Модифікація функціональної активності потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронної плазматичної мембрани зовнішньоклітинним безкальцієвим розчином

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук україни інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

Автореферат

дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.02 - біофізика

Модифікація функціональної активності потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронної плазматичної мембрани зовнішньоклітинним безкальцієвим розчином

Король Сергій Васильович

Київ 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Міжнародному центрі молекулярної фізіології НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, академік НАН та АМН України, професор Костюк Платон Григорович директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, академік НАН України, професор Веселовський Микола Сергійович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України завідувач відділом фізіології нейронних мереж,

кандидат біологічних наук, Іванова Світлана Юріївна Міжнародний центр молекулярної фізіології НАН України, науковий співробітник.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 доктор біологічних наук З.О. Сорокіна.

Анотація

нейрон гіпокамп спінальний ганглій

Король С.В. - Модифікація функціональної активності потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронної плазматичної мембрани зовнішньоклітинним безкальцієвим розчином. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Міжнародний центр молекулярної фізіології НАН України, Київ, 2009.

Дисертація присвячена дослідженню впливу безкальцієвого позаклітинного розчину на функціональні характеристики потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв та нейронів культури гіпокампа щурів. За допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” виявлено неспецифічний калієвий та натрієвий струм через потенціалкеровані кальцієві канали нейронів спінальних гангліїв та неспецифічний калієвий струм через кальцієві канали нейронів культури гіпокампа щурів у зовнішньоклітинному безкальцієвому розчині. Показано чутливість неспецифічного калієвого струму через потенціалкеровані кальцієві канали досліджених нейронів до блокаторів кальцієвих каналів нікелю, ніфедипіна та кобальту в безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині. Продемонстровано, що при застосуванні позаклітинного розчину без іонів кальцію вольт-амперна характеристика (ВАХ) і крива стаціонарної активації потенціалкерованих кальцієвих каналів зсунулись у напрямку гіперполяризації на 10-13 мВ. Достовірних змін кривої стаціонарної інактивації при застосуванні безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину виявлено не було. При порівнянні ВАХ кальцієвих каналів при застосуванні безкальцієвих позаклітинних розчинів різного іонного складу встановлено, що кальцієві канали є менш проникними для іонів калію, ніж для іонів натрію.

Ключові слова: потенціалкеровані кальцієві канали, нейрони спінальних гангліїв, нейрони культури гіпокампа, безкальцієвий зовнішньоклітинний розчин, неспецифічний калієвий струм, вольт-амперна характеристика, крива стаціонарної активації.

Аннотация

Король С.В. - Модификация функциональной активности потенциалуправляемых кальциевых каналов нейронной плазматической мембраны внеклеточным бескальциевым раствором. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. Международный центр молекулярной физиологии НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвящена исследованию влияния бескальциевого внеклеточного раствора на функциональные характеристики потенциалуправляемых кальциевых каналов нейронов спинальных ганглиев и нейронов культуры гиппокампа крыс. Посредством метода фиксации потенциала в конфигурации “целая клетка” выявлен неспецифический калиевый и натриевый ток через потенциалуправляемые кальциевые каналы нейронов спинальных ганглиев и неспецифический калиевый ток через кальциевые каналы нейронов культуры гиппокампа крыс во внеклеточном бескальциевом растворе. Показана чувствительность неспецифического калиевого тока через потенциалуправляемые кальциевые каналы исследованных нейронов к блокаторам кальциевых каналов никелю, нифедипину и кобальту в бескальциевом внеклеточном растворе.

Продемонстрировано, что при использовании внеклеточного раствора без ионов кальция вольт-амперная характеристика (ВАХ) и кривая стационарной активации потенциалуправляемых кальциевых каналов сместились в направлении гиперполяризации на 10-13 мВ. Достоверных изменений кривой стационарной инактивации при использовании бескальциевого внеклеточного раствора обнаружено не было. При сравнении ВАХ кальциевых каналов при использовании бескальциевых внеклеточных растворов разного ионного состава выявлено, что кальциевые каналы менее проницаемы для ионов калия, чем для натрия.

Ключевые слова: потенциалуправляемые кальциевые каналы, нейроны спинальных ганглиев, нейроны культуры гиппокампа, бескальциевый внеклеточный раствор, неспецифический калиевый ток, вольт-амперная характеристика, кривая стационарной активации.

Annotation

Korol S.V. - Modification of functional activity of neuronal plasma membrane voltage-gated calcium channels by external calcium-free solution. - Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of biological sciences on the speciality 03.00.02 - biophysics. - International Center of Molecular Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

Dissertation is devoted to the investigation of influence of calcium-free external solution on functional characteristics of voltage-gated calcium channels of rat dorsal root ganglion and hippocampal cultured neurons.

In calcium-free external solution nonspecific potassium and sodium currents through voltage-gated calcium channels of rat dorsal root ganglion neurons and nonspecific potassium current via voltage-gated calcium channels of rat hippocampal cell culture were revealed with whole cell patch clamp technique. Inward current has been revealed after replacement of control solution with calcium concentration 2 mM by calcium-free one with potassium concentration 10 mM at the end of prepulse with amplitude -100 mV and duration 100 ms. Holding potential was -60 mV. After returning to control solution amplitude of current returned to initial value. In control solution calcium current was neglible small in comparison with discovered current in calcium-free solution at used prepulse. If calcium-free solution contained cesium ions instead of potassium ones any current could not be detected. Current amplitude increased with increasing of potassium concentration. Such dependence could be observed also in the case of hippocampal cell culture.

It has been found that low voltage-activated calcium channel antagonist nickel in concentration 300 мM inhibited potassium current in calcium-free solution by 69 ± 4 % (mean ± SEM) (p < 0.001, n = 5). After administration of nifedipine, the blocker of L-type calcium channel, in calcium-free solution amplitude of potassium current was 94 ± 2 % (p < 0.001, n = 6) smaller than amplitude of potassium current in calcium-free solution without nifedipine. So we concluded that potassium current passed through at least L- and T-type calcium channels in calcium-free medium. It was shown that current-voltage characteristic of voltage-gated calcium channels shifted 10 2 mV (p < 0.05, n = 9) to hyperpolarization direction in solution without calcium ions: in control external solution peak of the current-voltage relation of calcium channels was at membrane potential -10.1 2.3 mV and in calcium-free medium maximum of the current-voltage characteristic has been observed at -19.9 2 mV (p < 0.05, n = 9).

