇ МІКРОФЛОРИ І ОРГАНІЗМУ ГОСПОДАРЯ: РЕГУЛЮВАННЯ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ ТА МІКРОБНОГО ГОМЕОСТАЗУ

Успішність розробки і застосування бактеріальних препаратів значною мірою залежить від повноти фундаментальних знань про механізми регуляції складних процесів взаємодії слизових оболонок організму господаря із бактеріями-коменсалами.

Механізми модуляції імунної відповіді організму господаря внаслідок взаємодії з коменсалами слизових оболонок. Досліджено зв'язок здатності бактерій до колонізації організму з їх імуномодуляторними властивостями. Найбільшу колонізуючу здатність виявлено у штаму M. morganii 1/7 (до 1010 КУО/г у різних відділах кишечника протягом 70 діб спостереження). Інші досліджені нами представники коменсальної і транзиторної мікрофлори кишечника за рівнями колонізації розташовуються в такий низхідний ряд: Schaedler's E. coli (108 КУО/г), L. salivarius ASF 361 (107 КУО/г), L. acidophilus ASF 360 і E. coli 058 (106 КУО/г) та B. subtilis 090 (103-104 КУО/г).

Встановлено, що кількість загального IgAs, індукованого M. morganii, дорівнює 924 нг/мл, а специфічного - 44 нг/мл. Штам Shaedler's E. coli за колонізуючою здатністю поступається M. morganii, однак за кількістю локально продукованих імуноглобулінів (до 0,7 мкг/мл і 450 мкг/мл відповідно для В6 та BALB/c мишей) та утворенням специфічного IgAs (100 нг/мл), тобто за імуномодуляторними властивостями він переважає інші досліджені нами штами. Лактобактерії мали меншу здатність колонізувати кишечник стерильних мишей порівняно з морганелами і ешерихіями, проте і вони призводили до утворення значної кількості IgAs (100-150 мкг/мл) локально. Нарешті, штам B. subtilis 090 також характеризується низькими колонізуючими властивостями і високою здатністю до індукції загального IgA в різних відділах тонкого кишечника імунокомпетентних BALB/c мишей (1382-2485 нг/мл). Його повна елімінація при однократному оральному введенні відбувається на 11 добу. І навіть за такої короткочасної колонізації спостерігається середній рівень специфічної відповіді (46 нг/мл), характерний для більшості коменсалів кишечника. Отже, здатність представників нормальної мікрофлори до колонізації слизових оболонок організму є не єдиною запорукою виявлення їх імуномодуляторних властивостей.

Бактерії-коменсали і В-підсистема імунітету. Специфічність локальної імунної відповіді до ТН-І антигенів бактеріального походження. На розробленій нами експериментальній моделі показано, що В1 клітини можуть бути селективно стимульовані через їх В-клітинний рецептор бактеріальним Т-незалежним типу 1 антигеном фосфорилхоліном ФХ+ мутантного штаму 552 H. influenzae. При цьому напрацювання імунної відповіді локально (в НАЛТ) є строго специфічним і не спостерігається за умови колонізації мишей ФХ- мутантним штамом 445 H. influenzae. Синтез специфічного до ФХ IgA забезпечувався головним чином В1 клітинами, внесок класичних В2 клітин був незначним. Доведено, що для напрацювання такої імунної відповіді на ТН-1 антиген необхідною є присутність Т-клітин. У цьому випадку вони відіграють “посередницьку” роль, не здійснюючи прямої стимуляції В клітин.

Стимулювання коменсалами продукції інтерферону НК ІЕП за умови комбінованого імунодефіциту та транслокація бактерій при дефіциті IgA. Найбільш важливим підрозділом клітинної складової локальної імунної системи є інтраепітеліальний простір (ІЕП). На початок наших досліджень маловідомою була роль коменсальної флори в розвитку та активації лімфоцитів ІЕП, особливо НК.

Встановлено, що колонізація стерильних БМ scid мишей Schaedler's E. coli призводить до різкого зростання кількості НК, тоді як для антиген-вільних мишей (АВ) та ЗВЧ BALB/c ця кількість є порівняно незначною. Найбільший вміст НК відмічено в ІЕП звичайних (колонізованих нормальною мікрофлорою) імунодефіцитних мишей. У scid мишей, інокульованих штамом Schaedler's E. coli, кількість утвореного локально (у проксимальному відділі товстого кишечника мишей) ?-інтерферону на 1 порядок і більше перевищує аналогічний показник для БМ мишей, а експресія генів, що відповідають за синтез інтерферону, в десятки разів збільшується у порівнянні із ЗВЧ BALB/c та БМ і ЗВЧ scid мишами. З розглянутого прикладу очевидною стає суттєва роль коменсалів у формуванні НК в ІЕП.

