Молекулярні маркери в дослідженні геному кукурудзи (Zea mays L.)

Більшість генотипів кукурудзи вітчизняної і зарубіжної селекції, які культивуються в Україні, в аспекті їх стійкості до ураження грибами роду Fusarium, вивчене недостатньо. Ідентифікація QTL стійкості значно підвищить ефективність селекційних робіт із створення ліній і гібридів кукурудзи, стійких до збудників фузаріозних гнилей, найбільш поширених патогенів кукурудзи в умовах півдня України, а також продемонструє можливість використання молекулярних маркерів цих QTL у селекційних програмах із добором за маркерами (Marker-assisted selection).

Роботу із створення ДНК-маркера локусів стійкості кукурудзи до фузаріозної гнилі проводили за такою схемою. (1) ПЛР-аналіз ДНК батьківських ліній і виявлення поліморфних локусів. (2) Створення сумішей ДНК рослин домінантних і рецесивних гомозиготних генотипів за даними фітопатологічного польового і лабораторного тестування. (3) ПЛР-аналіз ДНК батьківських ліній і контрастних сумішей ДНК з використанням відібраних праймерів. (4) Скринінг F2-популяции за поліморфними локусами. (5) Визначення зчеплення маркера(ів) з локусом(ами) стійкості. (6) Тестування генотипів кукурудзи на стійкість за допомогою розробленого маркера.

Провели пошук серед 27 пар SSR-, 20 пар STS-, 24 ISSR- і 23 довільних праймерів тих, які детектують поліморфізм між батьківськими лініями. За допомогою ПЛР-аналізу інбредних ліній R221 і Одеська 139 визначено

40 поліморфних локусів.

Рослини F1, одержані від схрещування контрастних за стійкістю ліній Одеська 139 і R221, мали високий ступінь стійкості (0-10 % поразки), що свідчить про домінантну природу гена стійкості. Фенотипічний прояв стійкості визначали на 170 рослинах F2-популяції, що розщеплюється. 32 рослини віднесли до сприйнятливих, що відповідало розщеплюванню 3 : 1 (ч2 = 3,16 при Р = 0,10-0,05).

З 138 стійких рослин F2 за результатами фітопатологічного польового тестування ураженості рослин F3-сімей фузаріозною гниллю 34 F2-рослини оцінили як гомозиготні стійкі генотипи, 104 - гетерозиготні генотипи. За результатами лабораторної оцінки (обліку схожості насіння на інфекційному фоні) 41 F2-рослину охарактеризували як гомозиготні стійкі генотипи, 97 - гетерозиготні генотипи.

На основі узагальненої (польової і лабораторної) оцінки F3-сімей відібрані рослини покоління F2, гомозиготні за стійкістю (28 рослин) і сприйнятливістю (31 рослину).

Створили дві суміші ДНК рослин домінантних і рецесивних гомозиготних генотипів для ПЛР-ампліфікації за BSA-методом (по 15 зразків ДНК на суміш).

З 14 праймерів (пар праймерів), за допомогою яких виявлений поліморфізм між батьківськими лініями, використання семи пар праймерів дозволило детектувати поліморфізм між контрастними сумішами ДНК. Проведений ПЛР-аналіз добраних локусів у індивідуальних рослин F2-популяції. Дані ПЛР-аналізу за ознакою наявність/відсутність фрагмента зіставляли з результатами гібридологічного аналізу відповіді рослини на ураження (стійкість/сприйнятливість). При аналізі п'яти локусів не встановлено зв'язку між ознакою стійкості та алельним складом тестованих локусів.

При аналізі SSR-локусу phi001 знайдені поліморфні фрагменти ампліфікації, які розрізняють батьківські лінії і контрастні за стійкістю пули ДНК: фрагмент ампліфікації довжиною 180 п. н., характерний для стійкої лінії Одеська 139 і суміші ДНК стійких F2-зразків, і фрагмент ампліфікації довжиною 195 п. н., характерний для нестійкої лінії R221 і суміші ДНК нестійких F2-зразків. Аналогічні результати отримані при використанні пари STS-праймерів RGA11, дизайн яких розроблений на основі амінокислотної послідовності лейцин-збагачених ділянок аналогів генів стійкості: фрагменти ампліфікації довжиною 240 п. н. і 265 п. н. відповідно характерні для „стійких” і „сприйнятливих” генотипів

Для визначення зчеплення поліморфних локусів phi001 і RGA11 з геном стійкості до фузаріозної гнилі генотипували рекомбінанти F2-популяції даними маркерами. На рис. 7 наведено електрофореграми фрагментів ампліфікації локусу RGA11 при ПЛР-аналізі рослин F2-популяції.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

М 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

Рис. 7. Електрофореграма продуктів ампліфікації локусу RGA11 ДНК індивідуальних рослин F2-популяції (1-34)

Одержані дані генотипування рекомбінантів F2-популяції і фенотипового прояву стійкості до фузаріозної гнилі аналізували за допомогою комп'ютерної програми «JOINMAP ver. 2.0» з картувальною функцією Козамбі.

Відстань маркерів phi001 і RGA11 від гена стійкості склала 30,3 і

18,3 сМ, відповідно. Відома хромосомна локалізація мікросателітного локусу phi001 дозволила локалізувати локус RGA11: він знаходиться на короткому плечі хромосоми 1 (рис. 8).

