Генетичне поліпшення якості пшениці

Різниця за ізоферментним складом б-амілази сортів Одеська напівкарликова та Обрій контролюється трьома локусами: б-Amy-B1 (алелі С2 та А8, А10), б-Amy-D1 (алелі С3 та нуль-алель) та не визначеним локусом з алелем А5 та нуль-алелем.

Не менш значна за об'ємом досліджень робота була виконана з генетичного аналізу в-амілаз зерна пшениці. Логіка дослідження генетики в-амілаз була такою ж, як і вивчення генетичного контролю ізоферментного складу б-амілази: від нуллі-тетрасомних та дітелосомних ліній сорту Чайніз Спрінг, через гібридологічний аналіз ізоферментного складу в-амілази в системі міжсортових схрещувань до встановлення можливого зв'язку з агрономічними ознаками пшениці і, в першу чергу, якістю зерна.

Однією з найцікавіших комбінацій для дослідження було схрещування Одеська 51 Лікафен. Зимограми в-амілази цих сортів показані на рис. 3.

В цій комбінації схрещування ми вивчали успадковування кожного ізоферменту в-амілази та їх комбінацій окремо (табл. 2).

Аналіз розщеплення свідчить, що ізоферменти в-амілази 2 і 3 сорту Лікафен контролюються кожний окремим локусом, які успадковуються незалежно. Ізофермент 4 (або коректніше - електрофоретичний компонент з активністю в-амілази) сорту Одеська 51 контролюється двома незалежними локусами.

Таблиця 2 Успадковування ізоферментів в-амілази в F2 від схрещування сортів пшениці Одеська 51 Лікафен

В цілому результати генетичного аналізу ізоферментного складу в-амілази вказують, що генетичне різноманіття, яке спостерігається за ізоферментним складом цього ферменту серед сортів пшениці, контролюється, головним чином, трьома локусами: в-Amy-А (ідентифіковано два алеля), в-Amy-В (ідентифіковано два алеля), та в-Amy-D (також ідентифіковано два алеля).

В наших дослідженнях було продемонстровано зв'язок ізоферментного складу б- та в-амілази зерна пшениці з деякими агрономічними ознаками, такими як мутантний (зморшкуватий) ендосперм високолізинового мутанту М90/8, особливостями проростання зерна пшениці.

Достовірно установленого зв'язку ізоферментного складу б- та в-амілаз зерна з показниками хлібопекарської якості в кількох комбінаціях не було знайдено.

Чужорідний генетичний пул як джерело розширення генетичного поліморфізму пшениці за ознаками якості зерна. Наступним завданням дисертаційної роботи була спроба інтрогресії від дикорослих видів в геном культурної пшениці екзотичних алелів Gli/Glu-локусів у руслі розвитку стратегічної для селекції пшениці тематики: розширення за рахунок дикорослих видів генетичної варіабельності, пов'язаної з якістю зерна, яка могла бути ефективно використаною в селекції нових сортів цієї культури.

Ми поставили перед собою завдання не лише перенести від співродичів в геном культурної пшениці окремі гени, що контролюють ознаки якості зерна, а створити на основі цих генів оригінальний генетичний матеріал, придатний для прямого і ефективного використання в гібридних комбінаціях селекційних схрещувань.

Для здійснення цієї мети нами була сформульована стратегічна програма досліджень, яка включає чотири головні позиції:

1) принцип добору дикорослих видів-донорів ознак якості зерна для схрещування з сортами культурної пшениці;

2) цитогенетична методологія виконання віддалених схрещувань, беккросів та добору оригінального генетичного матеріалу;

3) методи оцінки за ознаками якості зерна оригінального генетичного матеріалу від віддалених схрещувань;

4) спосіб впровадження оригінального міжвидового генетичного матеріалу в селекційний процес.

В результаті ми зосередили свій вибір на генетично близьких до культурної пшениці дикоростучих видах-донорах ознак якості, таких як егілопси (Aegilops). Теоретичне обґрунтування цього вибору подане в рукописі дисертації.

Цитогенетична методологія наших досліджень з інтрогресії генів в геном культурної пшениці базується на чотирьох основних теоретичних положеннях:

а) визнанні пріоритету цитоплазми культурної пшениці перед цитоплазмою дикорослих видів - всі первинні схрещування та беккроси виконувалися з використанням базових комерційних сортів пшениці як материнського компоненту;

б) визнанні ключової ролі геному D у ботанічного виду м'якої пшениці Triticum aestivum L. як культури взагалі та у визначенні її хлібопекарської якості, особливо в міжвидових схрещуваннях використовувалися головним чином егілопси - донори геному D;

в) визнанні ролі чоловічих гамет (пилку) як „генетичного фільтру” дефективних гамет з кількісними (анеуплоїдними) та структурними хромосомними абераціями - всі беккроси (крім BC1 у схрещуваннях з високою стерильністю) виконувалися з використанням у якості материнської компоненти базових комерційних сортів пшениці, що сприяло елімінації або зниженню частоти передачі через чоловічу статеву сферу дефективних гамет, зниженню чисельності генотипів з послабленою життєздатністю, підвищенню ефективності добору перспективного селекційного матеріалу з чужорідними інтрогресіями;

г) наданні в дослідженнях пріоритету класам білків зерна, які мають домінуючий вплив на фізичні властивості клейковини пшениці: гліадини (локус Gli-1), як генетичні маркери низькомолекулярних глютенінів (локус Glu-3) та високомолекулярні глютеніни (локус Glu-1).

Нами розроблені та впроваджені в практику досліджень генетичного матеріалу міжвидових схрещувань методи міні-електрофорезу білків зерна, які дозволяють вибірково контролювати саме необхідні нам білки, що кодуються цільовими локусами Gli-1/Glu-3 і Glu-1 та завдяки експресності цих методів вчасно виконувати скринінг великих вибірок міжвидових гібридів.

