Клонування генів формальдегіддегідрогенази FLD1 і формальдегідредуктази ADH1 дріжджів Hansenula polymorpha та генно-інженерне конструювання продуцентів дегідрогенази та редуктази формальдегіду

Размещено на http://www.allbest.ru/

9

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

УДК 575.2:577.152.1+602.6+661.727.1

Клонування генів формальдегіддегідрогенази FLD1 і формальдегідредуктази ADH1 дріжджів Hansenula polymorpha та генно-інженерне конструювання продуцентів дегідрогенази та редуктази формальдегіду

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ПАРИЖАК Соломія Ярославівна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі аналітичної біотехнології Інституту біології клітини НАН України, м. Львів.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Гончар Михайло Васильович,

Інститут біології клітини НАН України, м. Львів

завідувач відділу аналітичної біотехнології.

Офіційні опоненти: член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Мацелюх Богдан Павлович,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д.К. Заболотного НАН України, м. Київ,

завідувач відділу генетики мікроорганізмів;

доктор біологічних наук,

Галкін Анатолій Павлович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії

НАН України, м. Київ,

завідувач відділу біоінженерії.

Захист відбудеться “24” грудня 2009 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий “ 17 ” листопада 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О. А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Технічний прогрес, розвиток науки ставлять перед людством низку проблем, здавалося б другорядних, але необхідних для вирішення. Однією з таких проблем останнім часом стала потреба в нейтралізації шкідливого впливу на живі організми деяких хімічних речовин, які утворюються внаслідок практичної діяльності людини. Серед речовин-забруднювачів, які мало вивчені та привертають увагу дослідників чи не провідне місце займає формальдегід (ФА). ФА є широко поширеним промисловим продуктом, який використовується при виробництві багатьох промислових матеріалів і товарів широкого вжитку, як стерилізуючий агент у медицині та фармакології [Gerberich and Seaman, 1994]. Велика частина ФА потрапляє в повітря з відходами виробництва, автомобільними вихлопними газами, а також з різних будівельних матеріалів [Hileman, 1982; Flyvholm and Andersen, 1993; Formaldehyd, 1993]. Він може потрапляти в організм людини з озонованою питною водою [Kalkowska et al., 1995] та певних харчових продуктів. У заморожених рибних продуктах може нагромаджуватись до 200 мг ФА на 1 кг вологої маси, що пов'язано з ферментативною деградацією природного осморегулятора деяких видів риб, оксиду триметиламіну, яка протікає при неглибокому замороженні [Rehbein, 1995]. ФА є токсичною і небезпечною для здоров'я сполукою. Останнім часом медики розвинених країн все частіше звертають увагу на негативний вплив формальдегіду на самопочуття і здоров'я людей, які контактують з ним. ФА подразнює слизові оболонки очей, верхніх дихальних шляхів і є дуже активним сенсибілізатором шкіри. ФА класифікується як мутаген та канцероген [Feron et al., 1991], що підтверджується в експериментах на мікроорганізмах (мутагенна дія) та мишах і щурах (індукція ракових пухлин) [Squire and Cameron, 1984], ФА відіграє важливу патогенетичну роль у розвитку клінічних ускладнень діабету [Yu, 1998]. Наведені факти свідчать про необхідність розробок методів аналізу та детоксикації цієї сполуки, в тому числі біотехнологічних підходів з використанням мікроорганізмів, здатних утилізувати ФА, та ферментів, селективних до цього всюдисущого супутника нашої цивілізації та природного компонента живих систем від часу виникнення її органічних попередників. На сьогодні в літературі описано низку нових підходів для кількісного та якісного аналізу ФА, зокрема, ферментативно-хромогенні системи, газова і рідинна хроматографія, флуориметрія, рефрактометрія та спектрофотометрія, амперометричний сенсор із застосуванням інжекційної техніки, оптичний біосенсор та ферментний біосенсор на базі рН-чутливого транзисторного перетворювача. Але в багатьох із них є недоліки, які зумовлюють пошук нових сучасних високочутливих, селективних та дешевих методів моніторингу ФА в середовищах довкілля та харчових продуктах, у тому числі біосенсорних. Пошук та генетичне конструювання мікробних продуцентів ферментів, які беруть участь у метаболізмі ФА, можуть мати біоаналітичне значення при розробці нових ензиматичних і біосенсорних систем аналізу ФА.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відділі аналітичної біотехнології Інституту біології клітини НАН України. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу і виконувалась в рамках бюджетних тем: “Створення нових біоаналітичних систем на основі оксидоредуктаз” (№ держреєстрації 0106U002598) та проекту “Розробка і виготовлення експериментальних зразків електрохімічних біосенсорів для аналізу формальдегіду в харчових продуктах, фармацевтичних препаратах та довкіллі” (№ держреєстрації 0107U005246) комплексної науково-технічної програми фундаментальних досліджень НАН України “Сенсорні системи для медико-екологічних та промислово-технологічних потреб”.

Робота виконувалась також у рамках міжнародного наукового гранту INTAS OPEN CALL 03-51-6278 “Novel biosensors and analysis kits based on genetically engineered biomolecules for formaldehyde assay”, двох міжнародних індивідуальних проектів: West-Ukrainian BioMedical Research Center (WUBMRC-2006 та WUBMRC-2007) “New biosensors and analysis kits based on recombinant yeast formaldehyde dehydrogenase for formaldehyde assay”, “Enzyme- and cells-based biosensors for assay of formaldehyde in vaccines, food products and consumer goods” та NATO Linkage Grant LST.NUKR.CLG 980621 “Novel biological and chemical sensors for formaldehyde monitoring in wastewaters, foodstuffs and pharmaceuticals”.

Мета та завдання роботи. Метою роботи було отримати рекомбінантні штами термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha з підвищеною продукцією формальдегіддегідрогенази та формальдегідредуктази, які можуть мати біоаналітичне використання; дослідити особливості регуляції синтезу цих ферментів у рекомбінантних штамів, розробити просту і ефективну схему виділення та очистки формальдегідредуктази із відібраного продуцента та створити нові біосенсорні підходи для визначення формальдегіду на основі рекомбінантних штамів.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

сконструювати надпродуценти формальдегіддегідрогенази (ФдДГ) на основі метилотрофних дріжджів H. polymorpha;

дослідити динаміку синтезу ФдДГ та інших ферментів, які беруть участь у метаболізмі формальдегіду, залежно від умов культивування клітин: фази росту, температури, джерел вуглецю та азоту;

оптимізувати умови культивування дріжджів з метою підвищення рівня синтезу цільових ферментів - ФдДГ та формальдегідредуктази (ФР);

розробити оптимальну схему виділення та очистки формальдегідредуктази з відібраного продуцента ферменту;

отримати та охарактеризувати продуценти формальдегідредуктази метилотрофних дріжджів H. polymorpha;

розробити основи імпендансного та амперометричного аналізу формальдегіду з використанням формальдегіддегідрогенази та клітин генно-інженерних надпродуцентів дріжджової глутатіон-залежної формальдегіддегідрогенази;

апробувати мікробні біосенсори для аналізу вмісту ФА в модельних та реальних зразках і порівняти отримані результати з референтними методами.

