Зміни кальцієвого гомеостазу в нейронах культури гіпокампа щурів при інкубації з в-амілоїдом

Список опублікованих робіт за темою дисертації

1. Порушення кальцієвого гомеостазу при хворобі Альцгеймера / Т. Ю. Король, С. В. Король, О. П. Костюк, П. Г. Костюк // Neurophysiology. - 2008. - Т. 40, № 5/6. - С. 457-464.

2. Зміни кальцієвого гомеостазу в культивованих нейронах гіпокампа, викликані впливом в-амілоїду / Т. Ю. Король, С. В. Король, О. П. Костюк, П. Г. Костюк // Neurophysiology. - 2008. - Т. 40, №1. - С. 9-12. (Самостійно виконано експериментальну частину та підготовлено матеріали до друку).

3. Король Т. Ю. Вплив білка в-амілоїду на кальцієві канали плазматичної мембрани культивованих нейронів гіпокампа / Т. Ю. Король, О. П. Костюк, П. Г. Костюк // Фізіологічний журнал. - 2009. - Т. 55, № 4, - С. 10-16. (Здобувачем самостійно виконано частину експериментального матеріалу та підготовлено статтю до друку).

4. Король Т. Ю. Ушкодження кальційзахоплюючої функції мітохондрій при експериментальній хворобі Альцгеймера / Тетяна Король, Олена Костюк // Доповіді НАН України. - 2009. - № 6. - С. 186-190. (Самостійно проведено експериментальну частину та підготовлено статтю до друку).

Тези доповідей:

1. в-amyloid peptide induces changes in calcium signalling in hippocampal cells / T. Korol, S. Korol, O. P. Kostyuk, P. G. Kostyuk. // Acta Physiologica. - 2007. - V. 191, suppl. 658. - P. 69.

2. Store-operated calcium entry in sensory DRG neurons / S. Korol, T. Korol, O. P. Kostyuk, P. G. Kostyuk. // Acta Physiologica. - 2007. - V. 191, suppl. 658. - P. 56.

3. Capacitative calcium entry induced by activation of ryanodine receptors of endoplasmic reticulum in rat DRG neurons / S. V. Korol, T. Yu. Korol, O. P. Kostyuk, P. G. Kostyuk. // Фізіологічний журнал. - 2008. - Т. 54, № 2. - С. 116-117.

АНОТАЦІЇ

Король Т. Ю. Зміни кальцієвого гомеостазу в нейронах культури гіпокампа щурів при інкубації з в-амілоїдом. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, 2009.

Дисертація присвячена комплексному дослідженню впливу білка в_1-42-амілоїда, основного компонента сенільних бляшок при хворобі Альцгеймера, на кальцієвий гомеостаз нейронів культури гіпокампа щурів, зокрема, на зміни базової концентрації кальцію та функціонування кальцієвих каналів плазматичної мембрани та мітохондрій. За допомогою методу двохвильового вимірювання внутрішньоклітинної концентрації кальцію з використанням мембранопроникної форми флуоресцентного барвника fura-2/AM було показано, що інкубація нейронів культури гіпокампа щурів з в_1-42-амілоїдом призводить до статистично достовірного підвищення базового рівня [Са²⁺]_і. За умов інкубації культури нейронів гіпокампа з в_1-42-амілоїдом виявлено достовірне збільшення амплітуди та часу напівспаду кальцієвих транзієнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією нейронів культури гіпокампа, а також площі транзієнта. За допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” встановлено, що в_1-42-амілоїд призводить до достовірного збільшення густини кальцієвих струмів нейронів на 70% порівняно з контрольним значенням. При оцінці кінетичних характеристик потенціалкерованих кальцієвих каналів було встановлено достовірну зміну в кривій стаціонарної активації. При дослідженні кривої стаціонарної інактивації кальцієвих каналів клітин культури гіпокампа після інкубації з в_1-42-амілоїдом статистично достовірної різниці порівняно з відповідною кривою, отриманою в контрольних умовах, виявлено не було. При порівнянні кальцієвих транзієнтів, викликаних прикладанням гіперкалієвого розчину та гіперкалієвого розчину з мітохондріальним протонофором СССР, в нейронах культури гіпокампа, інкубованих з в_1-42-амілоїдом, статистично достовірної різниці між амплітудами виявлено не було (на відміну від контрольних показників), що може вказувати на порушення кальційзахоплюючої функції мітохондрій.

