Зміни кальцієвого гомеостазу в нейронах культури гіпокампа щурів при інкубації з в-амілоїдом

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

УДК 612.825.8:616.89-008.46+577.352.4

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ЗМІНИ КАЛЬЦІЄВОГО ГОМЕОСТАЗУ В НЕЙРОНАХ КУЛЬТУРИ ГІПОКАМПА ЩУРІВ ПРИ ІНКУБАЦІЇ З в-АМІЛОЇДОМ

03.00.02 - біофізика

Король Тетяна Юріївна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Міжнародному центрі молекулярної фізіології НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук Костюк Олена Платонівна Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, провідний науковий співробітник

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Федулова Світлана Анатоліївна Інститут фізіології ім. О. О.Богомольця НАН України, завідувач лабораторії біофізики синаптичної передачі

доктор медичних наук Бачинська Наталія Юріївна Інститут геронтології АНМ України, завідувач відділу вікової фізіології та патології нервової системи

Захист відбудеться 17 листопада 2009 року о 12:00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 15 жовтня 2009 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 доктор біологічних наук З. О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Серед широкого спектру нейродегенеративних захворювань особливе місце за своїм негативним значенням для суспільства відіграє хвороба Альцгеймера. Характерною особливістю даного захворювання є поступове прогресування порушень пам'яті та вищих мозкових функцій аж до повного розладу інтелекту та психічної діяльності. Це найбільш розповсюджена форма деменції в похилому віці, що вражає від 0.3% осіб після 65 року життя до 4% людей доросліше 85 років, що складає в цілому більш ніж 26.6 млн. людей у всьому світі. Спадкові захворювання хворобою Альцгеймера виникають у людей віком 40-60 років, спорадичні (не спадкові, найбільш розповсюджені) - у віці 65 років і старше. Зі збільшенням тривалості життя в теперішній час відсоток захворювань стає вищим, тому дослідження порушень молекулярних механізмів, які призводять до виникнення даної патології, стає більш актуальним.

Основу патоморфологічної картини хвороби Альцгеймера складають церебральний амілоїдоз інтра- та екстрацелюлярної (переважно навколосудинної) локалізації, загибель нейронів мозку та астрогліоз. Дані морфологічні зміни утворюються в певній послідовності в різних відділах мозку. Найбільш ранні перетворення локалізуються в медіобазальних відділах лобних частин (енторінальна кора), в подальшому характерні морфологічні зміни поширюються на область гіпокампа та медіальних відділів скроневих частин кори. Характерним для цієї патології, окрім описаного вище, є також зниження кількості та щільності синапсів в області гіпокампа.

Основними нейропаталогічними характеристиками хвороби Альцгеймера є наявність у мозку хворих характерних нейрофібрилярних філаментів (утворених з патологічно видозміненого тау-білка, що входить до складу цитоскелета) та сенільних бляшок, основним структурним компонентом яких є білок в-амілоїд. в-Амілоїд являє собою пептид розміром 42 амінокислотних залишків (Pearson, 2006), який продукується при розщепленні доволі великого мембранного білка - білка-попередника амілоїду (amyloid precursor protein - APP). Точна функція як АРР, так і в-амілоїду невідома, але найбільш імовірним є те, що вони беруть безпосередню участь у синаптогенезі. В організмі людини в умовах як норми, так і патології була виявлена велика кількість різновидів в-амілоїдів, котрі відрізняються між собою довжиною амінокислотного ланцюга (від 39 до 43 амінокислотних залишків). Експериментально було показано, що при хворобі Альцгеймера збільшується концентрація довших молекул амілоїдів, а саме молекул з 42 амінокислотними залишками (Glabe and Kayed, 2006).

Відомо, що кальцій має значення для функціонування клітин взагалі і нейронів зокрема. Іони кальцію відігріють важливу роль в опосередкуванні таких процесів, як екзоцитоз, синаптична передача, транскрипція генів, синаптична пластичність і багато інших. Зміни концентрації кальцію всередині клітини відбуваються завдяки функціонуванню не тільки різноманітних мембранних каналів, але й внутрішньоклітинних кальційрегулюючих структур (ендоплазматичного ретикулуму, мітохондрій) та ензимів (кальційзалежних АТФаз) (Костюк, 2001). Було виявлено, що в-амілоїд, присутній у надлишкових кількостях, може проявляти в мозку нейротоксичні властивості та призводити до порушення кальцієвого гомеостазу: викликати продукування великої кількості вільних радикалів, збільшувати кількість активних форм кисню, призводити до пошкодження дендритів нервових клітин, індукувати апоптоз та некроз нейронів. Експериментальними дослідженнями було встановлено, що в-амілоїд може порушувати кальцієвий гомеостаз нейронів через активацію кальцієвих каналів плазматичної мембрани, що в свою чергу призводить до пошкодження мітохондрій, розвитку вільнорадикального окислення нейронних мембран (Stutzmann, 2005).

Отже, дослідження зміни кальцієвого гомеостазу та функціонування внутрішньоклітинних кальційрегулюючих структур нейронів центральної нервової системи при впливі амілоїду являє безсумнівний науковий інтерес та може розширити розуміння молекулярних механізмів виникнення та розвитку хвороби Альцгеймера, а також слугувати для пошуку фармакологічних засобів для лікування та можливого запобігання цієї патології. Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації була затверджена на спільному засіданні Вченої ради Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця та Вченої ради МЦМФ НАНУ 7 березня 2006 року, протокол № 5. Робота виконувалась у рамках наукової теми „З'ясування можливих засобів корекції змін ефективності синаптичної передачі на різних рівнях нервової системи” (номер державної реєстрації 0106U010931, 2007-2009 р.) Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України, а також наукової теми „Механізми внутрішньоклітинної та міжклітинної сигналізації; вивчення шляхів їх модуляції та пошук нових фармакологічних впливів” (номер державної реєстрації 0107U010843, 2008-2010 р.) Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Мета і завдання дослідження. Мета даної роботи полягала у встановленні можливого впливу білка в-амілоїду на зміни у внутрішньоклітинному кальцієвому гомеостазі нейронів культури гіпокампа щурів. Для її здійснення були поставлені наступні завдання:

· за допомогою методу двохвильового вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію з використанням мембранопроникної форми флуоресцентного барвника fura-2 виявити можливий вплив білка в-амілоїду на цитоплазматичну концентрацію кальцію в спокої в нейронах культури гіпокампа;

· порівняти характеристики кальцієвих транзієнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в нейронах культури гіпокампа щурів в контрольних умовах та після інкубації з в-амілоїдом;

· за допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” дослідити можливий вплив в-амілоїду на амплітуду кальцієвих струмів та порівняти з контрольними показниками;

· дослідити електрофізіологічні характеристики кальцієвих каналів в нейронах культури гіпокампа та виявити можливі відмінності при наявності в-амілоїдом;

· виявити можливий вплив в-амілоїду на зміни в роботі кальційакумулюючої функції мітохондрій нейронів культури гіпокампа.