Steady-state activation curve obtained in calcium-free medium also underwent some changes. Half-maximal potential of steady-state activation curve in control conditions was -34.3 ± 2.2 mV and in calcium-free solution this parameter acquired value of -44.3 ± 3.1 mV (р < 0.02, n = 15). Therefore steady-state activation curve shifted 10 ± 2.5 mV (р < 0.02, n = 15) to more negative membrane potentials in test conditions. Slope factor has not been changed and it was about 4.5 mV. Statistically reliable alterations in steady-state inactivation curve of calcium channels were not detected in calcium-free external solution. Half-maximal potential of steady-state inactivation had value about -76 mV and slope factor of curve was approximately 5.5 mV in both solutions (n = 15).

In order to investigate sodium permeability of calcium channels of dorsal root ganglion neurons in calcium-free solution it have been used difference method. Nonselective calcium channel blocker cobalt was used in this method to separate sodium current to two components one of which passed through calcium channels and another one passed via sodium channels in calcium-free solution. Peak of current-voltage relation of sodium current through calcium channels was near -22 mV (n = 8). During comparison of current-voltage characteristics of voltage-gated calcium channels of dorsal root ganglion neurons in external solutions with different ion compositions it was determined that calcium channels are less permeable for potassium than for sodium ions. Maximal value of current-voltage relation for calcium current was taken as 100 %. According to such scale maximum of current-voltage characteristic for sodium current was 57 %, and maximal value of current-voltage curve for potassium current was 39 % in calcium-free solution. It was concluded that such distribution of current amplitudes is due to different crystal radii of taken monovalent cations. Crystal radius of potassium ion is bigger than that one of sodium ion, so we could observe smaller potassium current than sodium one. Described shifts in voltage dependent characteristics can be explained by changes in surface potential after calcium ion removal.

Keywords: voltage-gated calcium channel, dorsal root ganglion neuron, hippocampal cell culture, calcium-free external solution, nonspecific potassium current, current-voltage characteristic, steady-state activation curve.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Жива клітина відокремлена від зовнішнього середовища двошаровою ліпідною мембраною, вибірково проникною для різних іонів, необхідних для підтримання життєдіяльності клітини. Іони натрію та калію необхідні клітині для підтримання потенціалу спокою на її мембрані, виникнення та формування потенціалу дії, транспорту цукрів та амінокислот в клітину, підтримання водно-сольового балансу та багатьох інших процесів. У свою чергу, іони кальцію здатні впливати на внутрішньо- та міжклітинні процеси, запускати і модулювати певні сигнальні каскади. Вхід кальцію в клітину може бути хімічним сигналом для активації екзоцитозу (секреції), скорочення м'язів, активації іонних каналів, певних метаболічних шляхів, експресії генів тощо.

Потенціалкеровані кальцієві канали є одним з головних шляхів входу кальцію в збудливих клітинах. Вони представляють собою велику родину білків, які мають різноманітні біофізичні властивості та молекулярну будову. На основі їх фармакологічних та біофізичних властивостей виділяють кальцієві канали N-, L-, P/Q-, R- та Т-типу. Всі вони присутні в мембранах нейронів мозку, деякі з них містяться також у мембранах нейронів периферичної нервової системи, зокрема в нейронах спінальних гангліїв. На сьогоднішній день відомо, що потенціалкеровані кальцієві канали плазматичної мембрани однієї й тієї ж клітини можуть значно відрізнятись порогами активації, потенціалзалежністю кінетичних та стаціонарних характеристик, селективними властивостями, фармакологічною чутливістю, провідністю поодинокого каналу та ін.

Вивчення властивостей потенціалкерованих кальцієвих каналів представляє безсумнівний науковий інтерес, оскільки кальцієві канали відіграють важливу роль у процесах, що протікають у всьому організмі і, зокрема, у нервовій системі. Кальцієві канали в нормальних фізіологічних умовах, коли концентрація позаклітинного кальцію становить приблизно 2 мМ, є високоселективними структурами по відношенню до іонів кальцію. Проте свого часу видатними вітчизняними вченими з Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця Костюком П.Г. та Кришталем О.О. було виявлено, що при зниженні зовнішньоклітинної концентрації двовалентних катіонів до мікромолярних значень або при повному їх усуненні кальцієві канали втрачали селективність і ставали здатними пропускати одновалентні катіони. Також відомі факти про те, що в організмі можливе виникнення патологічних станів, при яких концентрація кальцію в зовнішньоклітинному мікрооточенні кальцієвих каналів може падати нижче фізіологічних значень. Цілком імовірно, що в таких умовах кальцієві канали можуть деякий час проводити одновалентні катіони, серед яких можуть бути іони калію.

Незважаючи на велику кількість робіт, присвячених дослідженням потенціалкерованих кальцієвих каналів, багато питань залишається нез'ясованими. Продовження досліджень фундаментальних властивостей, зокрема проникності кальцієвих каналів для одновалентних катіонів (у тому числі й для калію) у середовищах без кальцію та інших двовалентних катіонів, може пролити світло на питання функціонування даних білкових структур та їх складових компонентів в умовах in vitro та in vivo, а також у нормальному фізіологічному стані та при деяких патологіях, за виникнення та розвиток яких відповідають ті чи інші зміни в роботі потенціалкерованих кальцієвих каналів. Тому, дійсно, вивчення калієвої проникності потенціал-керованих кальцієвих каналів, яка виникає при застосуванні безкальцієвого розчину, є актуальним, оскільки воно може дати більш детальне розуміння молекулярної природи та механізмів функціонування кальцієвих каналів, а також надати можливість екстраполювати отримані результати на функціональний рівень організму при виникненні певних патологій у нервовій системі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тему дисертації було затверджено на спільному засіданні Вченої ради Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця та Вченої ради МЦМФ НАНУ 7 березня 2006 року, протокол № 5. Робота виконувалась у рамках наукової теми „З'ясування можливих засобів корекції змін ефективності синаптичної передачі на різних рівнях нервової системи” (номер державної реєстрації 0106U010931, 2007-2009 р.) Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України, а також наукової теми „Механізми внутрішньоклітинної та міжклітинної сигналізації; вивчення шляхів їх модуляції та пошук нових фармакологічних впливів” (номер державної реєстрації 0107U010843, 2008-2010 р.) Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Мета і завдання дослідження. Мета даної роботи полягала у вивченні змін біофізичних властивостей потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв та культивованих нейронів гіпокампа щурів при відсутності іонів кальцію в зовнішньоклітинному розчині. Для її здійснення були поставлені наступні завдання:

за допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” виявити можливий неспецифічний калієвий та натрієвий струм через потенціалкеровані кальцієві канали нейронів спінальних гангліїв та клітин культури гіпокампа щурів при відсутності іонів кальцію в позаклітинному розчині;

дослідити фармакологічні властивості неспецифічного калієвого та натрієвого струму;

дослідити електрофізіологічні характеристики неспецифічного калієвого струму через потенціалкеровані кальцієві канали;

дослідити потенціалзалежність неспецифічного калієвого та натрієвого струму через потенціалкеровані кальцієві канали у безкальцієвому розчині.

Об'єкт дослідження - нейрони спінальних гангліїв та нейрони культури гіпокампа щурів.

Предмет дослідження - неспецифічна проникність потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв та нейронів культури гіпокампа щурів для одновалентних катіонів, яка виникає при застосуванні безкальцієвого розчину.

Методи дослідження - ферментативна ізоляція нейронів спінальних гангліїв щурів; приготування та культивування нейронів гіпокампа щурів; реєстрація струмів за допомогою методу фіксації мембранного потенціалу в конфігурації “ціла клітина”.

Наукова новизна одержаних результатів. Незважаючи на велику кількість робіт, присвячених вивченню властивостей потенціалзалежних кальцієвих каналів, у тому числі при застосуванні позаклітинного середовища без двовалентних катіонів, деякі проблеми залишаються невирішеними. Біофізичні властивості кальцієвих каналів у таких умовах досліджувались переважно при використанні іонів натрію в якості проникаючих іонів, хоча проникність цих каналів вивчали також для таких одновалентних катіонів, як літій, рубідій, цезій. Однак праць, присвячених вивченню калієвої провідності кальцієвих каналів плазматичної мембрани нейронів, знайти практично неможливо. Таким чином, в даній роботі вперше детально досліджено феномен калієвої провідності потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронних мембран, що виникає при застосуванні безкальцієвого позаклітинного середовища.

При використанні методу „петч-клемп” у конфігурації „ціла клітина” вперше досліджено біофізичні характеристики (вольт-амперна характеристика, криві стаціонарної активації та інактивації) потенціалкерованих кальцієвих каналів гостроізольованих нейронів спінальних гангліїв та культивованих нейронів гіпокампа щура при прикладанні зовнішнього розчину, який не містив іонів кальцію, носіями струму в якому являлись іони калію.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Результати, отримані на нейронах спінальних гангліїв та культивованих нейронах гіпокампа, мають переважно фундаментальне значення. Порівняння характеристик потенціалкерованих кальцієвих каналів, отриманих у контрольних умовах та в умовах дії безкальцієвого середовища, може допомогти в більш глибокому розумінні селективних та воротних механізмів функціонування кальцієвого каналу, а також у відшуканні тіснішого зв'язку між молекулярною будовою та функціональним призначенням каналу. У практичному сенсі отримані в роботі дані деякою мірою можуть бути використані при розробці та дослідженні дії фармакологічних препаратів, призначених для лікування нейропатій (зокрема, епілепсії), при яких можуть спостерігатись локальні зниження міжклітинної концентрації кальцію в нервовій системі.

Особистий внесок здобувача. Підбір, огляд та аналіз літературних даних проведено особисто автором. Усі експерименти з дослідження електрофізіологічних характеристик потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв та нейронів культури гіпокампа щурів у контрольних умовах та при застосуванні безкальцієвого розчину проводились особисто дисертантом. Нейрони спінальних гангліїв щура виділялись також особисто здобувачем. Клітини культури гіпокампа для проведення експериментів вирощувались автором. Обробка та статистичний аналіз отриманих даних проводились автором особисто. Планування напрямків дослідження та узагальнення отриманих результатів проводилось за участю наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на міжнародній об'єднаній конференції для молодих учених Словацького фізіологічного товариства, Фізіологічного товариства та Федерації європейських фізіологічних товариств, Братислава, Словакія, 2007; сумісній українсько-польській конференції для молодих учених Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця та Ненські Інституту експериментальної фізіології “Механізми внутрішньоклітинної сигналізації”, Київ, Україна, 2007; VІІI Національній школі молодих вчених-фармакологів України, "Тисовець", Сколе (Карпати), Україна, 2008, а також на семінарах сектору молекулярної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, Україна, в 2007 та 2008 роках.

Публікації. За результатами роботи опубліковано три статті у наукових журналах, затверджених ВАК України, та тези двох доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, аналізу літературних джерел, опису об'єктів, методів та результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 200 найменувань (з них 14 кирилицею, 186 - латиницею). Робота виконана на 130 сторінках та ілюстрована 37 рисунками.

2. Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність дослідження потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв та нейронів культури гіпокампа щурів при впливі на них зовнішньоклітинного безкальцієвого розчину, сформульовані мета і завдання дослідження, наведено відомості про наукову новизну, теоретичну і практичну цінність та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ 1. “Огляд літератури” присвячений висвітленню відомих аспектів функціонування потенціалкерованих кальцієвих каналів. Розглянуто класифікацію кальцієвих каналів, їх молекулярну структуру, описано фармакологічну чутливість кожного типу каналів. Приділено увагу опису біофізичних характеристик потенціалкерованих кальцієвих каналів, їх іонної селективності, локалізації каналів в організмі. Розглянуто основні характеристики нейронів спінальних гангліїв щурів і структурну організацію гіпокампа. Проведено узагальнення проблеми та окреслено напрямки даного дослідження.