Формою завершеного дослідження ми обрали генотип (рослину) або групу рослин з бажаною інтрогресією, а в найкращому варіанті ділянку стандартного суцільного посіву площею 5 м2, висіяну за стандартною схемою контрольного селекційного розсадника у порівнянні з сортами-стандартами. Остання форма впровадження генетичного матеріалу з чужорідною інтрогресією є найбільш прийнятною, оскільки дає можливість об'єктивно характеризувати інтрогресивні лінії в умовах стандартного польового селекційного досліду.

Перш ніж почати цілеспрямовану роботу з інтрогресії чужорідних генів в геном культурної пшениці ми виконали цитологічне дослідження потомств від віддалених схрещувань, щоб уявити реальну картину руйнації хромосомного набору культурної пшениці, яка має місце в результаті віддалених схрещувань. В якості моделі була обрана комбінація схрещування комерційного високоякісного сорту Обрій (геномна формула ААВВDD) з амфіплоїдом Авролата (геномна формула ААВВUU), який був створений і наданий нам для використання Є.Г. Жировим (м. Краснодар). Обидва компоненти схрещування мають в диплоїдному наборі 42 хромосоми. У амфіплоїда Авролата геноми А та В від сорту Аврора, геном U - від диплоїдного дикорослого виду егілопсу Ae.umbellulata, який має геном U, генетично близький до геному D м'якої пшениці, та екзотичні локуси Gli-U1 і Glu-U1, що кодують оригінальні електрофоретичні варіанти гліадинів та високомолекулярних глютенінів цього виду.

Щоб мати приблизну уяву про структурні аномалії хромосом, ми поділили телосомічні фрагменти хромосом на умовно довгоплечі (L) та умовно короткоплечі (S). Фрагменти хромосом з обома частково делетованими плечами позначили як Х.

Серед популяції гібридів F4 (рослини F3) було знайдено наступні типи хромосомних аберацій на фоні різних чисел хромосом: 40+Х, 47+Х, 42+Х, 45+Х, 40+2Х, 38+teloS, 39+ teloS, 40+ teloS, 41+ teloS, 42+ teloS, 44+ teloS, 49+ teloS, 34+ teloS, 35+ teloS, 35+ teloL, 36+ teloL+Х, 38+ teloS+Х, 40+ teloS+ teloL, 41+ iso, 42+dicentr., 42+ teloS+Х, 43+ teloS+2Х, 22+ teloL, 40+ teloL, 40+2 teloL, 41+ teloL, 42+ teloL, 42+2 teloL, 43+ teloL, 43+2 teloL, 44+ teloL, 45+ teloL, 46+ teloL, 49+ teloL, 50+ teloL.

Серед аберантних типів хромосом виявлено один з діцентричною хромосомою та один з ізохромосомою, утвореною коротким плечем сателітної хромосоми.

Розподіл генотипів з хромосомами без структурних аберацій в популяції F4 в цілому близький до нормального розподілу. Мінімальна чисельність хромосом була 22, максимальна - 64. Найвища частота в популяції F4 знайдена для генотипів з числом хромосом 40, 41 та 42 або в частотах, відповідно, 0,197, 0,188 та 0,176.

В цій же популяції ми досліджували успадковування високомолекулярних глютенінів, що кодуються локусом Glu-U1 хромосоми 1U егілопсу Ae.umbellulata. Було проаналізовано за допомогою електрофорезу 156 зерен F4 з різних рослин F3. У 55 з них ідентифіковано дві субодиниці високомолекулярних глютенінів, що кодуються локусом Glu-U1. Ці субодиниці були присутні в кожному з 55 зерен сумісно, як у вихідного амфіплоїду Авролата, або колекційного зразка егілопсу Ae. umbellulata, К2244 (ВІР), який використовувався в нашому досліді для порівняння. Інакше кажучи, спостерігається помітне відхилення частоти появи (0,35) в популяції F4 маркерного для хромосоми 1U егілопсу Ae. umbellulata локусу Glu-U1 від очікуваної частоти приблизно 0,50. Це вказує як на можливість відбору проти локусу Glu-U1 (або хромосоми 1U), так і на те, що хромосома 1U не належить до числа тих 4-5 хромосом, яка здатна в метафазі М1 мейозу стабільно формувати з гомеологічною хромосомою 1D пшениці біваленти. Але така частота появи генотипів з локусом Glu-U1 була достатньо високою, щоб зробити добір життєздатних генотипів з локусом Glu-U1 для подальшого вивчення впливу цього локусу на хлібопекарські властивості борошна пшениці.

Одними з найбільш інтенсивно використовуваних в дослідженнях з інтрогресії в геном культурної пшениці екзотичних алелів Gli/Glu-локусів були такі дикорослі види, як Ae. cylindrica (геномна формула ССDD, 2n=28), Ae. taushii (геномна формула DD, 2n=14), Ae. ventricosa (геномна формула DDUnUn, 2n=28), Ae. variabilis (геномна формула UUSS, 2n=28).

Всі дикорослі види (підвиди), а також штучні синтетики або амфіплоїди, що використовувалися в роботі, були вивчені за електрофоретичним складом білків зерна у порівнянні з базовими сортами-реціпієнтами м'якої пшениці. Загальні висновки за результатами порівняльного електрофоретичного аналізу клейковинних білків зерна дикорослих видів та амфіплоїдів наступні:

- дикорослі види характеризуються надзвичайно широким генетичним поліморфізмом гліадинів та глютенінів;

- серед дикоростучих видів практично не зустрічаються такі, які містять ідентичні пшеничним алелі локусів Gli-1 та Glu-1.

Ідентифікувати в електрофореграмах білків зерна дикоростучих видів алелі локусів Gli-2, Glu-2 та Glu-3 досить складно. Лише у колекційних ліній Ae. tausсhii в електрофореграмах гліадинів та глютенінів були знайдені схожі з пшеничними алелі локусів Gli-1 та Glu-1.