Об'єкт дослідження - нейрони культури гіпкампа.

Предмет дослідження - зміни клітинного кальцієвого гомеостазу в нейронах культури гіпокампа при впливі в-амілоїду.

Методи дослідження - реєстрація струмів з використанням методики фіксації мембранного потенціалу в конфігурації „ціла клітина” та методу двохвильового вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію з використанням мембранопроникної форми флуоресцентного барвника fura-2/AM.

Наукова новизна одержаних результатів. В даній роботі вперше було проведено комплексне дослідження впливу білка в-амілоїду на кальцієвий гомеостаз нейронів культури гіпокампа.

З використанням методики “петч-клемп” у конфігурації “ціла клітина” було досліджено зміни у біофізичних характеристиках (стаціонарна активація та інактивація, кінетичні показники) потенціалкерованих кальцієвих каналів культури гіпокампа щурів після 24-годинної інкубації з в-амілоїдом. Також за допомогою методу двохвильового вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію з використанням мембранопроникної форми флуоресцентного барвника fura-2/AM було встановлено зміни у внутрішньоклітинній концентрації кальцію та кальцієвих транзієнтів за умов попередньої інкубації з в-амілоїдом. Нами були виявлені зміни у кальційзахоплюючій функції мітохондрій нейронів культури гіпокампа.

Практичне та теоретичне значення роботи. Результати, одержані в даній роботі, мають як теоретичне, так і практичне значення. Детальне дослідження механізмів, які лежать в основі порушень кальційрегулюючих внутрішньоклітинних структур при інкубації нейронів з білком в-амілоїдом, може значно розширити розуміння причин, які лежать в основі виникнення хвороби Альцгеймера. Одержані в роботі дані можуть бути основою для розробки ефективних фармакологічних підходів для корекції та лікування даної патології.

Особистий внесок здобувача. Всі експерименти по визначенню впливу в-амілоїду на зміни нейронного кальцієвого гомеостазу в клітинах культури гіпокампа щурів, підбір, огляд та аналіз літературних даних, а також статистична обробка одержаних даних проводились автором особисто. Також за участю наукового керівника проведено планування напрямків досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на міжнародній об'єднаній конференції для молодих вчених Словацького фізіологічного товариства, Фізіологічного товариства та Федерації європейських фізіологічних товариств, Братислава, Словакія, 2007; сумісній українсько-польській конференції для молодих учених Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця та Ненські Інституту експериментальної фізіології “Механізми внутрішньоклітинної сигналізації”, Київ, Україна, 2007; VІІI Національній школі молодих вчених-фармакологів України, "Тисовець", Сколе (Карпати), Україна, 2008, а також на семінарах сектору молекулярної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, Україна, в 2007 та 2008 роках.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано чотири статті у наукових журналах, затверджених ВАК України, та тези трьох доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів та результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 245 найменувань (з них 4 кирилицею, 241 латиницею). Робота виконана на 135 сторінках та проілюстрована 37 рисунками та 6 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність дослідження впливу білка в-амілоїду на кальцієвий гомеостаз нейронів гіпокампа, сформульовані мета і завдання дослідження, наведено відомості про наукову новизну, практичну цінність та апробацію отриманих результатів, публікації матеріалів дисертації.

Розділ 1 “Огляд літератури” присвячений висвітленню відомих аспектів хвороби Альцгеймера. Особливу увагу сфокусовано на молекулярних змінах при даній хворобі, зокрема, утворенні білка в-амілоїду і його токсичних властивостях. Розглянуто особливості функціонування кальційрегулюючих структур, зокрема, мітохондрій, потенціалкерованих кальцієвих каналів плазматичної мембрани та ендоплазматичного ретикулуму у фізіологічних умовах. Описано механізми змін функціонування ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій на експериментальних моделях хвороби Альцгеймера.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 “Матеріали та методи досліджень” описано використання наступних методичних підходів:

· приготування первинної дисоційованої культури нейронів гіпокампа;

· експериментальна модель хвороби Альцгеймера;

· метод фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина”;

· метод двохвильового вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію з використанням мембранопроникної форми флуоресцентного барвника fura-2/AM;

· обробка отриманих результатів досліджень, апроксимація даних.

Метод приготування первинної дисоційованої культури нейронів гіпокампа щурів. Для одержання клітин для культивування, новонароджених щурів лінії Вістар декапітували та виділяли гіпокампи. Потім гіпокампи розрізали на п'ять частин кожний, після чого переносили в розчин, який містив 0.05% пронази Е (“Serva”, США). Ферментативну обробку проводили протягом 18 хвилин при 32 °С. Після цього шматочки гіпокампа промивали три рази розчином для виділення, що не містив ферменту. Для отримання ізольованих клітин шматочки гіпокампа переносили в розчин, який готували додаванням 1 мл розчину для виділення до 1 мл поживного середовища, та диспергували за допомогою Пастерівських піпеток з діаметрами кінчиків, що послідовно зменшувались (остання піпетка мала діаметр кінчика 250 мкм). Для оцінки кількості виділених клітин в 1 мл використовували камеру Горяєва та готували суспензію клітин, що мала густину 3х10⁵ клітин на 1 мл, шляхом додавання необхідного об'єму поживного середовища. Потім 200 мкл суспензії клітин, що мітила 60 тис. клітин, наносили на покривні скельця розміром 12х12 мм, що були попередньо оброблені 0.1% розчином полі-L-орнітина. Після 2 годин інкубації при 36 °С в атмосфері збагаченій СО₂ (5%) в кожну чашку Петрі додавали 2 мл поживного середовища, в склад якого входило 90% мінімального середовища Ігла (МЕМ, “SIGMA”, США), бікарбонатний буфер (2.2 г/л NaHCO₃), 10% кінської сироватки (“GIBCO”, США), 10 мкг/мл інсуліну та антибіотики: натрієва сіль бензилпеніциліну - 50 од/мл та стрептоміцин сульфат - 50 мкг/мл. Нейрони культивувались протягом 2 тижнів в інкубаторі при 36 °С в атмосфері збагаченій СО₂ (5%). Заміна поживного середовища проводилась кожні 4 дні (відбирали 400 мкл з чашки Петрі та додавали 400 мкл свіжого середовища). Після 3 діб in vitro культуру обробляли фторурацилом (1мкМ) (“SIGMA”, США) протягом 24 годин, для пригнічення проліферації гліальних клітин, після цього проводили повну заміну розчину. Заміну поживного середовища проводили кожні 4 дні шляхом відбирання 400 мкл середовища з чашки Петрі та додавання 400 мкл свіжого середовища. Нейрони брали в експеримент на 12-13 день.