Об'єктом дослідження були гени обміну ФА та їх білкові продукти - оксидо-редуктази метилотрофних дріжджів, що мають біоаналітичне значення.

Предметом дослідження було генно-інженерне конструювання продуцентів формальдегіддегідрогенази та формальдегідредуктази, дослідження регуляції синтезу цих ферментів та створення нових біосенсорних підходів для аналізу вмісту формальдегіду за допомогою рекомбінантних клітин та ферментів.

Методи дослідження: для конструювання рекомбінантних векторів використовували різноманітні молекулярно-біологічні підходи, такі як рестрикційний аналіз ДНК, отримання фрагментів ДНК з агарозного гелю, лігування вектора із вставкою, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) та ін. Аналіз копійності генів здійснювали за допомогою Саузерн-гібридизації. Для характеристики білкових продуктів досліджуваних генів застосовували аналіз активності ферментів, нативний електрофорез білків, іонообмінну хроматографію, ензиматичні та хімічні методи кількісного аналізу речовин, біосенсорний аналіз, статистичний аналіз, методи комп'ютерного аналізу та комп'ютерні бази даних відомих генів та білків.

Наукова новизна отриманих результатів. Результати, представлені в дисертаційній роботі, дозволяють глибше зрозуміти механізми детоксикації ФА в метилотрофних дріжджів та їх генетичну регуляцію. У результаті виконаної роботи вперше сконструйовано генно-інженерні продуценти глутатіон-залежної формальдегіддегідрогенази та формальдегідредуктази на основі метилотрофних дріжджів H. polymorpha.

Досліджено динаміку синтезу формальдегіддегідрогенази, формальдегідредуктази та алкогольдегідрогенази (АДГ), які беруть участь у метаболізмі формальдегіду, залежно від умов культивування клітин.

Клоновано ген ADH1 Saccharomyces сerevisiae для надекспресії у геномі дріжджів H. polymorpha. Проведено пошук гомологічних послідовностей гена ADH1 S. сerevisiae в геномі H. рolymorpha, ідентифіковано та клоновано дві відкриті рамки зчитування (orf 1017 та orf 347), які мають найбільшу гомологію до гену ADH1 S. cerevisiae.

Для створення мікробних електродних сенсорів, чутливих до формальдегіду, вперше використано генетично сконструйовані штами метилотрофних дріжджів H. polymorpha з високим вмістом NAD+- і глутатіон-залежної формальдегіддегідрогенази як селективні біоелементи.

Вперше показано, що дво-кофакторна рекомбінантна формальдегіддегідрогеназа може служити стабільним біоселективним елементом для створення імпедансного біосенсора.

Практичне значення одержаних результатів. Сконструйовано генно-інженерні надпродуценти ФдДГази - фермента біоаналітичного значення. Розроблено схему препаративного отримання очищеного препарату формальдегідредуктази з рекомбінантного штаму H. polymorpha Tf 22-142.

Сконструйовано лабораторні прототипи амперометричних біосенсорів на основі рекомбінантних клітин H. polymorpha зі збільшеною копійністю гена FLD1 з використанням вільнодифундуючого медіатора феназинметосульфату та вивчено їх аналітичні характеристики. Показано можливість використання розроблених мікробних біосенсорів для визначення формальдегіду в реальних зразках дезінфікуючих та фармацевтичних засобів. Запропоновані амперометричні клітинні біосенсори є перспективними для практики завдяки низці переваг над традиційними ферментними сенсорами: простота отримання біоелементу, дешевизна та стабільність. Також клітинні сенсори мають ширший лінійний діапазон функціонування у порівнянні з ферментними аналогами, що є зручним для аналізу формальдегіду в зразках з високим вмістом цієї сполуки, оскільки процедура визначення не потребує їх додаткового розведення.

Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи автором самостійно відібрано та проаналізовано наукову літературу та підготовано огляд літератури за темою наукового дослідження. Вся експериментальна частина дисертаційної роботи була виконана здобувачем особисто, за винятком деяких експериментів, що проводилися спільно з співробітниками відділу аналітичної біотехнології Інституту біології клітини НАН України (м. Львів, Україна). Розробка програми вирішення поставлених завдань, аналіз та обговорення отриманих результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником - доктором біол. наук, проф. Гончаром М.В., а також з канд. хім. наук Гайдою Г.З., канд. біол. наук Ребцем Ю.В. та інж. Демків О.М., з якими автор має спільні публікації.

Розробка лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів для аналізу формальдегіду на основі рекомбінантних клітин H. polymorpha та вивчення їх аналітичних характеристик проводилась в лабораторії електроаналітичної хімії та сенсорики Рурського університету (м. Бохум, Німеччина) під керівництвом професора Вольфганга Шумана.

Підготовку публікацій у профільні наукові журнали та збірники тез доповідей за результатами дисертаційної роботи здобувач здійснювала разом із співавторами.

Апробація результатів досліджень. Результати досліджень були особисто представлені дисертантом у вигляді усних та стендових доповідей на таких вітчизняних та міжнародних конференціях, конгресах та наукових зібраннях: ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції “Біотехнологія. Освіта. Наука” (Львів, Україна, 2004), конференції “Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, Україна, 2006), “Regional Cooperation for Health, Science and Technology (RECOOP HST) Consortium Meeting” “Bridges in Life Sciences” (Печ, Угорщина, 2007), І - ІV Міжнародних конференціях студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, Україна, 2005 - 2008 рр.), XIX науковій сесії наукового товариства ім. Шевченка (Львів, Україна, 2008), на 12-му Міжнародному конгресі по дріжджах “Yeast for Human Progress” (Київ, Україна, 2008), “Regional Cooperation for Health, Science and Technology (RECOOP HST) Consortium Meeting” “Bridges in Life Sciences” (Загреб, Хорватія, 2008), наукових конференціях молодих вчених Інституту біології клітини НАН України у 2005 - 2008 рр.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 27 наукових праць, які включають 9 статей у співавторстві (п'ять із них - у закордонних журналах) та тези 18 доповідей на міжнародних та українських наукових конференціях та з'їздах.

Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 164 сторінках комп'ютерного набору. Вона складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, розділу, де викладено отримані результати та їх обговорення, а також із висновків і списку використаної літератури. Робота містить 77 рисунків та 11 таблиць. Список використаної літератури налічує 243 джерела.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді висвітлюється питання обміну метанолу у метилотрофних дріжджів та бактерій і його регуляції. Дається характеристика генів резистентності до формальдегіду та механізми його детоксикації. Оскільки частина дисертаційної роботи присвячена пошуку нових біосенсорних підходів для кількісного визначення формальдегіду, то в огляді літератури проводиться порівняння відомих на даний час лабораторних моделей біосенсорів для аналізу цільового аналіту.