У розділі 2. “Матеріали та методи дослідження” описано використання наступних методів:

ферментативне виділення ізольованих нейронів спінальних гангліїв щурів;

метод приготування первинної дисоційованої культури нейронів гіпокампа;

метод фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина”;

обробка отриманих результатів досліджень, апроксимація даних.

Ферментативне виділення ізольованих нейронів спінальних гангліїв щурів. В експериментах використовували щурів лінії Вістар віком три тижні. Для дослідів виділяли спінальні ганглії поперекового відділу, які розміщували в охолодженому до 4 °С розчині для ізоляції нервових клітин (базовому розчині) на 15-20 хв. Потім ганглії переносили у 2 мл підігрітого до 37 °С базового розчину, який вміщував 0.5 мг/мл протеази (тип ХІV; “Sigma”, США) і 0.5 мг/мл колагенази (тип ІА; “Sigma”, США), і витримували при зазначеній температурі протягом 35 хв, забезпечуючи постійне перемішування за допомогою шейкера-термостата. Після ферментативної обробки ганглії відмивали базовим розчином кімнатної температури без ферментів протягом 5 хв. Для отримання клітинної суспензії тканину гангліїв, яка знаходилась у 1 мл базового розчину, пропускали через скляні оплавлені пастерівські піпетки різних діаметрів протягом 5 хв. Отриману клітинну суспензію розливали в чашки Петрі й витримували при кімнатній температурі протягом 15 хв для прикріплення клітин до дна чашок.

Клітини використовували в експерименті протягом 2-3 год після виділення. Контрольні досліди продемонстрували, що ізольовані таким методом нейрони зберігають свої основні характеристики протягом 6 годин. Для експериментів відбирали фазово-контрастні нейрони, які добре прикріпились до дна чашок Петрі. Не менш важливими критеріями відбору були наявність кальцієвого струму у відповідь на деполяризаційне зміщення мембранного потенціалу і відсутність великого струму витоку.

Метод приготування первинної дисоційованої культури нейронів гіпокампа. Для одержання клітин для культивування, новонароджених щурів лінії Вістар декапітували та виділяли гіпокампи. Гіпокампи розрізали на п'ять частин кожний, після чого переносили в розчин для виділення гіпокампа, який містив 0.5 мг/мл пронази Е (“Serva”, США). Ферментативну обробку проводили протягом 18 хвилин при 32 °С. Після цього шматочки гіпокампа промивали три рази розчином для виділення, що не містив ферменту. Для отримання ізольованих клітин шматочки гіпокампа переносили в розчин, який готували додаванням 1 мл розчину для виділення до 1 мл поживного середовища, та диспергували за допомогою Пастерівських піпеток з діаметром кінчиків, що послідовно зменшувались (остання піпетка мала діаметр кінчика 250 мкм). Для оцінки кількості виділених клітин в 1 мл використовували камеру Горяєва та готували суспензію клітин, що мала густину 310⁵ клітин на 1 мл, шляхом додавання необхідного об'єму поживного середовища.

Потім 200 мкл суспензії клітин, що містила 60 тис. клітин, наносили на покривні скельця розміром 1212 мм, що були попередньо оброблені 0.1%-розчином полі-L-орнітина. Після 2 годин інкубації при 36 °С в атмосфері, збагаченій 5 % СО₂, в кожну чашку Петрі додавали 2 мл поживного середовища, до складу якого входило 90 % мінімального середовища Ігла (МЕМ, “Sigma”, США), бікарбонатний буфер (2.2 г/л NaHCO₃), 10 % кінської сироватки (“Gibko”, США), 10 мкг/мл інсуліну та антибіотики: натрієву сіль бензилпеніциліну - 50 од/мл та стрептоміцину сульфат 50 мкг/мл. Нейрони культивували протягом 2 тижнів в інкубаторі при 36 °С в атмосфері, збагаченій СО₂ (5 %). Після 3 діб in vitro культуру обробляли фторурацилом (1 мкМ) (“Sigma”, США) протягом 24 годин з метою пригнічення проліферації гліальних клітин, після чого проводили повну заміну поживного середовища. Заміну поживного середовища проводили кожні 4 дні шляхом відбирання 400 мкл середовища з чашки Петрі та додавання 400 мкл свіжого середовища.

Метод фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина”. Мембранні іонні струми в нейронах спінальних гангліїв та нейронах культури гіпокампа реєстрували за допомогою методу “петч-клемп” у конфігурації „ціла клітина”. У наших експериментах чашка Петрі з клітинами встановлювалась на предметному столику інвертованого мікроскопа Zeiss (Німеччина). Скляні мікропіпетки витягували на електронній мікрокузні (Sutter, США) з капілярів, виготовлених з боросилікатного скла фірми WPI (США), зовнішній діаметр яких становив 1.5 мм. В експериментах з нейронами спінальних гангліїв використовували скляні мікропіпетки, опір кінчика яких становив 3-5 МОм, а при дослідженні нейронів культури гіпокампа готували мікропіпетки з опором 7-10 МОм при їх заповненні внутрішньоклітинним розчином.

Гігаомні контакти між клітинною мембраною та піпеткою утворювали, притискаючи піпетку з прикладеним до неї невеликим позитивним тиском до поверхні клітини і потім скидаючи цей тиск до атмосферного і прикладаючи інколи невеликий негативний тиск. Утворення гігаомного контакту контролювали в режимі фіксації потенціалу, подаючи на мембрану прямокутні гіперполяризаційні імпульси амплітудою -10 мВ. Після утворення щільного контакту піпетки з поверхнею мембрани здійснювалась компенсація ємності піпетки відносно зовнішнього розчину.