Для перевірки маркувального потенціалу розробленого ДНК-маркера протестували генотипи кукурудзи з різним ступенем стійкості за локусом RGA11. 50 ліній кукурудзи, що розрізняються стійкістю до фузаріозної гнилі, скринували з використанням STS-праймерів до локусу RGA11. З 25 ліній, оцінених фенотипово як стійкі, у 19 виявили наявність фрагмента ампліфікації довжиною 240 п. н. При ПЛР-аналізі локусу RGA11 25 ліній, сприйнятливих до фузаріозної гнилі, у 18 був присутній фрагмент довжиною 265 п. н. У 13 випадках виявлено невідповідність між алельним складом генотипу за локусом RGA11 і стійкістю/сприйнятливістю до фузаріозу. Шість ліній за даним локусом були гетерозиготними. RGA11-маркер був ефективний в 74 % порівнянь.

Рис. 8. Схема розташування потенційного маркера стійкості до фузаріозної гнилі

Таким чином, проведено генотипування F2-популяції, одержаної від схрещування ліній кукурудзи Одеська 139 і R221, контрастних за стійкістю до фузаріозної гнилі. За допомогою різних технік ПЛР з використанням

93 (пар) праймерів проскринована ДНК ліній Одеська 139 і R221 і сумішей домінантних і рецесивних гомозиготних F2-зразків на наявність поліморфізму. Виявлений кодомінантний ДНК-маркер RGA11 до локусу, що відповідає за стійкість кукурудзи до фузаріозної гнилі. Картування локусу стійкості до фузаріозної гнилі дозволило локалізувати його на короткому плечі хромосоми 1 на відстані 18,3 сМ дистальніше від маркера RGA11.

Для підвищення ідентифікуючої здатності маркера RGA11 провели секвенування алеля локусу RGA11 довжиною 240 п.н., що маркує стійкі генотипи. Нуклеотидна послідовність 240 п.н.-RGA11-алеля є комплементарною ретротранспозону Grande (ZDGRANDE1). За даними нуклеотидної послідовності сконструйована пара праймерів до кінцевих ділянок даного фрагмента ДНК. Тестування генотипів кукурудзи із різною стійкістю до фузаріозної гнилі продемонструвало його певні переваги (менша кількість невідповідностей при порівнянні маркер - ознака; менші розміри ампліфікуємих алелів). Даний маркер може бути використаний в селекції при доборі генотипів кукурудзи, стійкість яких регулюється даним геном. Перевагою виявленого маркера є його кодомінантність, що дозволяє тестувати як стійкі, так і сприйнятливі генотипи кукурудзи.

ВИСНОВКИ

Вперше теоретично і експериментально проаналізовано внутрішньовидовий молекулярно-генетичний поліморфізм різних фракцій геному кукурудзи за допомогою ДНК-маркерів та запропоновано загальну стратегію оцінки генотипів кукурудзи, яка охоплює всі аспекти створення маркерних систем та їхнього практичного застосування в селекційному процесі.

1. Розроблено теоретичні і методичні положення використання молекулярно-генетичного поліморфізму ДНК, що виявляється за допомогою молекулярних маркерів, у генетико-селекційних дослідженнях кукурудзи. Відпрацьовані етапи проведення ДНК-типування генотипів кукурудзи, що включають виділення ДНК із різних біологічних об'єктів (паростків, зерна, листя), добір праймерів, ампліфікацію за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, електрофоретичне фракціонування фрагментів ДНК у агарозних і поліакриламідних гелях, статистичну обробку результатів та їхнє документування.

2. Оцінено показники дискримінаційної сили і параметри інформативності 22 мікросателітних локусів, внаслідок чого підібрано маркерну систему з високим дискримінаційним потенціалом для проведення ідентифікації та реєстрації генотипів, тестування генетичної чистоти інбредних ліній і гібридів.

3. Для інбредних ліній характерний гомозиготний стан проаналізованих мікросателітних локусів, тоді як для простих гібридів виявлено як гомо-, так і гетерозиготний стан SSR-локусів. За алельним складом мікросателітних локусів оцінено генетичну чистоту 188 генотипів кукурудзи: лінії гомозиготні, прості гібриди однорідні.

4. Виявлено набори алелів мікросателітних локусів, індивідуальні (унікальні) для кожного генотипу, з результатами диференціації та ідентифікації 92 ліній і гібридів кукурудзи,

5. ДНК-профіль простих гібридів є кодомінантною гетерозиготою, тобто результує алелі, характерні для обох батьківських ліній. Дане явище дозволяє при складанні генетичної формули гібриду і знанні тільки однієї батьківської форми визначити алельний стан мікросателітних локусів іншої (передбачуваної) батьківської лінії, що має велике значення при відновленні втрачених родоводів або при неповних даних про педігрі.

6. Вперше запропоновано фіксацію генотипу кукурудзи у вигляді генетичних (літеро-цифрових) формул, що відображають алельний склад мікросателітних локусів, для впровадження в державну реєстрацію сортів рослин.

7. Вперше створено електронну базу даних ДНК-типування ліній і гібридів кукурудзи, придатних для розповсюдження в Україні, що включає генетичні формули, інформацію про локуси, хромосомну локалізацію, кількість і довжину алелів, частоту зустрічальності, умови проведення ПЛР-аналізу і дозволяє здійснювати зберігання, поповнення і порівняння результатів як відносно генотипів, так і відносно аналізованих локусів.