В результаті багаторічної (1987-2007 рр.) роботи з віддаленої гібридизації в культурну пшеницю від дикорослих видів перенесено цілий ряд екзотичних Gli/Glu-алелів. Щоб уявити генетичне різноманіття за алельним складом локусу Glu-D1 (високомолекулярні глютеніни), що було інтрогресовано від егілопсів, носіїв геному D, в геном культурної пшениці за участю автора цієї дисертації, наведемо лише найбільш використовувані у наших схрещуваннях типи алелів локусу Glu-D1, зображені на рис. 4.

Узагальнюючи результати досліджень в цьому напрямі слід зазначити, що інтрогресовані нами в культурну пшеницю чужорідні екзотичні Gli/Glu-алелі головним чином негативно впливають на ознаки хлібопекарської якості борошна пшениці. Але, разом з тим, нами зафіксовані позитивні і навіть досить сильні позитивні ефекти чужорідних алелів на хлібопекарські властивості борошна пшениці. Наведемо кілька прикладів негативного та позитивного впливу інтрогресованих від дикорослих видів в пшеницю Gli/Glu-алелів.

Дослідження якісних показників у сімей, що походять від схрещування пшениці з Ae. umbellulata показало, що негативний вплив на якість борошна в цих комбінаціях обумовлений присутністю локусу Glu-U1, розміщеного в довгому плечі хромосоми 1U геному егілопса Ae. umbellulata у складі амфіплоїда Авролата з геномною формулою ААВВUU (табл. 3).

Таблиця 3 Показники якості зерна сімей пшениці від схрещування ВС1/F4 (Одеська напівкарликова Авролата)Одеська напівкарликова

Одна група була представлена рекомбінантно-інбредними сім'ями, які мають у складі гліадинів хромосомну транслокацію від Ae. cylindrica з алелем Glі-D1cyl, інша група - зі звичайним альтернативним алелем пшениці Glі-D1g (табл. 4).

Таблиця 4 Показники якості борошна у сімей пшениці від віддаленого схрещування ВС2/F4 Одеська напівкарликова Ae. cylindrica

** Р <0,01; *** Р <0,001.

З метою вивчення впливу алеля Glі-D1cyl, інтрогресованого в пшеницю від Ae. cylindrica на показники якості борошна, нами були відібрані дві групи найкращих за агрономічними ознаками зразків з гібридної популяції ВС2/F4 схрещування сорту Одеська напівкарликова зі зразком егілопсу Ae. cylindrica, відібраного з місцевої дикорослої популяції.

Наведені в таблиці 4 дані свідчать, що сім'ї пшениці від схрещування з Ae. cylindrica, які мають алель Glі-D1cyl, достовірно відрізняються від сімей з альтернативним пшеничним алелем Glі-D1g за розміром часток борошна та реологічною оцінкою за міксографом. Це, як зазначалося, важливі показники, оскільки перший характеризує борошномельні характеристики зерна пшениці, а другий - фізичні властивості тіста.

Іншими словами, сім'ї з екзотичним алелем Glі-D1cyl характеризуються більш високою твердістю зерна (у різних дослідах в середньому 8% від загальної варіабельності) та вищим показником фізичної якості тіста у порівнянні з сім'ями з пшеничним алелем Glі-D1g, навіть з достовірно зниженим вмістом білка в зерні. Слід зауважити, що означений характер відмінностей за ознаками якості зерна генотипів з алелем Glі-D1cyl та іншими альтернативними алелями пшениці в інших схрещуваннях за участю Ae. cylindrica підтверджувався протягом кількох років вивчення.

На основі ліній з інтрогресією 1DScyl створений цінний селекційний матеріал, який використовується в селекційних програмах Селекційно-генетичного інституту. Крім генного кластеру Glі-D1cyl/Glu-D3cyl нами визначено також позитивний ефект на якість пшеничного борошна кількох алелів Glі-D1ts/Glu-D3ts, інтрогресованих від Ae. tauschii, та досить сильний ефект алеля Glu-B1, інтрогресованого від дикорослої пшениці T. dicoccoides.

В популяціях від схрещування сортів хлібопекарської пшениці з дикорослими видами, такими як Ae. cylindrica та Ae. umbellulata знайдено генотипи з мінімальними розмірами часток борошна (2-7 мкм). Аналогічна картина спостерігалася в популяціях від схрещування сортів пшениці з дикорослим видом Ae. tauschii. Такий розмір часток борошна характерний для пшениці типу soft, в той час як сорти пшениці Обрій та Одеська напівкарликова, які первинно використовувалися нами у віддалених схрещуваннях, є типовими сортами hard.

Генетичний контроль такої технологічно важливої ознаки зерна пшениці, як „консистенція ендосперму”, або англійською “endosperm texture”, контролюється головним локусом На, розміщеним в короткому плечі хромосоми 5D пшениці. Ознака „м'якозерність”, або soft-тип пшениці ботанічного виду T. aestivum L., контролюється домінантним алелем дикого типу На, тоді як за „твердозерність”, або hard-тип, відповідає рецесивний алель цього локусу - ha. Гранулометричною ознакою крохмалю пшениці з м'якозерною консистенцією (soft) є значна частка мілких крохмальних гранул (тип D за розміром в межах 2 мкм).

Слід особливо підкреслити, що всі без виключення комерційні сорти хлібопекарської пшениці, районовані в Україні, належать до типу hard і в Державному реєстрі немає жодного районованого сорту з консистенцією soft. Сорти пшениці типу soft в цивілізованому світі є сортами, борошно яких має спеціальне використання для виготовлення кондитерських виробів. Відсутність у Державному реєстрі сортів пшениці типу soft означає також, що в Україні не зареєстровано жодного сорту кондитерського напряму використання, а кондитерські вироби (печиво, крекери, торти, тістечка, вафлі) виробляються з нетехнологічного для цих виробів борошна хлібопекарської пшениці типу hard, що безумовно негативно позначається на якості цих виробів.

