Молекулярні маркери в дослідженні геному кукурудзи (Zea mays L.)

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

03.00.22 - Молекулярна генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Молекулярні маркери в дослідженні геному кукурудзи (Zea mays L.)

Кожухова Наталія Едуардівна

КИЇВ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру в рослинництві УААН (м. Одеса).

Науковий консультант

доктор біологічних наук, професор,

академік УААН

Сиволап Юрій Михайлович,

Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН, директор.

Офіційні опоненти

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Малюта Станіслав Станіславович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН

України, головний науковий співробітник відділу

молекулярної генетики;

доктор біологічних наук, професор

Кучук Микола Вікторович,

Iнститут клiтинної бiологiї та генетичної iнженерiї НАН України,

заступник завідувача відділу генетичної інженерії;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Ларченко Катерина Андріївна,

Інститут фізіології рослин та генетики НАН України,

провідний науковий співробітник відділу експериментального мутагенезу

Захист дисертації відбудеться 25 листопада 2008 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 24.10.2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження організації і мінливості геномів є одним із найважливіших завдань молекулярної генетики. В останні півстоліття уявлення про геном залежали від розвитку методології визначення специфічності структури ДНК. Починаючи з відкриття Е. Чаргафа видоспецифічності відношення пуринових і піримідинових азотистих основ, кожний наступний новий підхід до аналізу мінливості ДНК поповнював знання про геном. Так, аналіз кінетики реасоціації ДНК виявив різницю між геномами про- і еукаріотів, аналіз поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів ДНК дозволив оцінити організацію і мінливість окремих генів, і, нарешті, впровадження ДНК-технологій на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) надало найбільш широкі можливості аналізу мінливості ДНК.

Досягнення молекулярної генетики внесли величезний внесок в загальну біологію, зокрема, в рослинництво. Вирішення теоретичних і практичних проблем поліпшення рослин в останні 15 років багато в чому залежить від розвитку і впровадження молекулярних маркерів. В практику рослинництва введено відбір за допомогою маркерів (Marker Assisted Selection, MAS), що свідчить про прямий вплив досягнень молекулярної генетики на підвищення ефективності вирішення економічно важливих проблем народного господарства.

Останнім часом об'єктами молекулярно-генетичного дослідження стали геноми важливіших сільськогосподарських культур, серед яких особливе місце посідає кукурудза.

Кукурудза (Zea mays L.) є однією з найбільш поширених і продуктивних злакових культур у світовому землеробстві, у тому числі і в Україні. Це модельний класичний генетичний об'єкт. Генетичні дослідження кукурудзи, розпочаті на рубежі 19 і 20 століть, сприяли корінному поліпшенню даної культури і послужили основою для розвитку теоретичної і прикладної генетики рослин. Розробки, здійснені вперше на кукурудзі, перенесені на інші культури, що сприяло підвищенню загального рівня генетичних досліджень і селекційних технологій.

У зв'язку з прогресуючим збідненням генофонду культурних рослин збереження і збагачення генного пулу рослин, зокрема кукурудзи, є актуальною проблемою. Оцінка генетичної різноманітності вихідного селекційного матеріалу, характеристика існуючого генофонду, визначення ступеня спорідненості сортів вимагає розробки надійних і ефективних методів їх диференціації та ідентифікації. У свою чергу, оцінка генетичної різноманітності разом із інформацією про родовід і основні агрономічно важливі ознаки забезпечить об'єктивну основу для опису генотипів та їх реєстрації. Ліберізация ринку насіння, створення в країнах СНД приватних селекційно-насінневих підприємств підсилює необхідність контролю і охорони прав авторів комерційно використовуваних сортів, ліній, гібридів. Молекулярно-генетична ідентифікація ліній (точна, об'єктивна, достатньо швидка) необхідна для здійснення контролю генетичної однорідності генотипів, встановлення їх оригінальності і відповідності стандарту при обміні лініями між селекційними установами.

Успіхи гетерозисної селекції кукурудзи значною мірою залежать від генетичної різноманітності вихідного матеріалу. Добір ліній для гібридних комбінацій традиційно здійснюють на основі оцінки морфологічних (фенотипових) ознак, що має ряд серйозних обмежень. Ці обмеження, а також зростаючі масштаби селекції кукурудзи, ініціюють розробку нових, ефективніших методів добору вихідних форм.

Впровадження молекулярних маркерів дозволило розвинути методологію локалізації і контролю генів, що визначають кількісні та якісні ознаки, зокрема, генів стійкості до несприятливих біотичних і абіотичних факторів. Кукурудза уражається понад 100 видами патогенів, з яких одними з найбільш шкідливих є гриби роду Fusarium. Молекулярно-генетичне дослідження видового і штамового складу фітопатогенних грибів, їх ідентифікація та аналіз мінливості є важливим попереднім етапом роботи, спрямованої на маркування генів стійкості до даних фітопатогенів. Необхідним є знання загального потенціалу патогенності, який закладений в генетичному матеріалі фітопатогенів, що дозволить прогнозувати можливу шкоду і розробити надійні заходи боротьби.

Більшість генотипів кукурудзи вітчизняної і зарубіжної селекції, які культивуються в Україні, відносно їх стійкості до ураження грибами роду Fusarium вивчено недостатньо. Ідентифікація генів стійкості значно підвищить ефективність селекційних робіт із створення ліній і гібридів кукурудзи, стійких до збудників фузаріозних гнилей, найбільш поширених патогенів кукурудзи в умовах півдня України, а також продемонструє можливість використання молекулярних маркерів цих генів у селекційних програмах з добором за маркерами.

У зв'язку з вищезазначеним, теоретичний і практичний інтерес має молекулярно-генетичний аналіз геному кукурудзи і розробка тест-системи молекулярних маркерів для визначення генетичної чистоти та унікальності генотипів (їх реєстрація), гетерозисного потенціалу інбредних ліній, ступеня стійкості до фузаріозної гнилі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру в рослинництві УААН (ПБЦ) в рамках науково-технічної програми (НТП) УААН «Сільськогосподарська біотехнологія 2001-2005 рр.» (№ 318/92 від

24.10.2001 р.), підпрограми I „Новітні біотехнології в рослинництві”, напряму 3 «Використання молекулярно-біологічних методів в генетико-селекційній роботі», проблеми 3.1 «Створення вихідного селекційного матеріалу основних сільськогосподарських культур з використанням молекулярних маркерів» за завданнями 3.1.2.2. «Створення ефективної системи прогнозування гетерозису на основі дослідження характеру зв'язку молекулярних маркерів з ознаками продуктивності кукурудзи», 3.1.2.4. «Створення бази даних ДНК-типування ліній та гібридів кукурудзи Держреєстру», 3.2.2.1. «Маркування генів стійкості кукурудзи до видів роду Fusarium», а також в рамках НТП Міністерства науки і освіти України «Біотехнологія рослин і біобезпека» (№ ДП/145-2003 від 26.06.2003 р.) за завданням «Розробка і впровадження ДНК-технології ідентифікації і каталогізації зареєстрованих в Україні сортів, ліній, гібридів пшениці, ячменю, кукурудзи».

