Клонування генів формальдегіддегідрогенази FLD1 і формальдегідредуктази ADH1 дріжджів Hansenula polymorpha та генно-інженерне конструювання продуцентів дегідрогенази та редуктази формальдегіду

Для отримання надпродуцента ФР метилотрофних дріжджів H. polymorpha клоновано ген ADH1 S. cerevisiae під контролем сильного конститутивного промотора гена GAP1 H. рolymorpha. Ідентифіковано та клоновано ген ADH1 H. рolymorpha, який кодує одну з ізоформ алкогольдегідрогенази (АДГ), яка проявляє ФА-редуктазну активність. Надекспресія генів ADH1 S. cerevisiae та ADH1 H. polymorpha в клітинах H. polymorpha призводить до збільшення резистентності рекомбінантних штамів до ФА і суттєвого підвищення питомих активностей АДГ І/ФР в безклітинних екстрактах рекомбінантних штамів.

Інтактні клітини рекомбінантних дріжджів H. polymorpha з високим вмістом NAD+- і глутатіон-залежної ФдДГ використано як біоселективні елементи для амперометричного визначення ФА. Сконструйовані мікробні біосенсори були успішно застосовані для визначення ФА в реальних зразках дезінфікуючих і фармацевтичних засобів та вакцини проти вірусної геморагічної хвороби кролів.

Ключові слова: метилотрофні дріжджі, формальдегіддегідрогеназа, формальдегідредуктаза, формальдегід, рекомбінантні дріжджові клітини, амперометричний біосенсор.

АННОТАЦИЯ

Парижак С.Я. Клонирование генов формальдегиддегидрогеназы FLD1 и формальдегидредуктазы ADH1 дрожжей Hansenula polymorpha, а также генно-инженерное конструирование продуцентов дегидрогеназы и редуктазы формальдегида. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2009.

Дисертационная работа посвящена конструированию микробных продуцентов формальдегиддегидрогеназы (ФдДГ) и формальдегидредуктазы (ФР), исследованию регуляции синтеза этих ферментов в рекомбинантных штаммах метилотрофних дрожжей H. polymorpha и их использованию в биосенсорном анализе формальдегида (ФА).

Cконструированы перспективные сверхпродуценты дрожжевой глутатион-зависимой ФдДГ термотолерантных метилотрофных дрожжей H. polymorpha с повышенной копийностью гена FLD1 этого же организма, характеризующиеся повышенной резистентностью к ФА (до 20 мМ). Исследованы оптимальные условия их культивирования для достижения максимального уровня активности целевого фермента.

Для получения надпродуцента ФР метилотрофных дрожжей H. polymorpha клонировано ген ADH1 S. cerevisiae под контролем сильного конститутивного промотора гена GAP1 H. рolymorpha. Идентифицировано и клонировано ген ADH1 H. рolymorpha, кодирующий одну из изоформ алкогольдегидрогеназы (АДГ), которая проявляет ФА-редуктазную активность. Повышенная экспрессия генов ADH1 S. cerevisiae и ADH1 H. polymorpha в клетках H. polymorpha приводит к увеличению резистентности рекомбинантных штаммов к ФА и существенному повышению удельных активностей АДГ І/ФР в безклеточных экстрактах реципиентных штаммов.

Интактные клетки рекомбинантных дрожжей H. polymorpha с высоким содержанием NAD+- и глутатион-зависимой ФдДГ использованы в качестве биоселективных элементов для амперометрического определения ФА. Сконструированные микробные биосенсоры были успешно применены для определения ФА в реальных образцах дезинфицирующих и фармацевтических средств, а также препаратов вакцины против вирусной геморраргической лихорадки кроликов.

Ключевые слова: метилотрофные дрожжи, формальдегиддегидрогеназа, формальдегидредуктаза, формальдегид, рекомбинантные дрожжевые клетки, амперометрический биосенсор.

SUMMARY

Paryzhak S.Ya. Сloning genes of formaldehyde dehydrogenase FLD1 and formaldehyde reductase ADH1 of the yeast Hansenula polymorpha and gene-engineering construction of producers of dehydrogenase and reductase of formaldehyde. - Manuscript.

The thesis for Philosophy Doctor scientific degree in Biology (Ph. D.), speciality 03.00.15 - Genetics. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

The thesis is devoted to construction of microbial producers of formaldehyde dehydrogenase (FdDH) and formaldehyde reductase (FR), study of the regulation of their synthesis and application of these enzymes in biosensor analysis of formaldehyde (FA). Perspective gene-engineered yeast clones, originated from the recipient thermotolerant methylotrophic yeast H. polymorpha with multi-copy integration of the FLD1 gene and with elevated resistance to FA (up to 20 mM) have been developed. It was shown that recombinant strains harbor 6-8 copies of FLD1 gene. The optimal cultivation conditions for the selected strains were established which resulted in a maximal synthesis of the target enzyme (with activity of 9 oles•min-1•mg-1 protein in cell-free extract).

Different alcohol dehydrogenases (ADH) are involved in FA detoxification in yeasts. Adh1p of S. cerevisiae reduces acetaldehyde to ethanol and simultaneously catalyzes NADH-dependent reduction of FA to methanol. To obtain recombinant strains of methylotrophic yeast H. polymorpha capable to over-produce FR, ORF of ADH1 gene from chromosomal DNA of S. cerevisiae BY 4742 strain was cloned into an integrative plasmid р21 under the control of strong constitutive promotеr of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (HpGAP). The constructed plasmid р21ADH1Sc was used for multi-copy integration of the target ADH1 gene into genome of H. polymorpha NCYC 495 (leu1-1) and H. рolymorpha CВS 4732 (leu2-2) recipient strains. Selection of the strains was carried out by resistance to zeocine. Two ORF that have more than 80% homology to ADH1 gene of S. cerevisiae were found in the genome of H. polymorpha. One of them was cloned in plasmid р21 and transformed into genome of H. polymorpha leu2-2. Stable recombinant strains had an elevated resistance to FA and higher activities of ADH and FR in cell-free extracts, when compared to the parental strains. The constructed strains are promising organisms for bioremediation of FA, for using in analytical biotechnology and can be used as FR and ADH I sources.

Intact and permeabilised cells of the gene-engineered thermotolerant methylotrophic yeast H. polymorpha, with a high content of NAD+- and gluta-thione-dependent FdDH, were used as the biorecognition elements for amperometric assay of FA. The yeast cells were immobilized on the graphite working electrode by physical fixation of the cell suspension by means of Nafion membranes (phenazine methosulphate was used as a free-diffusing redox mediator). Detection limit for the biosensor based on intact recombinant yeast cells was found to be 0.1 mM. The developed biosensors are selective, inexpensive and stable over several days, as well as simple to manufacture and operate. The constructed microbial biosensors were successfully applied for FA determination in real samples of commercial chemical product (formalin), pharmaceutical (Formidron), disinfectant (Descoton forte) and rabbit vaccine against viral haemorrhage. A good correlation was observed between the biosensors' approaches and photometric enzymatic method, as well as three routinely used chemical ones (chromotropic acid, MBTH and Purpald). The developed bioanalytical approaches can be recommended for practical application instead of labour- and time-consuming chemical methods.

Key words: methylotrophic yeast, formaldehyde dehydrogenase, formaldehyde reductase, formaldehyde, recombinant yeast cells, amperometric biosensor.

Размещено на Allbest.ru