В ВС1/F5 поколінні від схрещування сорту пшениці Обрій (генотип ha/ha) зі штучним аміплоїдом (генотип Ha/Ha), походженням з Краснодарського НДІСГ, T. palmovae (2n=28, геномна формула ААDD, геном А від дикоростучої пшениці T. monococcum, геном D від егілопсу Ae. tauschii), нами було здійснено добір кількох кращих за агрономічними ознаками сестринських ліній типу soft (№7/175 та №7/567). Подальше дослідження зерна та борошна цих ліній показало, що вони характеризуються екстремальними параметрами ознаки м'якозерності: мають високі від'ємні значення за шкалою інфрачервогого аналізатора (-40-50), тоді як борошно пшениці soft має низькі позитивні значення (5-15), а борошно пшениці hard ідентифікується в діапазоні 25-45 одиниць діапазону шкали інфрачервоного аналізатора Inframatic 8611 (Perten, Швеція), відкаліброваного для аналізу борошна, твердозерності хлібопекарської пшениці.

11У зв'язку з цим ми вважаємо, що лінії №7/175 та №7/567 належать до типу extra-soft, або екстра-м'якозерної пшениці. Цей висновок підтверджено також дослідженням незалежної лабораторії США (Western Wheat Quality Laboratory, USDA-ARS, Pullman, WA) під керівництвом доктора К. Морріс, в якій виконано електрофоретичний аналіз фріабіліну крохмальних зерен ліній №№ 7/175 та 7/567 за допомогою SDS-електрофорезу (SDS-PAGE). В цій лабораторії було знайдено, що фріабілін крохмальних зерен ліній №7/175 та №7/567 має на 100 дальтон нижчу молекулярну масу і більш високу мобільність та інтенсивність в SDS-ПААГ у порівнянні з фріабіліном крохмальних гранул сортів звичайної м'якозерної пшениці з молекулярною масою 14,4 кДа.

Результати цих досліджень дають підстави стверджувати, що в результаті схрещування сорту твердозерної пшениці Обрій (генотип ha/ha) з амфіплоїдом T. palmovae (генотип Ha/Ha) мала місце хромосомна транслокація в геном пшениці сегменту короткого плеча хромосоми 5D Ae. tauschii з домінантним алелем Ha, що кодує фріабілін егілопсу, який має дещо нижчу молекулярну масу (а отже і молекулярну структуру), ніж фріабілін пшениці типу soft (рис. 5). Як результат, алель Ha егілопсу Ae. tauschii експресується як фенотип екстра-soft.

В результаті подальшого вивчення комплексу агрономічних показників екстра-м'якозерних ліній в системі конкурсного та попереднього сортовипробовування було встановлено, що лінія №7/567 в середньому за чотири роки випробовування перевищувала за урожаєм зерна сорт-стандарт Альбатрос на 2-4 ц/га. Це дало нам підстави для передачі у 2001 році екстра-м'якозерної лінії №7/567 під назвою Оксана в Державне сортовипробування.

За результатами чотирьох років Державного сортовипробування сорт Оксана занесений в Державний реєстр, як перший національний стандарт сорту пшениці кондитерського напряму використання типу ЕSRW - екстра-м'якозерна, червонозерна, озима.

На основі сорту Оксана, як оригінального вихідного генетичного матеріалу, автором цієї дисертаційної роботи вперше в Селекційно-генетичному інституті і в Україні започатковано програму селекції сортів пшениці кондитерського напряму використання. На цей час вже створено більш перспективний, ніж сорт Оксана, селекційний матеріал кондитерського напряму використання як з червоним, так і білим зерном (тип ESWW - екстра-м'якозерна, білозерна, озима). Сорти ESWW типу призначені для кондитерських виробів, які потребують високої білизни борошна.

Новітні напрями генетичного поліпшення якості зерна пшениці. Одним з найважливіших завдань дисертаційної роботи були дослідження, спрямовані на розвиток новітніх напрямів генетичного поліпшення якості зерна пшениці. генетичний секвенування алельний селекція

Хромосомно-інженерна модифікація центричної житньо-пшеничної транслокації 1RS.1BL та її використання в селекції пшениці на якість зерна. Житньо-пшенична хромосомна транслокація 1RS.1BL має надзвичайно широке використання в селекції та генетиці культури пшениці завдяки тому, що ця транслокація несе комплекс генів (Lr26, Sr31, Yr9, Pm8), які забезпечують стійкість пшениці проти ряду хвороб, позитивно впливають на зернову продуктивність. Та протягом більш як 30 років використання в селекції транслокації 1RS.1BL селекціонери постійно зтикаються з вкрай негативним впливом житнього локусу Sec-1 на хлібопекарські властивості борошна селекційних ліній пшениці з житньо-пшеничною транслокацією 1RS.1BL.

Всі попередні спроби цитогенетичного втручання в структуру 1RS.1BL транслокації з метою елімінації локусу Sec-1 закінчилися невдачею, бо вони не вирішували водночас три головних завдання: а) залишити в транслокованому плечі 1RS максимум позитивного для селекції житнього хроматину; б) вилучити негативний для якості пшениці житній локус Sec-1; с) замінити його позитивним щодо якості гомеологічним локусом Gli-B1 пшениці.

Вперше таке завдання було вирішено професором Каліфорнійського університету (США) А. Лукашевським (2000 р.) створенням модифікованої хромосомно-інженерним шляхом транслокації 1RSm.1BL. На завершальному етапі цієї роботи (1994-95 р.р.) автор дисертації був запрошений професором А. Лукашевським в Каліфорнійський університет для участі у спільних дослідженнях. В результаті Селекційно-генетичний інститут отримав право ексклюзивного використання 1RSm.1BL транслокації в селекційно-генетичних дослідженнях.

