Генетичне поліпшення якості пшениці

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

СЕЛЕКЦІЙНО-ГЕНЕТИЧНИЙ ІНСТИТУТ-НАЦІОНАЛЬНИЙ ЦЕНТР НАСІННЄЗНАВСТВА ТА СОРТОВИВЧЕННЯ

03.00.15 - генетика

УДК 575.113.2:577.112.82

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

ГЕНЕТИЧНЕ ПОЛІПШЕННЯ ЯКОСТІ ПШЕНИЦІ

РИБАЛКА ОЛЕКСАНДР

ІЛЛІЧ

Одеса - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Селекційно-генетичному інституті - Національному центрі насіннєзнавства та сортовивчення, УААН

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік УААН

Сиволап Юрій Михайлович,

Південний біотехнологічний центр у рослинництві УААН, директор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Орлюк Анатолій Павлович, Інститут землеробства південного регіону УААН, завідувач відділу селекції

доктор біологічних наук, професор Чугункова Тетяна Володимирівна, Інститут фізіології рослин і генетики Національної академії наук України, завідувач відділу генетичних основ гетерозису доктор біологічних наук, професор Герасименко Володимир Пилипович, Одеський державний аграрний університет Мінагрополітики України, завідувач кафедри селекції, генетики та захисту рослин, проректор

Захист відбудеться 6 березня 2009 р. о 1230 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.363.01 Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення,

65036, м. Одеса-36, Овідіопольська дорога, 3

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення,

65036, м. Одеса-36, Овідіопольська дорога, 3

Автореферат розісланий 3 лютого 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради З.В. Щербина

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Якість зерна пшениці - тема глобальна і постійно актуальна в усьому світі. Україна - це країна пшениці, яка упевнено заявляє про себе на світовому ринку постійно зростаючим об'ємом зернового експорту. На жаль, українська пшениця поступається за якістю кращим світовим брендам. Не задовольняє рівень якості пшеничного борошна і виробників хліба та хлібопродуктів на внутрішньому ринку. А це означає, що питання якості пшеничного зерна залишається всебічно актуальним.

На теренах колишнього СРСР виконано чисельні дослідження загальних питань якості зерна, які найбільш повно висвітлено в монографіях О.О. Созінова (А.А. Созинов, 1977; А.А. Созинов, Г.П. Жемела, 1983, інш.).

Але нам не відомо жодної докторської роботи, присвяченої комплексному дослідженню питань генетики якості зерна пшениці. Тоді як без глибокого розуміння генетики ознак якості неможливо здійснювати цілеспрямоване поліпшення сортів пшениці за якістю зерна шляхом селекції, яка базується на:

а) генетичних концепціях, побудованих на результатах всебічного вивчення генетичного контролю ознаки якості зерна та її складових;

б) новому генетичному різноманітті, яке може бути ефективно контрольованим доступними методами оцінки та мати чіткі генетичні ефекти на ознаки якості зерна;

в) використанні методів оцінки якості, які дозволяють вести ефективний добір кращих за якістю генотипів у ранніх поколіннях селекційних популяцій;

г) ефективному контролі генетичної чистоти сортів за показниками якості зерна.

Тема цієї дисертаційної роботи передбачає вивчення вищезазначених питань в системі, що дозволяє не лише пояснити певні аспекти генетичного контролю ознак якості зерна пшениці, а й запропонувати селекції принципово новий генетичний матеріал, нові більш ефективні методи його оцінки, нові шляхи еволюції селекції у напряму створення кращих та різноманітних за якістю борошна сучасних сортів.

Це перша дисертаційна робота, присвячена не лише глибокому вивченню генетики хлібопекарської якості борошна пшениці. В ній вперше поставлено питання генетичного поліпшення пшениці за показниками бісквітної якості, харчової та технічної цінності, закладено генетичні основи для нових напрямів селекції сортів пшениці спеціального використання за ознаками якості зерна.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Проведені дослідження виконувались в межах НТП УААН: 1991-1995 рр. - „Розробити генетичні основи якості продукції сільськогосподарських рослин і шляхи їх селекційного використання” (№ д.р. 0194U035090); 1996-2000 рр. - „Теоретичні основи селекції та насінництва сільськогосподарських культур» (№ д.р. 03.04-МВ/322-97), завдання 01.06.01 „Опрацювати генетичну класифікацію запасних і ферментних білків пшениці, ячменю, кукурудзи, соняшника і запропонувати технології ідентифікації генотипів у процесі селекції”, 01.06.02 „Вивчити генетичну природу якості продукції сільськогосподарських рослин та опрацювати шляхи її селекційного використання”, 02.01.01 „Розробити методи інтеграції в геном пшениці стороннього генетичного матеріалу з генами дефіцитних ознак на основі опрацювання методів хромосомної інженерії та віддаленої гібридизації”; 2000-2005 рр. - „Теоретичні основи селекції сільськогосподарських культур”, завдання „Вивчити генетичні зв'язки модельних і маркерних ознак з господарськими показниками сільськогосподарських рослин” (№ д.р. 0104U005931), «Розробити методи створення та розширення генетичної мінливості сільськогосподарських культур» (№ д.р. 0104U005932); 2006-2010 рр. - „Генетичні системи комплексних ознак адаптивності сільськогосподарських культур”, завдання „Дослідити генетичні системи контролю синтезу білків і крохмалю зерна та їх використання для створення сортів пшениці, ячменю, тритикале спеціального призначення”.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження є вивчення генетичного контролю ознак якості зерна пшениці та розробка на цій основі нових напрямів селекції сортів пшениці спеціального використання.

Для виконання поставленої мети розглядалися такі наукові завдання:

- ідентифікація окремих генів (алелів), що кодують біосинтез білків зерна та крохмалю пшениці, вивчення структури і властивостей окремих білків у співвідношенні до їх генетичного контролю, успадковування та впливу окремих генів на якість борошна;

- інтрогресія в геном пшениці та збагачення селекційного генофонду пшениці новими генами, які мають радикальний вплив на якість борошна пшениці для створення сучасних сортів з докорінно іншими показниками якості;

- розробка та впровадження в селекційний процес нових методів ефективної оцінки якості.