8. Виявлено статистично достовірну кореляцію між значеннями генетичних дистанцій в наборі інбредних ліній, використаних для схрещування за діалельною схемою, і рівнем гетерозису відповідних простих гібридів. Розроблено ДНК-технологію прогнозування рівня гетерозису простих гібридів кукурудзи за значеннями генетичних дистанцій між батьківськими формами і алельним складом мікросателітних локусів.

9. Вперше вивчено внутрішньовидовий молекулярно-генетичний поліморфізм Fusarium moniliforme як представника найшкідливіших грибів для кукурудзи. Аналіз різних ділянок геному показав 96 % рівень поліморфізму даного виду грибів, що свідчить про високий ступінь пристосовування патогену як до різних умов навколишнього середовища, так і до різних за ступенем стійкості рослин-господарів.

10. Кластеризація штамів F. moniliforme, що відрізняються за рівнем патогенності, за значеннями генетичних дистанцій, розрахованих за даними ПЛР-аналізу, збігла з угрупуванням за рівнем патогенності.

11. Проаналізовано геномні ділянки, специфічні для роду Fusarium і виду F. moniliforme. Розроблено ДНК-технологію детекції зараженості зерна кукурудзи грибами роду Fusarium, показано високу чутливість і специфічність тест-системи.

12. На хромосомі 1 виявлено кодомінантний ДНК-маркер RGA11 до локусу, що відповідає за стійкість кукурудзи до коренево-стеблевої гнилі (збудник F. moniliforme), на відстані 18,3 сМ. Нуклеотидна послідовність 240 п.н.-RGA11-алеля є комплементарною ретротранспозону Grande.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Розроблені принципи ДНК-типування ліній і гібридів кукурудзи на основі аналізу мікросателітних локусів рекомендуються для тестування генетичної однорідності селекційного матеріалу, визначення рівня гібридності простих гібридів, оцінки автентичності генотипу.

2. Розроблену ДНК-технологію рекомендується використовувати для реєстрації генотипів кукурудзи у вигляді генетичних формул, що відображають алельний склад мікросателітних локусів, і отримання генетичного паспорта лінії або гібриду.

3. Маркер RGA11, ідентифікований в даному дослідженні, може бути використаний для скринінгу генотипів кукурудзи на стійкість, контрольовану зчепленим з ним геном стійкості до фузаріозної гнилі.

4. Виявлені залежності значень генетичних дистанцій між лініями і рівнем гетерозису відповідних простих гібридів можуть бути основою для прогнозування схрещувань з метою отримання високогетерозисних гібридів.

5. Розроблені тест-системи детекції грибів роду Fusarium у зерні кукурудзи рекомендується застосовувати при аналізі зерна, що закладається на тривале зберігання, а також харчової продукції, що виготовляється із зерна кукурудзи.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сиволап Ю.М. Идентификация инбредных линий кукурузы с помощью произвольно праймированной ПЦР и SSR-ПЦР / Ю.М. Сиволап,Н.Э. Кожухова, Б.Ф. Вареник // Доклады РАСН. - 1999. - № 6. - С. 3-6.

Особистий внесок здобувача - проведений аналіз ДНК 46 інбредних ліній кукурудзи методами довільно праймованої ПЛР і SSR-ПЛР, здійснено порівняння дискримінаційного потенціалу різних ПЛР-маркерів.

2. Кожухова Н.Э. Определение «гибридности» простых гибридов кукурузы методом SSR-ПЦР / Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап, Б.Ф. Вареник // Цитология и генетика. - 2001. - Т. 35, № 2. - С. 43-48.

Особистий внесок здобувача - проведено генотипування інбредних ліній і простих гібридів кукурудзи за допомогою SSR-ПЛР, вивчено характер спадкоємства фрагментів ампліфікації, запропоновано тест-систему для визначення гібридності простих гібридів кукурудзи.

3. Kozhukhova N. Maize genotypes differentiation, identification and registration by SSR-markers / N. Kozhukhova, Yu. Sivolap // Documents on the Seventh Session of the working Group on Biochemical and Molecular Techniques and DNA-Profiling in Particular (BMT) of UPOV. Hanover, Germany. 21-23.11.2001. Document BMT/7/19 Prov. Annex III. - P. 11-15.

Особистий внесок здобувача - здійснено диференціацію та ідентифікацію інбредних ліній і простих гібридів кукурудзи за допомогою SSR-ПЛР, розроблено схему реєстрації генотипів у вигляді генетичних формул, що відображають алельний склад мікросателітних локусів.

4. ДНК-маркери в селекції та насінництві кукурудзи / Сиволап Ю.М., Кожухова Н.Е., Доменюк В.П. [та ін.] // Вісник аграрної науки. - 2003. - № 6. - С. 45-48.

Особистий внесок здобувача - проаналізовано сучасний стан впровадження ДНК-маркерів в світову практику селекції і насінництва кукурудзи, оцінено перспективність ДНК-технологій, розроблених у ПБЦ, для підвищення ефективності селекційного процесу в Україні.

5. Кожухова Н.Э. Молекулярно-генетическая характеристика инбредных линий и простых гибридов кукурузы Zea mays L. / Н.Э. Кожухова, Б.Ф. Вареник, Ю.М. Сиволап // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. праць. - Київ, 2003. - С. 345-350.

Особистий внесок здобувача - проведено генотипування інбредних ліній і простих гібридів кукурудзи, оцінений рівень ефективності використаної маркерної системи і показники інформативності SSR-локусів.