Хромосомно-інженерна модифікація 1RSm.1BL, на відміну від оригінальної 1RS.1BL, зберігає всі цінні властивості останньої, містить пшеничний локус Gli-1 замість житнього локусу Sec-1, і не має жодних негативних наслідків на якість пшеничного борошна. Але хромосомна конструкція 1RSm.1BL містить два короткі сайти хроматину плеча хромосоми 1ВS пшениці, як потенційні сайти рекомбінації між 1RSm та 1BS, а значить і певної імовірності руйнування хромосомної конструкції 1RSm.1BL шляхом кросинговеру у випадку звичайних міжсортових схрещувань. Крім того, модифікована 1RSm.1BL транслокація створена на базі ярого сорту Pavon і не може бути ефективно використана в прямих схрещуваннях для створення сортів озимої пшениці.

З метою ефективного використання в селекції на якість пшениці модифікованої хромосомної конструкції 1RSm.1BL (без її кросоверної рекомбінації) нами запропоновано і здійснено програму досліджень, яка включає застосування проміжної дітелосомної лінії dt1DL”, та складається з кількох послідовних етапів:

- отримання рекомбінантної дітелосомної лінії dt1BL” озимого типу розвитку, яка містила б в хромосомному плечі 1ВL найсильніший за позитивним впливом на якість борошна (серед усіх відомих сьогодні в межах світового сортименту пшениці) глютенін-кодуючий алель Glu-B1 77+8;

- використання озимої рекомбінантної дітелосомної dt1BL” лінії з метою переводу модифікованої транслокації 1RSm.1BL на озимий тип розвитку та введення в довге плече 1ВL алеля Glu-B1 77+8 з метою максимально ефективного використання цієї транслокації в селекції пшениці на якість борошна;

- створення селекційного матеріалу пшениці з рекомбінантним критичним плечем dt1BL”+Glu-B177+8 та пряме використання його в схрещуваннях з озимою транслокаційною лінією 1RSm.1BL.

Хромосомно-інженерна конструкція 1RSm.1BL зберігає ефективну стійкість проти листової іржі (ген Lr26), а генетичний матеріал на всіх етапах цієї програми легко контролюється за допомогою електрофорезу без необхідності застосування цитологічного аналізу хромосом.

З використанням генетичного матеріалу на базі транслокації 1RSm.1BL спільно з Білгородським НДІСГ РАСГН створено два сорти озимої пшениці Богданка (а.с. РФ № 48449, пат. РФ № 4186) та Синтетик (а.с. № 48580, пат. РФ № 4185), занесені в Державний реєстр Російської Федерації.

Використання генів Wx (ваксі), що контролюють біосинтез амілози крохмалю пшениці. Пшениця ваксі з нульовим вмістом амілози в крохмалі - це нове слово в сучасній селекції пшениці. Одним з перших генетичні лінії пшениці ваксі отримав д-р Роберт Грейбош з Університету штату Небраска (США, м. Лінкольн) у 1998 році. В 2000 році лінії ярої пшениці ваксі, а в 2002 році лінії озимої пшениці ваксі були передані Р. Грейбошем автору цього автореферату для ексклюзивного використання.

Отриманий від д-ра Р. Грейбоша генетичний матеріал як ярого, так і озимого типу розвитку походить від схрещування двох сортів пшениці Kanto 107 (нуль-алелі генів Wx-A1 та Wx-B1) та Bai Huo (нуль-алель гена Wx-D1) і абсолютно не придатний для селекційного використання через ряд негативних агрономічних показників, таких як тонка полягаюча соломина, мілкий колос, осипання зерна та ін.

Тому наші дослідження пшениці ваксі ставили за мету створення на базі комерційних сортів СГІ вихідного селекційного матеріалу з генотипом ваксі (потрійний рецесив за генотипом генів Wx-A1, Wx-B1 та Wx-D1), придатного для подальшого використання в селекційних програмах інституту з метою покращення хлібопекарської якості, та створення сортів пшениці ваксі спеціального призначення для виробництва локшини та крохмалю харчового та технічного використання.

Наші дослідження, виконані у співробітництві з Південним біотехнологічним центром у рослинництві (академік УААН Ю. Сиволап) показали, що майже всі сучасні сорти селекції СГІ мають генотип, що містить три гомеологічні домінантні Wx-гени: Wx-A1, Wx-B1 та Wx-D1. Це означає, що у нас не було іншого вибору, як використовувати схрещування типу потрійний домінант х потрійний рецессив (ваксі) щоб здійснити добори генотипів ваксі, адаптованих до місцевих умов вирощування та придатних для селекційного використання. Схрещуючи потрійний домінант за генами Wx (позначимо його як +++) з генетичною лінією ваксі (позначимо її як 000) за простою схемою тригібридного успадковування можна очікувати представлені нижче генотипи за генами Wx в популяції F2.

З наведеного переліку теоретично можливих генотипів видно, що від такого типу схрещування в популяції F2 можна очікувати лише одну (!) рослину з 64 з потрійним рецессивом (000000) за генами Wx. А якщо взяти до уваги що ця одна рослина має комбінувати в собі ще й ряд цінних агрономічних ознак, то можна уявити наскільки складною та масштабною за об'ємом має бути програма селекції пшениці ваксі.

Ми розпочали таку програму зі схрещування одного з найкращих за якістю борошна та зерновою продуктивністю сорту Куяльник (генотип ++++++ за генами Wx) з 15 лініями пшениці ваксі (генотип 000000). Дослідження ставило на меті комбінування позитивних щодо якості борошна алелів Gli/Glu сорту Куяльник на основі генотипу ваксі. Іншими словами, ми ставили на меті створення ліній з генотипом ваксі та відмінними фізичними показниками клейковини від сорту Куяльник. Кожна популяція F2 з 15 комбінацій схрещування була представлена щонайменше 500 рослинами, що дає теоретичну можливість відібрати 7-8 рослин з генотипом ваксі (000000). Практично ж імовірність добору особин з генотипом ваксі була значно нижчою (2-3 особини), оскільки пріоритетом селекційного добору є комплекс позитивних агрономічних ознак рослини і лише потім - генотип ваксі.

З метою посилення ефективності добору в популяції F2 та F3 генотипів ваксі та частково ваксі використовували технологію ПЛР-маркерів з послідовностями праймерів, що фланкують гени Wx. Ця робота виконувалася у співробітництві з Південним біотехнологічним центром у рослинництві.