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала в аналізі молекулярно-генетичного поліморфізму геному кукурудзи і розробці на основі одержаних даних маркерних систем для використання в селекційному процесі.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

- добір маркерних систем на основі ПЛР-аналізу ДНК;

- оцінка дискримінаційного потенціалу маркерних систем;

- оцінка генетичної чистоти ліній і гібридів кукурудзи;

- диференціація та ідентифікація генотипів кукурудзи;

- аналіз алельного складу добраних мікросателітних локусів генотипів кукурудзи; маркер геном кукурудза

- розробка принципової схеми реєстрації генотипів та фіксування ліній і гібридів у вигляді генетичних формул;

- створення бази даних ДНК-типування ліній і гібридів кукурудзи;

- порівняння генетичних дистанцій між лініями, алельного складу SSR-локусів і рівня гетерозису відповідних міжлінійних гібридів;

- ідентифікація локусів геному кукурудзи, що відповідають за стійкість до фузаріозної гнилі;

- розробка тест-системи для комплексної оцінки генотипу кукурудзи, а саме: його генетичної чистоти, автентичності, гетерозисного потенціалу, ступеня стійкості до фузаріозної гнилі.

Об'єкт дослідження: мінливість геному кукурудзи.

Предмет дослідження: поліморфні ділянки геному кукурудзи.

Методи дослідження: методи виділення ДНК із різних біологічних об'єктів (паростків, листя, ендосперму кукурудзи, мицелія грибів); різновиди ПЛР-аналізу (довільно праймована ПЛР, ISSR, SSR, STS); електрофорез в агарозних і поліакриламідних гелях; гібридологічний аналіз; методи біологічної статистики; біометричні методи маркування і картування (з використанням картуючих функцій Козамбі); визначення генетичних дистанцій; метод кластеризації UPGMA.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено системний молекулярно-генетичний аналіз генотипів ліній і гібридів кукурудзи, зареєстрованих в Україні.

Здійснено мікросателітний аналіз генотипів кукурудзи, використовуваних в Україні, одержані дані про унікальний алельний склад SSR-локусів для кожного генотипу. Перевірена генетична однорідність ліній і гібридів кукурудзи за високополіморфними маркерами.

Створено тест-панель 20 мікросателітних маркерів із високою дискримінаційною здатністю. Проведена диференціація, ідентифікація і реєстрація у вигляді генетичних формул генотипів кукурудзи. Створено базу даних ДНК-типування інбредних ліній і гібридів кукурудзи, що культивуються в Україні.

Проведений кореляційний аналіз значень генетичних дистанцій між інбредними лініями, розрахованих за даними ДНК-типування, і рівня гетерозису відповідних простих гібридів. Встановлений алельний склад мікросателітних локусів у вихідних ліній і гібридів, складені модельні формули, пов'язані з комбінаційною здатністю ліній.

Вивчений внутрішньовидовий молекулярно-генетичний поліморфізм грибів Fusarium moniliforme, що викликають коренево-стеблові гнилі кукурудзи, розроблено систему ПЛР-маркерів для диференціації видів і штамів фузаріїв. Запропоновано STS-маркери для ідентифікації роду Fusarium і виду F. moniliforme в зерні кукурудзи за відсутності візуальних симптомів.

Маркований і картований на молекулярно-генетичній карті кукурудзи локус, що відповідає за стійкість до коренево-стеблової гнилі (збудники - гриби роду Fusarium).

Практичне значення одержаних результатів полягає в розробці елементів MAS, а саме в розробці універсальної тест-панелі ДНК-маркерів для оцінки генетичної однорідності вихідного селекційного матеріалу, диференціації, ідентифікації і реєстрації генотипів. Створено базу даних ДНК-типування ліній і гібридів кукурудзи, зареєстрованих в Україні. Запропоновано метод прогнозування рівня гетерозису простих гібридів кукурудзи на основі ДНК-типування батьківських форм і розрахунку генетичних дистанцій між ними. Розроблено ДНК-технологію детекції грибів роду Fusarium в зерні при його закладці на тривале зберігання. Одержаний ДНК-маркер до локусу стійкості кукурудзи до фузаріумних коренево-стеблових гнилей може бути використано для скринінгу селекційного матеріалу на наявність стійкості до даного патогену. Отримані результати оформлені у вигляді методичних розробок, захищені патентами України на винахід і корисну модель.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проаналізовано літературні дані за темою дисертаційної роботи, виділено ДНК із понад 500 зразків різного біологічного походження, проведено ДНК-типування ліній і гібридів кукурудзи, що культивуються в Україні, та протестовано генетичну однорідність цього рослинного матеріалу. Детектовано молекулярно-генетичний поліморфізм батьківських ліній Одеська 139 і R221 за допомогою різних ПЛР-методів (довільно праймована ПЛР, ISSR, SSR, STS). Проведено ДНК-типування 170 зразків F2-популяції, що розщеплюється. F3-родини оцінено за ступенем ураженості F. moniliforme в лабораторних умовах при штучному зараженні рослин. Здійснено кластерний аналіз штамів F. moniliforme з різним рівнем патогенності. Знайдено достовірні кореляції між рівнем гетерозису простих гібридів і значеннями генетичних дистанцій між відповідними батьківськими лініями, одержаними за даними ДНК-типування.

Здобувач висловлює подяку за допомогу в плануванні і проведенні селекційних досліджень к.с.-г.н., доценту, провідному науковому співробітнику відділу селекції і насінництва кукурудзи Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насінництва і сортовивчення (СГІ) Б.Ф.Варенику, за надання комп'ютерних програм і поради к.б.н., доценту, науковому співробітнику відділу молекулярної генетики ПБЦ Р.Н.Календарю, за співробітництво при виконанні експериментальних робіт молодшому науковому співробітнику відділу молекулярної генетики ПБЦ Захаровій О.О.