6. Кожухова Н.Э. Идентификация и регистрация генотипов кукурузы при помощи молекулярных маркеров / Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Генетика. - 2004. - Т.40, № 1. - С. 59-66.

Особистий внесок здобувача - здійснено генотипування інбредних ліній і гібридів кукурудзи за допомогою мікросателітних маркерів, створені генетичні формули, що відображають алельний склад SSR-локусів досліджених генотипів.

7. Молекулярно-генетичний аналіз популяцій Fusarium spp. південного регіону України / О.О. Дерев,янко, Н.Е. Кожухова, О.В. Бабаянц [та ін.] // Вісник Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова. - 2004. - Т. 9, вип. 5,

№ 1. - С. 105-112.

Особистий внесок здобувача - проведений ПЛР-аналіз видового і штамового складу грибів роду Fusarium Одеської області, визначений рівень між- і внутрішньовидового поліморфізму.

8. Сиволап Ю.М. ДНК-технології в реєстрації і охороні прав на сорти рослин / Ю.М. Сиволап, Н.Е. Кожухова // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. - 2005. - № 1. - С. 66-74.

Особистий внесок здобувача - проаналізовано сучасний стан впровадження ДНК-технологій в світову практику захисту прав на сорти рослин, оцінено перспективність ДНК-технологій, розроблених у ПБЦ, для реєстрації сортів рослин в Україні.

9. Кожухова Н.Э. Прогнозирующий потенциал ДНК-маркеров в гетерозисной селекции кукурузы / Н.Э. Кожухова, Б.Ф. Вареник, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика. - 2005. - Т. 39, № 1. - С. 14-20.

Особистий внесок здобувача - проведено генотипування ліній кукурудзи за допомогою різних ПЛР-технік, підраховано значення генетичних дистанцій між лініями за даними ПЛР-аналізу і рівень гетерозису відповідних гібридів, здійснено порівняння даних ПЛР-аналізу і рівня гетерозису.

10. Ефименко В.Г. Полиморфизм микросателлитной ДНК и изучение генетических ресурсов кукурузы / В.Г. Ефименко, Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика. - 2005. - Т. 39, № 2. - С. 10-15.

Особистий внесок здобувача - досліджено молекулярно-генетичний поліморфізм мікросателітної фракції геному кукурудзи, проведено порівняння частот зустрічальності алелів і генотипів двох вибірок ліній і гібридів (південного і східного регіонів України).

11. Кожухова Н.Э. ДНК-маркеры в развитии теории и практики селекции кукурузы / Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Молекулярная и прикладная генетика: Сб. научн. трудов. - Минск, 2005. - Т. 1. - С. 37-40.

Особистий внесок здобувача - продемонстровано практичне застосування ДНК-маркерів, розроблених на основі ПЛР-аналізу поліморфізму ліній і гібридів кукурудзи вітчизняної і світової селекції, для вирішення проблем генетики, селекції і насінництва кукурудзи.

12. Єфименко В.Г. Молекулярно-генетична характеристика генотипів кукурудзи за складом мікросателітних локусів / В.Г. Єфименко, Н.Е. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Вісник Українського товариства генетиків і селекционерів. - 2006. - Т. 4, № 1. - С. 21-30.

Особистий внесок здобувача - проведено ПЛР-аналіз 80 ліній і гібридів кукурудзи, вивчений алельний склад 21 мікросателітного локусу, створено електронна база даних ДНК-типування.

13. Деревянко О.А. Молекулярные маркеры геномов фузарий для определения инфицированности зерна кукурузы / О.А. Деревянко, Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. праць. - 2006. - Т. 3. - С. 93-97.

Особистий внесок здобувача - розроблено технологію детекції фузаріїв у зерні кукурудзи, засновану на ПЛР-ампліфікації специфічного для Fusarium spp. регіону генома.

14. Кожухова Н.Е. Ідентифікація локусів геному кукурудзи, що детермінують стійкість до фузаріозної гнилі / Н.Е. Кожухова, Ю.М. Сиволап, Б.Ф. Вареник // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. праць. - 2006. - Т. 3. - С. 113-117.

Особистий внесок здобувача - проведено оцінку ураженості F3-рослин кукурудзи фузаріозною гниллю, виявлено гомозиготні генотипи, проведено пошук поліморфних локусів між контрастними за стійкістю лініями, встановлено кореляції між алельним складом поліморфних локусів та ознакою стійкості.

15. Кожухова Н.Э. Базы данных по геномике растений // Вісник Харківського національного аграрного університету ім. В.В. Докучаєва. Серія «Біологія». - 2006. - Вып. 2, № 9. - С. 122-127.

16. Кожухова Н.Э. Молекулярные маркеры в генетико-селекционных исследованиях кукурузы / Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика. - 2006. - Т. 40, № 5. - С.82-93.

Особистий внесок здобувача - проаналізовано сучасний стан молекулярно-генетичних досліджень геному кукурудзи, показано необхідність використання в генетиці, селекції і насінництві кукурудзи новітньої ДНК-технології.

17. Кожухова Н.Е. Маркування локусів, що детермінують стійкість кукурудзи до фузаріозних гнилей / Н.Е. Кожухова, Ю.М. Сиволап, Б.Ф. Вареник [та ін.] // Цитология и генетика. - 2007. - Т. 41, № 2. - С. 37-41.