Конфігурацію „ціла клітина” отримували при прориві мембрани під піпеткою імпульсами негативного тиску, після чого записували ємнісний струм у відповідь на гіперполяризаційний імпульс амплітудою - 10 мВ. Вихідний сигнал підсилювача фільтрували за допомогою цифрового фільтра з частотою зрізу 10 кГц і чотириполюсного фільтра Бесселя при частоті зрізу 1 кГц. Генерація командних імпульсів і реєстрація струмів були забезпечені комп'ютерною системою при використанні програмного забезпечення “pClamp 6” (“Axon”, США). Отримані дані обробляли за допомогою програм “Clampfit 9.0” (“Axon Instruments, Inc.”, США), “Microsoft Excel 2002” (“Microsoft”, США), “SigmaStat 3.5” (“Systat Software, Inc.”, США) та “OriginPro 7.0” (“OriginLab Corporation”, США). Склад розчинів. Для ізоляції нервових клітин спінальних гангліїв та перфузії чашки Петрі з клітинами застосовували базовий розчин наступного складу (у мілімолях на 1 л): NaCl - 140, KCl - 2, MgCl₂ - 2, CaCl₂ - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10 (рН 7.35).

З метою ізоляції струмів лише через потенціалкеровані кальцієві канали іони натрію замінили на хлорид холіну, а калієві канали блокували тетраетиламонієм (ТЕА). Проникність кальцієвих каналів для іонів кальцію порівнювалась з такою для іонів калію та натрію. З цією метою зовнішньоклітинний розчин містив іони калію або натрію в залежності від типу експерименту. Таким чином, зовнішньоклітинний розчин мав наступний склад (у мілімолях на 1 л): хлорид холіну - 130, TEA-Cl - 25, CaCl₂ - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10, MgCl₂ - 0.6, KCl або NaCl в залежності від типу експерименту - 10 (рН 7.35).

При дослідженні калієвої та натрієвої проникності потенціалкерованих кальцієвих каналів зовнішньоклітинний розчин замінювали на безкальцієвий такого складу (у мілімолях на 1 л): хлорид холіну - 130, TEA-Cl - 25, HEPES - 10, глюкоза - 10, MgCl₂ - 0.6, KCl - 10 (або NaCl - 10) (рН 7.35). Як можна бачити, безкальцієвий розчин отримували шляхом вилучення іонів кальцію зі складу контрольного розчину без додавання хелаторів двовалентних катіонів. Такий розчин називають номінально безкальцієвим розчином. Розчин, яким заповнювали скляні мікропіпетки, мав такий склад (у мілімолях на 1 л): CsCl - 105, HEPES - 10, EGTA - 10, MgATP - 2, CaCl₂ - 1, MgCl₂ - 2 (рН 7.3).

Розчин для виділення гіпокампа мав наступний склад (у мілімолях на 1 л): NaCl - 140, KCl - 5, CaCl₂ - 0.2, HEPES - 10, глюкоза - 10 (рН 7.35), а також містив антибіотики: натрієву сіль бензилпеніциліну - 50 од/мл та стрептоміцину сульфат - 50 мкг/мл. Поживне середовище для культивування нейронів гіпокампа містило наступні компоненти: 90% мінімального середовища Ігла (МЕМ, “Sigma”, США), бікарбонатний буфер (2.2 г/л NaHCO₃), 10 % кінської сироватки (“Gibco”, США), 10 мкг/мл інсуліну та антибіотики: натрієву сіль бензилпеніциліну - 50 од/мл та стрептоміцину сульфат - 50 мкг/мл. Обробка отриманих результатів досліджень та апроксимація даних. У наших дослідженнях ми розглядали такі потенціалзалежні характеристики кальцієвих каналів, як вольт-амперна характеристика (ВАХ) і криві стаціонарної активації та інактивації. Для отримання ВАХ потенціалкерованих кальцієвих каналів використовували наступний протокол. Спочатку від підтримуваного потенціалу - 90 мВ подавали прямокутний імпульс потенціалу амплітудою 10 мВ для визначення пасивних характеристик мембрани. Потім подавали тестові прямокутні імпульси потенціалу (V_test) в діапазоні від 90 до 40 мВ та від -10 до +30 мВ з інкрементом 10 мВ, а в діапазоні від 40 до 10 мВ - з інкрементом 5 мВ. Тривалість V_test була 100 мс. Інтервал між сусідніми імпульсами становив 5 с. Графік ВАХ потенціалкерованих кальцієвих каналів будували як залежність значення амплітуди струму від амплітуди V_test.

Криву стаціонарної активації потенціалкерованих кальцієвих каналів будували за допомогою наступного протоколу. Підтримуваний потенціал становив V_hold = -80 мВ. Потім його змінювали до значень потенціалу кондиціонуючих преімпульсів у діапазоні від -80 до -30 мВ та від +20 до +100 мВ з інкрементом 10 мВ, а в діапазоні від -30 до +20 мВ - з інкрементом 5 мВ. Тривалість преімпульсів складала 40 мс. Після кожного преімпульсу потенціал зміщували до значення тестового потенціалу, який дорівнював -60 мВ і мав тривалість 150 мс. При таких зміщеннях виникали деактиваційні струми, амплітуди яких використовували для побудови кривої стаціонарної активації кальцієвих каналів. Після цього рівень потенціалу знову повертали до значення V_hold. Інтервал між імпульсами становив 5 с. Криву стаціонарної активації будували як залежність амплітуд деактиваційних струмів від амплітуд кондиціонуючих преімпульсів.

При реєстрації кривої стаціонарної інактивації підтримуваний потенціал V_hold складав -100 мВ. Перед тестовим потенціалом тривалістю 100 мс, який складав 0 мВ, подавали кондиціонуючі преімпульси від -100 до 0 мВ з інкрементом 5 мВ тривалістю 2.5 с та інтервалом між сусідніми імпульсами 5 с. Графік залежності амплітуд струму під час тестового потенціалу від амплітуд кондиціонуючих преімпульсів являє собою криву стаціонарної інактивації потенціалкерованих кальцієвих каналів. Криві стаціонарної активації та інактивації каналів апроксимували рівнянням Больцмана вигляду:

, [1]

де І/I_max - нормований до максимального значення струм, V_1/2 - потенціал половинної активації/інактивації каналів, V_pre - значення кондиціонуючого преімпульсу, k - фактор нахилу потенціалзалежної характеристики. Параметр R² точності апроксимації кривих становив 0.98. Числові дані представлені як середні арифметичні середньоквадратична похибка (SEM) (). Після кожного результату приводиться значення n, яке дорівнює кількості досліджених клітин. Для оцінки достовірності відмінностей використовувалась величина р, розрахована з використанням t-тесту Ст'юдента. Критерієм достовірності відмінностей було обрано значення p < 0.05.