Таким чином, імунокомпетентні миші характеризуються відносно малою кількістю НК у ІЕП і, відповідно, незначним рівнем IFN-?, продукованого локально. Суттєве збільшення зазначених показників спостерігається у імунодефіцитних мишей, але лише за умови їх активації коменсальними мікроорганізмами. Потужним індуктором такої локальної імунної відповіді є Schaedler's E. coli. При використанні даного штаму бактерій рівень інтерферону в кишечнику досягає максимуму на 14-й день після оральної інокуляції і лише через місяць наближається до норми звичайних імунодефіцитних мишей.

Феномен бактеріальної транслокації та аналіз основних механізмів регуляції проникності слизових оболонок. Забезпечення гомеостазу організму господаря визначається спрямованістю процесів взаємодії його слизових оболонок із бактеріями, зокрема взаємодія коменсальної і транзиторної мікрофлори з слизовими епітеліальними поверхнями кишечника і верхніх дихальних шляхів регулює феномен транслокації бактерій. Для дослідження даного феномену нами використано такі лінії мишей: а) стерильні scid, б) нокаутні за продукцією IgA і вихідного типу B6 та в) BALB/c. Застосовували штами L. acidophilus ASF 360, L. salivarius ASF 361, Schaedler's E. coli і

M. morganii 1/7. Встановлено, що колонізація комбіновано-дефіцитних мишей і мишей з типовою імунною системою бактеріями-коменсалами не супроводжується їх транслокацією у внутрішні органи. Оральна ж інокуляція IgA нокаутних мишей двома штамами лактобацил призводить до швидкого проникнення і дисемінації останніх протягом 7-14 днів в легенях (до 1,0·101 КУО/г), серці, селезінці (1,5·104), печінці (8,3·103-1,1·104) і нирках (1,1·104-6,3·104). Інокуляція цих же ліній мишей штамами Schaedler's E.coli і M.morganii не призводить до їх транслокації. Більше того, завчасне (за 24 години) введення IgA нокаутним мишам штамів Schaedler's E. coli чи M. morganii попереджує проникнення лактобацил через слизові оболонки кишечника. Для з'ясування можливих механізмів, що зумовлюють такі закономірності транслокації, ми, крім очевидного фактору продукування IgA, визначали також експресію генів, що кодують утворення аутокринного фактору росту (Reg III) у кишечнику та поверхневого протеїну (SP-D) у легенях.

Роль аутокринного ростового фактору Reg III ? і ? та сурфактантного протеїну SP-D в регулюванні гомеостазу КАЛТ і НАЛТ організму. Нами зафіксовано достовірне збільшення експресії генів Reg III, особливо ?, внаслідок колонізації IgA нокаутних мишей бактеріями-коменсалами. При цьому найбільший рівень аутокринного фактору росту спостерігали (рис. 5) у випадку орального введення мишам штаму Schaedler's E. coli, а через 24 години - L. salivarius 361, дещо менший - при застосуванні лише культури лактобацил. Зазначені результати доводять факт участі Reg III ? у регулюванні проникності слизових оболонок кишечника.

Щодо рівнів експресії поверхнево-активного білкa в легеневих тканинах, то нами зафіксовано його аналогічне достовірне збільшення у IgA нокаутних мишей, колонізованих обома (спочатку Schaedler's E. coli і потім L. salivarius) або ж одним штамом L. salivarius. Тобто, як і у випадку з аутокринним фактором росту (рис. 5), зростання рівнів експресії поверхневого білкa SP-D легень спостерігали лише у двох експериментальних груп мишей (3б і 4б на рисунку). Звідси можна зробити висновок, що досліджувана пара молекул і процесів є визначальними для регулювання механізмів бактеріальної транслокації коменсальних бактерій. Це підтверджується й нещодавно виявленою у Reg III селективною здатністю вибірково зв'язувати грампозитивні бактерії (Hooper et al., 2001, 2003). Дослідження стану і кількості клітин макрофагів (МФ) та нейтрофілів (НФ) в лімфатичній тканині, асоційованій з бронхами і легенями (БАЛТ), показало, що наявність морфологічно нормальних МФ і повна відсутність НФ в БАЛТ має місце лише у випадку подвійної колонізації IgA нокаутних мишей (спочатку - Schaedler's E. coli, потім - L. salivarius ASF 361).