Матеріали та методи дослідження. У роботi використовували наступні штами дріжджів із колекції Інституту біології клітини НАН України: Hansenula polymorpha NCYC 495; H. polymorpha CBS 4732; H. polymorpha 356 лінії DL1; H. polymorpha К-105 (gcr1 catX) - безкаталазний мутант метилотрофних дріжджів з порушеною катаболітною репресією синтезу алкогольоксидази; Candida boidinii T2A; Saccharomyces cerevisiae BY4742; Pichia pastoris GS115; P. pastoris SMD542.

Дріжджі вирощували на багатому середовищі (YPD, у г/л): пептон - 10; дріжджовий екстракт - 5; глюкоза - 20) або на синтетичному середовищі Беркгольдера (СБ) [Шавловський та ін., 1978] з наступним мінеральним складом (у г/л): КН2РО4 - 1; (NH4)2SO4 - 3,5; MgSO4•7H2O - 0,5; CaCl2 - 0,1; залізо вносили у середовище у вигляді солі Мора в концентрації 0,2 мг/л, зі стандартною кількістю мікроелементів та 0,05 % дріжджовим екстрактом “Дiфко”. Джерелом вуглецю слугували глюкоза (Glc) (1 або 2%), метанол (МеOH) (1 %), етанол (EtOH) (1 %) або гліцерол (Glyc) (2 %), а джерелом азоту - хлорид амонію (NH4Cl), сульфат амонію - (NH4)2SO4, метиламін гідрохлорид CH3NH3Cl. До середовища при необхідності додавали лейцин - до концентрації 40 мг/л. Агаризовані середовища містили 2 % агару. Культури дріжджів вирощували у термостатах на чашках Петрі при температурі 30 оС. Культивування в рідких середовищах проводили у пробірках або колбах об'ємом 250 мл на круговому шейкері (200 об./хв) за температури 30 оС, 37 оС або 42 оС.

Безклітинні екстракти для визначення активності ферментів отримували як описано в роботі [Демків та ін., 2005]. Концентрацію білка в безклітинних екстрактах визначали методом Лоурі [Lowry et al., 1951]. Калібрувальним стандартом служив альбумін сироватки бика.

Загальні активності ферментів у свіжих безклітинних екстрактах визначали спектрофотометрично при 340 нм за швидкістю утворення NADH - для ФдДГ [Demkiv et al., 2005], ФДГ [Schutte et al., 1976], АДГ [Steinman et al., 1967] або формазану [Murdanoto et al., 1997] чи утилізації NADH - для ФР [Майдан и др., 1997], у відповідних реакційних сумішах, які містили фермент, субстрат і кофактори в 50 мМ фосфатному буфері, а неспецифічні активності - за тих же умов, але без додавання субстрату. Проведення нативного електрофорезу та виявлення білкових зон в ПААГ здійснювали за [Ornstein et al., 1964]. Проявлення зон формальдегіддегідрогеназної активності проводили при інкубації ПААГ протягом 15-20 хв при кімнатній температурі, за відсутності прямих сонячних променів із сумішшю наступного складу: 1 мМ ФА; 1 мМ NAD; 2 мМ GSH; 0,05 мМ нітротетразолієвий синій і 0,003 мМ феназинметосульфат в 50 мМ ФБ, pH 8,0 [Майдан и др., 1997].

Для аналізу ФА використовували три хімічних методи: з хромотроповою кислотою [Polska Norma, 1971], з 3-метил-2-бензотіазолінонгідразоном (MBTH) [Sawicki et al., 1961] та пурпальдом [Avigard, 1983], а також розроблений у відділі аналітичної біотехнології Інституту біології клітини ензиматичний метод [Demkiv et al., 2007].

Методи культивування бактерій E. сoli та молекулярно-генетичні методи описані в [Sambrook et al., 1989]. Трансформацію дріжджових клітин проводили методом електропорації [Faber et al., 1994], літійхлористим методом [Das et al, 1984], літійацетатним методом [Gietz et al., 2002], а також після попереднього сферопластування клітин [Клонирование ДНК, 1988] за допомогою бактерійної літікази [Struhl et al., 1979]. Аналіз за Саузерном здійснювали, використовуючи нерадіоактивну ECL-систему (Amersham Pharmacia Biotech) прямого мічення і детекції нуклеїнових кислот, дотримуючись інструкції.

Амперометричні біосенсори конструювали у трьохелектродній конфігурації. Електродом порівняння служив срібло-хлорсрібний електрод Ag/AgCl/3МKCl або насичений каломельний електрод (НКЕ), як допоміжний використовувався стержневий платиновий електрод, а робочий електрод формувався на основі графітового стержня (тип RW001, діаметр 3,05 мм). Амперометричні дослідження проводились з використанням потенціостату “Autolab” (PGSTAT12, Utrecht, Нідерланди) або восьмиканального потенціостату, приєднаних до персонального комп'ютера.

Іммобілізацію рекомбінантних клітин на поверхні робочого електроду проводили шляхом фізичної фіксації клітинної суспензії за допомогою діалізної мембрани або нафіону та електроосадження в шарі полімеру CP58, синтезованого в лабораторії аналітичної хімії та електросенсорики Рурського університету (м. Бохум, ФРН).

Графічну та статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за допомогою програмних пакетів Microsoft Origin та Excel.

Результати досліджень та їх обговорення

Скринінг видів та штамів метилотрофних дріжджів - продуцентів глутатіон-залежної ФдДГ. Відомо, що синтез дріжджової глутатіон-залежної ФдДГ індукується при метилотрофному рості, тому пошук оптимального штама-реципієнта, придатного для конструювання продуцентів ФдДГ, було здійснено серед метилотрофних дріжджів, наявних у колекції Інституту біології клітини. Для цього клітини дріжджів вирощували за однакових умов у синтетичному середовищі з 1 % метанолом до середини логарифмічної фази, отримували безклітинні екстракти і визначали в них загальну активність ФдДГ. Усі тестовані метилотрофні дріжджі володіли високим рівнем синтезу цільового ферменту. Найвища активність ФдДГ була виявлена в безклітинних екстрактах штамів дріжджів: H. рolymorpha NCYC 495 (leu1-1) - 1,25 ± 0,01; H. рolymorpha CВS 4732 (leu2-2) - 1,13 ± 0,03 та C. boidinii T2A - 1,1 ± 0,06 мкмоль·хв-1·мг-1 білка. Оскільки вищезгадані штами дріжджів H. рolymorpha є термотолерантними і мають ауксотрофні маркери, що є зручним для генетичного конструювання, то їх було взято за основу для створення продуцентів ФдДГ.