Обробка клітин культури гіпокампа в-амілоїдом. В наших експериментах модель хвороби Альцгеймера одержували внаслідок додавання концентрованого розчину в-амілоїду до культурального середовища в кінцевій концентрації 2 мкМ за 24 години до експериментів по вимірюванню внутрішньоклітинної концентрації кальцію ([Ca²⁺]_і) та реєстрації струмів у нейронах культури гіпокампа. Ми використовували в-амілоїд довжиною в 42 амінокислотних залишки (в_1-42-амілоїд).

Флуоресцентний метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Для кількісного визначення концентрації кальцію в нейронах культури гіпокампа використовували мембранопроникну форму барвника fura-2 (fura-2/AM). При зв'язуванні fura-2 з кальцієм відбувається характерне зміщення спектру збудження цього барвника. При збудженні світлом з довжиною хвилі 390 нм відбувається зменшення інтенсивності флуоресценції, а при збудженні світлом з довжиною хвилі 340 нм - збільшення. Максимум флуоресцентної емісії припадає на довжину хвилі 510 нм. Знаючи відносну зміну інтенсивності флуоресценції при збудженні двома довжинами хвиль, можна розрахувати [Са²⁺]_і в клітині за наступною формулою, яка була запропонована Грінкевичем та співавторами в 1985 (Grynkiewicz et al., 1985):

[Ca²⁺]_i=K_d*b*(R-R_min)/(R_max-R) [1]

де K_d - константа дисоціації комплексу fura-2 з кальцієм, R = F₃₆₀/F₃₉₀ - поточне співвідношення флуоресцентних сигналів, R_min = F₃₆₀/F₃₉₀| Ca₀ - те ж відношення в розчині з низькою концентрацією Са²⁺, R_max=F₃₆₀/F₃₉₀|Ca_? - те ж відношення в розчині з високою концентрацією Са²⁺, b = F₃₉₀|Ca0/F₃₉₀|Ca_? - відношення флуоресцентних сигналів у розчинах з низькою та високою концентраціями Са²⁺ при збудженні довжиною хвилі 390 нм. Параметри R_min, R_max та b визначали експериментально.

Для введення кальційчутливого зонда клітини культури гіпокампа поміщали в базовий розчин, який містив естерефіковану незаряджену форму барвника fura-2 ацетоксиметилестер, в концентрації 5 мкМ, розчинену в диметилсульфоксиді з додаванням детергенту плуронік F-127 (0,02%). В такій формі барвник проникає в клітину, потім ендогенними естеразами ефірні групи відщеплюються а зонд стає зарядженим і покинути клітину не може. Забарвлення проводилось 30 хвилин при температурі 34 ⁰С, після чого клітини відмивались і додатково залишались в темряві протягом 30 хвилин для повної деестерефікації зонду fura-2/AM.

Метод фіксації потенціалу в конфігурації „ціла клітина”. Мембранні іонні струми в нейронах культури гіпокампа реєстрували за допомогою методу „петч-клемп” у конфігурації „ціла клітина”. У наших експериментах чашка Петрі з клітинами встановлювалась у препаратоводій, розміщений на предметному столику інвертованого мікроскопу Zeiss (Німеччина). Скляні мікропіпетки виготовлювали за допомогою електронного пулеру (Sutter, США) з капілярів, виготовлених з боросилікатного скла фірми WPI (США), зовнішній діаметр яких становив 1.5 мм. Скляні мікропіпетки мали кінчик з діаметром 0.3-1 мкм. Опір мікропіпеток при заповненні стандартним „внутрішньоклітинним” розчином становив 9-14 МОм. Мікропіпетку закріплювали в полікарбонатному тримачі, що був приєднаний до попереднього підсилювача Dagan 3900А (Dagan Corporation, CША). Попередній підсилювач був змонтований на платформі мікроманіпулятора. Гігаомні контакти між клітинною мембраною та мікропіпеткою утворювали шляхом притискання мікропіпетки, до якої було прикладено невеликий позитивний тиск, до поверхні клітини і послідовно знижуючи тиск до рівня атмосферного або інколи прикладаючи невеликий негативний тиск. Утворення гігаомного контакту контролювали в режимі фіксації потенціалу, подаючи на мембрану гіперполяризаційні імпульси прямокутної форми амплітудою -10 мВ. Після утворення гігаомного контакту піпетки здійснювали компенсацію ємності мікропіпетки. Прорив мембрани для отримання конфігурації „ціла клітина” здійснювали за допомогою прикладання до мікропіпетки імпульсів негативного тиску, після чого реєстрували ємнісний струм у відповідь на гіперполяризаційний імпульс амплітудою 10 мВ. Вихідний сигнал підсилювача фільтрували за допомогою чотириполюсного фільтра Бесселя, що мав частоту зрізу 1 кГц, а також за допомогою цифрового фільтра, що мав частоту зрізу 10 кГц. Реєстрація струмів та генерація командних імпульсів була забезпечена комп'ютерною системою з використанням програмного забезпечення „pClamp 6” („Axon”, США). Отримані дані обробляли за допомогою програм “Clampfit 9.0” (“Axon Instruments, Inc.”, США), “Microsoft Excel 2002” (“Microsoft”, США) та “OriginPro 7.0” (“OriginLab Corporation”, США).

Склад розчинів. Для перфузії чашки Петрі з клітинами застосовувався базовий розчин наступного складу (у мілімолях на 1 л): NaCl - 140, KCl - 2, MgCl₂ - 2, CaCl₂ - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10; рН доводили до значення 7.35 за допомогою NaOH.