Особистий внесок здобувача - здійснено пошук локусів, поліморфних між інбредними лініями кукурудзи, з використанням 90 ПЛР-праймерів, генотипування рекомбінантів популяції F2, ДНК-маркування і картування локусу стійкості.

18. Кожухова Н.Е. Молекулярно-генетична ідентифікація мікотоксичних фузаріїв / Н.Е. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Одеський медичний журнал. - 2007. - Т. 104, № 6. - С. 54-56.

Особистий внесок здобувача - проведено ПЛР-аналіз об'єктів рослинного походження на ураженість фузаріумними грибами за генами токсиноутворення, розроблено ДНК-технологію детекції токсинопродукуючих грибів роду Fusarium як потенційних збудників мікотоксикозів людини.

19. Кожухова Н.Е. ДНК-маркер стійкості кукурудзи до фузаріозних гнилей та роль мобільних елементів в стійкості до фітопатогенів / Н.Е. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Вісник Одеського національного університету. - 2007. - Т. 12, вип. 5 (Біологія). - С. 148-156.

Особистий внесок здобувача - виявлено кодомінантний маркер RGA11 локусу, що відповідає за стійкість кукурудзи до Fusarium spp., локалізований на короткому плечі хромосоми 1 на відстані 18,3 сМ. Проведено секвенування 240 п.н.-алеля, характерного для стійких генотипів. Показаний можливий вплив мобільних елементів на прояв ознаки стійкості до фітопатогенів.

20. Захарова О.А. Генетическая вариабельность Fusarium moniliforme Sheldon, поражающего зерна кукурузы / О.А. Захарова, Б.Ф. Вареник, Н.Э. Кожухова Н.Э. [та ін.] // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб. наук. праць. - Київ, 2007. - Т. 1. - С. 40-44.

Особистий внесок здобувача - проведено ПЛР-аналіз штамів Fusarium moniliforme Sheldon, що виділено з насіння генотипів біло- і жовтозерної кукурудзи; здійнено кластерізацію штамів за даними молекулярно-генетичного поліморфізму.

21. Кожухова Н.Е. ПЛР-аналіз геному кукурудзи в рішенні селекційних задач / Н.Е. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Аграрний вісник Причорномор'я. - 2007. - Вип. 41. - С. 35-43.

Особистий внесок здобувача - досліджено молекулярно-генетичний поліморфізм геному кукурудзи з використанням маркерів, що генеруються в процесі полімеразної ланцюгової реакції, розроблено системи ПЛР-маркерів для вдосконалення селекційного процесу і насінництва кукурудзи.

22. Кожухова Н.Е. Система ДНК-маркерів для скринингу кукурудзи на стійкість до фузаріозної гнилі та наявність збудника / Н.Е. Кожухова,

Ю.М. Сиволап // Карантин і захист рослин. - 2008. - № 4. - С. 10-11.

Особистий внесок здобувача - проведено аналіз варіабельних і консервативних ділянок геномів кукурудзи і фузаріумних грибів у системі «фітопатоген - рослина-хазяїн», розроблено ДНК-технологію оцінки генотипів кукурудзи на стійкість до фузаріозної гнилі та тестування насіння, продуктів його переробки та ґрунту на наявність збудників цієї хвороби - грибів роду Fusarium.

23. Кожухова Н.Е. Молекулярно-генетичні маркери в рішенні теоретичних і практичних задач селекції кукурудзи // Вісник аграрної науки. - 2008. - № 4. - С. 49-53.

24. Кожухова Н.Е. ПЛР-маркери в розвитку теорії і практики селекції кукурудзи / Н.Е. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Науковий вісник Чернівецького університету. Серія: Біологія. - 2008. - Вип. 373. - С. 62-69.

Особистий внесок здобувача - проведено ПЛР-аналіз геному кукурудзи за високополіморфними регіонами, створено тест-панелі молекулярних маркерів для комплексно оцінки генотипів кукурудзи для контролю генетичної чистоту, визначення спорідненості, індивідуалізації ліній і гібридів, реєстрації їх у вигляді генетичних формул, скринінгу на наявність стійкості до фузаріозної гнилі, добору пар для високоврожайних схрещувань.

25. Кожухова Н.Е. ДНК-маркери в насінництві кукурудзи / Н.Е. Кожухова, О.О. Захарова // Зб. наук. праць Південного філіалу «Кримський Агротехнологічний Університет» НАУ. - 2008. - Вип. 107. - С. 142-144.

Особистий внесок здобувача - проаналізовано мікросателітні локуси генома кукурудзи за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. За даними ДНК-профілювання розроблено системи молекулярних маркерів для оцінки якості зерна кукурудзи та продуктів його переробки.

26. Деклараційний патент на винахід 62244А. Сиволап Ю.М., Кожухова Н.Е. Спосіб реєстрації генотипів кукурудзи. - Заявл. 07.02.2003; Опубл. 15.12.2003. - Бюл. № 12. - 3 с.

Особистий внесок здобувача - розроблено спосіб реєстрації генотипів кукурудзи у вигляді генетичних формул, що включає етапи відбору зразків, виділення ДНК, ПЛР-ампліфікації, гель-електрофорезу, документування результатів.

27. Деклараційний патент на винахід 65839. Сиволап Ю.М.,Кожухова Н.Е. Спосіб встановлення типовості інбредних ліній кукурудзи. - Заявл. 09.06.2003; Опубл. 15.04.2004. - Бюл. № 4. - 3 с.