Отримання, характеристика та генетичний аналіз рекомбінантних штамів H. polymorpha - продуцентів ФдДГ. З метою отримання надпродуцента дріжджової глутатіон-залежної ФдДГ було використано два вектори для селекції багатокопійних інтегрантів H. polymorpha pHpFLD1 та pHp(FLD1)2. Плазміди містили одну (pHpFLD1; 6,9 кб) або дві (pHp(FLD1)2; 8,9 кб) вставки гену FLD1 H. polymorpha 356. Проведено трансформацію клітин дріжджів H. polymorpha інтактними формами даних плазмід. Вивчалась ефективність трансформації клітин трьома методами - електропорацією [Faber et al., 1994], літійхлоридним методом [Das et al., 1984] та протопластуванням [Клонирование ДНК, 1988] за допомогою бактерійної літікази [Struhl et al., 1979]. Найкращу ефективність трансформації виявив штам NCYC 495 (leu1-1) - 2·103 колоній/мкг ДНК при електропорації в присутності кільцевого вектора рHp(FLD1)2. Частота трансформації літійхлоридним методом була на два порядки нижча - 20 колоній/мкг ДНК, проте вихід трансформантів з підвищеною активністю ФдДГ був вищим. Умови проведення хімічної трансформації були дещо модифіковані, зокрема, були змінені температура та тривалість температурного шоку, якому піддавалися клітини (замість 5 хв при 40 оС витримували 10 хв при 50 оС), у зв'язку з термотолерантністю дріжджів H. polymorpha. Найнижча ефективність спостерігалась при трансформації протопластів - 0,5 колоній/мкг ДНК.

Рисунок 1 ілюструє тандемну інтеграцію вектора pHpFLD1 в хромосому реципієнтного штаму H. polymorpha. Хромосомну ДНК вихідного штаму (leu2-2) та ДНК трансформантів (2 - 8) було оброблено рестриктазою HindIII. У якості зонду було використано повнорозмірний ген FLD1 H. polymorpha, який мітили пероксидазою хрону, використовуючи нерадіоактивну систему ECL. Після гібридизації отримали фрагмент величиною 1,5 т.п.н., який відповідає гену FLD1 H. polymorpha. Кількісну оцінку копійності гену FLD1 в геномі інтегрантів проводили за допомогою Саузерн дот-блот аналізу (рис. 2). Здатність до росту за високих концентрацій ФА у трансформантів чітко корелювала з кількістю копій вектора, інтегрованих у геном трансформанта. Аналіз методом Саузерн-гібридизації показав, що, дійсно, штами, резистентні до підвищених концентрацій ФА, містять щонайменше 6 копій інтегрованої плазміди pHpFLD1, порівняно з сигналом, отриманим з 1 копії гена вихідного штаму [Baerends et al., 2002]. Як видно з рисунків 2 та 3, найбільшу кількість копій гену FLD1 містить інтегрант Tf 11-6 - більше восьми. Такої високої копійності було досягнено завдяки використанню для трансформації плазміди pHp(FLD1)2 з двома вставками цільового гену.

Усі трансформанти, отримані літійхлоридним методом, характеризувались підвищеною стійкістю до ФА на середовищах з різною його концентрацією (5-20 мМ) у порівнянні з вихідним штамом leu2-2 (рис. 3 А, Б).

Для 80 трансформантів, резистентних до 10 мМ ФА, вивчали генетичну стабільність за збереженням прототрофності за лейцином та резистентністю до ФА. Найбільш резистентними трансформантами, отриманими з leu2-2, виявилися: Тf 22-126, Тf 22-142 (до 20 мМ ФА в 1 % метанольному середовищі з 1 % дріжджовим екстрактом). Трансформанти володіли кращими ростовими характеристиками в 1 % метанольному середовищі (рідкому та агаризованому) як з ФА, так і за його відсутності. Штам Tf 22-142 ріс в середовищі з 15 мМ ФА при розведенні суспензії клітин до А600 0,001 (рис. 3А).

Дослідження регуляції синтезу ферментів, які беруть участь у метаболізмі ФА, та оптимізація умов надсинтезу ФдДГ та ФР. Найбільш резистентні до ФА трансформанти тестували за рівнем активності ФдДГ в безклітинних екстрактах. Визначення активності ФдДГ в безклітинних екстрактах кращих штамів показало, що питома активність ферменту в них у кілька разів вища, ніж у вихідного штаму. У рекомбінантних штамів Тf 11-6, Тf 22-126 і Тf 22-142 ця активність була більшою, ніж у вихідних штамів leu1-1 та leu2-2, в п'ять разів, і досягала 5 Од./мг білка, при вирощуванні дріжджів при температурі 37 оС [Парижак та ін., 2006].

Для клітин трансформантів було досліджено оптимальні умови культивування (вплив джерел вуглецю, азоту, ФА, фази росту і температури) з метою досягнення максимального виходу цільових ферментів: ФдДГ, ФР і АДГ (рис. 4). Встановлено оптимальні умови культивування генно-інженерних штамів H. polymorpha як потенційних надпродуцентів ФдДГ. З'ясовано, що для досягнення максимального виходу цільового ферменту як джерело вуглецю слід використовувати метанол, як джерело азоту - метиламінгідрохлорид, як додатковий індуктор біосинтезу ферменту - ФА. Дослідили вплив різних джерел вуглецю на синтез ФР та АДГ у вихідного штаму leu2-2 та його трансформанту Tf 22-142. Як видно з рис. 4, у середовищі з етанолом активності АДГ та ФР є найвищими, порівнюючи з середовищем з глюкозою чи метанолом. Виявили, що найвищі активності ФР та АДГ спостерігаються у стаціонарній фазі росту. Із клітин рекомбінантного штаму Тf 22-142, вирощених на середовищах з різними джерелами вуглецю, отримували безклітинні екстракти (БЕ). Їх піддавали електрофорезу в ПААГ, з подальшою візуалізацією зон ФдДГ активності, витримуючи гелеві пластинки у інкубаційній суміші (15-20 хв), формазановим методом (додаючи 0,05 мМ нітротетразолієвий синій і 0,003 мМ феназинметосульфат) (рис. 5).

Оскільки сконструйовані штами надпродуценти ФдДГ водночас мали підвищений рівень інших ферментів метаболізму ФА, зокрема, ФР, було вирішено використати клітини рекомбінантного штаму Tf 22-142 як джерело для виділення ФР. Для розробки оптимального методу виділення і очистки ФР, клітини Tf 22-42 культивували на стандартному етанольному (1 %) середовищі до біомаси не нижче 1 мг/мл. Осаджені відмиті клітини руйнували на дезінтеграторі. ФР виділяли з БЕ шляхом двостадійної іонообмінної хроматографії на аніонообмінному сорбенті DЕАЕ-Toyopearl 650М (TSK-Gel, Японія), у результаті чого отримано в аналітичних кількостях частково очищений препарат ФР з питомою активністю 10 - 12 Од./мг білка.