З метою ізоляції струмів лише через потенціалкеровані кальцієві канали іони натрію були замінені на іони хлорид холіну, а калієві канали були блоковані тетраетиламонієм. Таким чином, зовнішньоклітинний розчин мав наступний склад (у мілімолях на 1 л): хлорид холіну- 130, TEA-Cl - 25, CaCl₂ - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10, MgCl₂ - 2; рН доводили до значення 7.35 за допомогою КОН.

Розчин, яким заповнювали скляні мікропіпетки, мав такий склад (у мілімолях на 1 л): CsCl - 105, HEPES - 10, EGTA - 10, MgATP - 2, CaCl₂ - 1, MgCl₂ - 2; рН доводили до значення 7.3 за допомогою CsOH.

Для кальційметрії використовували наступні розчини: базовий розчин, який використовувався під час усіх експериментальних процедур, містив, мМ: NaCl - 140, KCl - 2, MgCl₂ - 2, CaCl₂ - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10; рН доводили до значення 7.35 за допомогою NaOH. Даний розчин використовувався в якості перфузуючого розчину в експериментальній камері, а також для прикладання досліджуваних речовин.

Гіперкалієвий розчин містив, мМ: NaCl - 82, KCl - 50, MgCl₂ - 2, CaCl₂ - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10; рН доводили до значення 7.35 за допомогою NaOH.

Розчин для виділення гіпокампа мав наступний склад: NaCl - 140, KCl - 5, CaCl₂ - 0,2, HEPES - 10, глюкоза - 10; рН доводили до значення 7.35 за допомогою NaOH; антибіотики: натрієва сіль бензилпеніцеліну - 50 од/мл та стрептоміцин сульфат 50 мкг/мл.

Поживне середовище для культивування нейронів гіпокампа містило наступні компоненти: 90% мінімального середовища Ігла ( МЕМ, “SIGMA”, США), бікарбонатний буфер (2.2 г/л NaHCO₃), 10% кінської сиворотки (“GIBCO”, США), 10 мкг/мл інсуліну та антибіотики: натрієва сіль бензилпеніцеліну-50 од/мл, та стрептоміцин сульфат 50 мкг/мл. Всі розчини аплікували до клітин культури гіпокампа шляхом повної заміни розчину в експериментальній камері.

Обробка отриманих результатів досліджень та апроксимація даних. Для отримання вольт-амперної характеристики (ВАХ) потенціалкерованих кальцієвих каналів використовували наступний протокол. Спочатку від підтримуваного потенціалу -80 мВ подавали прямокутний імпульс потенціалу амплітудою -10 мВ для визначення пасивних характеристик мембрани. Потім подавали тестові прямокутні імпульси потенціалу (V_test) в діапазоні від -80 до -60 мВ та від -10 до +20 мВ з інкрементом 10 мВ, а в діапазоні від -60 до -10 мВ - з інкрементом 5 мВ. Графік ВАХ потенціалкерованих кальцієвих каналів будували як залежність максимального значення амплітуди струму від амплітуди V_test.

Для вимірювання характеристик стаціонарної активації потенціалкерованих кальцієвих використовували наступний протокол. Підтримуваний потенціал становив V_hold = -80 мВ. Потім потенціал змінювали до значень потенціалу кондиціонуючих преімпульсів (V_pre) в діапазоні від -80 до -30 мВ та від +20 до +100 мВ з інкрементом 10 мВ, а в діапазоні від -30 до +20 мВ - з інкрементом 5 мВ. Тривалість преімпульсів складала 40 мс. Після кожного преімпульсу потенціал зміщувався до значення тестового потенціалу (V_test), який дорівнював -30 мВ і мав тривалість 150 мс. Після цього рівень потенціалу знову повертали до значення V_hold. Для визначення характеристик для стаціонарної інактивації використовували наступний протокол. Підтримуваний потенціал складав -100 мВ. Перед тестовим потенціалом тривалістю 100 мс, який складав 0 мВ, подавали кондиціонуючі преімпульси від -100 до 0 мВ з інкрементом 5 мВ тривалістю 2.5 с та інтервалом між сусідніми імпульсами 5 с

Криві стаціонарної активації та інактивації каналів апроксимували рівнянням Больцмана вигляду

, [2]

де І/I_max - нормований до максимального значення струм, V_h - потенціал половинної активації/інактивації каналів, V_pre - значення кондиціонуючого преімпульсу, k - фактор нахилу потенціалзалежної характеристики. Параметр R² точності апроксимації становив 0.99.

Кальцієві транзієнти, отримані в контрольних умовах апроксимували сумою двох експонент за формулою:

[3]

де А₁, А₂ - амплітудні коефіцієнти, ф₁, ф₂ - константи часу спаду, С - константа. У даному випадку параметр R² точності апроксимації становив 0.98.

Час напівспаду кальцієвого транзієнта обчислювали за формулою:

t_0.5 = t_(max/2)2 - t_(max/2)1 [4]

кальцієвий гомеостаз нейрон гіпокамп

де t_(max/2)1,2 - значення часу по обидва боки від піку кальцієвого транзієнта, при яких величина [Ca²⁺]_i дорівнює половині амплітуди сигналу.

Числові дані представлені як середні арифметичні середньоквадратична похибка (SEM). Після кожного результату приводилось значення n, яке дорівнювало кількості досліджених клітин у незалежних експериментах. Для оцінки достовірності відмінностей використовувалась величина р, розрахована з використанням t-тесту Ст'юдента. У третьому розділі “Результати досліджень” експериментально визначені зміни кальцієвої сигналізації нейронів культури гіпокампа при інкубації з пептидом в-амілоїдом: зміни базової концентрації кальцію в нейронах, зміни характеристик кальцієвих струмів та функціонування кальційрегулюючих структур.

Кальцієва сигналізація у клітинах культури гіпокампа щурів у контрольних умовах. Концентрація [Са²⁺]_і у цитозолі нейронів культури гіпокампа щурів у контрольних умовах (базовий рівень) складала 76 ± 8 нМ (n = 10).