Основні положення і висновки дисертаційної роботи, сформульовані автором, обговорено разом із науковим консультантом - доктором біологічних наук, професором, академіком УААН Ю.М. Сиволапом, якому автор висловлює щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень представлені на Міжнародному симпозіумі «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Мінськ, Білорусь, 2001 р.), VII сесії робочої групи UPOV по біохімічним і молекулярним технологіям і ДНК-профілюванню (Ганновер, Німеччина, 2001 р.), Міжнародній конференції “Plant, Animal, Microbe Genomes X” (Сан-Дієго, США, 2002 р.), Міжнародному симпозіумі “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources” (Ялта, Україна, 2002 р.), Міжнародній нараді “Application of Molecular Markers in Studies on Plants” (Варшава, Польща, 2002 р.), II Міжнародному симпозіумі «Генетическая инженерия и современные биотехнологии» (Кишинеу, Молдова, 2002 р.), Всеукраїнській конференції молодих учених “Засади сталого розвитку аграрної галузі” (Київ, Україна, 2002 р.), Міжнародній конференції “Plant, Animal, Microbe Genomes XI” (Сан-Дієго, США, 2003 р.), II Міжнародній конференції молодих учених «Сучасні проблеми генетики, біотехнології і селекції рослин» (Харків, Україна, 2003 р.), Ювілейній науковій конференції студентів, аспірантів і молодих учених, присвяченій 180-річчю з дня народження Л.С. Ценковського «Біорізноманітність. Екологія. Еволюція. Адаптація.» (Одеса, Україна, 2003 р.),

IV Міжнародній конференції «Геном растений» (Одеса, Україна, 2003 р.),

II конференції Московського суспільства генетиків і селекціонерів ім.

М.І. Вавилова, присвяченій 115-річчю з дня народження академіка М.І.Вавілова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, Росія, 2003 р.), Міжнародній науковій конференції “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология” (Мінськ, Білорусь, 2004 р.), IV Міжнародній ірано-російській конференції «Agriculture and Natural Resources» (ШахреКорд, Іран, 2004 р.), Міжнародній науково-практичній конференції «Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання» (Оброшино, Україна, 2005 р.), Міжнародній науковій конференції «Современные проблемы генетики» (Мінськ, Білорусь, 2005 р.), Ш Міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів», присвяченій 100-річчю з дня народження С.М. Гершензона і П.К. Шкварникова (Алушта, Україна, 2006 р.), Міжнародній науковій конференції “Мікробні біотехнології”, присвяченій 140-річчю з дня народження Д.К. Заболотного (Одеса, Україна, 2006 р.), Міжнародній науково-практичній конференції «Актуальні проблеми імунітету та захисту сільськогосподарських культур від хвороб і шкідників» (Одеса, Україна, 2007 р.), VIII з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова (Алушта, Україна, 2007 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані в 25 наукових статтях, із них 18 у вітчизняних і зарубіжних фахових виданнях, п'яти патентах, трьох методичних рекомендаціях, та тезах 16 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, розділу матеріалів і методів досліджень, чотирьох розділів власних результатів досліджень, аналізу і узагальнення результатів, висновків, практичних рекомендацій, переліку використаної літератури.

Роботу викладено на 303 сторінках машинописного тексту, включаючи 36 таблиць і 32 рисунка. Перелік використаної літератури включає 496 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи досліджень. Генотипування і складання генетичних формул проводили на 58 інбредних лініях і 34 гібридах селекції Інституту зернового господарства (ІЗГ, м. Дніпропетровськ), СГІ (м. Одеса) і світової колекції. Для ідентифікації і маркування локусів, що відповідають за стійкість до фузаріозних стеблово-кореневих гнилей, досліджували інбредні лінії, контрастні за стійкістю: Одеська 139 (стійка) і R221 (сприйнятлива), які схрестили для отримання F1- і F2-популяцій. 217 індивідуальних рослин F2-покоління було самозапилене для отримання F3-родин. Для оцінки ідентифікуючої здатності маркера стійкості використовували 50 інбредних ліній, що розрізняються за стійкістю до фузаріозної гнилі. Оцінку прогнозуючого потенціалу ДНК-маркерів у гетерозисній селекції здійснювали на 15 інбредних лініях, що відносяться до ранньої групи стиглості.

Матеріалом для дослідження внутрішньовидового поліморфізму Fusarium moniliforme Sheldon var. lactis (Pir.et Rib.) Bilai (секція Elegans) служили вісім штамів із різним рівнем патогенності. Для розробки тест-системи детекції видів роду Fusarium досліджували вісім видів, що належать до різних секцій:

F. moniliforme v. lactis, F. oxysporum (секція Elegans), F. graminearum, F. culmorum, F. gibbosum, F. macroceras (секція Discolor), F. sporotrichiella (секція Sporotrichiella), F. avenaceum (секція Roseum).

Виділення ДНК з паростків і листя. Паростки вирощували в темряві у термостаті при 24 0С протягом семи діб. Листя (перші) збирали з рослин, які росли в полі. Сегмент паростку або листа довжиною 1 см розтирали до повної гомогенізації тканини товкачем у ступці з 1 мл лікуючого буфера (0,1 M Na3EDTA; 0,1 M трис-HCl pH 8,5; 0,1 M NaCl; 1,0 % додецилсульфат Na; 0,1 % Tритон X-100; 100 мкг/мл протеїназа К). Лізат переносили в мікропробірку типу „Епендорф” (далі - епендорф) та інкубували 1 год при 55 0С, після чого додавали РНКазу А до кінцевої концентрації 1 мкг/мл та інкубували 1 год при 37 0С. Лізат обробляли рівним об'ємом суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішували до утворення білої емульсії. Одержану суміш центрифугували 5 хв при 14000 об./хв на мікроцентрифузі “Еppendorf 5415”, водну фазу переносили в іншій епендорф. До водної фази додавали рівний об'єм ізопропилового спирту, перемішували. Центрифугували при 14000 об./хв протягом 4 хв на мікроцентрифузі “Еppendorf 5415”, надосадову рідину зливали. Осад промивали двічі 500 мкл охолодженого 70,0 % етанолу центрифугуванням при 14000 об./хв протягом 2 хв на мікроцентрифузі “Еppendorf 5415”. Надосадову рідину зливали, осад підсушували при кімнатній температурі 20 хв і розчиняли в 300 мкл TE-буфера (0,01 М трис-HCl рН 8,0; 0,001 М Na3ЕDТА).

Виділення ДНК із зерен. 10 зерен розмолочували за допомогою лабораторного млина. 100 мг розмолотого матеріалу поміщали в епендорф, заливали 500 мкл лікуючого TES-буфера (100 mМ трис-HCl рН 8,0; 10 mМ Na3EDTA; 2,0 % додецилсульфат Na; 100 мкг/мл протеїнази К). Інкубували

1 год при 60 0С і додавали 140 мкл 5 М NaCl і 1/10 об'єму (близько 65 мкл) 10,0 % CTAB. Інкубували 10 хв при 65 0С. Додавали рівний об'єм суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішували і центрифугували 10 хв при 14000 об./хв на мікроцентрифузі “Еppendorf 5415”, водну фазу переносили в іншій епендорф, додавали 0,5 об'єму ізопропилового спирту, інкубували 1 год при 0 0С. Центрифугували 5 хв при 14000 об./хв на мікроцентрифузі “Еppendorf 5415”. Подальші стадії відповідають таким при виділенні ДНК з паростків і листя.