Конструювання та ензимологічна характеристика рекомбінантних надпродуцентів формальдегідредуктази. Для підвищення виходу ФР із клітин метилотрофних дріжджів, було вирішено провести генно-інженерне конструювання штаму, здатного до надекспресії гена ADH1, який кодує ФР. Відомо, що продукт гену ADH1 S. сerevisiae крім дегідрогеназних властивостей, володіє редуктазними, тому нами було вирішено клонувати даний ген для надекспресії у геномі дріжджів H. polymorpha. З метою конструювання плазміди експресії, що містить ген ADH1, за допомогою ПЛР, використовуючи сконструйовані праймери (ScFor5'- (ATCATATGTCTATCCCAGAAACTCAA-3')/ScRev(5'-AgcggCcGCATGCCG GTAGAGGTGT-3') і хромосомну ДНК S. cerevisiae BY 4742 як матрицю ми ампліфікували відкриту рамку зчитування гена ADH1 S. cerevisiae. Для полегшення ПЛР, хромосомну ДНК розщеплювали ферментом XbaI. Отриманий фрагмент величиною 1,2 т.п.н. клонували в плазміду pBluescriptIIKS+ за допомогою T/A клонування. Як результат, отримано плазміду pBlSc6. На наступному етапі роботи ген ADH1 S. cerevisiae, фланкований сайтами рестрикції NdeI і NotI, субклонували у плазміду інтегративного типу р21 під сильний конститутивний промотор гена гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAP1) H. рolymorpha. р21 містить домінантний маркер стійкості до зеоцину ZeoR, який забезпечує селекцію у дріжджах. Одержану плазміду було названо р21ADH1Sc (рис. 6).

Сконструйовану плазміду експресії р21ADH1Sc лінеаризували рестриктазою BamHІ та трансформували за допомогою електропорації у штами H. polymorpha NCYC 495 (leu1-1) та H. рolymorpha CВS 4732 (leu2-2). Відбір трансформантів/інтегрантів проводили за резистентністю до зеоцину (за концентрації 150 мкг/мл). Середня ефективність трансформації становила 1,5х103 та 20 (число ZeoR-трансформантів/мкг ДНК) для штамів H. рolymorpha leu1-1 та H. рolymorpha leu2-2, відповідно.

Відібрані штами стабілізували шляхом культивування в неселективних умовах протягом восьми-десяти генерацій з подальшим перенесенням на середовище з зеоцином. Наявність у геномі трансформантів рекомбінатної плазміди, що містить ген ADH1 S. cerevisiae, тестували за допомогою ПЛР. За використання праймерів ScFor/ScRev і хромосомної ДНК стабільних трансформантів як матриці, був отриманий фрагмент очікуваної величини (~ 1,2 т.п.н.). Інтегранти, що містили цю рекомбінантну конструкцію, досліджували на резистентність до ФА. Щоб переконатися, що підвищена резистентність до ФА зумовлена активністю ФР, отримані трансформанти і вихідний штам вирощували на середовищі з 1 % Glc та ФА. У присутності Glc синтез ФдДГ є репресований, тому детоксикація ФА здійснюється за іншим механізмом. Як видно з рис. 7, отримані трансформанти за таких умов вирощування виявилися більш резистентними до ФА. Активності АДГ та ФР у інтегрантів зростали синхронно, але не в однаковій мірі (рис. 8).

Скринінг гомологічних послідовностей гену ADH1 S. сerevisiae в геномі H. рolymorpha. Оскільки на сьогодні залишаються невивченими гени, продукти яких володіють формальдегідредуктазними активностями у H. polymorpha, ми вирішили створити вектори із включенням до їх складу ВРЗ orf 347 та orf 1014 і дослідити продукти експресії цих генів. З цією метою, використовуючи сконструйовані праймери (Orf347HpFor (5'-TcatATGAT GTC TAT TTC GAG AGT TG-3')/Orf347HpRev (5'-agcGGCCGc ACC AGT TAT TTA CCT-3'), Orf1014HpFor (5'-TcaTATGGC ATC CTT CTA TCA ATCA-3')/Orf1014HpRev (5'- TGCGGCCGC ATC ATA TTC ATT CAC CTA T-3' і хромосомну ДНК H. polymorpha як матрицю ми ампліфікували ВРЗ orf 347 та orf 1014. Отримані фрагменти (1,5 т.п.н., 1 т.п.н.) клонували в плазміду pBluescriptIIKS+ за допомогою T/A клонування. Як результат, були отримані плазміди pBlorf347 та pBlorf1014. Плазміду pBlorf1014 було використано для подальшого субклонування гену Orf1014. pBlorf1014 гідролізували ендонуклеазами рестрикції NotI та HindIII, проводили елюцію фрагмента ДНК, розміром 1,0 т.п.н., який лігували з NotI - HindIII розщепленим вектором р21. Ген Orf1014 H. polymorpha умовно позначили ADH1. В результаті було сконструйовано рекомбінантну конструкцію, що отримала назву р21ADH1Hp, величиною 8,9 т.п.н.

Одержану плазміду використали для електротрансформації штама H. рolymorpha leu2-2. Було показано, що р21ADH1Hp трансформує вищезазначений штам до Leu+ZeoR-фенотипу з частотою приблизно 1,2х103 трансф./мкг ДНК. Отримані трансформанти стабілізували, культивуючи почергово в селективних (в середовищі YPD з антибіотиком) і неселективних умовах (YPD) протягом шести пересівів. Додатковим маркером для селекції служив ген LEU2 S. сerevisiae, наявний в складі вектора. Усі стабільні трансформанти, резистентні до зеоцину, були прототрофами по лейцину. У трансформантів, які добре росли на середовищі з зеоцином, досліджували продуктивність синтезу АДГ та ФР. Рекомбінантні штами характеризувалися вищим синтезом цільових ферментів у порівнянні з leu2-2 H. polymorpha. Активність АДГ в безклітинних екстрактах Tf 2 та Tf 3 була в 1,5 - 3 рази вищою, ніж у leu2-2, і сягала 0,66 - 1,33 Од./мг білка. Активність ФР в безклітинних екстрактах Tf 2 та Tf 3 була в 1,3 - 3,7 раза вищою, ніж у leu2-2, і сягала 1,23 - 4,6 Од./мг білка. Отже, плазміда р21ADH1Hp збільшує продуктивність продуцента ФР в середньому в 3 рази. Наявність у геномі трансформантів рекомбінатної плазміди, що містить ген Orf1014 H. polymorpha, тестували за допомогою ПЛР при температурі 51,5 оС. Використовували праймери ScFor/ScRev і хромосомну ДНК стабільних трансформантів як матрицю. Як результат, був отриманий фрагмент очікуваної величини (~ 1,0 т.п.н.). Інтегранти володіли підвищеною резистентністю до ФА і здатні були рости при 3 мМ ФА в середовищі з 1% Glc.