Об'єкт досліджень - генетичний матеріал пшениці та сума генетичних факторів, що лежать в основі детермінації та формування цієї складної ознаки в процесі селекції.

Предметом дослідження є генетичні системи та механізми генетичного контролю гетерогенних сумішей білків зерна, властивостей крохмалю у зв'язку з їх впливом на технологічні показники борошна пшениці.

Методи дослідження. Гібридологічний, цитологічний, цитогенетичний, анеуплоїдний, телосомний, біохімічний, технологічний аналізи, метод віддалених схрещувань, статистичний та комп'ютерний аналізи.

Наукова новизна результатів досліджень полягає в наступному:

- вперше виконано картування на короткому плечі хромосоми 1ВS пшениці генного локусу Gli-B1, який кодує синтез запасних білків ендосперму гліадинів. Дослідження мали світовий пріоритет. Аналогічна робота була виконана в Кембріджському університеті трьома роками пізніше (P. Payne, L. Holt, A. Worland, C. Law, 1982).

- вивчено особливості генетичного контролю та успадковування амілолітичних ферментів зерна пшениці, досліджено зв'язки алелів маркерних генів (альфа- та бета-амілази) з селекційно цінними ознаками;

- вперше виконано секвенування (визначення N-термінальної послідовності амінокислот) індивідуальних білків-проламінів, які кодуються алельними кластерами генів, що входять до складу так званого „блоку” зчеплених при успадковуванні електрофоретичних компонентів гліадинів пшениці та cекалінів жита;

- вперше експериментально обґрунтовано гіпотезу про причини негативного впливу запасних білків секалінів жита, що кодуються локусом Sec-1 і синтезуються в ендоспермі пшениці, на реологічні, технологічні та хлібопекарські властивості борошна пшениці;

- за участі дисертанта виконано хромосомно-інженерну модифікацію сегмента короткого плеча житньої хромосоми 1RS з вилученням генного кластера Sec-1, який кодує синтез запасних білків ендосперму жита - секалінів, та заміщенням його на пшеничний генний кластер Gli-B1/Glu-B3 шляхом ph-індукованої генетичної рекомбінації. Опрацьовано способи практичного використання модифікованої транслокації в селекції пшениці на якість;

- розроблено та впроваджено в практику електрофоретичного аналізу (в Україні - Селекційно-генетичний інститут, у Франції - лабораторія компанії Limagrain group) новий метод міні-SDS електрофорезу запасних білків зерна пшениці (гліадинів та глютенінів);

- на базі віддалених схрещувань створено перспективні для селекційного використання оригінальні генетичні лінії пшениці з екзотичними алелями, які кодують синтез запасних білків зерна та мають специфічні ефекти на показники хлібопекарської якості борошна пшениці;

- на базі віддалених схрещувань створено селекційні лінії пшениці з геном На, який має радикальний вплив на консистенцію ендосперму (твердість) зернівки;

- на основі використання гена Ha (хромосома 5D) з ефектом «екстра-софт», походженням від Aegilops tauschii (DD, 2n=14) створено перспективний селекційний матеріал та перший в Україні сорт бісквітної пшениці Оксана - перший національний стандарт для сортів цієї категорії (районований у 2007 р.) для спеціального кондитерського використання. Започатковано новий напрям селекції сортів пшениці кондитерського використання;

- вперше здійснено перенесення в геном пшениці від місцевого ендемічного дикорослого злака Aegilops cylindrica (CCDD, 2n=28) серії генів з позитивним впливом на якість зерна та ефективною стійкістю проти важливих грибних захворювань;

- впроваджено в практику створення селекційного матеріалу нові спонтанні мутації, гени, інтрогресовані в пшеницю від видів-співродичів, хромосомні транслокації та трансгени. На базі цього різноманітного генетичного матеріалу в Селекційно-генетичному інституті за участі дисертанта здійснюється програма селекції сортів пшениці спеціального використання: екстра-сильних, кондитерських, пшениці ваксі, чорнозерної пшениці з підвищеною поживною цінністю зерна, сортів для виробництва біоетанолу;

- з метою поліпшення харчової цінності борошна пшениці за вмістом бета-глюканів та токолів (токоферолів і токотриенолів) вперше висунуто та обґрунтовано ідею взаємоузгодженої селекції ячменю з селекцією сортів хлібопекарської пшениці шляхом дослідження генетики та гармонічного поєднання ознак якості борошна цих двох культур у борошно-сумішах;

- розроблено та впроваджено в практику оцінки якості генетичного і селекційного матеріалу та якості товарного зерна пшениці ефективний двоетапний експрес-метод седиментації SDS-30 (деклараційний патент № 17023, МПК (2006) А01Н 1/04, пріоритет від 15.09.2006 р.);

- вперше в Україні та СНД здійснено оцінку технічної якості зерна сортів і генетичних ліній пшениці за ознакою ефективності трансформації крохмалю зерна в біоетанол. Визначено критерії селекції пшениці на ефективну ферментабільність крохмалю, запропоновано генетичний матеріал для використання в селекції цього напряму та започатковано в Селекційно-генетичному інституті новий напрям селекції сортів пшениці спеціального призначення для виробництва біоетанолу;

- впроваджено (в Селекційно-генетичному інституті з 2005 р.) нову систему оцінки селекційного матеріалу пшениці за показниками якості, яка при високій об'єктивності оцінки дозволяє суттєво скоротити фізичний об'єм селекційного матеріалу;

- впроваджено нову систему контролю генетичної чистоти сортів пшениці за ознаками якості зерна з використанням електрофоретичного аналізу клейковинних білків, починаючи з першого року формування розсадників первинного насінництва.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень впроваджені у вигляді:

а) теоретичних концепцій, які обґрунтовують явище алелізму генних кластерів, що кодують синтез запасних білків та спрямовані на поліпшення ефективності використання чужорідних інтрогресій в селекції на якість пшениці;

б) генотипів-донорів нових генів (алелів), нових селекційних ліній, нового сорту кондитерського використання та перспективного селекційного матеріалу, спрямованого на створення сортів екстра-сильної пшениці, сортів кондитерського використання, сортів чорнозерної пшениці підвищеної харчової цінності, сортів ваксі, сортів голозерного ячменю, призначеного для виробництва борошна та як добавки для покращення пшеничного хліба;

в) нових лабораторних методів оцінки генетичного і селекційного матеріалу пшениці в процесі селекції та первинного насінництва.