Добір генотипів ваксі здійснювали також в популяції F3 та F4. Слід зазначити, що імовірність добору генотипів ваксі в цих поколіннях вища, ніж в популяції F2, оскільки рослини F2 з генотипами 0+0000, +00000, 000+00, 00+000, 00000+, 0000+0 здатні вищепляти в наступному поколінні генотипи ваксі з частотою 0,25.

З урожаю 2006-2007 р. нами виділено (з популяцій F2, F3, F4, загальною чисельністю більше 7000 особин) та ідентифіковано більше 100 сімей F3, F4 з генотипом ваксі та задовільними агрономічними ознаками. В якості остаточного тесту на ознаку ваксі використовували показник „число падіння” та забарвлення крохмальних гранул у розчині Люголя за розробленою нами експрес-процедурою. Кращі за агрономічними показниками генотипи ваксі обрані для схрещування з іншими сортами пшениці з метою використання ознаки ваксі для створення вихідного матеріалу для селекції сортів пшениці технічного використання (виробництво біоетанолу).

Зразки пшениці ваксі досліджувалися у відділі генетичних основ селекції Селекційно-генетичного інституту за комплексом технологічних показників. В результаті було встановлено, що пшениця ваксі є надзвичайно цікавим та перспективним генетичним матеріалом для використання в селекції. Порівняння ліній пшениці ваксі за урожаєм зерна свідчить, що вони не поступаються звичайним сортам пшениці ні за масою 1000 зерен, ні за іншими показниками зернової продуктивності. У ліній ваксі не помічено будь-яких очевидних недоліків, які могли б негативно впливати на урожай зерна. Лінії пшениці ваксі також не відрізнялися від звичайних сортів пшениці за виходом борошна на лабораторному млині Бюлер.

У наших дослідах лінії пшениці ваксі мали підвищені показники водо-поглинальної спроможності борошна (до 72%). При одному й тому ж вмісті білка в зерні пшениця ваксі має вміст клейковини на 3-5% вищий. Борошно пшениці ваксі має аномально низький показник „число падіння”, ЧП в межах 65-72 сек. Пшениця ваксі має суттєво кращі, порівняно з хлібопекарською пшеницею, показники якості локшини. Борошно пшениці ваксі не може використовуватися в чистому вигляді для випічки хліба, оскільки її тісто має аномально високу підйомну силу, що негативно впливає на структуру м'якуша. Борошно пшениці ваксі як добавка до борошна пшениці з низькою газогенеруючою здатністю є прекрасним поліпшувачем пшеничного хліба.

Добавка борошна пшениці ваксі 10, 20 і 30% до борошна хлібопекарської пшениці сорту Українка з ЧП 387 сек. знижувала показник ЧП борошносуміші до 165 сек. та суттєво підвищувала об'єм хліба зі 100 г борошна (від 1000 до 1360 смі) та загальну оцінку якості хліба від 3,3 до 4,5 балів.

Використання трансгенних ліній з екстра-копіями глютенін-кодуючих генів 1Dx5 та 1Ах2*, спонтанних мутацій з ефектом екстра-експресії та спонтанних точкових мутацій для поліпшення якості борошна пшениці. Сучасні трансгенні технології в галузі покращення хлібопекарських якостей борошна концентруються на досить оригінальному напрямі: підвищенні в геномі пшениці кількості копій генів, які мають попередньо визначений позитивний вплив на якість борошна.

Дві такі трансгенні лінії пшениці, отримані на базі мексиканського білозерного сорту ярої пшениці Bob White, використані в наших дослідженнях. Трансгенний матеріал для ексклюзивного дослідження отримано від автора, д-ра Анн Блечл (Західний регіональний НД центр СГ США, Каліфорнія). Лінія з трьома екстра-копіями химерного гену 1Dx5 з надлишковими залишками цистеїну в молекулі високомолекулярного глютеніну (хромосома 1D) та лінія з трьома екстра-копіями гена 1Ах2* (хромосома 1А), що також кодує біосинтез високомолекулярного глютеніну, були схрещені з одним з найкращих за показниками хлібопекарської якості сортом селекції СГІ Куяльник.

Сорт Куяльник має в довгому плечі хромосоми 1В тандемно дуплікований генний кластер, генетичний ефект якого проявляється в екстра-експресії синтезу субодиниці 7 високомолекулярних глютенінів. Ми позначаємо цей кластер як Glu-B1 77+8.

Це схрещування ставило на меті комбінування в одному генотипі найсильнішого серед відомих у пшениці щодо позитивного впливу на якість борошна локусу Glu-B1 77+8 сорту Куяльник з екстра-копіями генів 1Dx5 та 1Ах2*. Можливість такого комбінування зазначених локусів, загалом, немає генетичних обмежень, оскільки всі вихідні копії цих генів локалізовані в різних хромосомах і успадковуються незалежно. Локалізація екстра-копій трансгенів 1Dx5 та 1Ах2* невідома, так-як в результаті актів трансформації ці гени теоретично могли бути інтегрованими в будь-яку хромосому пшениці сорту-реципієнта.

Нами була досліджена стабільність та відтворюваність екстра-експресії субодиниць високомолекулярних глютенінів 2* та 5 у відповідних трансгенних ліній. Ми не знайшли жодних відхилень ні за інтенсивністю прояву на електрофореграмах субодиниць 1Ах2* та 1Dx5, ані за складом інших субодиниць високомолекулярних глютенінів та гліадинів. Це дає підстави стверджувати, що експресія трансгенів 1Ах2* та 1Dx5 стабільно відтворюється у трансгенних рослин, вирощених в умовах Одеси.