Розробка амперометричних біосенсорів на основі рекомбінантних клітин метилотрофних дріжджів H. polymorpha. Метою роботи була розробка нових варіантів амперометричних мікробних біосенсорів на основі сконструйованих рекомбінантних клітин для кількісного визначення ФА. Оскільки спільним недоліком мікробних сенсорів на основі інтактних клітин є відносна повільність розвитку стаціонарного сигналу та низька селективність сенсорної відповіді, для подолання цих труднощів було вирішено використати в якості біоселективного елементу клітини генно-інженерних надпродуцентів дріжджової глутатіон-залежної ФдДГ. Основним біорозпізнаючим елементом сконструйованих амперометричних біосенсорів були клітини вихідних (leu1-1 і leu2-2) та рекомбінантних штамів (Тf 11-6 і Тf 22-142) термотолерантних метилотрофних дріжджів H. polymorpha [Gayda et al., 2008]. Дріжджові клітини іммобілізували на графітовому робочому електроді фізичною фіксацією клітинної суспензії за допомогою діалізної мембрани або нафіону (феназинметосульфат (ФМС) служив у ролі вільнодифундуючого редокс медіатора). Передбачалось, що медіатор ФМС проникає в клітину, забирає в цитозолі електрони з відновленого NADH, який утворюється в реакції з ФдДГ у присутності ФА, і дифундує назад до робочого електрода (рис. 9).

Біоаналітичні характеристики модельних мікробних біосенсорів. Для сконструйованого модельного біосенсора (на основі рекомбінантного штаму Tf 11-6) вивчали біоаналітичні характеристики (лінійний діапазон відгуку, чутливість, селективність). На підставі концентраційної залежності з'ясовано, що для клітинного біосенсора максимальна відповідь становить 1017 ± 39 нA для 3,05 мм (діаметр) електроду. Позірна величина константи Міхаеліса-Ментен (Км) для сконструйованого сенсора відносно ФА складає 20,1 ± 1,41 мM.

Верхня межа лінійної області калібрувальної кривої для створеного біосенсора становить 8 мМ, а нижня межа складає 0,25 мМ. Встановлено оптимальні умови функціонування біосенсорів: 50 мМ фосфатний буфер, рН 7,6-8,2, температура 45-50 °С, що співпадає з рН- і температурним оптимумами для очищеного препарату рекомбінантної ФдДГ [Demkiv et al., 2007]. Для оцінки різниці фізико-хімічних характеристик мікробних амперометричних біосенсорів на основі батьківських і рекомбінантних клітин дріжджів H. polymorpha, було розроблено різні типи сенсорів. Чітко видно (рис. 10), що рекомбінантні клітини дають вищий і швидший відгук на ФА, ніж клітини дикого типу.

Для вивчення стабільності, мікробні сенсори з архітектурою Tf11-6інт.-NAD+-GSH-нафіон, Tf11-6перм.-NAD+-GSH-нафіон тестувались при 24 оC на автоматичному аналізаторі інжекційного типу “OLGA” (від англ. on-line general analyzer) [Schuhmann W. et al., 1995], розробленому в лабораторії проф. В. Шумана (Рурський університет, ФРН) (рис. 11).

Важливою характеристикою біосенсора є його селективність. При дослідженні селективності розробленого амперометричного клітинного біосенсора встановлено, що найбільша спорідненість для сенсора спостерігається до ФА (100 %), менша - до метилгліоксалю (9,9 %) та етанолу (6 %). Відгук на ацетальдегід, пропіональдегід та масляний альдегід був протилежного напрямку (замість окислення відбувалось відновлення субстрату). Це можна пояснити функціонуванням в клітинах інших ферментів з відмінною від ФдДГ специфічністю. Чутливість до метилгліоксалю, мабуть, пов'язана із структурною подібністю останнього до ФА. Проте, з практичної точки зору, цей факт не ускладнює аналіз реальних зразків на вміст ФА, оскільки метилгліоксаль дуже рідко зустрічається в природних зразках та промислових продуктах.

Стабільність при зберіганні сконструйованих біосенсорів з рекомбінантними дріжджовими клітинами вивчалась шляхом повторних вимірів сенсорного відгуку відносно 0,5 мМ ФА при зберіганні біоелектродів при +4 оС у 50 мM ФБ, pH 8,0. Стабільність електродів була хорошою, оскільки, при 50 %-ному падінні сигналу на 6-у добу, сенсорний відгук падав незначно упродовж 5-ти наступних днів.

Практичне використання мікробних біосенсорів на основі рекомбінантних клітин H. polymorpha Tf 11-6. Можливість практичного використання сконструйованих біосенсорів вивчалась на реальних зразках дезінфікуючих, фармацевтичних засобів та промисловій вакцині проти вірусної геморагічної хвороби кролів, у комбінації з методом „повторного додавання стандарту”, беручи до уваги можливість інтерферуючого впливу компонентів зразків на визначення ФА.

Концентрація ФА у розведених зразках була визначена біосенсорним методом шляхом екстраполяції і складала 3,26 М для “Дескотону форте”; 1,48 М - для “Формідрону”; 13,89 М - для формаліну та 0,042 М - для вакцини проти вірусної геморагічної хвороби кролів. Розраховані величини вмісту ФА для досліджуваних зразків були порівняні з результатами чотирьох референтних методів - трьох хімічних методів (з МБТГ, хромотроповою кислотою, пурпальдом) та ензиматичного підходу за допомогою набору “Форматест”. Було показано, що дані біосенсорного аналізу добре корелюють із результатами, отриманими хімічними та ензиматичним методами [Paryzhak et al., 2008].

ВИСНОВКИ

У результаті виконання дисертаційної роботи отримано рекомбінантні штами термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha з підвищеною продукцією формальдегіддегідрогенази і формальдегідредуктази, досліджено особливості регуляції синтезу цих ферментів та створено нові клітинні біосенсори для визначення формальдегіду з використанням сконструйованих рекомбінантних штамів.

Основні наукові і практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

Створено стабільні генно-інженерні надпродуценти дріжджової глутатіон-залежної формальдегіддегідрогенази H. polymorpha шляхом трансформації клітин плазмідами інтегративного типу, що містять одну та дві копії гену FLD1 цього ж організму. Встановлено, що рекомбінантні штами містять від 6 до 8 копій цільового гена.

Показано, що одержані трансформанти, резистентні до підвищених концентрацій фомальдегіду - до 20 мМ, за певних умов культивування можуть бути продуцентами не тільки формальдегіддегідрогенази, але і алкогольдегідрогенази, формальдегідредуктази та форміатдегідрогенази. Оптимізовано умови культивування рекомбінантних штамів та досліджено динаміку синтезу цільових ферментів, які беруть участь у метаболізмі формальдегіду.