У третьому розділі “Результати досліджень” експериментально визначено характеристики потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв та нейронів культури гіпокампа при застосуванні безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину. Оскільки за ознакою активуючого потенціалу потенціалкеровані кальцієві канали поділяють на дві групи, низько- та високопорогові, то дослідження калієвої проникності кальцієвих каналів проводили поетапно: спочатку вивчали властивості низькопорогових кальцієвих каналів у безкальцієвому розчині, а потім - викокопорогових.

Калієва проникність низькопорогових кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв щура. Вхідні струми були виявлені після заміни контрольного розчину (який вміщував 2 мМ кальцію) на тестовий (безкальцієве середовище з 10 мМ калію), безпосередньо після закінчення преімпульсу амплітудою -100 мВ тривалістю 100 мс. Підтримуваний потенціал становив -60 мВ. При поверненні до контрольного розчину амплітуда струму набувала початкової величини. Тут зображено вольт-амперні характеристики, отримані в контрольному розчині, який вміщував 2 мМ кальцію та 10 мМ калію, та в безкальцієвому розчині з 10 мМ калію для того ж нейрона спінального ганглія. Якщо замість калію безкальцієвий розчин містив іони цезію, то помітного струму не спостерігали. Після ж прикладання безкальцієвого калійвмісного розчину з'являвся вхідний струм, який швидко інактивувався протягом деполяризуючого імпульсу. Тут наведено вольт-амперні характеристики, отримані на нейроні спінального ганглія, який перебував у трьох різних розчинах: у контрольному (?), в безкальцієвому безкалієвому розчині, який містив 4 мМ цезію (?), та в безкальцієвому розчині з калієм у концентрації 4 мМ (?). Як можна бачити з рисунка, на всьому дослідженому діапазоні потенціалів помітний цезієвий струм був відсутнім.

При використанні безкальцієвого розчину амплітуда струмів зростала при збільшенні концентрації іонів калію. При відмиванні контрольним розчином відбувалось відновлення амплітуди струму до початкового значення. При цьому вольт-амперні криві при заміні розчинів змінювались відповідним чином. Представлено вольт-амперні характеристики, отримані на одному й тому ж нейроні в контрольному (?), безкальцієвому безкалієвому розчині (?) та безкальцієвих розчинах, які містили 5 (?) і 10 мМ (_) калію.

Результати описаної серії експериментів дають нам змогу припустити, що вхідний струм у безкальцієвому розчині переноситься іонами калію. На основі даних про те, що потенціалкеровані кальцієві канали втрачають селективність у розчині без двовалентних катіонів, ми висунули припущення, що в наших експериментальних умовах при застосуванні безкальцієвого розчину вхідний калієвий струм проходить саме через кальцієві канали. Фармакологічні властивості вхідних калієвих струмів у безкальцієвому розчині в нейронах спінальних гангліїв щура. Для того, щоб переконатися у тому, що калієвий струм в безкальцієвому розчині проходить через потенціалкеровані кальцієві канали, було досліджено дію декількох речовин. Зокрема, було випробувано ефект блокаторів потенціалзалежних кальцієвих каналів, таких як кобальт (неселективний блокатор), нікель (блокатор низькопорогових кальцієвих каналів або кальцієвих каналів Т-типу) та ніфедипін - антагоніст високопо-рогових кальцієвих каналів L-типу, на калієвий струм. Нами було встановлено, що антагоніст потенціалкерованих кальцієвих каналів Т-типу нікель у концентрації 300 мкМ пригнічує калієвий струм у безкальцієвому розчині на 69 ± 4 % (p < 0.001, n = 5) порівняно зі струмом в контрольних умовах при деполяризації мембрани від -100 до -60 мВ. Характерним проявом дії нікелю на досліджувані струми було “просідання” ділянки вольт-амперної залежності в області більш негативних її потенціалів. У високопороговій ділянці даної залежності достовірних відмінностей виявлено не було.

У результаті описаних експериментів ми встановили, що калієвий струм у безкальцієвому розчині проходить принаймні через низькопорогові кальцієві канали. З літературних джерел відомо, що мембрана соми нейронів спінальних гангліїв містить у великій кількості кальцієві канали L-типу, які відносяться до високопорогових кальцієвих каналів. Кальцієві канали L-типу є дигідропирідинчутливими, а ніфедипін, який відноситься до класу дигідропирідинів, є селективним блокатором каналів L-типу. Тому для того, щоб перевірити можливість протікання калієвого струму через високопорогові кальцієві канали, ми використали ніфедипін.

У результаті проведення експериментів було з'ясовано, що при застосуванні ніфедипіна в концентрації 50 мкМ відбувається пригнічення вхідного калієвого струму в безкальцієвому середовищі на 94 ± 2 % (p < 0.001, n = 6) порівняно зі струмом у безкальцієвому розчині без ніфедипіна при деполяризаційному переході від підтримуваного потенціалу -100 мВ до значення -20 мВ. Після побудови вольт-амперної характеристики можна спостерігати чіткі зміни у її вигляді при застосуванні ніфедипіна: видно значне пригнічення кривої на ділянці, яка відповідає максимуму струму через високопорогові кальцієві канали. Таким чином, експериментальні дані дозволяють нам зробити висновок, що 1) отриманий вхідний струм в безкальцієвому розчині є калієвим, і 2) даний струм входить в клітину через потенціалкеровані кальцієві канали принаймні Т- та L-типу.

