Модифікація функціональної активності потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронної плазматичної мембрани зовнішньоклітинним безкальцієвим розчином

Останнім часом субодиничну структуру натрієвого і кальцієвого потенціалкерованого каналу розглядають у вигляді комплексу, який складається з двох основних доменів: домену воротного механізму та домену іонної пори. Домен воротного механізму є функціональною одиницею. Він реагує на зміни потенціалу переміщенням зарядів, що входять до його складу. На відміну від нього, чотири домени іонної пори формують центральну пору, проникну для іонів. Тобто, функціональні потенціалкеровані іонні канали складаються з чотирьох воротних механізмів на периферії та центральної іонпроникної пори. Потенціалчутливий домен також знайдено у складі інших мембранних білків, які, однак, не мають домену пори (протоновий канал, потенціалзалежна фосфатаза). Це означає, що потенціалчутливий домен є надзвичайно розповсюдженим і може розглядатись як потенціалчутливий модуль, що вбудовується у різноманітні білки. Таким чином можуть утворюватись і потенціалкеровані іонні канали. Без сумніву, іонний склад зовнішнього середовища може впливати не тільки на селективність каналу, але й на його воротні функції, втручаючись у зв'язки потенціалчутливого домену з доменом іонної пори каналу, що може призводити до зсувів потенціалзалежних характеристик.

Існує ряд захворювань, причиною виникнення яких є порушення функціонування кальцієвих каналів. Одним з таких захворювань є епілепсія. При дослідженні даної хвороби було виявлено, що в певних структурах кори головного мозку перед епілептичним нападом відбувається різке падіння зовнішньоклітинної концентрації кальцію ([Ca²⁺]_о) до значень порядку 0.45 - 0.55 мМ, а під час самих нападів концентрація кальцію становить 1.2 мМ. При іншому нервовому розладі, депресії, що поширюється, концентрація зовнішньоклітинного кальцію знижується навіть до 0.08 мМ. Очевидно, струми через кальцієві канали повинні змінюватись при зниженні позаклітинної концентрації кальцію. Оскільки амплітуда кальцієвих струмів залежить від концентрації кальцію в зовнішньому середовищі, при зниженні [Ca²⁺]_о, що спостерігається при епілептичних нападах, кальцієвий струм повинен був би зменшитись. Проте, виявилось, що зменшення [Ca²⁺]_о може здійснювати збуджуючий ефект, імовірно, внаслідок зміни селективності кальцієвих каналів. Остання обставина може призводити до деполяризації мембрани і, як наслідок, опосередковувати збудження нейронів, що до цього знаходились у спокою. Зважаючи на сказане, слід взяти до уваги, що ситуації, в яких концентрація двовалентних катіонів у зовнішньоклітинному середовищі ставала б нижче нормального значення, можуть бути цілком реальними. Такі зміни носять патологічний характер.

Отже, можливість проникності кальцієвих каналів для одновалентних катіонів in vivo цілком реальна. Експериментальне моделювання такої ситуації дає змогу більш детально охарактеризувати структурні особливості пороформуючих частин кальцієвих каналів, що лежать в основі їх фундаментальних властивостей генерувати внутрішньоклітинні кальцієві сигнали, які призводять до запуску низки регулюючих механізмів. Останніми десятиліттями все частіше з'являються роботи, присвячені дослідженню структурних та функціональних особливостей селективного фільтра, воротного механізму та сенсору напруги потенціалзалежних кальцієвих каналів. Так, при використанні методу заміщень амінокислот, що звернені всередину пори каналу, виявляється, що в деяких випадках кальцієві канали перестають пропускати двовалентні катіони, проте одновалентні катіони легко проникають через них. Можливо, маніпуляції з молекулярною структурою певних компонентів каналу в кінцевому результаті можуть привести до наслідків, подібних до тих, які ми мали змогу спостерігати у наших експериментах з використанням безкальцієвого розчину.

Такі методи із застосуванням мутацій конкретних частин каналу (зокрема, елементів селективного фільтра) дозволяють більш точно відтворити їх структуру і робити більш обґрунтовані припущення щодо процесів, що відбуваються в каналі при його проходженні іоном того чи іншого типу, будь то дво- або одновалентний катіон. Проте, такий метод потребує ще принаймні й біофізичних досліджень, які доповнюють експерименти з використанням заміщень амінокислот. Адже саме електрофізіологічні вимірювання здатні дати відповіді на питання, що відбувається з каналами при певних маніпуляціях над ними, оскільки в таких дослідженнях швидко виявляються реакції каналів на зовнішні стимули, задані в експериментальних умовах.

Висновки

У дисертаційній роботі, відповідно до поставлених мети та завдань, за допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” проведено дослідження функціонування потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів спінальних гангліїв і нейронів культури гіпокампа щурів у зовнішньоклітинному безкальцієвому розчині.

1. Виявлено неспецифічний калієвий та натрієвий струм через потенціалке-ровані кальцієві канали нейронів спінальних гангліїв та нейронів культури гіпокампа щурів.

2. Показано статистично достовірне пригнічення неспецифічного калієвого струму при застосуванні блокаторів кальцієвих каналів ніфедипіна та нікелю, яке складало 94 та 69 % відповідно. Виявлено, що дія неселективного блокатора потенціалкерованих кальцієвих каналів кобальту призводила до майже повного зникнення натрієвого струму через кальцієві канали. У цьому випадку пригнічення складало 98 %.

3. Встановлено статистично достовірне зміщення кривої стаціонарної активації кальцієвих каналів: в контрольних умовах потенціал половинної активації становив - 34 мВ, а при застосуванні безкальцієвого розчину - 44 мВ. Коефіцієнт нахилу не змінився і складав 4.5 мВ. При дослідженні кривої стаціонарної інактивації кальцієвих каналів статистично достовірної різниці не виявлено.

4. При порівнянні вольт-амперних характеристик кальцієвих каналів при застосуванні позаклітинних безкальцієвих розчинів різного іонного складу встановлено, що кальцієві канали є менш проникними для іонів калію, ніж для натрію. ВАХ кальцієвих каналів при застосуванні безкальцієвого розчину як з іонами калію, так й іонами натрію були зміщені в напрямку гіперполяризації на 13 мВ по відношенню до ВАХ, отриманої в контрольних умовах.

5. Таким чином, іони кальцію, окрім ключової ролі у внутрішньоклітинній передачі сигналу при збудженні та багатьох інших процесах життєдіяльності клітини, також є важливим фактором, який визначає селективність і воротні механізми потенціалкерованих кальцієвих каналів.

Список робіт за темою дисертації

1. Характеристики депокерованих кальцієвих каналів, активованих спустошенням ріанодинчутливих кальцієвих депо ендоплазматичного ретиклулуму, у нейронах спінальних гангліїв щура / С.В. Король, Т.Ю. Король, О.П. Костюк, П.Г. Костюк // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2007. - Т. 39, № 3. - С. 195-200.

2. Калієва проникність потенціалкерованих кальцієвих каналів нейронів дорсальних гангліїв у безкальцієвому середовищі / С.В. Король, Т.Ю. Король, О.П. Костюк, П.Г. Костюк // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2008. - Т. 40, № 2. - С. 93-99.

3. Король С.В. Неспецифічні струми через потенціалкеровані кальцієві канали нейронів спінальних гангліїв щурів у безкальцієвому розчині / Сергій Король, Олена Костюк // Доповіді Національної академії наук України. - 2009. - № 5. - С. 195-199.

Размещено на Allbest.ru