Особистий внесок здобувача - проаналізовано інбредні лінії кукурудзи за мікросателітними локусами, добрано тест-панель молекулярних маркерів для оцінки генетичної чистоти ліній кукурудзи.

28. Деклараційний патент на винахід 68814A. Сиволап Ю.М.,Кожухова Н.Е. Спосіб встановлення рівня гібридності у простих (міжлінійних) гібридів кукурудзи. - Заявл. 30.10.2003; Опубл. 16.08.2004. - Бюл. № 8. - 3 с.

Особистий внесок здобувача - розроблено спосіб оцінки рівня гібридності простих гібридів кукурудзи за дослідженням молекулярно-генетичного поліморфізму мікросателітних локусів.

29. Деклараційний патент на корисну модель 7146. Сиволап Ю.М., Кожухова Н.Е. Спосіб прогнозування гетерозису врожаю зерна простих гібридів кукурудзи. - Заявл. 14.09.2004; Опубл. 15.06.2005. - Бюл. № 6. - 4 с.

Особистий внесок здобувача - проаналізовано інбредні лінії кукурудзи за допомогою довільно праймованої і SSR-ПЛР, проведено кореляційний аналіз значень генетичних дистанцій між лініями, одержаних за ПЛР-даними, алельного складу мікросателітних локусів і рівня гетерозису відповідних простих гібридів.

30. Патент на корисну модель № 17730. Захарова О.О., Кожухова Н.Е., Сиволап Ю.М. Спосіб експрес-детекції Fusarium moniliforme Sheldon var. lactis (Pirotta et Riboni) Bilai у зерні кукурудзи. Заявл. 31.03.2006.; Опубл. 16.10.2006. - Бюл. № 10. - 6 с.

Особистий внесок здобувача - розроблено ДНК-технологію детекції Fusarium moniliforme Sheldon var. lactis в зерні кукурудзи, що включає виділення ДНК, ПЛР-ампліфікацію видоспецифічного регіону.

31. Ідентифікація і реєстрація генотипів м'якої пшениці (Triticum aestivum L.), ячменю (Hordeum vulgare L.), кукурудзи (Zea mays L.), соняшника (Helianthus annuus L.) за допомогою аналізу мікросателітних локусів / Ю.М. Сиволап, В.В.Волкодав, Н.Е. Кожухова [та ін.] // Методичні рекомендації. - Одеса, 2004. - 14 с.

Особистий внесок здобувача - розроблено систему реєстрації генотипів кукурудзи, що включає тестування генетичної однорідності зразків, генотипування за 20 мікросателітними локусами, фіксацію алельного складу SSR-локусів у вигляді генетичної формули.

32. Сиволап Ю.М. Оцінка генотипів кукурудзи (Zea mays L.) на стійкість до коренево-стеблевої гнилі (збудник Fusarium moniliforme Sheldon) / Ю.М. Сиволап, Н.Е. Кожухова // Методичні рекомендації. - Одеса, 2007. - 8 с.

Особистий внесок здобувача - розроблено систему скринінгу генотипів кукурудзи на наявність стійкості до фузаріозної гнилі, що включає етапи виділення ДНК, ПЛР-ампліфікації за маркером стійкості та детекції певних фрагментів ампліфікації.

33. Сиволап Ю.М. Молекулярно-генетична детекція грибів роду Fusarium у зерні кукурудзи (Zea mays L.) / Ю.М. Сиволап, Н.Е. Кожухова, О.О. Захарова // Методичні рекомендації. - Одеса, 2007. - 8 с.

Особистий внесок здобувача - обґрунтовано принципи молекулярно-генетичної детекції фузаріумних грибів за допомогою ПЛР-аналізу родо- і видоспецифічних ділянок геномів.

34. Кожухова Н.Э. Идентификация генотипов кукурузы с помощью SSR-маркеров / Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология: Междунар. симпозиум. Минск, Беларусь, 22-24 ноября 2001 г. - Минск, 2001. - С. 78-79.

Особистий внесок здобувача - досліджено мікросателітні локуси в вибірці інбредних ліній і простих гібридів, порівняно їх алельний склад, розраховано вірогідність виключення небатьківських форм при визначенні гібридності.

35. Kozhukhova N. Maize genotypes differentiation, identification and registration by SSR-markers / N. Kozhukhova, Yu. Sivolap // Application of Molecular Markers in Studies on Plants: International Workshop, Warsaw, Polska, 25-29 September 2002. - Warsaw, 2002. - P. 54.

Особистий внесок здобувача - добрано панель мікросателітних маркерів для диференціації і ідентифікації генотипів кукурудзи, проведено генотипування ліній і гібридів кукурудзи.

36. Кожухова Н.Э. SSR-маркеры в исследованиях молекулярно-генетического полиморфизма кукурузы (Zea mays L.) / Н.Э. Кожухова,Ю.М. Сиволап // Генетическая инженерия и современные биотехнологии: II Междунар. симпозиум, Кишинэу, Молдова, 24-25 октября 2002 г. - Кишинэу, 2002. - С. 54-59.

Особистий внесок здобувача - проведено мікросателітний аналіз генотипів кукурудзи, протестовано гібридність простих гібридів кукурудзи, оцінено генетичну однорідність вихідного рослинного матеріалу.