Виділення ДНК із міцелію грибів. Міцелій збирали в епендорф за допомогою мікробіологічної петлі з твердого культурального середовища - картопляно-цукрозного агару. Зібраний міцелій (близько 500 мг) заливали

500 мкл лізуючого TES-буфера, струшували на вортексі. Інкубували 1 год при

55 °С. Додавали NaCl до концентрації 1,4 М і 1/10 об'єму 10,0 % CTAB. Інкубували 10 хв при 65 °С. Додавали рівний об'єм суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішували до появи білої емульсії. Інкубували 30 хв при 0 °С і центрифугували 10 хв при 14000 об./хв Надосадну рідину переносили в іншій епендорф, додавали 225 мкл 5,0 М ацетату амонію, обережно перемішували і поміщали на лід на 30 хв; центрифугували 10 хв при 14000 об./хв. Надосадову рідину переносили в іншій епендорф, додавали 0,55 об'єму ізопропанолу; поміщали на лід на 15 хв Центрифугували 5 хв при 14000 об./хв. Зливали надосадну рідину, осад двічі промивали 1 мл охолодженого 70,0 % етанолу центрифугуванням при 14000 об./хв протягом 2 хв на мікроцентрифузі “Еppendorf 5415”. Надосадову рідину зливали, осад підсушували при кімнатній температурі і додавали 100 мкл TE-буфера з 1 мкг/мл РНКази А, інкубували 1 год при 37 0С. Додавали 300 мкл суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішували до появи білої емульсії. Одержану суміш центрифугували 5 хв при 14000 об./хв на мікроцентрифузі “Еppendorf 5415”, водну фазу (розчин ДНК) переносили в іншій епендорф.

Флуориметричне визначення концентрації ДНК. Концентрацію ДНК визначали на флуориметрі “TKO 100 Dedicated mini Fluorometer” (“Hoefer Scientific Instruments”, США) з використанням TNE-буфера (0,01 M трис-HCl

pH 7,4; 0,2 M NaCl; 0,001 M Na3EDTA) у присутності 0,1 мкг/мл флуоресцентного барвника Hoechst 33258 згідно інструкції до приладу.

Умови проведення полімеразної ланцюгової реакції. ПЛР проводили в 0,5 мкл-епендорфах в термоциклері «Терцик» («ДНК-технология», Росія). Реакційна суміш об'ємом 20 мкл містила буфер (0,05 М KCl; 0,02 М трис-HCl pH 8,4; 0,002 М MgCl2; 0,01 % Tвін-20); по 0,2 mМ кожного dАTP, dCTP, dTTP, dGTP; 0,25 mkМ праймера; 20 нг ДНК; 2 одиниці ДНК-полімерази Taq. На реакційну суміш нашаровували 20 мкл мінерального масла. Температурний режим ампліфікації: перша денатурація 94 0С 2 хв; фінальна елонгація 72 оС 3 хв; 30 основних циклів: денатурація 94 оС 1 хв; відпалювання праймерів 52 0С 1 хв; елонгація 72 0С 2 хв.

Електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації. Продукти ПЛР з парами праймерів (5 мкл-аліквоти ПЛР-суміші) фракціонували в 10,0 % поліакриламідному гелі в ТВЕ-буфері (0,089 М трис-HCl pH 8,0; 0,089 М борна кислота; 0,002 М Na3EDTA) при постійній напрузі 500 В і температурі 60 0С

2-3 год залежно від довжини фрагментів ампліфікації в апараті для вертикального гель-електрофорезу («Hoefer Scientific Instruments», США; «Хеликон», Росія). Продукти ПЛР з одиничними праймерами (10 мкл реакційної суміші) розділяли в 2,0 % „підводному” агарозному гелі в ТВЕ-буфері при постійній напрузі 50-100 В і кімнатній температурі 1-2 год залежно від довжини фрагментів ампліфікації в апараті для горизонтального гель-електрофорезу («Hoefer Scientific Instruments», США; «Хеликон», Росія).

Візуалізація продуктів ампліфікації. Для забарвлення продуктів ампліфікації, розділених в агарозних гелях, гель поміщали в ТВЕ-буфер з

5 мкг/мл бромістим етидієм на 15 хв і фотографували в ультрафіолетовому світлі (300 нм) на плівку «Мікрат-300» з використанням світлофільтру ОС-12. Поліакриламідний гель фарбували таким чином. Гель промивали деіонізованою водою 1 хв і проводили фіксацію ДНК в гелі 10,0 % етанолом протягом 5 хв Переносили гель в 1,0 % азотну кислоту на 6 хв і промивали кілька разів деіонізованою водою при інтенсивному струшуванні. Гель витримували 20 хв в 0,012 М AgNO3 у темноті, промивали двічі деіонізованою водою при інтенсивному струшуванні. Інкубували гель в холодному (+4 оС) оновлюючому розчині (0,28 М Na2CO3, 0,019 % формалін), замінюючи розчин після кожного його потемніння до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Фіксували гель в 10,0 % оцетовій кислоті 5 хв, промивали 2 хв деіонізованою водою і зберігали між двома шарами прозорої поліетиленової плівки. Відеозображення електрофоретичних профілів ампліфікованої ДНК і оцінку довжини продуктів ампліфікації одержували за допомогою системи документування і аналізу гелів „Image Master VDS” ("AmershamPharmaciaBiotech", OKВ) згідно інструкції користувача устаткування.

Визначення генетичних дистанцій і кластерний аналіз. Встановлення генетичних дистанцій згідно мірі схожості NL і графічну побудову дендрограм генотипів за незваженим парногруповим методом із арифметичним усереднюванням (Unweighted Pair-Group Method, UPGMA) на основі даних електрофоретичного розділення продуктів ампліфікації здійснювали за допомогою комп'ютерної програми «TREES 4.0». Наявність і відсутність продукту ампліфікації однакової молекулярної маси кодували „1” і „0” відповідно.

Математичний аналіз. Рівень поліморфізму оцінювали у відсотках як відношення поліморфних ПЛР-локусів до загального числа детектованих ПЛР-локусів: P= np / np+nnp х 100 %, де np і nnp - число поліморфних і неполіморфних ПЛР-локусів, відповідно.

Значення частот зустрічальності алелів кожного локусу розраховували як відношення числа даного алеля до загального числа алелів, відмічених для даного локуса в даній вибірці генотипів.

Індекси поліморфності (Polymorphic Index Content, PIC) досліджених локусів розраховували за формулою:

n

PIC = 1 - fi2 ,

i=1

де f2i - частота i-того алеля.

Очікувану гетерозиготність (Hexp) розраховували за формулою:

Hexp = (1 - f2i) х n / (n - 1),

де f2i - частота i-того алеля.