Саме у цих тварин кількість МФ є достовірно меншою (2,63·105 МФ/мл), порівняно з мишами, інокульованими одним чи обома штамами лактобацил (7,75·105 МФ/мл). Отже, функціональні молекули Reg III в КАЛТ та SP-D в НАЛТ забезпечують вибіркову проникність слизових оболонок щодо представників коменсальної мікрофлори і, відповідно, причетні до регулювання бактеріальної транслокації; клітинні механізми першої лінії захисту забезпечуються НК в КАЛТ та МФ і НФ в НАЛТ.

Бактерії-коменсали та активація ДК: вплив бактерій на секрецію цитокінів ДК людини. Всі згадані вище бактерії-коменсали слизових оболонок перевірено нами на здатність індукувати синтез про- і/чи протизапальних цитокінів ДК периферійної крові людини. Встановлено, що секреція протизапального цитокіну IL-10 ДК максимально провокується B. subtilis 090, а прозапального цитокіну IL-6 - штамами Schaedler's E. coli та M. morganii. Штам 058 E. coli володіє лише помірною здатністю індукувати синтез IL-6 (150-180 нг/мл) та IL-23 (10 пг/мл). Суттєву експресію IL-12, що відповідає, зокрема, за стимулювання резистентності організму до патогенів шляхом регуляції процесів диференціації наївних Т-клітин в Т хелпери 1, зумовлює лише один із тестованих штамів - Schaedler's E. coli (2-9 нг/мл). Цей же штам індукує секрецію IL-8 (500-2000 нг/мл), а також IL-1b (4-7 нг/мл). Відомо, що IL-8 є важливим медіатором вродженої імунної відповіді і сигналом для імунних клітин до міграції в зону запалення, тоді як IL-1b є посередником запалення, що приймає участь в регулюванні проліферації, диференціації та апоптозу імунних клітин. Подібним до Schaedler's E. coli за спектром активації цитокінів виявився штам M. morganii 1/7, який також максимально стимулює продукування IL-8 (2600 нг/мл) та IL-1b (5-6 нг/мл). Штам Schaedler's E. coli був також здатний індукувати продукцію ДК TNF-a (100-250 нг/мл). Відомо, що саме TNF-a є цитокіном, який стимулює системне запалення, ініціюючи виникнення реакції гострої фази. Зазначений штам призводить до активації експресії генів Nod2 (4-5·103) ДК людини уже через 5 годин експозиції. Ще більший рівень експресії Nod2 зумовлювала 5-годинна інкубація ДК із штамом M. morganii (2-3·103-4·109). Решта тестованих штамів не призводили до активації (порівняно з інтактним контролем) експресії генів Nod1 та Nod2. Останні є цитозольними білковими молекулами, що зумовлюють імунну відповідь на бактеріальний пептидоглікан (Tattoli et al., 2007) і стимулюють запуск прозапальних вроджених механізмів захисту організму шляхом індукції оксиду азоту та антимікробних пептидів. Іншими словами Nod1 і Nod2 є ключовими молекулами в контролі імунної відповіді на збудники бактеріальних інфекцій та запалення. Нами доведено, що грамнегативні представники коменсальної мікрофлори, що містять ЛПС, а не пептидоглікан (ПГ), здатні стимулювати in vitro збільшення експресії Nod1 і Nod2 генів ДК людини. Слід відмітити також, що вроджена імунна відповідь до інфекційних агентів, зокрема до L. monocytogenes, залежить від продукування Nod1 та Nod2 макрофагами. Більше того, звільнення організму від лістерій за умови експериментальної інфекції спостерігали лише у мишей, попередньо стимульованих введенням ЛПС чи E. coli. Тобто Nod1 і Nod2 поступаються лише тол-подібним рецепторам (TLR) в плані розпізнавання бактерій та спрямування і розвитку захисних механізмів організму (Kim et al., 2008). Нещодавно було показано, що Nalp3 стимулюється деякими грампозитивними, але не грамнегативними бактеріями (Ogura, Sutterwala, Flavell, 2006). З іншого боку, є повідомлення про ключову роль саме Nalp3, а не Nalp1 у забезпеченні виникнення ЛПС-індукованого локального запалення (Gonzбlez-Benнtez et al., 2008). Nalp3 (криопірін) є одним із компонентів численної білкової платформи сприяння активації вродженого імунітету і є прекурсором утворення прозапальної каспази 1, що, в свою чергу, ініціює синтез прекурсору IL-1b, вивільнення якого і призводить до сильної локальної запальної реакції. Нами показано, що M. morganii стимулює експресію генів caspase-1 і Nalp3 (криопіну) ДК людини (відповідно в кількостях 0,5·102 - 2·101 і 4-7·103 через 5 годин експозиції), тоді як штам Schaedler's E. coli активує лише експресію caspase-1.