37. Дерев'янко О.О. ПЛР-аналіз молекулярно-генетичної різноманітності популяції грибів Fusarium moniliforme var. lactis / О.О. Дерев'янко, Н.Е. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Засади сталого розвитку аграрної галузі: Всеукр. конференція молодих вчених, Київ, Україна, 28-30 жовтня 2002 р. - Київ, 2002. - С. 63-64.

Особистий внесок здобувача - досліджено молекулярно-генетичний внутрішньовидовий поліморфізм Fusarium moniliforme var. lactis за допомогою довільно праймованої ПЛР, проведено кластерний аналіз.

38. Kozhuhova N. Maize genotypes PCR-analysis for some genetics and breeding purposes / N. Kozhuhova, D. Trebelski, Yu. Sivolap // Plant and Animal Genome XI: The International Conference on the Status of Plant and Animal Genome Research, San-Diego, USA, 11-15 January 2003. - San-Diego, 2003. - P. 183.

Особистий внесок здобувача - оптимізовано умови проведення ПЛР-аналізу, здійснено добір праймерів, проведено генотипування ліній і гібридів кукурудзи.

39. Кожухова Н.Э. Оптимизация условий выделения высокомолекулярной ДНК из мицелия грибов рода Fusarium / Н.Э. Кожухова, А.В. Ямборко, В.Г. Ефименко // Биоразнообразие. Экология. Эволюция. Адаптация: Юбилейная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященная 180-летию со дня рождения Л.С. Ценковского, Одесса, Украина, 28 марта -1 апреля 2003 г. - Одесса, 2003. - С. 61.

Особистий внесок здобувача - здійснено добір умов виділення ДНК із міцелію (кількість вихідного матеріалу, склад буфера, що лізує, час і температура інкубації), оцінено якість і кількість виділеної ДНК і її придатність для подальшого ПЛР-аналізу.

40. Деревянко О.А. Анализ молекулярно-генетического полиморфизма грибов рода Fusarium / О.А. Деревянко, Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений: II Междунар. конференция молодых ученых, Харьков, Украина, 19-23 мая 2003 г. - Харьков, 2003. - С. 26-27.

Особистий внесок здобувача - оптимізовано умови ПЛР-аналізу, проведено пошук видоспецифічних фрагментів ампліфікації, вивчено міжвидовий поліморфізм, розраховано генетичні дистанції.

41. Кожухова Н.Э. Перспективы ПЦР-анализа в гетерозисной селекции кукурузы / Н.Э. Кожухова, Е.В. Гудыменко, Ю.М. Сиволап [та ін.] // Геном растений: IV Междунар. конференция, Одесса, Украина, 10-13 июня 2003 г. - Одесс а, 2003. - С. 19.

Особистий внесок здобувача - перевірено генетичну однорідність рослинного матеріалу, проведено генотипування інбредних ліній кукурудзи, розраховано генетичні дистанції.

42. Кожухова Н.Э. ПЦР-маркеры для исследования молекулярно-генетического полиморфизма кукурузы / Н.Э. Кожухова, Д.Ю. Требельский, Ю.М. Сиволап // Актуальные проблемы генетики: II конференция Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова, посвященная 115-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова, Москва, Россия, 20-21 февраля 2003 г. - Москва, 2003. - Т. 2. - С. 138-139.

Особистий внесок здобувача - досліджено генетичну різноманітність 60 інбредних ліній кукурудзи на внутрішньовидовому рівні, здійснено кластерний аналіз, проведено порівняння з даними педігрі і належності до гетерозисних груп.

43. Кожухова Н.Э. Прогнозирующий потенциал ПЦР-маркеров в гетерозисной селекции кукурузы / Н.Э. Кожухова, Б.Ф. Вареник, Ю.М. Сиволап // Молекулярная генетика, геномика и биотехнология: Междунар. научная конференция, Минск, Беларусь, 24-26 ноября 2004 г. - Минск, 2004. - С. 74-76.

Особистий внесок здобувача - проведено диференціацію інбредних ліній кукурудзи, розраховано генетичні дистанції, визначено показники врожайності простих гібридів, оцінено зв'язок між даними ПЛР-аналізу і рівнем гетерозису.

44. Sivolap Y. DNA-technology in plant production improvement / Yu. Sivolap, A. Brick, N. Khozhukhova [et al.] // Agriculture and Natural Resources: IV International Iran and Russia Conference, ShahreKord, Iran, 8-10 September 2004. - 2004. - P. 70-71.

Особистий внесок здобувача - проаналізовано можливості і перспективи розроблених ДНК-технологій для підвищення ефективності селекційного процесу кукурудзи.

45. Ефименко В.Г. ДНК-типирование линий и гибридов кукурузы для идентификации генофонда кукурузы в Украине / В.Г. Ефименко, Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Генетические ресурсы для адаптивного растениеводства: мобилизация, инвентаризация, сохранение, использование: Междунар. научно-практическая конференция, Оброшино, Украина, 29 июня - 1 июля 2005 г. - Оброшино, 2005. - С. 243-244.

Особистий внесок здобувача - проведено генотипування інбредних ліній і гібридів кукурудзи двох вітчизняних центрів селекції і світової селекції, складено генетичні формули.

46. Ефименко В.Г. Корреляционный анализ аллельного состава SSR-локусов генотипов кукурузы и их принадлежости к гетерозисным группам / В.Г. Ефименко, Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Современные проблемы генетики: Междунар. научная конференция (к 40-летию Института генетики и цитологии НАН Беларуси), Минск, Беларусь, 17-18 ноября 2005 г. - Минск, 2005. - С. 86.