Особистий внесок здобувача. Здобувач приймав участь у:

а) формулюванні ідей, робочих гіпотез, розробці планів виконання досліджень, теоретичному аналізі результатів досліджень, формулюванні теоретичних концепцій;

б) виконанні всіх польових та лабораторних дослідів, оцінок;

в) технічному вдосконаленні лабораторних методик, виготовленні лабораторних приладів;

г) підготовці матеріалів досліджень до друку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були презентовані на міжнародній робочій нараді з генетики запасних білків (Paris, France, 1980); на VII ботанічній конференції (Київ, 1980); Всесоюзній конференції „Экология и генетика растений и животных” (Кишинев, 1981); на V Всесоюзному симпозіумі „Молекулярные механизмы генетических процессов” (Москва, 1983); V з'їзді селекціонерів і генетиків України (Київ, 1986); I, II, III International Crop Science Congress „Plant Genome. On the Status on the Plant Genome Research” (Ames, Iowa, USA, 1992; San Diego, USA, 1994, 1995); на І Українському симпозіумі з генетичної інженерії „Регулируемая генетическая изменчивость культурных растений” (Ялта, 1992); міжнародній конференції „Plant Biotechnology and Genetic Engineering” (Kyiv, 1994), міжнародній конференції „Молекулярно-генетичні маркери рослин” (Київ, 1996); міжнародній конференції „Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводства, животноводстве, ветеринарии” (Москва, 1997); нарадах Limagrain group з питань генетики та селекції пшениці на якість зерна „Wheat Pre-Breeding Meeting” (Chappes, France, 1996, 2001; Chartainvilliers, France, 2004); на з'їздах Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавілова „Фактори експериментальної еволюції організмів” (2006), „Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології” (2007).

Публікації. Основні положення дисертації висвітлено у 54 наукових публікаціях: 48 статтях і тезах доповідей (26 праць у фахових виданнях ВАК України), 3 патентах та 3 авторських свідоцтвах на сорти озимої пшениці.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 313 сторінках машинописного тексту. Текст складається зі вступу, 13 розділів, аналізу літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень та дискусійної частини, заключних висновків та практичних рекомендацій.

Робота містить 36 таблиць і 105 малюнків. Список використаної літератури включає 290 найменувань, з них 61- вітчизняних авторів, 229 - іноземних джерел.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Генетика білків зерна та їх роль у визначенні якості пшениці (огляд літератури). У розділі здійснено аналіз результатів досліджень, присвячених вивченню генетики, біохімії клейковинних білків і ферментів зерна пшениці та жита (генетичний поліморфізм), молекулярної структури клейковинних білків пшениці та жита, генетики білків та ферментів, пов'язаних з синтезом крохмалю зерна пшениці. Показано зв'язок між окремими локусами (алелями), що кодують біосинтез білків і ферментів зерна та технологічною оцінкою, хлібопекарською якістю борошна. Зроблено критичний аналіз вітчизняних досліджень, їх порівняння зі світовими здобутками в галузі генетики якості зерна пшениці.

Матеріали і методи. Наведено відомості про матеріали і методи досліджень.

Використаний матеріал. У роботі використано для досліджень різноманітний генетичний матеріал (культурні сорти пшениці, дикоростучі види, штучні амфіплоїди-синтетики, мутантні та рекомбінантно-інбредні лінії, хромосомно-аберантні, нуллісомно-тетрасомні та транслокаційні лінії, інтрогресивні та трансгенні лінії) походженням як з провідних селекційних центрів світу (Європа, Канада, США, Мексика), так і різних генетичних колекцій (ВІР СРСР, Краснодар, Вірменія, Азербайджан, Франція, CIMMYT - Мексика).

Екстракція гліадинів зерна пшениці здійснювалася за стандартною процедурою, розробленою в лабораторії проф. Д. Казарди (Західний регіональний науково-дослідний центр Департаменту сільського господарства США, м. Берклі, Каліфорнія, 1982).

Процедура відновлення та S-карбоксиметилювання гліадинів виконувалася з метою блокування хімічним радикалом зворотної реакції окислення відновлених сульфгідрильних груп білків - SH до внутрішньомолекулярних - S-S-містків.

В основу процедури S-карбоксиметилювання гліадинів покладено метод A. Crestfield, S. Moore, W. Stein, 1963.

Ферментативний (триптичний) гідроліз відновлених та S-карбоксиметильованих гліадинів виконували за стандартною процедурою, розробленою в лабораторії проф. Д. Казарди, в реакційній суміші: піридин (0,05 М), сечовина (4,0М), СаСІ2 2Н2О (0,02 М), СН3СООН (рН 6,8-7,0), вода демінералізована. Пептиди після ферментативного гідролізу гліадинів розподіляли за допомогою одномірного та двомірного електрофорезу.

Гель фільтрацію запасних білків зерна пшениці виконували (за стандартною процедурою, розробленою в лабораторії професора Д. Казарди) на сефадексі G-100, еквілібровному розчином 0,01 М оцтової кислоти, рН 3,1.

Детекцію фракцій елюату на вміст певних субодиниць білка виконували за допомогою вертикального електрофорезу проб кожної пробірки за методом, запропонованим автором цієї дисертаційної роботи. Елюати діалізували протягом доби проти води на холоду, ліофілізували і використовували для подальшого контролю та очистки окремих індивідуальних білків.

Розподіл та препаративне виділення індивідуальних білків за допомогою іонообмінної гель-хроматографії виконували на колонках з іонообмінною смолою катіоніт-аніонітом карбокси-метил-целюлозою СМ 52 або СМ 32 компанії Whatman (Велика Британія).