Проведене дослідження систем кальцієвої сигналізації нейронів культури гіпокампа за умов інкубації з в_1-42-амілоїдом вказує на їх комплексне порушення, що стосується як механізмів входу кальцію через канальні структури плазматичної мембрани, так і механізмів акумуляції іонів кальцію цитоплазматичними структурами, в першу чергу мітохондріями. Цей комплекс порушень може бути істотним компонентом патологічних змін функцій гіпокампа при хворобі Альцгеймера.

Ключові слова: нейрони культури гіпокампа, потенціалкеровані кальцієві канали, в-амілоїд, хвороба Альцгеймера, мітохондрія.

Король Т. Ю. Изменение кальциевого гомеостаза нейронов культуры гиппокампа крыс при инкубации с в-амилоидом. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвящена исследованию влияния белка в_1-42-амилоида, основного компонента сенильных бляшек при болезни Альцгеймера, на кальциевый гомеостаз нейронов культуры гиппокампа крыс. С помощью метода двухволнового измерения внутриклеточной концентрации кальция с использованием мембранопроникающей формы флюоресцентного красителя fura-2/AM было показано, что суточная инкубация нейронов культуры гиппокампа с в-амилоидом приводит к статистически достоверному повышению базового уровня кальция. Также было обнаружено, что у нейронов культуры, которые инкубировались с в_1-42-амилоидом, достоверно были увеличены амплитуды и время полуспада кальциевых транзиентов, вызванных гиперкалиевой деполяризацией, а также площади транзиентов, которые соответствует количеству кальция в клетке. С использованием методики „пэтч-клемп” в конфигурации „целая клетка” было исследовано влияние в_1-42-амилоида на кальциевые каналы и их биофизические характеристики (влияние на активацию и инактивацию) в нейронах культуры гиппокампа. Было установлено, что в_1-42-амилоид приводит к достоверному увеличению плотности кальциевых токов на 70% по сравнению с контрольным показателем. При оценке кинетических характеристик потенциалзависимых кальциевых каналов было выявлено смещение кривой стационарной активации в гиперполяризационную область; потенциал половинной активации уменьшился на 12 мВ относительно контрольного значения. При сравнении кальциевых транзиентов, вызванных приложением гиперкалиевого раствора и гиперкалиевого раствора с митохондриальным протонофором СССР, в нейронах культуры гиппокампа, инкубированных с в_1-42-амилоидом, статистически достоверной разницы между амплитудами транзиентов выявлено не было (в отличие от контроля), что может указывать на нарушение кальцийзахватывающей функции митохондрий. Данные исследования систем кальциевой сигнализации нейронов культуры гиппокампа при условии их инкубации с в_1-42-амилоидом свидетельствуют о комплексном нарушении, которое включает в себя как вход кальция через канальные структуры плазматической мембраны, так и механизмы аккумуляции кальция цитоплазматическими структурами, в первую очередь митохондриями. Этот комплекс нарушений может быть существенным компонентом патологических изменений функции гиппокампа при болезни Альцгеймера.

Ключевые слова: нейроны культуры гиппокампа, в-амилоид, болезнь Альцгеймера, кальциевые каналы, митохондрия.

Korol T. Yu. Influence of в-amyloid peptide on calcium signalling in hippocampal cell culture of rats. - Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of biological sciences on the speciality 03.00.02 - biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

This dissertation is devoted to the investigation of influence of the в-amyloid peptide, main component of senile plaques in the brain of patients with Alzheimer's disease, on calcium signalling in hippocampal cell culture. Accumulation of в-amyloid peptide of 42 amino acid length (Aв_1-42) in brain is an important characteristic for the etiology of Alzheimer's disease. Of all the possible processes generating the neurotoxic effects by Aв_1-42, disruption of intracellular Ca²⁺ homeostasis is the primary event. The aim of the study was to discover changes in basal calcium level and mitochondrial function as well as alterations in properties of voltage-gated calcium channels in hippocampal cell culture with experimental induced Alzheimer's disease.