Однією з важливих характеристик внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу є кінетика кальцієвих транзієнтів, обумовлених деполяризацією клітинної мембрани. Пікові значення кальцієвих транзієнтів характеризують вхід іонів кальцію в цитозоль клітини переважно через потенціалкеровані кальцієві канали, в той час як спад кривої характеризує виведення Са²⁺ з цитозолю. Імовірність відкриття потенціалкерованих кальцієвих каналів залежить від потенціалу мембрани. Кальцієвий сигнал, викликаний деполяризацією нейронів, ініціювали за допомогою аплікації розчину, що містив 50 мМ КСl (гіперкалієвий розчин). Деполяризація, викликана прикладанням гіперкалієвого розчину протягом 10 секунд, призводила до виникнення транзієнтного підвищення [Са²⁺]_і (кальцієвий транзієнт). Кальцієвий транзієнт мав фазу швидкого наростання від базового рівня до максимального значення, яке складало 572 ± 54 нМ (n = 9), та фазу повільного спаду. Найбільш інтенсивне зниження концентрації [Са²⁺]_і відбувалось у перші 8 секунд фази спаду. Потім його швидкість поступово зменшувалась, досягаючи базового рівня протягом 60 - 100 с. При меншому часі деполяризації (5 с) кальцієвий транзієнт досягав меншої амплітуди, а характер спаду наближався до лінійного. При збільшенні часу прикладання гіперкалієвого розчину до 15 с амплітуда [Са²⁺]_і транзієнта не зростала. Кальцієва сигналізація у нейронах культури гіпокампа щурів при інкубації з в_1-42-амілоїдом. Метою даних експериментів було встановлення механізмів змін функціонування кальційрегулюючих структур після інкубації культури клітин гіпокампа в_1-42-амілоїдом.

За допомогою методу двохвильової кальційметрії було встановлено, що рівень базової концентрації кальцію в нейронах культури гіпокампа щурів за умов 24-годинної інкубації з в_1-42-амілоїдом був достовірно підвищеним порівняно з контролем та складав 138 ± 12 нМ (p < 0.01, n = 19). Також було виявлене достовірне збільшення амплітуд деполяризаційних кальцієвих транзієнтів. Контрольне значення амплітуди кальцієвого транзієнта складало 506 ± 20 нМ (n = 9), а після інкубації з в-амілоїдом значення амплітуди становило 622 ± 34 нМ (n = 18). На рис. показано результати статистичної обробки амплітуд кальцієвих транзієнтів в контролі та після інкубації з в-амілоїдом відповідно (**p < 0.05, n = 18).

Суттєва різниця в характеристиках кальцієвих транзієнтів, викликаних при деполяризації клітини гіперкалієвим розчином, в нейронах культури гіпокампа в контролі та за умов попередньої інкубації з в-амілоїдом, була виявлена при аналізі кінетики їх спаду, яка характеризує виведення Са²⁺ з цитоплазми клітини. Транзієнти таких нейронів мали більший час спаду [Ca²⁺]_i.

Разом зі вказаними параметрами було обраховано інтеграл під кривою транзієнта, величина якого відповідала кількості кальцію в цитоплазмі клітини за період часу від початку деполяризації мембрани до моменту повернення [Ca²⁺]_і до базового рівня. В контрольних умовах величина інтегралу становила 12836 1545 нМ*с (n = 7), а після попередньої інкубації з в-амілоїдом даний показник становив 24663 ± 3681 нМ*с (р < 0.02, n = 7).

Ці результати можуть свідчити про те, що в-амілоїд впливає на вхід кальцію через канали плазматичної мембрани, або, імовірно, він може інкорпоруватись в клітинну мембрану, призводячи до утворення додаткових каналів, які пропускають кальцій. Також це може бути пов'язано з порушенням механізмів початкового виведення Са²⁺ з цитозолю кальційакумулюючими структурами. З іншого боку, можливо, що зміна амплітуди викликаних деполяризацією кальцієвих транзієнтів при інкубації клітин з в-амілоїдом, зумовлена комбінацією вищезгаданих ефектів.

Таким чином, було виявлено достовірну різницю в кількості кальцію, який знаходиться в цитоплазмі нейронів під час деполяризації клітини гіперкалієвим розчином після попередньої інкубації з в-амілоїдом, порівняно з відповідними параметрами в контрольних умовах.

Вплив в-амілоїду на вольт-амперну характеристику потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів гіпокампа щурів. Нейрони культури гіпокампа експресують низькопорогові та високопорогові кальцієві канали. На рис. А представлений приклад кальцієвих струмів в нейронах культури гіпокампа. Показано записи струмів, які містять високо- та низькопорогову компоненти та вольт-амперну характеристику потенціалкерованих кальцієвих каналів.

А зображено усереднені вольт-амперні криві густин кальцієвих струмів, отримані в контрольних умовах та при експериментальній моделі хвороби Альцгеймера.

Після інкубації клітин культури гіпокампа з в_1-42-амілоїдом вольт-амперні характеристики кальцієвих каналів зазнавали змін. З рисунку видно, що після інкубації з в_1-42-амілоїдом амплітуда кальцієвих струмів збільшувалась. Усереднене максимальне значення густини струмів переважно через високопорогові кальцієві канали в контрольних умовах становило j_{HVA контр} = -5.0 0.7 пА/пФ (n = 6) при мембранному потенціалі V_m -5 мВ, а після впливу в_1-42-амілоїду густина струму переважно через високопорогові кальцієві канали становила j_{HVA Ав} = -8.5 1.0 пА/пФ (p < 0.05, n = 12) при мембранному потенціалі V_m -15 мВ.

Таким чином, інкубація нейронів культури гіпокампа з в-амілоїдом призводить до збільшення амплітуди струму через потенціалкеровані кальцієві канали і до зміщення вольт-амперної характеристики кальцієвих каналів у бік негативних значень мембранного потенціалу.

Зміни кривої стаціонарної активації потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів культури гіпокампа щурів при впливі в_1-42-амілоїду. Криву стаціонарної активації кальцієвих каналів нейронів культури гіпокампа реєстрували в контрольних умовах та після інкубації культури з в_1-42-амілоїдом. З рис. 8 видно, що крива стаціонарної активації змістилась ліворуч поздовж осі мембранних потенціалів у порівнянні з контролем. Якщо в контрольних умовах потенціал половинної активації V_{1/2 контр} = -14.7 1.9 мВ (n = 5), то після інкубації з в_1-42-амілоїдом V_{1/2 Ав} = -26.4 ± 2.3 мВ (р < 0.01, n = 10).

Отже, після впливу в-амілоїду крива стаціонарної активації зсунулась в гіперполяризаційному напрямку порівняно з кривою в контрольних умовах приблизно на 12 мВ. Нахил кривої залишився практично незмінним.