Спостережувану гетерозиготність (Hobs) розраховували як відношення числа гетерозиготних генотипів до загального числа генотипів.

Загальне ефективне число алелів (Ne) розраховували згідно формули:

Ne = (ne -1),

де ne - ефективне число алелів для кожного локусу; ne = 1 / pi2.

Вірогідність виключення небатьківських форм (Probability of Exclusion, PE) за i-тим локусом і об'єднану вірогідність виключення (Combined Рrobability of Еxclusion, CPE) визначали відповідно за формулами:

РЕ = 2р2q2 і

k

СРЕ = 1 - (1-PEi),

i=1

де p і q - частоти алелів i-того локусу.

Дійсний гетерозис (Н) розраховували за формулою:

Н = ( (F1 - Pmax) / Pmax ) x 100 %,

де F1 - урожай зерна простого гібриду, Pmax - найбільший урожай зерна, одержаний у однієї з батьківських форм.

Кореляційний аналіз проводили з використанням комп'ютерної програми „EXСEL”. Достовірністю середніх значень агрономічних показників служив параметричний критерій Ст'юдента (t-критерій), який визначали як відношення різниці вибіркових середніх до їхньої помилки. Достовірність кореляцій враховували при 1,0 % і 0,1 % рівні значущості.

Оцінка ураженості кукурудзи фузаріозом у лабораторних умовах при штучному зараженні рослин. Оцінку стійкості кукурудзи до фузаріозної гнилі в лабораторних умовах провокаційного фону проводили за критерієм схожості. Схожість - це здатність насіння проростати протягом певного терміну за оптимальних умов, якими для насіння кукурудзи є темрява і змінна температура (6 год при 20 оС і 18 год при 30 оС). Термін обліку схожості для насіння кукурудзи складає 7 діб (день посіву і день обліку пророслого насіння вважають за одну добу). Схожими вважали нормально проросле насіння, що характеризується наступними ознаками: нормально розвинений головний корінець розміром не менше довжини сім'я і паросток не менше половини довжини сім'я. Несхожими вважали ненормально проросле насіння, у якого: паросток нормально розвинений, але корінця немає або корінець потворний (без волосків, темний, ниткоподібний, із здуттям і перетяжками, водянистий); корінець нормальний, але паросток потворний (тонкий, сильно витягнутий, сильно викривлений); корінець нормально розвинений, але без паростка. При обліку схожості в трьох повторах підраховували кількість нормально пророслого насіння. Схожість виражали у відсотках схожого насіння від загального числа насіння.

Для оцінки стійкості кукурудзи створили суспензію чистої культури п'яти штамів Fusarium moniliforme, яка була почата як культура з інфікованих качанів кукурудзи на картопляно-глюкозному агарі. Посів здійснювали шляхом перенесення невеликої кількості повітряного міцелію кожного штаму на поверхню рідкого середовища Чапека (100 мл) такого складу: 0,3 % NaNO3; 0,1 % K2HPO4; 0,05 % MgSO4 х H2O; 0,05 % KCl; 0,001 % FeSO4; 3,0 % глюкоза або сахароза. Інкубували при 24 оС у темряві в термостаті протягом двох тижнів і на гойдалці (80 об./хв) протягом двох тижнів. Суспензію фільтрували через три шари марлі. Визначення концентрації конідій проводили мікроскопічним методом (підраховували кількість конідій в 50 полях зору). Розводили суспензію до робочої концентрації 2-5 х 105 конідій/мл.

Для звільнення від грибів родів Rhizopus, Mucor і інших проводили дезінфекцію 40 рендомізовано добраних зерен кожного зразка кукурудзи таким чином. Насіння в марлевих мішечках промивали проточною водою протягом

1 год, дезінфікували поетапно 20 хв в 0,5 % KMnO4, 20 хв в 20,0 % «Доместосі», 20 хв в 0,1 Н HCl. Промивали п'ять разів у стерильній бідистильованій воді.

20 дезінфікованих зерен кожного зразка замочували в суспензії протягом 12 год. 20 дезінфікованих зерен як контроль замочували в стерильній бідистильованій воді протягом 12 год. Оброблене таким чином насіння висаджували в скляні чашки Петрі з фільтрувальним папером, змоченим у стерильній бідистильованій воді, так, щоб насіння не дотикалось один одного. Насіння пророщували згідно умов оцінки схожості.

Гібридологічний аналіз. Гібридологічний аналіз F2- і F3-популяцій проводили за ознакою стійкості до фузаріозної коренево-стеблової гнилі, аналіз розщеплювання - шляхом підрахунку стійких і сприйнятливих генотипів. Практично одержане і теоретично очікуване розщеплювання використовували для аналізу відповідності фактичних даних за критерієм ч2.

Визначення зчеплення і картування маркерних локусів. Вивчення зчеплення локусів стійкості і маркерних локусів і молекулярне картування здійснювали за допомогою комп'ютерної програми «JOINMAP ver. 2,0». Для встановлення зчеплення ДНК-маркера з локусом використовували багатоточковий аналіз. Локус вважали зчепленим з геном, якщо значення LOD (Logariphm of Odds Ratio) складало 3,0 і більше. Частоту рекомбінації оцінювали за принципом максимальної правдоподібності. Для перерахунку значень частот рекомбінації у відстань на генетичній карті використовували картувальну функцію Козамбі.

Результати досліджень і їх обговорення.

Розробка системи молекулярних маркерів з високим дискримінаційним потенціалом. За даними Smith et al. (1997) обрано 10 мікросателітних локусів за такими критеріями: локалізація на різних хромосомах, значення PIC не менше 0,5, довжина повтору не менше 3 п. н. Дискримінаційний потенціал системи молекулярних маркерів оцінювали на вибірці 40 генотипів. Визначали параметри інформативності поліморфізму 10 мікросателітних локусів, а саме: очікувану гетерозиготність (Не) (відповідає значенню індексу поліморфності, PIC), середньоарифметичне значення гетерозиготності (Hav), загальне ефективне число алелів (Ne).

При аналізі 10 SSR-локусів виявлено 28 алелів. Число алелів на локус варіювало від двох до п'яти. Середнє число алелів на локус склало 2,8. Середнє ефективне число алелів на локус склало 2,3. Середнє значення гетерозиготності, тобто показник генетичної різноманітності даної популяції з урахуванням даних частот алелів, для 10 досліджених локусів склало 0,53 (табл. 1).