The changes in neuronal Ca²⁺ homeostasis and voltage-dependent characteristics of calcium channels were revealed in rat hippocampal cell culture at comparison of Ca²⁺ signalling in control conditions and after 24-hour treatment with Aв_1-42. The cytoplasmic free Ca²⁺ concentration ([Ca²⁺]_i) was measured using fura-2 based microfluorometry. Hyperpotassium solution was used for inducing Ca²⁺ transients. To compare mitochondrial contribution to Ca²⁺ signals in experimental conditions was used uncoupler of mitochondria CCCP (10 мM) dissolved in hyperpotassium solution. It was revealed that after 24-hour incubation of hippocampal cell culture with Aв_1-42 basal level of [Ca²⁺]_i was 138±12 nM vs. 76±8 nM in control conditions (P < 0.01, n = 19). Amplitude of Ca²⁺ transient in control conditions was 506±20 nM, and after treatment with Aв_1-42 this parameter increased to 622±34 nM (P < 0.05, n = 18). Amplitude of transients induced by hyperpotassium solution with addition of CCCP was 23±3% greater than amplitude of transient induced by hyperpotassium solution alone in control cells. Area of transient that corresponds to amount of cell calcium after incubation of hippocampal cell culture with в-amyloid peptide was greater than control transient area.

After incubation with Aв_1-42 difference between amplitudes induced by hyperpotassium solution with and without CCCP was not detected that can point to impairment of Ca²⁺ uptake function of mitochondria during maximal increasing of [Ca²⁺]_i. Moreover, in cells treated with Aв_1-42 Ca²⁺ transients induced by hyperpotassium solution with CCCP were higher and broader than that ones in control neurons.

Heightened basal level of [Ca²⁺]_i after incubation of cells with Aв_1-42 may cause to intensification of Ca²⁺ uptake by mitochondria in cell resting state that may result in overload of organelles. It seems that this may be the reason for impossibility of rapid absorption of Ca²⁺ by mitochondria during excitation of the cell. Overload of mitochondria with Ca²⁺ may result in triggering of apoptosis.

Current-voltage relationship, steady-state activation and steady-state inactivation curves of voltage-operated calcium channels of hippocampal cell culture were obtained using whole-cell modification of patch clamp technique. Current density in Aв-treated cells was 70 % higher (P < 0.05, n = 12) than in control ones. Current-voltage relation of calcium channels after incubation of hippocampal cell culture with Aв_1-42 had 10-mV shift to the hyperpolarization direction in comparison with control neurons. Steady-state activation curve of calcium channels in hippocampal cells modified by Aв_1-42 had 12-mV shift (P < 0.001, n = 10) to more negative values of membrane potential as compared to control curve. In contrast with first two voltage dependencies steady-state inactivation curve of voltage-gated calcium channels was not changed after action of Aв_1-42.

Shifts of current-voltage characteristic and steady-state activation curve of voltage-operated calcium channels to the hyperpolarization direction after cell treatment with Aв_1-42 may point to facilitation in activation of calcium channels. Enhancement of current density after incubation of hippocampal cell culture with Aв_1-42 lets us suggest that probability of channel open state increases. It is possible that hyperphosphorilation of calcium channel proteins by set of protein kinases induced by action of Aв_1-42 may be the reason of such changes in voltage dependencies of calcium channels. We conclude that Aв_1-42 affects voltage-gated calcium channels of hippocampal cell culture by means of some intermediate mechanisms or directly that leads to disturbance in cell calcium homeostasis.

Such disturbances in functioning of voltage-gated calcium channels as well as mitochondria may be essential component of pathological alterations of hippocampal functions at Alzheimer's disease.

Key words: hippocampal cell culture, в-amyloid peptide, Alzheimer's disease, calcium channels, mitochondrion.

Размещено на Allbest.ru