Ми дослідили також популяцію рослин F3 від схрещування сорту Куяльник з трансгенними лініями 1Ах2* та 1Dx5. Завданням цього досліду було, по-перше, ізолювати сім'ї F3, що несуть локус Sec-1 жита, який присутній в оригінальному ярому сорті Bob White у вигляді транслокації 1RS.1BL і, по-друге, виділити генотипи, які комбінують локус Glu-B1 77+8 сорту Куяльник з трансгенними екстра-копіями генів 1Ах2* та 1Dx5. В результаті відібрано кілька десятків елітних сімей для подальшого дослідження показників хлібопекарської якості. Гібридна популяція цього схрещування має бути в подальшому дослідженою до покоління F5-F6 з метою добору генотипів, що комбінують цільові гени (спонтанна дуплікація та трансгени) з сильним позитивним ефектом на хлібопекарські властивості борошна пшениці.

Крім трансгенів нами залучені в схрещування сорти (лінії) пшениці, які несуть достовірно ідентифіковані спонтанні мутації генів, що кодують синтез високомолекулярних глютенінів. Це канадський сорт пшениці Гленлі з екстра-експресією локусу Glu-B1 7+8 та старий угорський сорт Банкуті 1201 з точковою мутацією в локусі Glu-А1, результатом якої є додатковий залишок амінокислоти цистеїну в молекулі субодтниці 1Ах2*.

Використання генетичного потенціалу видів-співродичів у підвищенні харчової цінності зерна пшениці. Харчова (біологічна) цінність борошна пшениці, а тому і хліба та хлібопродуктів ніколи не була в центрі уваги науковців ні в колишньому СРСР, ні нині в незалежній Україні. Нам не відомі ґрунтовні дослідження, які б переслідували мету поліпшення поживної (харчової) цінності зерна (борошна) хлібопекарської пшениці оскільки генетичний потенціал виду T. aestivum L. практично не містить необхідної для цієї мети генетичної варіабельності. Таке завдання, як виявляється, можна вирішувати лише за рахунок генетичної варіабельності видів-співродичів та інших віддалених видів.

Притому підвищення поживної якості пшеничного борошна можна здійснювати, з однієї сторони, за рахунок інтрогресії в геном пшениці від інших видів спеціальних генів, що контролюють хімічні компоненти, які в нормі не синтезуються, або синтезуються в невеликій кількості в зерні пшениці. З іншої сторони, поліпшення поживної якості пшеничного борошна можна здійснювати за рахунок добавки борошна з високими поживними характеристиками інших видів.

З метою підвищення харчової цінності пшениці нами започатковано і здійснюються дві програми:

1) використання інтрогресивної лінії Dong-10, походженням з Китаю, яка містить подвоєну транслокацію від пирію (Agropyron), має чорний колір зерна (пігментація перикарпу) та суттєво підвищений порівняно зі звичайною пшеницею вміст вітамінів (В1, В2, Е) та мікроелементів (Р, Са, Fe, Zn);

2) створення вихідного матеріалу для сортів голозерного ячменю на основі використання рецесивного гена, який контролює ознаку голозерності - n, а також генів, що впливають на колір алейронового шару зернівки - Bl(bl) та гена, що блокує біосинтез амілози крохмалю - wx (ваксі), плейотропно пов'язаного з підвищеним вмістом в-глюканів у зерні ячменю (до 9%).

Отримано цінний генетичний матеріал для створення сортів чорнозерної пшениці та голозерного ячменю. Останній, як джерело бета-глюканів, токолів та проантоціанидинів з метою поліпшення борошна пшениці за показниками харчової цінності.

Генетичні та селекційні критерії технічної якості зерна пшениці, як сировини для виробництва біоетанолу. В дисертаційній роботі представлені вперше в Україні результати дослідження генетичних та селекційних критеріїв технічної якості зерна пшениці, як сировини для виробництва біоетанолу.

Результати виконаних нами досліджень свідчать, що найвища ефективність трансформації крохмалю в біоетанол (650 л/1000 кг крохмлю) спостерігалася у генетичних ліній ваксі з аномальним хімічним складом крохмалю - нульовим вмістом амілози. Особливістю крохмальних гранул пшениці ваксі є те, що вони, на відміну від крохмальних гранул звичайної пшениці, фізично не стійкі проти механічного удару робочими органами млина під час помелу зерна і, як наслідок, значна частина крохмальних гранул руйнується. Це є причиною підвищення загальної активної фізичної поверхні крохмалю та його більш ефективної ферментації.

Іншим цікавим вихідним генетичним матеріалом для селекції сортів спирто-дистилятного напряму обіцяють бути лінії пшениці з екстра-високим показником м'якозерності (exstra-soft), типовим представником якої є вперше районований в Україні сорт пшениці бісквітного напряму використання під назвою Оксана. Генетичні лінії з такою, як у сорту Оксана, консистенцією ендосперму мають відносно високу, порівняно зі звичайними твердозерними сортами пшениці, частку мілких крохмальних гранул. Це також суттєво підвищує загальну активну поверхню крохмалю і, як наслідок, спричиняє більш високу ефективність його ферментації в біоетанол (620 л/1000 кг крохмалю).

Другим за значенням продуктом переробки зерна в біоетанол є сухий заброджений залишок, або скорочено англійською - DDGS (dry distilled grain soluble). DDGS - це органічна маса, яка за технологією трансформації зерна в біоетанол відбула кілька температурних стадій обробки, в тому числі високотемпературну фазу до 90-950С протягом кількох годин, фази ферментації, дріжджового бродіння та дистиляції і висушування. Ця маса має високий вміст легкоперетравлюваного білка, залишки крохмалю, бактеріальні білки і характеризується високою кормовою цінністю для тварин. Сухий заброджений залишок має базисну вологість близько 10%, добре зберігається і може використовуватися на корм як у чистому вигляді, так і у формі кормових сумішей.

Сорти та генетичні лінії пшениці були досліджені за ознакою виходу сухого забродженого залишку (від 235 до 320 кг на тонну завантаженого в реактор-ферментатор подрібненого зерна) після дистиляції та вмісту в ньому білка (від 32 до 41% в перерахунку на суху масу).