Таблиця 1

Показники інформативності маркерної системи

SSR- локус	Дов-жина алелів, п. н.	Частота зустрічальності алелів	Кіль-кість гомо- зигот	Кількість гетерозигот	Значення He	Ефек-тивне число алелів ne
				всього	серед гіб-ридів, %
phi 021	134	0,650	31	9	53	0,53	2,125
	142	0,200
	166	0,040
	170	0,070
	174	0,040
phi 064	101	0,375	30	10	59	0,70	3,353
	105	0,113
	113	0,338
	117	0,175
phi 127	128	0,275	34	6	35	0,40	1,663
	132	0,725
рhi 083	125	0,588	32	8	47	0,48	1,940
	133	0,412
phi 015	82	0,475	28	12	71	0,50	1,995
	94	0,525
phi 061	88	0,388	33	7	41	0,48	1,905
	96	0,612
рhi 079	175	0,175	32	8	47	0,50	2,015
	180	0,663
	185	0,162
phi 116	162	0,275	26	14	82	0,64	2,827
	167	0,450
	172	0,275
phi 070	78	0,350	28	12	71	0,67	2,994
	83	0,312
	88	0,338
phi 113	124	0,712	35	5	29	0,41	1,695
	128	0,288

Рівень інформативності використаної маркерної системи виявився достатнім для диференціації 40 генотипів кукурудзи. Аналіз параметрів інформативності 10 досліджених локусів показав необхідність виключення локусів phi061 і phi113 з тест-панелі із-за низьких значень PIC, малої кількості ампліфікованих алелів (як за нашими, так і за літературними даними) і складності повтору в локусі phi061 (ttct-gtat). Локуси phi127, phi015, phi083 використано в подальших дослідженнях, не дивлячись на малу кількість ампліфікованих алелів (по два для кожного локусу), оскільки, згідно інформації електронної бази даних MaizeGDB, для цих локусів характерна більша кількість алелів, що, можливо, і виявиться при збільшенні аналізованої вибірки.

Порівняльний аналіз одержаних даних із літературними показав нижчий рівень дискримінації даної маркерної системи, що дозволило зробити висновок про необхідність збільшення кількості досліджуваних локусів, щоб забезпечити можливість диференціації при подальшому аналізі нових генотипів (тобто при збільшенні вибірки).

Критеріями добору локусів (за даними літератури і електронної бази даних MaizeGDB) були локалізація на різних хромосомах, значення PIC не менше 0,5, довжина повтору не менше 3 п. н. В результаті було сформовано тест-панель із 20 мікросателітних локусів: phi055, phi064 (хромосома 1), рhi083 phi127 (хромосома 2), phi029, phi073 (хромосома 3), phi021, phi079, phi093 (хромосома 4), phi024 (хромосома 5), phi070, phi078 (хромосома 6), phi034, phi116 (хромосома 7), phi115, phi015 (хромосома 8), phi022, phi027 (хромосома 9), phi062, phi084 (хромосома 10).

Оцінка генетичної однорідності аналізованого матеріалу. Необхідним і обов'язковим етапом нашого дослідження був добір генетично однорідного вихідного матеріалу і оцінка ситуації з генетичною чистотою ліній і гібридів у насінництві кукурудзи України.

За критеріями - розташування на різних хромосомах і значення PIC не менше 0,7 - із сформованої тест-панелі обрано три високополіморфних локуси phi064 (хромосома 1, PIC 0,83), phi079 (хромосома 4, PIC 0,78), phi015 (хромосома 8, PIC 0,84), за якими проводили оцінку генетичної однорідності ліній і гібридів.

Визначення типовості, тобто відповідності генетичних показників еталонному зразку і генетичній однорідності, інбредних ліній є однією з обов'язкових процедур у селекції. Генетично однорідні лінії забезпечують отримання гібридного насіння F1 з високим (не менше 98 %) рівнем гібридності. Типовість інбредних ліній визначали за такими етапами: (1) виділення ДНК з 50 індивідуальних зразків лінії (виділення ДНК можливо здійснювати з будь-якої тканини рослини на будь-якій стадії онтогенезу (паросток, зерно, листя, корінь)); (2) створення п'яти сумішей, що містять ДНК 10 індивідуальних зразків; (3) ПЛР-ампліфікація мікросателітних локусів; (4) електрофорез фрагментів ДНК у поліакриламідному гелі; (5) порівняння електрофоретичних профілів ДНК між собою (рис. 1).

Лінію вважали однорідною у разі (1) ідентичності спектрів ампліфікованої ДНК всіх п'яти сумішей за аналізованими локусами і (2) гомозиготного стану аналізованих локусів. У разі виявлення внутрішньолінійної гетерогенності, тобто неідентичності між собою спектрів ампліфікації одного-усіх аналізованих локусів, або гетерозиготного стану одного-усіх аналізованих локусів робили висновок про неоднорідність лінії. Далі проводили ПЛР-аналіз ДНК індивідуальних зразків певної суміші і передбачали вибраковування нетипових.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

9,1 9,2 9,3 9,4 9,5 9,6 9,7 9,8 9,9 9,10

Рис. 1. Електрофореграми продуктів ампліфікації локусу phi064 сумішей ДНК індивідуальних зразків лінії Одеська 7 (1-5) і Одеська 24 (6-10) та ДНК індивідуальних зразків суміші № 9 (9,1-9,10)

Використання високоякісного насіння районованих гібридів забезпечує високий урожай зерна і зеленої маси кукурудзи. Для оцінки якості гібридного насіння необхідно встановити відсоток гібридності насіння в рік їх отримання на ділянках гібридизації (за 2-3 тижні до збору урожаю) і своєчасно прийняти рішення про подальше їх використання.

Однорідність гібридів оцінювали за даними ПЛР-аналізу трьох мікросателітних локусів. Етапи аналогічні таким при визначенні типовості ліній. Гібрид вважали одноріднім у разі (1) ідентичності спектрів ампліфікованої ДНК всіх п'яти сумішей за аналізованими локусами і (2) підсумовування в його ДНК-спектрі компонентів ампліфікації батьківських форм. У разі виявлення внутрішньогібридної гетерогенності, тобто неідентичності спектрів ампліфікованих ДНК між собою хоч би за одним аналізованим локусом, робили висновок про неоднорідність гібрида і передбачали вибраковування нетипових зразків шляхом ДНК-типування індивідуальних представників певної суміші.

Таким чином, розроблено ДНК-технологію визначення генетичної чистоти інбредних ліній і гібридів кукурудзи на основі аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму мікросателітних локусів, що дозволить підвищити надійність тестування партій насіння.

За допомогою розробленої ДНК-технології оцінено генетичну чистоту вихідного матеріалу (145 інбредних ліній і 43 гібридів) і виявлено однорідність досліджуваного матеріалу за трьома мікросателітними локусами. Для подальших досліджень використовували ДНК одного зразка кожного генотипу.

Добір генетично чистого матеріалу дозволив перейти до наступного етапу роботи, а саме диференціації та ідентифікації ліній і гібридів.