Розроблено схему виділення формальдегідредуктази з безклітинних екстрактів рекомбінантного штаму Tf 22-142 шляхом двостадійної іонообмінної хроматографії на аніоніті ДЕАЕ-Toyopearl 650М, що дозволяє отримувати препарат ферменту з питомою активністю понад 10 Од./мг білку.

Проведено пошук гомологічних послідовностей гена ADH1 S. сerevisiae в геномі H. рolymorpha, знайдено послідовності з 80% гомологією до гену ADH1 S. cerevisiae (Orf 347 та Orf 1014). За допомогою полімеразної ланцюгової реакції ізольовано та ідентифіковано ген ADH1 H. polymorpha, який кодує одну з ізоформ алкогольдегідрогеназ.

Для отримання надпродуцента формальдегідредуктази метилотрофних дріжджів H. polymorpha сконструйовано плазміди експресії р21Sc21 та р21ADH1Hp, що містять гени ADH1 (S. cerevisiae та H. рolymorpha, відповідно), під контролем сильного конститутивного промотора гена GAP1 H. рolymorpha.

Показано, що дво-кофакторна рекомбінантна формальдегіддегідрогеназа із H. рolymorpha може служити стабільним біоселективним елементом для створення імпедансного біосенсора.

Розроблено мікробні амперометричні біосенсори з використанням клітин генно-інженерних надпродуцентів дріжджової глутатіон-залежної формальдегіддегідрогенази Tf 11-6 і Tf 22-126 в ролі біоселективних елементів та апробовано їх при аналізі формальдегіду в реальних зразках формаліну, “Дескотону форте”, “Формідрону” та вакцини проти вірусної геморагічної хвороби кролів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Конструювання штамів - над-продуцентів формальдегіддегідрогенази метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha / О.М. Демків, С.Я. Парижак, О.С. Красовська, О.В. Стасик, Г.З. Гайда, А.А. Сибірний, М.В. Гончар // Біополімери і клітина. - 2005. - Т. 21, № 6. - С. 525-530. (Здобувач брала участь в опрацюванні робочої схеми експериментальних досліджень, аналізі літературних і експериментальних даних, отримувала рекомбінантні штами та вивчала їх резистентність до формальдегіду).

Дріжджові рекомбінантні штами як продуценти формальдегіддегідрогенази: конструювання, селекція, оптимізація умов культивування / С.Я. Парижак, О.М. Демків, Г.З. Гайда, М.В. Гончар // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. пр. / Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова. - К. Логос, - 2006. - С. 624-627. (Здобувач провела дослідження та статистичну обробку даних, проаналізувала та узагальнила літературні джерела, написала та оформила статтю).

Formaldehyde-sensitive sensor based on recombinant formaldehyde dehydrogenase using сapacitance versus voltage measurements / M.B. Ali, M. Gonchar, G. Gayda, S. Paryzhak, M.A. Maaref, N. Jaffrezic-Renault, Y. Korpan // Biosens. Bioelectron. - 2007. - Vol. 22, №12. - Р. 2790-2795. (Здобувач брала участь у препаративному отриманні ферменту, опрацюванні експериментальних даних та написанні статті).

Formaldehyde dehydrogenase from the recombinant yeast Hansenula polymorpha: іsolation and bioanalytic application / O. Demkiv, S. Paryzhak, G. Gayda, V.A. Sibirny, М.V. Gonchar // FEMS Yeast Res. - 2007. - Vol. 7, № 7. - P. 1153-1159. (Здобувач провела дослідження, проаналізувала та узагальнила літературні джерела, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та підготовці статті до друку).

Enzyme- and cells-based biosensors for assay of formaldehyde in vaccines / S. Paryzhak, O. Demkiv, G. Gayda, V. Sibirny, W. Schuhmann, М. Gonchar // 2nd Polish-Ukrainian Weigl Conference “Microbiology in the XXI century”, 24-26 September, 2007. - Warszawa, 2007. - P. 170-173. (Здобувач провела апробацію клітинних біосенсорів на реальних зразках вакцин та брала участь у написанні статті).

Reagentless amperometric formaldehydeselective biosensors based on the recombinant yeast formaldehyde dehydrogenase / O. Demkiv, O. Smutok, S. Paryzhak, G. Gayda, Y. Sultanov, D. Guschin, H. Shkil, W. Schuhmann, M. Gonchar // Talanta. - 2008. - Vol. 76. - P. 837-846. (Здобувач оволоділа методикою біосенсорного аналізу, провела дослідження та статистичну обробку даних, проаналізувала та опрацювала дані літератури, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті).

Recombinant formaldehyde dehydrogenase and gene-engineered methylotrophic yeasts as bioanalitycal instruments for assay of toxic formaldehyde / G. Gayda, O. Demkiv, S. Paryzhak, М. Gonchar, W. Schuhmann // Algal Toxins: Nature, Occurrence, Effect and Detection. Series A: Chemistry and Biology. - 2008. - P. 311-333. (Здобувачу належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз власних результатів та написання статті. Дисертант здійснила скринінг низки медіаторів, провела конструювання мікробних біосенсорів та апробувала їх при аналізі формальдегіду в реальних зразках фармацевтичних та дезінфікуючих засобів).

Intact recombinant cells of the yeast Hansenula polymorpha, over-producing formaldehyde dehydrogenase, as the sensitive bioelements for amperometric assay of formaldehyde / S. Paryzhak, O. Demkiv, M. Gonchar, W. Schuhmann // Sensor electronics and microsystem technologies. - 2008. - Vol. 2. - P. 28-38. (Здобувач розробила оптимальну архітектуру клітинного біосенсора із використанням вільнодифундуючого медіатора феназинметосульфату та дослідила основні його характеристики, написала та оформила статтю).

Формальдегідний кондуктометричний біосенсор на основі рекомбінантної формальдегіддегідрогенази дріжджів Hansenula polymorpha / О.Ф. Сосовська, Г.М. Павлішко, С.Я. Парижак, М.В. Гончар, Я.І. Корпан // Біополімери і клітина. - 2008. - Т. 24, № 2. - С. 135-141. (Здобувач отримала препарат рекомбінантної формальдегіддегідрогенази, опрацювала дані літератури та брала участь у написанні статті).

Конструювання штамів-продуцентів формальдегіддегідрогенази для експрес-аналізу вмісту формальдегіду у середовищах довкілля та харчових продуктах: ІІ Всеукраїнська науково-практична конференція [“Біотехнологія. Освіта. Наука”] / О.М. Демків, О.С. Красовська, О.В. Смуток, О.Г. Стасик, С.Я. Парижак, Г.З. Гайда, М.В. Гончар, (Львів, 6 - 8 жовт. 2004 р.). - Львів, 2004. - С. 124.

Парижак С.Я. Конструювання штамів-продуцентів формальдегід- дегідрогенази метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha: Перша Міжнародна конференція студентів та аспірантів [“Молодь і поступ біології”] / С.Я. Парижак, О.М. Демків, М.В. Гончар, (11 - 14 квіт. 2005 р.). - Львів, 2005 . - С. 134.