Потенціалзалежні характеристики кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв щурів у безкальцієвому розчині при використанні іонів калію в якості переносників заряду. Інформативними характеристиками каналів є їх вольт-амперні залежності. Для порівняння якісних змін вольт-амперної залежності, до яких призводить прикладання безкальцієвого розчину з іонами калію, ми пронормували та усереднили вольт-амперні характеристики потенціалкерованих кальцієвих каналів дев'яти нейронів, які перебували в контрольному розчині з 2 мМ кальцію та 10 мМ калію і в безкальцієвому середовищі з 10 мМ калію. Видно, що усунення іонів кальцію із зовнішнього середовища призводить до зміщення піку ВАХ у напрямку гіперполяризації приблизно на 10 мВ: якщо в контрольному розчині пік ВАХ кальцієвих каналів знаходився при потенціалі -10.1 ± 2.3 мВ, то в безкальцієвому середовищі максимум струму спостерігали при мембранному потенціалі -19.9 ± 2 мВ (p < 0.05, n = 9).

Разом з дослідженням ВАХ кальцієвих каналів ми вивчали можливі зміни кривих стаціонарної активації та інактивації цих каналів при застосуванні безкальцієвого розчину. Для побудови кривої стаціонарної активації потенціалкерованих кальцієвих каналів реєстрували деактиваційні струми, використовуючи стандартний протокол електричної стимуляції мембран клітин. При застосуванні безкальцієвого розчину крива стаціонарної активації потенціалкерованих кальцієвих каналів змінилась наступним чином. Було виявлено, що дана характеристика змістилась ліворуч вздовж осі потенціалів приблизно на 10 мВ після застосування безкальцієвого розчину: потенціал половинної активації в контрольних умовах становив |_контр = -34.3 ± 2.2 мВ, а при використанні без-кальцієвого розчину |_Са0 = -44.3 ± 3.1 мВ (р < 0.02, n = 15) (рис. 12). Коефіцієнт нахилу кривої при цьому суттєво не змінився: у контрольних умовах = 4.5 ± 0.6 мВ, після застосування безкальцієвого розчину - = 4.6 ± 0.5 мВ (n = 15).

Крива стаціонарної інактивації кальцієвих каналів при застосуванні безкальцієвого розчину не відрізнялась від кривої, отриманої в контрольних умовах. Якщо при застосуванні контрольного розчину потенціал половинної інактивації становив |_контр = -75.4 ± 3.1 мВ, а коефіцієнт нахилу = 5.8 ± 0.5 мВ, то при використанні безкальцієвого розчину |_Са0 = -76.6 ± 2.8 мВ, а = 5.1 ± 0.5 мВ (n = 15). Дослідження натрієвої проникності потенціалзалежних кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв щурів. Одним із завдань нашого дослідження було порівняти характеристики струмів через кальцієві канали для різних типів одновалентних катіонів. Зокрема, було порівняно параметри, отримані при використанні іонів калію та натрію у якості основних катіонів, що проникають через кальцієві канали у безкальцієвому середовищі в наших експериментальних умовах. Для реалізації поставленої задачі було застосовано різницевий метод. Спочатку реєстрації проводили в безкальцієвому розчині з 10 мМ натрію при застосуванні протоколу для побудови ВАХ каналів.

При цьому іони натрію мали змогу проникати через натрієві та кальцієві канали. Потім у розчин додавали неселективний блокатор кальцієвих каналів кобальт у концентрації 4 мМ для відокремлення компонента струму через потенціалкеровані натрієві канали. В результаті отримували натрієві струми, що проходять лише через потенціалзалежні натрієві канали. В такому випадку ми мали змогу побудувати вольт-амперну залежність натрієвих каналів. Після цього брали різницю відповідних пар реєстрацій струмів (що відповідали одному й тому ж зміщенню мембранного потенціалу), отримуючи таким чином натрієвий струм у безкальцієвому середовищі лише через кальцієві канали. Вольт-амперну характеристику кальцієвих каналів будували як залежність амплітуди різницевого натрієвого струму від амплітуди відповідного мембранного потенціалу. Як і при застосуванні іонів калію в якості основних переносників заряду через потенціалкеровані кальцієві канали в безкальцієвому розчині, вольт-амперна характеристика кальцієвих каналів, отримана при використанні іонів натрію, зазнавала зміщення в бік гіперполяризації. При цьому максимум вольт-амперної кривої кальцієвих каналів відповідав мембранному потенціалу -22 ± 3 мВ (n = 8).

ВАХ потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв при застосуванні позаклітинних розчинів різного іонного складу. Порівнюючи результати досліджень при застосуванні розчинів з трьома типами проникаючих катіонів, ми виявили, що провідність потенціалкерованих кальцієвих каналів для іонів кальцію є найбільшою серед провідностей цих каналів для інших типів катіонів, незва-жаючи на меншу концентрацію іонів кальцію. В той же час, проникність кальцієвих каналів для іонів калію є найменшою серед проникностей для усіх інших типів проникаючих катіонів, що використовувались у даній роботі. Імовірно, такі результати пов'язані зі специфікою самого кальцієвого каналу і з розподілом кристалічних радіусів катіонів.

Разом з тим, спостерігалось характерне зміщення вольт-амперних характеристик, отриманих у безкальцієвому розчині, в бік гіперполяризації на 14 ± 3 мВ (n = 8) порівняно з ВАХ у контрольному розчині. Тут зображено відсотковий розподіл максимальних значень ВАХ, зареєстрованих у кожному з розчинів. Максимальну амплітуду кальцієвого струму, зареєстрованого в контрольному розчині, було прийнято за 100 %. Відповідно до цього максимум ВАХ кальцієвих каналів при застосуванні іонів калію в якості основних переносників заряду через кальцієві канали в безкальцієвому розчині складає 39 ± 4 % (n = 8), а при використанні іонів натрію, які проходили через кальцієві канали в середовищі без іонів кальцію, максимальне значення ВАХ кальцієвих каналів становило 57 ± 5 % (n = 8). Отже, кальцієві канали є найменш проникними для іонів калію, імовірно, через найбільший кристалічний радіус іонів калію серед використаних типів проникаючих іонів. Калієва проникність потенціалкерованих кальцієвих каналів культивованих нейронів гіпокампа щурів. Для подальшого дослідження калієвої проникності потенціалкерованих кальцієвих каналів було взято клітини культури гіпокампа щурів з метою визначення можливої специфіки даного феномену, пов'язаної з різницею між типами клітин.