Колонку з іонообмінною смолою еквілібрували буфером наступного складу: розчин гліцину 0,01 М, розчин NaCI 0,04 М (концентрація солі залежить від типу створюваного градієнту концентрацій солі в буфері для елюції), розчин диметилформаміду 1,5 М (стартовий буфер).

Визначення N-термінальної послідовності амінокислот індивідуальних субодиниць білків здійснювали на автоматичному секвенаторі компанії Beckman (США), модель 890В з мікропроцесором SEQUEMAT та контролером послідовності SC-510 за ДММА-пептидною програмою 111374. Ідентифікацію ФТГ-амінокислот здійснювали за допомогою хроматографії високого тиску на колонці з реверсною фазою (HPLC-RP).

Електрофорез запасних білків пшениці в поліакриламідному гелі (ПААГ) з додецилсульфатом натрію (ДСН) виконували в пластині гелю стандартного формату згідно з базовою процедурою U. Laemli (1970).

Горизонтальний одномірний та двомірний електрофорез клейковинних білків гліадинів пшениці в ПААГ. Метод розроблений в лабораторії професора Д. Казарди (D. Mecham, D. Kasarda, C. Qualset, 1978).

Вертикальний одномірний електрофорез гліадинів пшениці в поліакрил-амідному гелі виконували згідно з процедурою R.Tkachuk, V. Metlish (1980).

Міні-електрофорез гліадинів в поліакриламідному гелі. Метод міні-електрофорезу гліадинів та дизайн електрофоретичного міні-приладу розроблений автором цієї дисертаційної роботи спеціально для використання в експресному режимі з метою електрофоретичного аналізу великих вибірок популяцій гібридів при віддалених схрещуваннях. В основу методичної розробки (для розділяючого гелю) покладений стандартний метод ISTA (J. Kraik, L. Horvath, E. Gregova, I. Zak, 1995).

Міні-ДСН-електрофорез високомолекулярних глютенінів пшениці в поліакриламідному гелі та дизайн електрофоретичного міні-приладу також розроблений автором цієї дисертаційної роботи. Метод призначений для використання в експресному режимі з метою електрофоретичного аналізу великих вибірок популяцій гібридів при віддалених схрещуваннях.

Електрофорез низькомолекулярних глютенінів зерна пшениці в поліакриламідному ДСН-гелі здійснювали за модифікованою в нашій лабораторії процедурою N. Singh, K. Shepherd, G. Cornish (1991).

Електрофоретичний аналіз альфа- та бета-амілаз зерна пшениці виконували за спорідненими лабораторними процедурами, розробленими в лабораторії відділу генетичних основ селекції СГІ. За основу при розробці цих лабораторних методик було взято метод О. Фурсова та Ю. Перуанського (1975).

Метод диференційного забарвлення хромосом по Гімза (C-banding). В роботі використовували модифікацію методу диференційного забарвлення мітотичних хромосом, розроблену в лабораторії проф. А. Лукашевського в Каліфорнійському університеті, Каліфорнія, Ріверсайд, США (A. Lukaszewski, X. Xu, 1995).

Метод цитологічного аналізу мітотичних хромосом в клітинах апікальної меристеми зародкових корінців розроблений за участю автора цієї дисертаційної роботи (А.Ф. Стельмах, Г.П. Бондарь, А.И. Рыбалка, 1974).

Крім описаних методичних процедур в роботі використовувалися різні прийоми віддаленої гібридизації, подолання стерильності гібридів F1, цитологічний аналіз хромосом в метафазі М-1 мейозу, методи телосомного та гібридологічного аналізу, варіаційної статистики.

Робота тісно пов'язана з методикою проведення польових дослідів. Щорічно об'єм польових досліджень сягав 6-15 тис. зразків, висіяних за типом колекційного та селекційного розсадника, 400-500 ділянок у дослідах за типом контрольного розсадника.

В роботі використано також серію стандартних лабораторних процедур технологічної оцінки показників якості зерна. Це різні методи помелу зерна на малогабаритних млинах та на великогабаритному млині Buhler MLU 202; метод визначення водопоглинальної спроможності борошна на фаринографі Брабендера; метод визначення „сили” борошна на альвеографі Шопена; методи мікро- та стандартної лабораторної випічки хліба; методи випічки печива; метод визначення поглинання лужної води борошном; метод седиментації по Зелені та метод седиментації SDS-30 в двох модифікаціях, розроблений автором цієї дисертаційної роботи; метод визначення „числа падіння” на приладі виробництва компанії Пертен (Швеція); метод визначення вмісту білка в зерні (борошні) за К'єльдалем; метод визначення вмісту білка в зерні (борошні), показника твердозерності на інфра-червоному аналізаторі Інфраматік 8611 (виробництво компанії Пертен, Швеція), метод визначення умовної крохмалистості зерна та інші.

Картування хромосоми 1В локусом GLI-B1, що кодує біосинтез гліадинів м'якої пшениці. Для картування локусу Gli-B1, що кодує біосинтез гліадинів, автором вперше використано телосомний метод, який за відсутності необхідної кількості генетичних маркерів на хромосомі дозволяє визначити генетичну відстань локусу від хромосомної центромери.

В результаті цього дослідження установлено, що локус Gli-B1 розміщений в короткому плечі хромосоми 1ВS пшениці на відстані 41,62,47% від центромери. Різні умови вирощування (температура, довжина фотоперіоду) рослин F1 достовірно не впливали на частоту генетичної рекомбінації в сегменті хромосоми, фланкованому локусом Gli-B1 та хромосомною центромерою.

Локус Gli-B1 був першим серед чисельних Gli/Glu-локусів пшениці, розміщеним на генетичній карті хромосом. Подібне дослідження було здійснене в Кембриджському університеті (Велика Британія) трьома роками пізніше (1982).

Крім пшеничного локусу Gli-B1 була здійснена спроба картувати за допомогою телосомного методу локус Sec-1, що кодує біосинтез клейковинних білків жита, в короткому плечі 1RS житньої хромосоми центричної житньо-пшеничної транслокації 1RS.1BL. Рекомбінації між гомеологічними сегментами хромосомних плеч 1ВS пшениці та 1RS жита в жодному з 2500 досліджених генотипів не зафіксовано.