Характеристика кривої стаціонарної інактивації потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів гіпокампа щурів після інкубації з в_1-42-амілоїдом. На рис. 9 представлені криві стаціонарної інактивації кальцієвих каналів в контрольних умовах та після інкубації з в_1-42-амілоїдом.

У контрольних умовах потенціал половинної інактивації V_{1/2 контр} = -42.3 ± 3.0 мВ (n = 5), а після впливу в-амілоїду потенціал половинної інактивації складав V_{1/2 Ав} = -44.2 ± 3.2 мВ (n = 10). Отже, статистично достовірної різниці між кривими стаціонарної інактивації потенціалкерованих кальцієвих каналів в контролі та після інкубації з в_1-42-амілоїдом виявлено не було.

Вплив уніпортера мітохондрій на амплітуду та кінетику кальцієвих сигналів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією, в контрольних умовах. Для дослідження впливу мітохондрій на амплітуду та кінетику кальцієвих сигналів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією, ми використовували позаклітинну аплікацію СССР (карбоніл-цианід 3-флорофенілгідразон) - протонофора, що у концентрації 1 - 10 мкМ викликає руйнування протонного градієнта на внутрішній мембрані мітохондрій та блокує роботу мітохондріального уніпортера, що призводить до порушення акумулювання мітохондріями цитозольного кальцію та підвищення концентрації [Са²⁺]_і.

У контрольних умовах амплітуда кальцієвого транзієнта у відповідь на аплікацію гіперкалієвого розчину становила 508 ± 30 нМ (n = 15). При деполяризації ж контрольних клітин гіперкалієвим розчином в присутності СССР (10 мкМ) відбувалось додаткове підвищення [Са²⁺]_і, амплітуда якого достовірно перевищувала (на 23 ± 3 %) величину кальцієвого транзієнта, викликаного прикладанням гіперкалієвого розчину, досягаючи величини 625 ± 39 нМ (р < 0.05, n = 15). Крім того, відбувалось уповільнення фази спаду транзієнта, особливо виражене протягом його перших кількох десятків секунд. Мітохондрії певною мірою обмежують амплітуду кальцієвого транзієнта, викликаного деполяризацією, загальмовуючи його початкову фазу та призводячи до появи плато. Очевидно, концентрація Са²⁺ у мітохондріях зростає під час наростання та під час спаду транзієнта. Виведення кальцію з мітохондрій відбувається повільно протягом кількох хвилин після майже повного повернення [Са²⁺]_і до базового рівня та не призводить до значних його коливань, очевидно компенсуючись іншими механізмами, що відповідають за виведення Са²⁺ з цитозолю.

Отже, ці результати свідчать про те, що мітохондрії як кальцієві депо, відіграють певну роль у формуванні амплітуди та кінетичних характеристик спаду кальцієвого транзієнта.

Зміни функціонування мітохондрій після інкубації з в_1-42-амілоїдом. Після попередньої інкубації культури нейронів гіпокампа з в_1-42-амілоїдом відбувалась зміна кінетики кальцієвих сигналів, викликаних прикладанням гіперкалієвого розчину у присутності СССР (10 мкМ), порівняно з відповідними значеннями при застосуванні гіперкалієвого розчину без СССР.

Амплітуда транзієнта достовірних змін не зазнала: при аплікації гіперкалієвого розчину вона становила 644 ± 62 нМ, а при прикладанні СССР у присутності гіперкалієвого розчину - 697 ± 66 нМ (n = 9) (на відміну від контрольних значень). Разом з тим, спостерігалось збільшення часу напівспаду кальцієвих транзієнтів.

Для того, щоб більш точно оцінити кінетику участі уніпортера мітохондрій у кальцієвій сигналізації, були побудовані графіки, що являли собою усереднене значення 15 кальцієвих деполяризаційних транзієнтів, отриманих у присутності СССР та різниці між ними, яка, власне, і відображає внесок уніпортера мітохондрій, нормованих до 100 %. З рисунка видно, що після впливу в-амілоїду кальцієвий транзієнт значно розширювався, що може свідчити про наявність надлишкової кількості кальцію в мітохондріях після інкубації клітин культури гіпокампа з в-амілоїдом. Це явище може бути пов'язане з тим, що при впливі в-амілоїду на нейрони ушкоджується кальційзахоплююча функція мітохондрії. У нашому випадку після інкубації з в-амілоїдом ми спостерігали підвищений рівень внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Імовірно, з метою стабілізації рівня внутрішньоклітинної концентрації кальцію мітохондрії інтенсивніше поглинали надлишкову кількість цитоплазматичного кальцію.

Характерним показником зміни кальцієвого сигналу, окрім його амплітуди, також є час напівспаду t_0.5 кальцієвого транзієнта. У нейронах культури гіпокампа параметр t_0.5 деполяризаційних кальцієвих транзієнтів при впливі мітохондріального протонофора СССР у концентрації 10 мкМ зріс з 11 ± 3 с у контрольних умовах до 32 ± 6 с після інкубації з в-амілоїдом (n = 15, р < 0.02).

Отже, інкубація нейронів культури гіпокампа з в-амілоїдом призвела до ушкодження кальційакумулюючої функції мітохондрій.

Обговорення результатів. Дана робота присвячена комплексному дослідженню кальцієвої сигналізації нейронів культури гіпокампа щурів, зокрема оцінці кінетичних характеристик процесів в контрольних умовах, а також на експериментальній моделі хвороби Альцгеймера. Ми показали порушення функціонування, обумовлені присутністю в_1-42-амілоїду, кальційрегулюючих структур, таких як мітохондрії та кальцієві канали плазматичної мембрани, а також зміни цитоплазматичної концентрації кальцію.

Нейродегенерація, асоційована з хворобою Альцгеймера, залучає складну систему клітинних та молекулярних взаємодій, включаючи компоненти збуджуючої відповіді, зокрема, екситотоксичне та окисне пошкодження, що призводить до метаболічних порушень, ненормальних відкладень білка, цитоскелетних аномалій та клітинної смерті. Оксидативний стрес є головним фактором, який причетний до порушення нейронного кальцієвого гомеостазу та нейронної загибелі. Пептид в-амілоїд являє собою основний патологічний маркер при хворобі Альцгеймера (Pearson, Peers, 2006).