Ефективність різних методів трансформації метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha плазмідами з геном FLD1: ІІ Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів [“Молодь і поступ біології”] / С.Я. Парижак, О.М. Демків, Р.А. Назарук, М.В. Гончар, (21 - 24 берез. 2006 р.). - Львів, 2006. - С. 150.

Development of formaldehyde-sensitive amperometric biosensor based on recombinant formaldehyde dehydrogenase from the gene-engineered yeast Hansenula polymorpha: Abs. of 2d International Conference [“Sensor electronic and Microsystems technologies”] / O. Demkiv, S. Paryzhak, O. Smutok, G. Gayda, M. Gonchar, W. Schuhmann, (26 - 30 June 2006.). - Odessa, 2006 . - P. 171.

Дріжджова формальдегіддегідрогеназа як аналітичний інструмент при визначенні вмісту формальдегіду ензиматичним та біосенсорними методами: Міжнародна наукова конференція [“Мікробні біотехнології”] / О.М. Демків, С.Я. Парижак, О.В. Смуток, Г.М. Павлішко, Г.З. Гайда, М.В. Гончар, (11-15 вересня 2006 р.). - Одеса, 2006 . - С. 119.

Formaldehyde dehydrogenase from recombinant Hansenula polymorpha strain and its bioanalytical application: 4th Hansenula Polymorpha Worldwide Network Conference / M. Gonchar, O. Demkiv, S. Paryzhak, O. Smutok, G. Gayda, W. Schuhmann, (3-5 September 2006). - Haren (Netherlands), 2006. - P. 22.

Детоксикація формальдегіду клітинами рекомбінантних штамів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha: 2-ий З'їзд Українського товариства клітинної біології / С.Я. Парижак, О.М. Демків, Г.З. Гайда, М.В. Гончар, (Київ, 23-26 жовт. 2007 р.). - Київ. 2007. - С. 79.

Paryzhak S. Bioanalytical application of formaldehyde dehydrogenase from the recombinant yeast Hansenula polymorpha: 3d International Conference for Students and Post-graduates [“Youth and Progress in Biology”] / S. Paryzhak, O. Demkiv, O. Ishchuk, (April 23-27 2007). - Lviv, 2007. - P. 179.

Enzyme- and cells-based bioanalytic approaches for assay of formaldehyde in consumer goods, environment and biological samples: RECOOP HST Cons. [“Bridges in Life Sciences”] / S. Paryzhak, O. Demkiv, G. Gayda, W. Schuhmann, M. Gonchar, (5 Octоber 2007). - Pecs, (Hungary), 2007. Vol. 1, N 1. - P. 78.

Formaldehyde dehydrogenase from genetically modified methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: isolation and characterization: Intern. conf. [“Biocatalysis - 2007: Fundamentals and Applications”] / G. Gayda, O. Demkiv, S. Paryzhak, M. Gonchar, (17-22 June, 2007). - Moscow-St. Petersburg, 2007. - P. 94.

Парижак С.Я. Генно-інженерне конструювання штамів-продуцентів формальдегідредуктази термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha: Міжнародна конференція студентів та аспірантів [“Молодь і поступ біології”] / С.Я. Парижак, М.С. Щоголєва, (7 - 10 квітня. 2008 р.). - Львів, 2008. - С. 143 - 144.

Construction of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha strains overproducing formaldehyde reductase: 12th International Congress on Yeasts / S. Paryzhak, M. Shchoholeva, Y. Rebets, M. Gonchar, (11-15 August, 2008). - Kyiv, 2008. - P. 269.

Formaldehyde reductase from formaldehyde-resistant gene-engineered methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: isolation and characterization: 12th International Congress on Yeasts / G. Gayda, S. Paryzhak, O. Demkiv, H. Ksheminska, M. Gonchar, (11-15 August, 2008). - Kyiv, 2008. - P. 304.

Recombinant cells of the yeast Hansenula polymorpha over-producing enzymes of analytical importance as the biorecognition elements: 12th International Congress on Yeasts / M. Gonchar, O. Smutok, O. Demkiv, S. Paryzhak, O. Zakalska, K. Dmytruk, A. Sibirny, (11-15 August, 2008). - Kyiv, 2008. - P. 312.

Формальдегідний кондуктометричний біосенсор на основі рекомбінантної формальдегіддегідрогенази дріжджів Hansenula polymorpha: 3-я Міжнародна науково-технічна конференція [“Сенсорна електроніка та мікросистемні технології”] (СЕМСТ - 3) / О.Ф. Сосовська, Г.М. Павлішко, С.Я. Парижак, М.В. Гончар, Я.І. Корпан, (2-6 черв. 2008 р.). - Одеса, 2008 . - С. 94.

Cells-based amperometric biosensors for formaldehyde monitoring in biological samples: RECOOP HST Cons. [“Bridges in Life Sciences”] / S. Paryzhak, O. Demkiv, W. Schuhmann, M. Gonchar, (4 Octоber, 2008). - Zagreb, (Croatia), 2008. Vol. 2, N 1. - P. 48.

Амперометричний біосенсор на платформі продукту окиснення нейтрального червоного: Конф. Хімфак. Аналітика / Б.Б. Остапович, Я.С. Ковалишин, Є.П. Ковальчук, С.Я. Парижак. - Львів, 2008. - С. 28.

Оксидо-редуктази та рекомбінантні клітини дріжджів як аналітичні інструменти: М.В. Гончар, Г.З. Гайда, О.В. Смуток, Г.М. Павлішко, О.М. Демків, С.Я. Парижак // VIII Українська конференція з аналітичної хімії (8-12 вересня 2008 року, м. Одеса). - Одеса: Атлант, 2008. - С. 40.

АНОТАЦІЯ

рекомбінантний штам дріжджі термотолерантний

Парижак С.Я. Клонування генів формальдегіддегідрогенази FLD1 і формальдегідредуктази ADH1 дріжджів Hansenula polymorpha та генно-інженерне конструювання продуцентів дегідрогенази та редуктази формальдегіду. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2009.

Дисертаційна робота присвячена конструюванню мікробних продуцентів формальдегіддегідрогенази (ФдДГ) та формальдегідредуктази (ФР), дослідженню регуляції синтезу цих ферментів у рекомбінантних штамів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha та їх використанню в біосенсорному аналізі формальдегіду (ФА).

Cконструйовано перспективні надпродуценти дріжджової глутатіон-залежної ФдДГ термотолерантних метилотрофних дріжджів H. polymorpha зі збільшеною копійністю гену FLD1 цього ж організму, які характеризувались підвищеною стійкістю до ФА (до 20 мМ). Досліджено оптимальні умови їх культивування для досягнення максимального рівня активності цільового фермента.

...