Встановлені нами профілі цитокінів та рівні експресії генів молекул, що регулюють про- і протизапальні процеси вродженої імунної відповіді організму, доводять перспективність використання досліджених штамів бактерій для створення біопрепаратів.

ВИСНОВКИ

Дана дисертаційна робота є новим фундаментальним напрямком досліджень на стику мікробної екології та імунології, оскільки теоретично обґрунтовує концепцію провідної участі мікроорганізмів у керуванні гомеостазу техногенно порушених екосистем і живих організмів.

Базуючись на результатах моніторингових досліджень закономірностей функціонування екосистем за умов поліелементного забруднення, обґрунтовано шляхи вирішення важливої народногосподарської проблеми відновлення техногенно порушених екосистем (на прикладі Верхнього Потисся) шляхом застосування нових бактеріальних препаратів вибіркової дії.

1. Ґрунти трансформованих заплавних екосистем Верхнього Потисся характеризувались понаднормовим зростанням вмісту ВМ одразу після аварійного забруднення ріки Тиса в 2000 році (на початок моніторингу перевищення ГДК для Zn становило 5 разів, Pb - 7, Cu - 1,3, а Mn - до 3,4 рази).

2. Інфільтраційний тип ґрунтів регіону досліджень зумовлює високу здатність ВМ до міграції та накопичення в живих системах, що спричиняє збіднення біорізноманіття мікробних і рослинних угруповань. В мікробних угрупованнях зростає відносний вміст представників умовно-патогенних видів бактерій у структурі мікробних ценозів ґрунту, а у рослинних угрупованнях переважають рудеральні види рослин. Коефіцієнт переходу свинцю із ґрунту у молоко зростає до 0,29-0,97%, а рівень транслокаційного переходу міді в системі ґрунт-молоко збільшується втричі.

3. За результатами однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) до судинних рослин - індикаторів і/або акумуляторів ВМ, найбільш перспективних для фіторемедіації забруднених територій, належать представники родин Ranunculaceae, Primulaceae, Malvaceae, Hederaceae, Salicaceae, Crassulaceae, Celastraceae і Juncaceae.

4. У складі мікробних угруповань найбільш стійкими до типових забруднювальних речовин регіону досліджень є представники родів Bacillus, Proteus і родини Enterobacteriaceae. Зростання чисельності патогенних і умовно-патогенних бактерій у ґрунтах і водах заплав Верхнього Потисся становить реальну епідеміологічну небезпеку для здоров'я населення.

5. Вперше запропоновано біотести для мікробіологічної та біохімічної експрес-діагностики ґрунтів досліджуваних екосистем за умов їх поліелементного забруднення солями ВМ: 1) наявність в пробах індикаторного штаму Acinetobacter spp.; 2) зменшення рівня не менш, як у два рази порівняно із контрольними ділянками, дегідрогеназної активності ґрунтів, забруднених йонами свинцю у кількості 23 мг/кг і більше.

6. ВМ за токсичністю дії на бактерії роду Rhizobium розміщено в такий ряд:

7. Pb > Cu > Ni > Co > Cs > Sr. Вперше виявлено здатність досліджуваних штамів сапрофітних та умовно-патогенних бактерій роду Klebsiella утилізувати тіоціанати та з'ясовано умови підвищення їх біодеструктивного потенціалу.

8. Запропоновано новий комплексний метод очистки промислових стічних вод від фенолів, що базується на використанні штаму A. hydrophila в матрицях із природного цеоліту (клиноптилоліту). У даного штаму вивчено бактеріальну плазміду pAR і побудовано її фізичну карту. Ділянка плазмідної ДНК, яка становить близько 1,3-1,5 т.п.н., несе інформацію гену ампіцилінрезистентності та відповідає за ініціацію реплікації. Вірогідно, що близько 3 т.п.н. в pAR можуть зумовлювати резистентність даного штаму до фенольного забруднення середовища.

9. Запропоновано і апробовано альтернативну до використання антибіотиків схему застосування Моноспорину-ПК для профілактики і терапії захворювань бактеріальної етіології у птахівництві. Доведено протективну і економічну ефективність використання Моноспорину-ПК у ветеринарії та його здатність до корекції функціональної активності щитовидної залози лабораторних і сільськогосподарських тварин.