Це дослідження поклало початок картуванню Gli/Glu-локусів на хромосомах пшениці.

Генетичне різноманіття клейковинних білків зерна пшениці: характеристика сортів методом двомірного (2М) електрофорезу гліадинів. Дослідження генетичного різноманіття за електрофоретичним складом клейковинних білків пшениці гліадинів серед сортів та генетичних ліній пшениці здійснювалося за допомогою двомірного (2М) електрофорезу білків, який, на відміну від одномірного (1М) електрофорезу, дозволяє виконувати розподіл гетерогенної суміші білків у двох напрямах. Це дає можливість більш детальної уяви про біохімічну гетерогенність (гомогенність) білків, які вважаються гомогенними при 1М електрофорезі та забезпечує можливість дискримінації генетичних ліній і сортів пшениці, які інколи бувають подібними або ідентичними за електрофореграмами 1М електрофорезу.

Результати цих досліджень значно розширюють уяву про генетичне різноманіття генотипів та сортів пшениці за складом клейковинних білків у порівнянні з 1М електрофорезом.

Дослідження за допомогою 2М електрофорезу гліадинів та водорозчинних білків альбумінів дозволило вперше з'ясувати біохімічні причини низької хлібопекарської якості борошна сортів пшениці з центричною житньо-пшеничною 1RS.1BL.

Ці дослідження показали, що секаліни жита, які кодуються локусом жита Sec-1 та синтезуються в ендоспермі сортів пшениці з житньо-пшеничною транслокацією 1RS.1BL, на відміну від гліадинів пшениці практично повністю розчиняються у демінералізованій воді. Розчиняючись у воді при замісі тіста, житні білки не здатні формувати з білками пшениці клейковинний комплекс, який необхідний для тіста задовільної хлібопекарської якості. Така разюча різниця між біохімічними властивостями білків пшениці та жита, як генетично далеких видів, лежить в первинній структурі (послідовності амінокислот) цих білків, про що піде мова далі в окремому розділі дисертаційної роботи.

Клейковинні білки пшениці, які кодуються локусами Gli-B1, Gli-D1, Gli-A2, Gli-D2 та Sec-1: препаративне виділення та очистка. Для дослідження первинної структури клейковинних білків гліадинів пшениці та жита, які кодуються локусами Gli-B1, Gli-D1, Gli-A2, Gli-D2 та Sec-1 було здійснено препаративне виділення, очистку, ідентифікацію та перевірку індивідуальності окремих білків, які кодуються зазначеними вище локусами.

Кожний очищений і ліофілізований препарат індивідуального білка - це окрема серія біохімічних процедур та умов розподілу гетерогенної суміші білків, які не повторюються.

В результаті використання системи препаративного виділення індивідуальних гліадинів та секалінів нами були ізольовані в очищеному вигляді, необхідному для виконання подальших досліджень, всі індивідуальні компоненти гліадинів, які входять до складу найбільш розповсюджених блоків (алелів) компонентів гліадину: 1D2 та 1D4 (локус Gli-D1) сортів Кавказ та Чейенн, 1В1 (локус Gli-В1) сортів Безоста 1 та Чейенн, 6А1 (локус Gli-A2) сорту Безоста 1, 6D1 (локус Gli-D2) сорту Чайніз Спрінг, індивідуальні секаліни (локус Sec-1) сорту Кавказ та інші.

Біохімічна характеристика гліадинів та секалінів, які кодуються локусами Gli-B1, Gli-D1, Gli-A2, Gli-D2 та Sec-1. Очищені препарати індивідуальних гліадинів пшениці та секалінів жита, які кодуються вищезазначеними локусами, були охарактеризовані за складом похідних пептидів триптичного гідролізу та первинною структурою: N-термінальною послідовністю амінокислот кожного індивідуального білка.

Препарати індивідуальних білків суттєво відрізнялися між собою як за динамікою триптичного гідролізу, так і за спектром утворених пептидів, що свідчить про різноманіття первинної структури цих білків. Фермент трипсин, як відомо, специфічно гідролізує пептидні зв'язки між амінокислотами, лізином або аргініном та суміжними амінокислотами. Різні спектри пептидів, різні їх розміри за молекулярною масою віддзеркалюють особливості первинної структури досліджуваних білків.

Особливо цінну інформацію для формування уяви про первинну структуру індивідуального білка дає процедура блокування сульфгідрильних SH-груп вихідного препарату цього білка різними хімічними радикалами перед гідролізом трипсином: йодооцтовою кислотою та йодоацетамідом.

У першому випадку пептиди, які містять у своєму складі амінокислоту цистеїн

(-SH група) заряджені негативно і рухаються за даних умов електрофоретичного розподілу повільніше, ніж у другому випадку, коли ці ж пептиди мають сульфгідрильні групи, блоковані позитивно зарядженим радикалом.

Наступною характеристикою індивідуальних гліадинів та секалінів, що кодуються локусами Gli-B1, Gli-D1, Gli-A2, Gli-D2 та Sec-1 була визначена первинна N-термінальна послідовність амінокислот індивідуальних білків. Послідовність амінокислот в молекулі білка (пептиду) за принципом ко-лінеарності відображає послідовність нуклеотидів частини структурного гена, який кодує синтез цього білка. Відмінність в структурі двох білків або поліпептидів лише за однією амінокислотою може вказувати на значну як структурну, так і функціональну різницю між цими білками (пептидами).

З метою спрощення сприйняття даних секвенування білків прийнято позначати трьохбуквені скорочення назви окремих амінокислот однобуквеними символами згідно з каталогом лабораторії Bio Rad (1982).

Нами було здійснено секвенування трьох індивідуальних компонентів А-гліадину, що складають „блок” зчеплено спадкових білкових компонентів, який за міжнародною номенклатурою позначається як алель b локусу Gli-A2. Інша частина А-гліадинів секвенована в лабораторії професора Д. Казарди раніше.