Першим завданням даної роботи було визначити залежність рівня базового [Ca²⁺]_і від наявності в_1-42.-амілоїду Була показана принципова відмінність у значеннях базового рівня [Ca²⁺]_і: концентрація кальцію виявилась достовірно підвищеною після попередньої інкубації з в_1-42-амілоїдом. У контрольних умовах цитоплазматична концентрація кальцію складала 76 нМ, а після інкубації з в_1-42-амілоїдом - 138 нМ. Подібне підвищення базового рівня кальцію було показане на культурі кортикальних нейронів та нейронів культури гіпокампа (Resende et al., 2007), де 48-годинна інкубація з в_1-40-амілоїдом та в_25-35-амілоїдом призводила до підвищення базового рівня кальцію, причому в гіпокампальних нейронах порівняно з кортикальними рівень кальцію був вищим. Однією з умов підвищення [Ca²⁺]_і при наявності в-амілоїду, можливо, міг бути вхід іонів Са²⁺ з позаклітинного середовища через канали, сформовані самим в-амілоїдом. Адже в експериментах in vitro було встановлено, що в_1-40-амілоїд може формувати пори в ліпідних бішарах, які мали здатність пропускати іони кальцію. Також Кавахара та співавтори показали, що в_1-40-амілоїд формує катіонселективні канали в мембрані клітинної лінії GT1-7 з провідністю 50-500 пСм. Активність цих каналів пригнічувалась додаванням 250 мкм цинку в базовий розчин, в той же час о-фенантролін (хелатор цинку) відновлював канальну активність (Kawahara and Kuroda, 2000). Подібні результати були одержані на кортикальних нейронах щурів при використанні в_25-35-амілоїду за допомогою методу петч-клемп у конфігурації perforated patch-clamp. в_25-35-Амілоїд у концентрації >10 нМ призводив до виникнення повільного вхідного струму (Furukawa et al., 1994). Вбудовування каналів, сформованих самим в-амілоїдом, в плазматичні мембрани може поступово спричиняти зміни мембранного потенціалу нейронів, призводячи до порушення їх збудливості. Крім того, інкорпорування таких каналів в мембрани ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій може спричинити активацію каспаз і, відповідно, призводити до апоптозу. Таким чином, ми вважаємо, що однією з причин підвищення базової концентрації кальцію в нейронах культури гіпокампа щурів після інкубації з в_1-42-амілоїдом може бути кальцієвий струм через канали, сформовані самим в_1-42-амілоїдом.

Нейрони являть собою збудливі клітини, які миттєво передають електрохімічні сигнали чітко контрольованим у просторі та часі способом. Вхід іонів кальцію крізь іонні канали клітинної мембрани спричинює відповідне підвищення їх концентрації у цитоплазмі. Це підвищення, яке називають кальцієвим сигналом або кальцієвим транзієнтом, є основним фактором запуску чи модуляції багатьох клітинних процесів, і тому часові, просторові та амплітудні характеристики його мають надзвичайно важливе значення для нормального функціонування клітини й можуть бути причиною його порушень. Тому наступним завданням даної роботи було порівняти кальцієві транзієнти, одержані в контрольних умовах та після інкубації з в_1-42-амілоїдом. Експериментально було встановлено, що інкубація нейронів гіпокампа щурів з в_1-42-амілоїдом призводила до збільшення амплітуди кальцієвого транзієнта. Контрольне значення амплітуди кальцієвого транзієнта складало 506 нМ, а після інкубації з в_1-42-амілоїдом значення амплітуди становило 622 нМ. Разом зі вказаними параметрами було обраховано інтеграл під кривою тарнзієнта, величина якого відповідає кількості кальцію в цитоплазмі клітини за період часу від початку деполяризації мембрани до моменту повернення [Ca²⁺]_і до базового рівня. В контрольних умовах величина інтегралу становила 12836 нМ*с, після інкубації з в_1-42-амілоїдом даний показник становив 24663 нМ*с. Встановлена різниця між значеннями амплітуд кальцієвих транзієнтів може свідчити про зміни у функціонуванні кальцієвих каналів плазматичної мембрани, а також про зміни у функціонуванні мітохондрій. Зміна часу напівспаду кальцієвих транзієнтів за умов інкубації з в_1-42-амілоїдом може свідчити також про ушкодження мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму.

Існують експериментальні докази того, що порушення функціонування мітохондрій являє собою ранній прояв хвороби Альцгеймера, який передує утворенню патологічних відкладень в мозку (Anandatheerthavarada and Devi, 2007). Дослідження, проведені на астроцитах, показали зниження мітохондріального потенціалу після інкубації з в-амілоїдом (Abramov et al., 2004). Експериментально було встановлено взаємозв'язок між наявністю в_25-35-амілоїду та ушкодженням мітохондріальної ДНК на клітинній лінії PC12. Разом з тим, було встановлено, що розчинна та нерозчинна форми в-амілоїду порушують процес утворення АТФ, призводячи до подальших дефектів мітохондріального енергетичного метаболізму та оксидативного стресу (Behl, 2005). В наших експериментах з метою дослідження функціонування мітохондрій як у контролі, так і після інкубації з в_1-42-амілоїдом, використовували блокатор мітохондріального уніпортера СССР. В контрольних експериментах при прикладанні СССР на фоні гіперкалієвого розчину відбувалось достовірне підвищення кальцієвого транзієнта, що вказує на те, що мітохондрії активно виконують кальційакумулюючу функцію. Мітохондрії обмежують амплітуду кальцієвого транзієнта, викликаного деполяризацією, загальмовуючи його початкову фазу, та призводять до появи подовженої фази спаду. Очевидно, концентрація Са²⁺ у мітохондріях зростає під час наростання та під час фази спаду транзієнта. За умов інкубації нейронів культури гіпокампа з в_1-42-амілоїдом достовірного підвищення амплітуди транзієнта при застосуванні СССР не спостерігалось (на відміну від контролю), що вказує на порушення кальційакумулюючої функції мітохондрій. Така зміна може бути обумовлена зниженням мітохондріального мембранного потенціалу. При порівнянні часу напівспаду кальцієвих транзієнтів при використанні СССР було виявлено, що інкубація з в_1-42-амілоїдом призводить до його збільшення. Наші дані співставні з результатами дослідів, проведених на фібробластах пацієнтів з хворобою Альцгеймера, в яких було продемонстровано зниження здатності захоплення кальцію мітохондріями та збільшення внутрішньоклітинної кальцієвої концентрації (Hirai et al., 2001).