Для реєстрації вольт-амперної залежності кальцієвих каналів нейронів гіпокампа було використано відповідний протокол. Наведено приклади реєстрацій струмів, відповідних вказаним зміщенням мембранного потенціалу, при яких спостерігали максимальні струми, у розчинах різного іонного складу. Вольт-амперні характеристики кальцієвих каналів культивованих клітин гіпокампа, отримані при використанні позаклітинних розчинів різного іонного складу.

Як і у випадку нейронів спінальних гангліїв, в даних експериментальних умовах амплітуда струму збільшується при підвищенні концентрації іонів калію в безкальцієвому розчині. Струм пригнічується під дією кобальту, а амплітуда кальцієвого струму більша за амплітуди струмів у безкальцієвому розчині, незважаючи на багатократне перевищення концентрацій калію порівняно з концентрацією кальцію. Разом з тим, максимуми ВАХ, отриманих у безкальцієвому розчині, зміщуються вздовж осі потенціалів у напрямку гіперполяризації порівняно з ВАХ у контрольних умовах. Таким чином, з якісної точки зору кальцієві канали нейронів культури гіпокампа у безкальцієвому середовищі функціонують цілком подібно до кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв. Різниця виявлена лише в амплітуді струмів. Амплітуди кальцієвих і калієвих струмів у нейронах гіпокампа менші за амплітуди струмів у нейронах спінальних гангліїв.

Обговорення результатів. Дана робота присвячена дослідженню біофізичних властивостей потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв та нейронів культури гіпокампа, яких набувають канали при застосуванні безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину. Зокрема, в даній роботі вивчали калієву та натрієву проникність кальцієвих каналів, яка проявлялась у них при прикладанні безкальцієвого розчину. Незважаючи на наявні знання про структуру та функції потенціалкерованих кальцієвих каналів, деякі питання, одним з яких є проблема селективності, залишаються нез'ясованими. Зокрема, в наш час залишається актуальною проблема зміни властивостей кальцієвих каналів у зовнішньоклітинних розчинах різного іонного складу.

Співставлення експериментальних результатів нашої роботи та деяких літературних даних дозволяє зробити висновок, що в безкальцієвому розчині селективний фільтр потенціалкерованих кальцієвих каналів досліджених нейронів у значній мірі якісно змінює свої властивості. У той же час, незважаючи на трансформацію властивостей цього фільтра, специфічні інгібітори потенціалкерованих кальцієвих каналів зберігають свою блокуючу дію на вхідні струми. Зазначений факт свідчить про те, що, на відміну від пори каналу, мішені блокаторів кальцієвих каналів не зазнають кардинальних змін у безкальцієвому розчині.

У даній роботі ми досліджували зміни біофізичних властивостей потенціалкерованих кальцієвих каналів плазматичної мембрани нейронів спінальних гангліїв та нейронів культури гіпокампа при застосуванні безкальцієвого розчину, в якому переносниками заряду через кальцієві канали були іони калію. У фізіологічних умовах кальцієві канали транспортують виключно двовалентні катіони. Однак у даному дослідженні продемонстровано, що ці канали при певних умовах можуть переходити в такий стан, в якому вони стають здатними працювати у якості калійтранспортуючої системи. Цей ефект досягався при застосуванні безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину, який містив іони калію, та кальцієвого хелатора EGTA, прикладеного з внутрішнього боку мембрани клітини. У той же час внутрішньоклітинний розчин був позбавлений іонів калію з метою створення електрохімічного градієнту для зовнішньоклітинних іонів калію, спрямованого всередину клітини. В якості основного катіону внутрішньоклітинний розчин містив іони цезію з метою блокування калієвих каналів.

Трансформація властивостей селективного фільтра, імовірно, тісно пов'язана з усуненням поодинокого іона кальцію з деякого високо специфічного кальційзв'язуючого сайту кальцієвого каналу. Вилучення іонів кальцію з зовнішньоклітинного розчину призводить до звільнення цього сайту, і канал набуває здатності пропускати одновалентні катіони. Щодо конкретної дії кожного агента, вплив якого було досліджено в даній роботі, то доволі значне пригнічення вхідних калієвих струмів ніфедипіном узгоджується з тим фактом, що мембрана соми нейронів спінальних гангліїв у великій кількості містить потенціалкеровані кальцієві канали L-типу. У той же час, в умовах, коли цей блокатор пригнічував значну частину струмів, деяка частка кальцієвих каналів залишається активною. Іони нікелю, які вважаються ефективними блокаторами низькопорогових кальцієвих каналів, навіть у концентрації 300 мкМ також не здатні повністю блокувати інтегральний калієвий струм, наявний в умовах наших дослідів. З урахуванням наведених даних стає очевидним, що калієві струми проходять через модифіковані потенціалкеровані кальцієві канали принаймні L- та T-типу.

Зсуви вздовж осі потенціалів, яких зазнають потенціалзалежні характеристики кальцієвих каналів (ВАХ і крива стаціонарної активації) внаслідок застосування безкальцієвого розчину, можуть вказувати на те, що розподіл поверхневих зарядів мембрани в таких умовах змінюється. Найбільш імовірним є те, що в безкальцієвому середовищі іони кальцію, присутні до того в порах каналів, витісняються катіонами калію. Разом з тим знімається екранування поверхневих негативних зарядів, розташованих на поверхні мембрани, яке створювалось іонами кальцію. Це призводить до зміни в керуванні воротними механізмами кальцієвих каналів і, як наслідок, до зміщень потенціалзалежностей згаданих вище характеристик вздовж осі абсцис у бік гіперполяризації.

Таким чином, результати наших експериментів свідчать про здатність потенціалкерованих кальцієвих каналів у безкальцієвому розчині пропускати всередину клітини не тільки одновалентні катіони натрію або літію, а й іони калію. При цьому слід зазначити, що дослідження проникності модифікованих кальцієвих каналів для одновалентних катіонів в основному проводилися в умовах відсутності в зовнішньому розчині будь-яких двовалентних катіонів. У наших же дослідженнях ми усували із зовнішньоклітинного розчину виключно іони кальцію, але залишали магній, хоча його концентрація була незначною (600 мкМ).