Серед восьми секвенованих компонентів А-гліадинів, що складають алель Gli-A2b, було знайдено наступні N-кінцеві послідовності амінокислот:

Для порівняння подаємо основну послідовність гліадину, що кодується локусом Gli-D2b (алель b):

N-кінцеві послідовності амінокислот А-гліадинів є подібними до 10 залишку і відрізнялися лише за позиціями, що підкреслені. Звертає увагу висока спорідненість основних послідовностей амінокислот в білках, що кодуються гомеолокусами Gli-A2 та Gli-D2. Різниця між N-кінцевими послідовностями амінокислот А-гліадинів до 10-го залишку є, головним чином, результатом заміщення амінокислоти валіну (V) на фенілаланін (F) або метіонін (M).

Нами було виконано також порівняння N-кінцевих послідовностей амінокислот шести індивідуальних препаративно виділених гліадинів, які входять до складу двох алелів одного й того ж локусу Gli-D1 сорту Кавказ (алель f - два індивідуальні гліадини щ-1 та щ-2) та сорту Чейенн (алель g - чотири індивідуальні гліадини). Алелі f та g зображені на рис. 1.

Було знайдено, що включно до 15 амінокислотних залишків гліадин щ-1 алеля Gli-D1f сорту Кавказ ідентичний першому та третьому (рахунок зверху-вниз) гліадинам алеля Gli-D1g сорту Чейенн. Тоді як N-кінцеві послідовності амінокислот гліадину щ-2 алеля Gli-D1f сорту Кавказ та другого і четвертого гліадинів алеля Gli-D1g сорту Чейенн були також ідентичними.

Для гліадинів щ-1 та щ-2 сорту Кавказ було знайдено наступні N-кінцеві послідовності амінокислот:

щ - 1 NH2 - K - E - L - Q - S - P - Q - Q - S - F - S - H - Q - Q - Q - P - F

щ - 2 NH2 - A - R - E - L - N - P - S - N - K - E - L - Q - S - P - Q - Q - S

Для порівняння подаємо також послідовність, визначену нами для індивідуального гліадину, який кодується локусом Gli-В1 сорту Чейенн:

1 5 10

NH2 - S - R - L - L - S - P - R - G - K - E - L - H - T -

Була визначена також N-кінцева послідовність амінокислот чотирьох індивідуальних секалінів сорту Кавказ, які складають блок спадкованих у тісному зчепленні електрофоретичних компонентів. Секалін R-2 при 2 М електрофоретичному розподілі містить щонайменше три індивідуальних секаліни, які були нами секвеновані. Наступний за електрофоретичною рухомістю секалін R-3 містить два субкомпоненти, які також були секвеновані. Основна N-кінцева послідовність амінокислот двох індивідуальних білків, які входять до складу секаліну R-2, була наступною:

1 5 10 15

NH2 - R - Q - L - N - P - S - E - Q - E - L - Q - S - P - Q - Q - P - V -

Для третього індивідуального секаліну знайдена послідовність:

1 5 10 15

NH2 - R - Q - L - N - P - L - E - Q - E - L - Q - S - P - Q - Q - P - V -

Секаліни R-2 та R-3 були виділені також з борошна жита сорту Фронтьє. За своєю гетерогенністю та послідовністю амінокислот до 35 залишку вони були ідентичними з секалінами R-2 та R-3, виділеними з борошна сорту Кавказ.

В позиції 6 цієї послідовності, на відміну від основної, установлено заміщення амінокислоти серіну (S) на лецин (L). Послідовність амінокислот двох індивідуальних секалінів в позиції R-3 була наступною:

NH2 - R - Q - L - N - P - S - E - Q - E - L - Q - S - P - Q - Q - P - V -

Виглядає цікавим порівняльний аналіз N-кінцевих послідовностей амінокислот препаративно виділених нами та очищених індивідуальних щ-гліадинів, які кодуються локусом Gli-D1 пшениці, та секалінів.

Якщо порівняти N-кінцеві послідовності амінокислот цих індивідуальних білків з певним зміщенням, то можна помітити загальні ідентичні фрагменти:

Така структурна спорідненість білків свідчить, що гени, які кодують біосинтез зазначених вище білків щ-гліадинів пшениці та секалінів жита, мають загальне монофілетичне походження, незважаючи на те, що в результаті генетичної дивергенції ці гени знаходяться в геномах різних, досить суттєво генетично віддалених видів, якими є пшениця і жито.

Таким чином, результати досліджень N-кінцевих послідовностей амінокислот препаративно виділених білків клейковини дають уяву про структурні особливості білків, генетичну спорідненість та генетичну дивергенцію генів, які кодують біосинтез білків гліадинів та секалінів. Ці дослідження дають підстави для розуміння генетичної природи складного генного кластера („алеля”), що контролює синтез клейковинних білків, його організацію, молекулярну структуру.

Наші дослідження свідчать про існування високої генетичної спорідненості білків, які кодуються локусами Gli-A2 та Gli-D2. Часткова спорідненість виявлена також між щ-гліадинами пшениці, що кодуються локусом Gli-D1, та секалінами жита, контрольованими локусом Sec-1. В той час як N-кінцева послідовність амінокислот гліадину, що кодується локусом Gli-B1 є суттєво відмінною від усіх інших послідовностей, які вивчалися в наших дослідах. Це підтверджує унікальність геному В культурної пшениці та вказує на генетичні відмінності в його еволюційному походженні.

Генетичний контроль ізоферментного складу амілолітичних ферментів зерна пшениці. Наступним завданням роботи було вивчення генетики амілолітичних ферментів б- та в-амілази, які є ключовими гідролітичними ферментами, що приймають участь в фундаментальних процесах обміну вуглеводів зерна. Вони мають пряме функціональне відношення до хлібопекарської якості борошна, хімічно і генетично асоційовані з клейковинними білками зерна, характеризуються значною біохімічною гетерогенністю та генетичним поліморфізмом.

Була визначена локалізація генетичного контролю б-ізо-амілаз зерна у сорту Чайніз Спрінг з використанням повної серії 42 нуллісомно-тетрасомних компенсованих та дітелосомних ліній. В результаті установлено, що критичними хромосомами, в яких локалізовані гени, що кодують синтез ізоамілаз зерна, являються 6AL, 6BL, 6DL, 7AL, 7BL, 7DL. Кожному б-Amy локусу у сорту Чайніз Спрінг відповідає, як правило, один компонент з б-амілазною активністю. Деякі компоненти контролюються за участю локусів кількох хромосом.