Порушення транспорту глюкози в кортикальних нейронах та нейронах гіпокампа вважають однією з причин зниження мітохондріального метаболізму в цих клітинах. В експериментах на культивованих нейронах гіпокампа та кортикальних нейронах при застосуванні в-амілоїду було показано залежне від його концентрації порушення транспорту ³Н-дезоксиглюкози. Зниження транспорту глюкози в нейронах призводить до зменшення кількості АТФ. Таким чином, ці факти вказують на безпосередню роль мітохондрій у нейродегенерації при хворобі Альцгеймера. Тому можна вважати, що рання терапевтична “корекція” роботи мітохондрій може бути ефективною при запобіганні розвитку та прогресування цієї хвороби у людей похилого віку.

Білок в-амілоїд може перебувати в розчинній та агрегованій формах (Pearson and Peers, 2006). Вважають, що агрегований нерозчинний амілоїд є проапоптотичним і може спричинювати клітинну дегенерацію шляхом порушення кальцієвого гомеостазу. Було представлено низку доказів того, що в-амілоїд може зумовлювати нейротоксичні ефекти, впливаючи на іонні канали плазматичної мембрани. В нашій роботі експериментально було встановлено, що інкубація нейронів культури гіпокампа з в_1-42-амілоїдом призводила до зростання амплітуди інтегрального струму через потенціалкеровані кальцієві канали на 70%. Причому, ділянка вольт-амперної кривої, яка переважно відповідала низькопороговим кальцієвим струмам, зазнавала більших змін (після інкубації вона збільшувалась на 130%), ніж та, що відповідає переважно високопороговим кальцієвим струмам (після інкубації збільшувалась на 70%). Разом з тим ми експериментально показали, що в_1-42-амілоїд призводить до зміни стаціонарної активації, що обумовлює зниження порогу активації кальцієвого каналу. Крива стаціонарної активації зсувалась на 10-15 мВ у бік гіперполяризації. На стаціонарну інактивацію впливів виявлено не було. Наші дані співставні з експериментальними даними декількох дослідницьких груп, які за допомогою методу фіксації потенціалу продемонстрували здатність амілоїду збільшувати кальцієвий струм в нейронах (Сook et al., 2005), а також на клітинній лінії N1E, 24-годинна інкубація якої з в_1-42-амілоїдом призвела до збільшення активності кальцієвих каналів. Подібне збільшення струму спостерігалось і в експериментах на центральних гранулярних та кортикальних нейронах, де їх попередньо інкубували з в_25-35-амілоїдом. Було висунуто припущення, що в цьому збільшенні задіяні потенціалкеровані кальцієві канали L- та N-типу. Лі та співавтори (Li et al., 2000) показали, що в-амілоїд також підсилює барієвий струм через кальцієві канали нейронів гіпокампа, але не призводить до зсуву кривої ВАХ та кінетики активації на відміну від наших даних. На культурі нейронів спінальних гангліїв було показано, що в_25-35-амілоїд збільшує мембранний кальцієвий струм (He et al., 2002), причому низькопороговий кальцієвий струм після інкубації зазнавав більших змін, ніж високопороговий.

Таким чином, приведені факти вказують на те, що патологічна дія в-амілоїду на нейрони може обумовлюватись впливом цього пептиду на структури плазматичної мембрани, відповідальні за проникнення іонів кальцію всередину клітини з зовнішнього середовища, призводячи до порушення кальцієвого гомеостазу нейронів. Наші дослідження підтверджують, що особливе значення в такому порушенні мають зміни в кальційакумулюючій функції цитоплазматичних структур, особливо мітохондрій, які здатні швидко захоплювати іони кальцію з цитоплазми і потім з деякою затримкою вивільнювати їх назад. Така затримка суттєво змінює часовий перебіг внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів і, відповідно, може істотно порушувати найбільш важливі клітинні функції, що і спостерігається при дослідженні патології нервової клітини. Дані зміни, імовірно, є істотним компонентом патологічних факторів, з якими пов'язаний розвиток хвороби Альцгеймера.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі за допомогою методу двохвильового вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію з використанням мембранопроникної форми флуоресцентного барвника fura-2/AM та методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” на експериментальній моделі хвороби Альцгеймера було встановлено порушення кальцієвого гомеостазу та кальційрегулюючих структур нейронів культури гіпокампа щурів.

1. Інкубація нейронів культури гіпокампа щурів протягом доби з пептидом в_1-42-амілоїдом призводить до статистично достовірного підвищення базового рівня [Са²⁺]_і порівняно з відповідним показником в контрольних клітинах.

2. При інкубації клітин гіпокампа з в_1-42-амілоїдом виявлено статистично достовірне збільшення площі, амплітуди та часу напівспаду кальцієвих транзієнтів нейронів культури гіпокампа, викликаних гіперкалієвою деполяризацією, порівняно з відповідними контрольними значеннями.

3. в_1-42-Амілоїд призводить до достовірного збільшення густини інтегрального струму через потенціалкеровані кальцієві канали клітин культури гіпокампа на 70% порівняно з контрольним значенням.

4. При оцінці кінетичних характеристик потенціалкерованих кальцієвих каналів було встановлено, що крива стаціонарної активації зсунулась в напрямку гіперполяризації порівняно з відповідною кривою в контрольних умовах на 12 мВ. При дослідженні кривої стаціонарної інактивації кальцієвих каналів клітин культури гіпокампа статистично достовірної різниці виявлено не було.

5. При порівнянні Са²⁺ транзієнтів, викликаних прикладанням гіперкалієвого розчину та гіперкалієвого розчину в присутності мітохондріального протонофора СССР, показано статистично достовірну різницю між амплітудами таких транзієнтів клітин культури гіпокампа в контрольних умовах. Після інкубації з в_1-42-амілоїдом різниці між амплітудами кальцієвих транзієнтів не спостерігалось, що вказує на порушення функціонування уніпоретра мітохондрій.

6. Проведене дослідження систем кальцієвої сигналізації нейронів культури гіпокампа за умов інкубації з в_1-42-амілоїдом вказує на їх комплексне порушення, що стосується як механізмів входу Са²⁺ через канальні структури плазматичної мембрани, так і механізмів акумуляції Са²⁺ цитоплазматичними структурами, в першу чергу мітохондріями. Цей комплекс порушень може бути істотним компонентом патологічних змін функцій гіпокампа при хворобі Альцгеймера.