Диференціація, ідентифікація і реєстрація генотипів кукурудзи за допомогою мікросателітних маркерів. Для генотипування і складання генетичних формул використовували 92 інбредних ліній і гібридів кукурудзи селекції ІЗГ, СГІ і світової селекції.

ПЛР-ампліфікація ДНК аналізованих генотипів із використанням 20 пар праймерів до мікросателітних локусів дозволила одержати унікальні для генотипів кукурудзи набори алелів. Для всіх інбредних ліній визначили гомозиготний стан досліджених локусів, тоді як для гібридів одержані гомо- і гетерозиготи. Спектр ампліфікованої ДНК гібридів містив компоненти спектрів ліній, які брали участь в їх створенні.

При аналізі 20 локусів вивлено від двох до шести алелів на локус, середня кількість алелів на локус склала 4,1. Дане значення вище за таке (2,8), що одержано при ПЛР-аналізі 10 мікросателітних локусів вибірки 40 генотипів. Виявлено зростання середнього значення PIC (з 0,53 до 0,68), що свідчить про підвищення дискримінаційного потенціалу даної маркерної системи.

Для кожного генотипу визначені розміри алелів мікросателітних локусів у парах нуклеотидів (п. н.). За цими показниками створена матриця даних ДНК-типування ліній і гібридів.

Унікальні комбінації алелів у ліній і гібридів дозволяють представити кожний генотип у вигляді генетичної формули. Кожний SSR-локус кодували буквою латинського алфавіту. Як нижній індекс використовували розмір алеля даного локусу (у п. н.). У разі гомозиготного стану локусу вказували один алель.

У формулі простого гібриду підсумовуються дані алельного складу мікросателітних локусів, характерних для батьківських форм. Якщо відома формула простого гібриду і однієї з батьківських ліній, можливо визначити іншу складову - генотип другої батьківської форми, і навпаки.

На основі системи управління базами даних ORACL 10gXE з можливістю web-доступу створено комп'ютерну базу даних ДНК-типування гібридів кукурудзи, зареєстрованих у «Реєстрі сортів рослин України» і «Державному реєстрі сортів рослин, придатних для розповсюдження в Україні» в 2003-2005 роки, та відповідних батьківських форм, а також ліній і гібридів світової селекції. Необхідність такої бази пов'язана як із зберіганням і порівняльним пошуком інформації про генотипи, так і з постійним поповненням результатами аналізу нових генотипів і нових мікросателітних локусів. Наявність такої бази даних дозволяє виконувати незалежну експертну оцінку комерційних партій насіння і захищати права селекціонерів - авторів сортів.

Таким чином, за даними аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму мікросателітних локусів розроблено ДНК-технологію диференціації, ідентифікації і реєстрації ліній і простих гібридів кукурудзи, що дозволяє оцінити новизну генотипу.

Реєстрацію генотипу необхідно проводити за таким порядком: виділення ДНК з наданих зразків, ПЛР-ампліфікація, електрофоретичне розділення і візуалізація продуктів ампліфікації, документування, обробка і оформлення результатів. Для визначення новизни генетичну формулу проаналізованого генотипу порівнюють з формулами генотипів бази даних. У разі відсутності такого генотипу, інформація про нього поповнює банк даних. На основі результатів аналізу замовнику видають «Генетичний паспорт лінії (гібриду)».

Сучасна селекція гібридів кукурудзи заснована на використанні явища гетерозису. Прояв гетерозису значною мірою залежить від генетичної мінливості вихідного матеріалу. Тому наступним етапом нашої роботи була оцінка генетичного різноманіття ліній за допомогою молекулярних маркерів для встановлення можливості прогнозування гетерозису простих гібридів.

Оцінка потенціалу ПЛР-маркерів для прогнозування гетерозису гібридів кукурудзи. Методом ПЛР з 10 ISSR-праймерами здійснювали диференціацію 15 інбредних ліній кукурудзи середньої групи стиглості (рис. 2).



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 М М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

а б

Рис. 2. Електрофореграми продуктів ампліфікації ДНК інбредних ліній кукурудзи Одеська 7 (1), Одеська 17 (2), Одеська 18 (3), Одеська 24 (4), Одеська 139 (5), Одеська 141 (6), ДК2/165 (7), OН43 (8), Х5753 (9), R221 (10), PLS61 (11), W401 (12), Ekc15 (13), BAM97 (14), Оk109 (15) при використанні праймерів Isp8 (а) і R10 (б). М - маркер молекулярної маси

Використано полілокусну маркерну систему, яка дозволяє одночасно охарактеризувати велику кількість ПЛР-локусів. Одержані спектри ампліфікованої ДНК, які унікальні для кожної лінії і включають від 10 до 17 компонентів. Проаналізовано 187 фрагментів ампліфікації, з яких 87 % поліморфних.

За допомогою комп'ютерної програми «TREES 4.0» розрахували генетичні дистанції (D) між лініями. Значення D варіювали від 0,033 до 0,538. Згідно значенням D пари ліній розділено на чотири групи: I - D?0,2; II - 0,2<D<0,3; III - 0,3<D<0,4; IV - D?0,4 (табл. 2). У I групі значення генетичних дистанцій склали 0,033-0,182; II групі - 0,200-0,294; III групі - 0,300-0,399;

IV групі - 0,412-0,538.

Провели діалельне схрещування вихідних ліній. Дані по врожаю зерна одержано для 56 гібридів, для яких підрахували дійсний гетерозис (Н) за врожаєм зерна (табл. 2).

Таблиця 2

Генетичні дистанції (D) між лініями і гетерозис (H) гібридів

Гібрид між лініями	D	Н, %
I група
Одеська 7	Одеська 139	0,033	3
Одеська 24	Одеська 139	0,033	6
Одеська 18	Одеська 7	0,033	46
Одеська 24	Одеська 17	0,033	47
W401	Одеська 18	0,033	66
Одеська 139	PLS61	0,033	90
Одеська 24	Одеська 18	0,068	68
Одеська 24	W401	0,091	96
ДК2/165	Одеська 139	0,143	15
R221	OK109	0,143	82
Одеська 7	Одеська 17	0,176	139
PLS61	W401	0,182	98
ДК2/165	W401	0,182	122
II група
Одеська 18	Одеська 139	0,200	19
Ok109	Одеська 141	0,200	63
Одеська 24	PLS61	0,200	86
Х5753	W401	0,217	11
W401	OK109	0,217	17
Одеська17	R221	0,222	165
X5753	Одеська 24	0,238	6
Х5753	R221	0,238	9
ДК2/165	Х5753	0,238	36
Одеська 139	ВАМ97	0,238	39
Одеська 18	OН43	0,250	166
Одеська 18	ВАМ97	0,263	65
ДК2/165	Одеська 18	0,263	113

Порівняли угрупування вихідних ліній, здійснене за значеннями D, з розподілом рівня гетерозису. Середнє значення D I групи ліній склало 0,091,

II групи - 0,245, III групи - 0,353, IV групи - 0,460. Середнє значення Н гібридів, одержаних від схрещування ліній I, II, III і IV групи, склало 66, 78, 144 і 146 %, відповідно. Коефіцієнти кореляції r значень генетичних дистанцій між лініями і рівнем гетерозису відповідних гібридів наступні: 0,60; 0,46, 0,61 (достовірно при рівні значущості Р = 0,05) і 0,41 (не достовірно) для ліній I, II, III і IV групи, відповідно.