Наголошуємо, що ми добре усвідомлюємо різницю між поняттями „електрофоретичний компонент з б-амілазною активністю” та „ізофермент б-амілази” згідно з відомим визначенням терміну „ізофермент” або „ізоензим” = ”ізозим” = (аллозим для гексаплоїдної пшениці), генетичний контроль якого визначений (J. Scandalios, 1964).

Ми вивчили ізоферментний склад б-амілази зерна у більш ніж 400 сортів озимої (247) та ярої (155) м'якої пшениці походженням з різних селекцентрів колишнього СРСР та деяких зарубіжних, головним чином ярих сортів.

Серед дослідженого сортименту було знайдено 8 основних типів зимограм б-амілази. Домінуючими серед досліджених сортів були типи зимограм ізоамілаз зерна 6 та 7. Інші типи становили меншу частку або зустрічалися лише в окремих сортів. Тип 3, незважаючи на попередньо генетично-передбачувану можливість його існування, не був знайдений нами взагалі.

Найбільш помітним результатом цього дослідження була знайдена досить суттєва різниця в частоті появи окремих типів зимограм б-амілази зерна у озимих та ярих сортів пшениці. Наприклад, домінуючий тип 6 був представлений у майже половини (45,7%) досліджених сортів озимої пшениці. Тоді як серед ярих він був представлений у 38,7% сортів. Суттєва різниця між ярими та озимими сортами була знайдена також для типу 5 (29,9% проти 3,9%), типу 2 (4,5% проти 22,3%), типу 1 (0,0% проти 9,7%).

Особливо значну різницю було зафіксовано між ярими та озимими сортами пшениці (57,6% проти 15,8%) за частотою появи швидкого ізофермента б-амілази зерна А8. Цікавим виявився також той факт, що майже всі сорти озимої пшениці (генеалогію яких нам вдалося з'ясувати), які мали в електрофореграмі б-амілази зерна цей ізофермент (А8+мінор А10), походять від схрещувань з участю сортів ярої пшениці.

Гібридологічний аналіз ізоферментного складу б-амілаз зерна нами було здійснено з використанням чотирьох міжсортових комбінацій схрещування. Зимограми б-амілази зерна цих сортів показані на рис. 2.

Найпростішим з точки зору генетичного контролю міжсортової різниці за складом б-амілази зерна виявилася комбінація схрещування Соналіка KVZ-CUT 75. Аналіз класів розщеплення в F2 цієї комбінації схрещування з урахуванням сумісного успадковування всіх трьох аллозимів б-амілази С1, С2 та С3 показав, що співвідношення класів розщеплення (чІ=6,59 та Р>0,20) добре узгоджується з теоретично очікуваним співвідношенням 3:6:3:1:2:1 для дигібридного схрещування, коли один із двох незалежних локусів представлений парою алелів, що коекспресуються, а інший локус - парою алелів, один з яких фенотипово активний, інший альтернативний - не активний (у нашому випадку неактивний алель у сорту KVZ-CUT 75).

Статистичні критерії оцінки успадковування ізоензимів С1, С3, А7 та А8, А10 в F2 комбінації схрещування Ціано 79 лінія № 46726 свідчать, що ці аллозими контролюються локусами, які незалежно успадковуються та розміщені в чотирьох різних хромосомах.

Згідно з логікою дослідження ми маємо підстави вважати, що аллозим С1 сорту Ціано 79, по аналогії з Чайніз Спрінг, кодується локусом в хромосомі 6АL, а аллозим С3 - локусом хромосоми 6DL. Ізозими б-амілази С1 і С3, відповідно, сортів Соналіка та KVZ-CUT 75 контролюються кодомінантними алелями одного й того ж локусу, розміщеного в хромосомі 6АL.

Розщеплення в F2 за ознакою присутність-відсутність ізоензиму С2 в зимограмах б-амілази гібридних зерен F2 від схрещування сортів Ольвія і Одеська напівкарликова з сортом Обрій не відповідало відношенню 3:1, як це мало місце в комбінації схрещування сортів Соналіка та KVZ-CUT 75. Частота появи цього ізоензиму, який контролюється за аналогією з Чайніз Спрінг локусом в хромосомі 6В, в популяціях гібридів F2 обох комбінацій схрещування Обрій Ольвія та Одеська напівкарликова Обрій була суттєво заниженою. В той же час частота появи двох ізоферментів б-амілази А8, А10, що успадковуються зчеплено, в обох комбінаціях схрещування була суттєво завищеною.

Генетична логіка успадковування альтернативних алелів одного й того ж локусу дає нам підстави для висновку, що ізоензим С2 зимограми б-амілази сортів Ольвія та Одеська напівкарликова та група ізоферментів А8, А10 сорту Обрій контролюються алелями одного й того ж локусу хромосоми 6В, хоча цей висновок і не підтверджується статистично. Нульова гіпотеза про зчеплення цих алелів неприйнятна, оскільки, по-перше, серед 450 вищепенців F2 обох комбінацій схрещування не було знайдено жодного генотипу, який можна було б вважати рекомбінантним: в зимограмах б-амілази яких ізоензим С2 та пара ізоензимів А8, А10 були б одночасно відсутніми. По-друге, чисельність гомозиготних класів С2/С2 та А8, А10/А8, А10 становила, відповідно, 82 і 156 або їх частоти, відповідно, 0,182 та 0,347, що свідчить про відсутність зчеплення.

Цікаво, що зміщення фактичного відношення розщеплення в F2 класів гомозиготних генотипів С2/С2 та А8, А10/А8, А10 від теоретично очікуваного 2 : 1 : 1 має чітку односторонньо направлену тенденцію навіть у випадково взятих вибірках малої чисельності (по 40-50 особин) в обох комбінаціях схрещування сортів Обрій Ольвія та Одеська напівкарликова Обрій (табл. 1).