Ці започатковані нами дослідження відкривають новий напрям селекції пшениці в Україні: селекції сортів спеціальної технічної якості для виробництва біоетанолу та виробництва кормів для тваринництва.

Розробка та удосконалення методів аналізу генетичного та селекційного матеріалу. В дисертації також представлені методичні розробки автора, метою яких є підвищення ефективності та продуктивності оцінки генетичного і селекційного матеріалу пшениці на якість борошна.

Зважаючи на те, що в наших дослідженнях, особливо пов'язаних з аналізом генетичного матеріалу від віддалених схрещувань, фігурують десятки тисяч гібридних сімей та інтрогресивних генетичних ліній, виникла необхідність удосконалення методів електрофоретичного розподілу клейковинних білків у напряму суттєвого підвищення продуктивності аналізу та якості розподілу гетерогенних білків зерна, які контролюються локусами Glu-1 та Glu-3/ Gli-1.

Найпоширенішою в провідних лабораторіях світу є процедура електрофоретичного розподілу високомолекулярних глютенінів (локус Glu-1) в поліакриламідному гелі в лужному середовищі та присутності детергенту додецилсульфату натрію (ДСН-ПААГ=SDS-PAGE). Процедура вертикального ДСН-ПААГ передбачає використання концентруючого (рН=6,8) та розподіляючого (рН=8,8) гелів в пластинах стандартного формату висотою 200-220 мм. Розподіл білків в системі ДСН-ПААГ стандартного формату триває до 8 годин або часто практикується електрофорез протягом ночі при низьких напругах постійного струму. Така процедура є малопродуктивною, а якість розподілу білків невисокою через дифузію субодиниць білка протягом тривалого часу електрофоретичного розподілу.

Нами розроблено нову, значно швидшу та ефективнішу процедуру електрофорезу ДСН-ПААГ в гелі міні-формату. Склад концентруючого та розподіляючого гелів для системи ДСН-ПААГ стандартного формату не працює задовільно в системі формату міні-ДСН-ПААГ. Тому склад концентруючого та розподіляючого гелів був нами докорінно зміненим. Найсуттєвішою і принциповою модифікацією стандартної процедури ДСН-ПААГ, запропонованою нами, є використання одного й того ж буферу (рН=7,95-8,0) в обох (концентруючому та розподіляючому) гелях міні-формату.

Це дозволило виконувати міні-ДСН-ПААГ у високовольтному режимі та скоротити час розподілу білків до 2, максимум - 3 годин. Зразки електрофореграм міні-ДСН-ПААГ показані в попередніх розділах цієї дисертаційної роботи. Процедура міні-ДСН-ПААГ була особливо ефективною для ідентифікації оригінальних алелів локусу Glu-1.

Крім значного скорочення часу на аналіз міні-ДСН-ПААГ процедура дає можливість високоякісного розподілу субодиниць високомолекулярних глютенінів та щ-гліадінів, чіткої дискримінації окремих субодиниць та алелів, що не завжди буває можливим за умов стандартної процедури ДСН-ПААГ.

Крім вище зазначеної процедури міні-ДСН-ПААГ, нами розроблена міні-модифікація методу вертикального електрофорезу гліадинів в ПААГ з концентруючим гелем, яка суттєво покращує якість розподілу електрофоретичних компонентів та надійність ідентифікації Gli-алелів, суттєво скорочує тривалість та в кілька разів знижує вартість аналізу.

Аналогічна модифікація розроблена для методу електрофоретичного аналізу низькомолекулярних глютенінів, що кодуються локусом Glu-3.

Нами також розроблений новий метод двоетапної ДСН-седиментації (SDS-30) для експресної оцінки якості борошна сортів, генетичних ліній та селекційного матеріалу пшениці.

Згідно з міжнародними стандартами ключовим показником якості борошна є показник “сила” борошна (W). Визначається “сила” борошна на альвеографі Chopin. Це досить тривалий у часі процес, недешево коштує і потребує для аналізу 600-700 г борошна 72% виходу та зольністю не вище 0,5-0,6%. Тому одразу ж після впровадження в технологічний аналіз французькою компанією Chopin приладу альвеограф набула привабливості ідея пошуку більш простого та експресного способу непрямого визначення “сили” борошна.

Ще в 40-х роках ХХ сторіччя була встановлена тісна кореляційна залежність між “силою” борошна і здатністю часток борошна набухати та осідати в органічних розчинниках. Так з'явилися три основні методи седиментації борошна: по Зелені, метод SDS-седиментації по Аксфорду та седиментація за методом Пумпянського-Созінова.

Ці методи седиментації мають ряд недоліків. Об'єм осаду седиментації значною мірою залежить від рівня твердозерності та загального вмісту білка в зерні. Через це залежність між показниками седиментації і “силою” борошна може бути значною мірою скоригована від зразка до зразка зерна як рівнем твердозерності так і вмістом білка в зерні або тим і іншим водночас.

Всі три методи седиментації виконуються в кислому середовищі в якому процеси ендогенного ферментативного протеолізу значною мірою блоковані. З цієї причини об'єм осаду седиментації не повною мірою віддзеркалює реальну картину агрегації та дезагрегації білків клейковини, які мають місце при змішуванні борошна з водою в процесі тістоутворення і які виражаються графічно альвеограмою як процес фізичної роботи деформації тіста (W). Тому виникла ідея моделювання процесу формування тіста шляхом попереднього змішування борошна з водою та інкубації суспензії при певних температурних умовах (автоліз) безпосередньо перед седиментацією. Ця ідея була успішно реалізована співробітниками нашої лабораторії у вигляді методу седиментації борошна під назвою С120. Показники седиментації за методом С120 значно кращі, ніж за методами Аксфорда та Пумпянського-Созінова корелювали з “силою” борошна, але й цей метод мав ряд недоліків, таких як значна тривалість аналізу в часі (дві години), можливість аналізу лише зразків борошна, неадекватна реакція на зниження показників якості борошна з пророслого зерна.