При збільшенні значень генетичних дистанцій між вихідними лініями спостерігається достовірне зростання рівня гетерозису відповідних гібридів

(рис. 3).

Рис. 3. Порівняння середніх значень генетичних дистанцій між вихідними лініями, розрахованими за даними ISSR-аналізу, і рівня гетерозису відповідних гібридів

При значенні генетичних дистанцій між лініями менше 0,300 рекомендуємо «вибраковувати» пари для схрещування як близькоспоріднені і такі, що не відповідають вимогам до вихідних форм для отримання високогетерозисних гібридів. Такі зразки можливо використовувати для підвищення продуктивності ліній. Значення генетичних дистанцій вище 0,300 дозволяють рекомендувати аналізовані лінії для гібридизації з метою отримання високогетерозисних гібридів.

Молекулярно-генетична ідентифікація і оцінка ступеня спорідненості вихідного матеріалу мають велике значення в практичній селекції на гетерозис. Емпіричний характер добору з десятків тисяч найбільш продуктивних гібридних комбінацій приводить до величезного об'єму неінформативних тестових схрещувань, значним витратам часу, засобів, коштів і не завжди забезпечує бажаний результат. Впровадження в селекційну практику ДНК-технології оцінки вихідного матеріалу дозволяє проводити диференціацію та ідентифікацію ліній і гібридів кукурудзи, визначати ступінь генетичної дивергенції між ними і більш цілеспрямовано підбирати батьківські пари для отримання високогетерозисних простих гібридів.

Окрім рівня гетерозису, на врожайність кукурудзи впливають безліч інших чинників, у тому числі і генетично обумовлена стійкість до хвороб і шкідників.

Маркування локусів стійкості до грибів роду Fusarium. Молекулярно-генетичне дослідження видового і штамового складу фітопатогенних організмів, їх ідентифікація і аналіз мінливості є важливим попереднім етапом роботи, направленої на маркування генів стійкості до даних фітопатогенів. Необхідним є знання загального потенціалу патогенності, який закладений в генетичному матеріалі фітопатогенів, що дозволить прогнозувати можливу шкоду і розробити надійні заходи боротьби.

Кукурудза уражається понад 100 видами патогенів. Фузаріози є одними з найбільш шкідливих хвороб кукурудзи, втрати від яких можуть досягати 50 % від загального врожаю. Небезпека цих грибів також полягає в продукуванні токсинів, що викликають мікотоксикози людей і сільськогосподарських тварин. В умовах півдня України основну роль у захворюваності кукурудзи гниллю відіграють гриби Fusarium moniliforme var. lactis.

Можливість використання ПЛР-аналізу для диференціації F. moniliforme оцінювали на прикладі восьми штамів, що розрізняються рівнем патогенності. Використання ПЛР з вісьма довільними праймерами дозволило унікально диференціювати досліджені штами. На рис. 4 наведено електрофореграму продуктів ампліфікації ДНК штамів F. moniliforme, одержаних при використанні праймеру Р60.

Рис. 4. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК штамів F. moniliforme 52 (1), 55 (2), 13 (3), 41 (4), 82 (5),

122 (6), 53 (7), 81 (8) при використанні праймера Р60

1 2 3 4 5 6 7 8

Спектри ампліфікованої ДНК включали від чотирьох до 17 компонентів, середнє число ПЛР-фрагментів на праймер склало 7,1. Проаналізовано 199 фрагментів ампліфікації, з яких 191 - поліморфні. Рівень поліморфізму склав 96 %.

За даними ПЛР-аналізу розраховано генетичні дистанції між дослідженими штамами і сконструйовано дендрограму (рис. 5).

Кластеризація штамів за даними ПЛР-аналізу збігалась з результатами очікуваного угрупування штамів за рівнем патогенності.

Таким чином, вивчений внутрішньовидовий склад популяції

F. moniliforme за допомогою ПЛР-методу, виявлено високий рівень поліморфізму, одержано кластеризацію штамів, що відображає угрупування за рівнем патогенності.

Для своєчасного захисту посівного і кормового зерна в період його зберігання необхідно проводити оцінку фітосанітарного стану зерна, тобто своєчасно діагностувати зараженість зерна фузаріями (до появи візуальних симптомів).

Для розробки ПЛР-системи експрес-детекції Fusarium spp. у зерні кукурудзи провели аналіз ДНК восьми видів, що належать до різних секцій:

F. moniliforme var. lactis, F. oxysporum (секція Elegans), F. graminearum,

F. culmorum, F. gibbosum, F. macroceras (секція Discolor), F. sporotrichiella (секція Sporotrichiella), F. avenaceum (секція Roseum).

Проводили ПЛР-ампліфікацію ділянки геному, специфічного для роду Fusarium, в двокомпонентній системі. Наявність після електрофоретичного розділення в агарозному гелі фрагментів ампліфікації довжиною 431 п. н. оцінювали як факт присутності в тестованому зразку грибів роду Fusarium. Чутливість способу оцінювали шляхом ПЛР-ампліфікації ДНК гриба в розведеннях при постійній концентрації ДНК кукурудзи. Мінімальна концентрація ДНК грибів роду Fusarium, яку можливо детектувати за допомогою даного методу, складає 1.10-4 нг/мл.

Для оцінки можливості детектування F. moniliforme Sheldon var. lactis у зерні проводили ПЛР-ампліфікацію видоспецифічної ділянки геному

F. moniliforme Sheldon var. lactis в двокомпонентній системі. Реєстрували наявність/відсутність фрагменту ампліфікації розміром 561 п. н. після електрофоретичного розподілу в агарозному гелі, результати реєстрації свідчили про наявність/відсутність інфекції, відповідно. Чутливість методу визначали шляхом встановлення найменшої кількості матричної ДНК F. moniliforme, достатнього для ампліфікації специфічного фрагмента. Визначили, що для детекції ДНК F. moniliforme в тканинах рослин досить концентрації 1 % (1:1х10-2) грибної ДНК в суміші з фоновою ДНК кукурудзи.

Таким чином, розроблено високочутливу і ефективну ДНК-технологію діагностики інфекції, викликаної фузаріями, в зерні кукурудзи, яка є точним, надійним, швидким способом експрес-аналізу великої кількості зразків.

...