Таблиця 1 Відхилення чисельності генотипів з ізоензимами б-амілази С2 та А8, А10 в F2 гібридів випадково взятих вибірок (n=450)

Комбінації ізоензимів

Фенотипові класи F2

++

+

+

++

+

+

++

+

+

++

+

+

++

+

+

F2, Одеська напівкарликова Обрій (n=200)

С2-А8, А10:

n1=40

n2=40

n3=40

n4=40

n5=40

фактичне

18 : 9 : 13

21 : 6 : 13

23 : 7 : 10

15 : 9 : 16

22 : 4 : 14

теоретичне

20 : 10 : 10

20 : 10 : 10

20 : 10 : 10

20 : 10 : 10

20 : 10 : 10

2 1 +3

+1 4 +3

+3 3 0

5 1 +6

2 6 +4

F2, Обрій Ольвія (n=250)

С2-А8, А10:

n1=50

n2=50

n3=50

n4=50

n5=50

фактичне

23 : 11 : 16

24 : 6 : 20

25 : 11 : 14

17 : 12 : 21

23 : 7 : 20

теоретич.

25:12,5:12,5

25:12,5:12,5

25:12,5:12,5

25:12,5:12,5

25:12,5:12,5

2 1,5 +3,5

1 6,5 +7,5

0 1,5 +1,5

8 0,5 +8,5

2 5,5 +7,5

Феномен закономірного зниження частоти появи в популяції F2 одного альтернативного алеля (С2) за рахунок підвищення частоти іншого (А8, А10) не описаний в джерелах, присвячених вивченню генетики б-амілази зерна пшениці. Для пояснення цього явища ми виходили з того, що для наших дослідів використовувалися індивідуальні зерна F2, які сформувалися на гібридних рослинах F1. Тобто, мова йде про генотипи F2, які ще не були рослинами. Це означає, що фактор, який привів до зміщення очікуваної рівної імовірності частот (0,25:0,25) вищеплення фенотипових гомозиготних класів, не є абіотичним, котрий міг би зумовлювати різну імовірність виживання С2/С2 або А8, А10/А8, А10 гомозиготних рослин F2.

Враховуючи викладені вище обставини, найбільш імовірною гіпотезою було припущення про існування конкуренції між гаметами, які несуть алелі С2 та А8, А10 одного й того ж локусу хромосоми 6В в гетерозиготній рослині F1. Гіпотеза щодо можливої конкуренції гамет з алелями С2 та А8, А10 підтверджується результатами аналізу розщеплення за складом ізоферментів б-амілази С2 та А8, А10 в F2 попередніх комбінацій схрещування Соналіка KVZ-CUT 75 та Ціано 79 лінія № 46726. В обох випадках розщеплення за ознакою присутність-відсутність ізоферментів С2 та А8, А10 відповідало очікуваному 3:1. Але в обох цих випадках алельним варіантом для С2, як і для А8, А10 був фенотипово неактивний (німий) нуль-алель.

Для перевірки гіпотези про існування феномену конкуренції між гаметами, що несуть алелі С2, або А8, А10, нами було виконано спеціальний дослід, який підтвердив факт більш високої конкурентоздатності гамет (пилку) сорту Обрій, які несуть алель, що контролює ізоензими б-амілази А8, А10 у порівнянні з чоловічими гаметами сорту Одеська напівкарликова, які мають алель, що кодує ізоензим С2. Але ж ізоензими С2 та А8, А10 синтезуються в зерні, що проростає, і здавалося б ніякого відношення до функції гамет мати не повинні. Можливо, що алелі, які контролюють ізоензими С2 та А8, А10 тісно зчеплені з іншими генами, які впливають на функцію гамет. Імовірно також, що алелі, які кодують ізоензими б-амілази С2 та А8, А10 активні і в пилковому зерні. Адже в пилковому зерні, як відомо, крохмаль є домінуючим за вмістом компонентом, розщеплення якого здійснюється амілазами пилкового зерна.

Важливо також підкреслити, що алель, який контролює групу ізоферментів б-амілази А8, А10 привнесений до генотипу сорту Обрій від його ярої батьківської форми, сорту Ред Рівер 68. Крім того, як свідчать результати наших попередніх досліджень, алель А8, А10 домінує за частотою появи серед сортів ярої пшениці і зустрічається з невисокою частотою головним чином у тих сортів озимої пшениці, які походять від схрещування з ярими. Сорт Обрій належить саме до цієї категорії сортів.

Таким чином, отримані результати генетичного аналізу ізоферментного складу б-амілази свідчать, що відмінність за ізоферментним складом б-амілази зерна між сортами пшениці Соналіка та KVZ-CUT 75 контролюється двома незалежними локусами в довгих плечах хромосом 6А та 6В. Згідно з міжнародною номенклатурою ці локуси мають символіку, відповідно, б-Amy-A1 та б-Amy-B1. При цьому локус б-Amy-A1 представлений двома кодомінантними алелями С1 та С3, а локус б-Amy-B1 має також два алеля, один з яких активний С2, а інший німий нуль-алель.

Різниця між зимограмами б-амілази зерна сорту Ціано 79 та лінії № 46726 контролюється чотирма незалежними локусами з двома (один активний, один неактивний) алелями кожний. Алель С1 локалізований в довгому плечі хромосоми 6А (локус б-Amy-A1), алель С3 - в довгому плечі хромосоми 6D (локус б-Amy-D1), алель А8, А10 - в довгому плечі хромосоми 6В (локус б-Amy-B1). Локалізація алеля А7 не визначена.

Різниця за ізоферментним складом б-амілази зерна сортів Обрій та Ольвія контролюється, головним чином, двома локусами в довгих плечах хромосом 6А (б-Amy-A1 )та 6В (б-Amy-B1), кожний з яких представлений двома фенотипово активними алелями (локус б-Amy-A1 - алелі С1 та С3, локус б-Amy-B1 - алелі С2 та А8, А10) та локусом б-Amy-D1 - з активним алелем С3 та нуль-алелем. Зимограми цих сортів відрізняються також в зоні А швидких ізоамілаз, але через нечіткість розподілу ця зона поки що не доступна для генетичного аналізу.

...