Особистий внесок здобувача - проведено генотипування інбредних ліній кукурудзи, здійснено порівняльний аналіз алельного складу мікросателітних локусів і належності до гетерозисних груп.

47. Cлищук Г.И. Молекулярно-генетические взаимоотношения грибов вида Fusarium moniliforme Sheld. с растением-хозяином Zea mays L. / Г.И. Cлищук, Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Мікробні біотехнології: Міжнар. наук. конференція, присвячена 140-річчю з дня народження д.к. заболотного, Одеса, Україна, 11-15 вересня 2006 р. - Одеса, 2006. - С. 25.

Особистий внесок здобувача - перевірено генетичну чистоту ліній кукурудзи, проведено ПЛР-аналіз поліморфізму ліній кукурудзи за локусами структури ендосперму.

48. Деревянко О.А. Молекулярно-генетическая характеристика популяций fusarium южного региона Украины / О.А. Деревянко, Г.Д. Попелюк, Н.Э. Кожухова [и др.] // 10 Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН, Пущино, Россия,17-21 апреля 2006 г. - Пущино, 2006. - С. 15.

Особистий внесок здобувача - проведено ПЛР-аналіз міжвидового, внутрішньовидового і внутрішньоштамового поліморфізму Fusarium, виявлено зміни ДНК-спектру клонів штамів залежно від ступеня стійкості рослини-господаря.

49. Кожухова Н.Э. Роль мобильных элементов в устойчивости к фитопатогенам / Н.Э. Кожухова, Ю.М. Сиволап // Актуальні проблеми імунітету та захисту сільськогосподарських культур від хвороб і шкідників: Міжнар. науково-практична конференція, Одеса, Україна, 11-14 вересня 2007 р. - Одеса, 2007. - С. 35-36.

Особистий внесок здобувача - проведено секвенування ампліфікованого алеля маркера стійкості до фузаріозної гнилі та порівняно з даними секвенування геному кукурудзи в електронній базі даних, показано гомологію з ретротранспозоном Grande.

АНОТАЦІЯ

Кожухова Н.Е. Молекулярні маркери в дослідженні геному кукурудзи (Zea mays L.). - Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня доктора бiологiчних наук за спецiальнiстю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Iнститут молекулярної бiологiї та генетики НАН України, Київ, 2008.

Дисертація містить теоретичний та експериментальний матеріал з аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму геному кукурудзи, розробки маркерних систем та використання їх в генетико-селекційних дослідженнях кукурудзи. Проаналізовано алельний склад SSR-локусів генотипів кукурудзи вітчизняної і світової селекції, створено тест-панель 20 маркерів з високою дискримінаційною здатністю. Оцінено генетичну чистоту ліній і гібридів кукурудзи за даними маркерами. Проведено диференціацію, ідентифікацію та реєстрацію у вигляді генетичних формул генотипів. Створено базу даних ДНК-типування ліній і гібридів кукурудзи, що культивуються в Україні. Проаналізовано кореляції значень генетичних дистанцій між лініями за даними ДНК-типування і рівня гетерозису відповідних гібридів. Встановлено алельний склад SSR-локусів у ліній і гібридів і складені модельні формули, пов'язані з комбінаційною здатністю ліній.

Марковано і картовано на хромосомі 1 кукурудзи локус, що відповідає за стійкість до фузаріозної гнилі. Розроблено STS-маркер RGA11 на відстані 18,3 cM для використання в селекції при доборі стійких генотипів кукурудзи.

Ключові слова: поліморфізм, геном, ДНК-маркери, кукурудза.

АННОТАЦИЯ

Кожухова Н.Э. Молекулярные маркеры в исследовании генома кукурузы (Zea mays L.). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация содержит теоретический и экспериментальный материал по анализу молекулярно-генетического полиморфизма разных регионов генома кукурузы (локусов, содержащих микросателлитные повторы, участков между SSR-повторами, анонимных последовательностей) и разработке на его основе ДНК-маркеров, генерируемых в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР), для их использования в генетико-селекционных исследованиях кукурузы.

Отработаны этапы проведения ДНК-типирования генотипов кукурузы, включающие выделение ДНК из различных биологических объектов (проростки, зерно, листья), подбор праймеров, амплификацию с помощью полимеразной цепной реакции, электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК в агарозных и полиакриламидных гелях, статистическую обработку результатов и их документирование.

Оценены показатели дискриминационной силы и параметры информативности 22 микросателлитных локусов, позволившие создать тест-панель 20 SSR-локусов с высоким дискриминационным потенциалом, перспективную для проведения идентификации и регистрации генотипов, тестирования генетической чистоты инбредных линий и гибридов.

Показано, что для инбредных линий характерно гомозиготное состояние проанализированных микросателлитных локусов, тогда как для простых гибридов отмечено как гомо-, так и гетерозиготное состояние SSR-локусов. По аллельному составу микросателлитных локусов оценена генетическая чистота 80 генотипов кукурузы, показавшая гомозиготность линий и однородность простых гибридов.

По результатам микросателлитного анализа, позволившего провести дифференциацию и идентификацию 80 линий и гибридов кукурузы, выявлены наборы аллелей, индивидуальные (уникальные) для каждого генотипа.

Впервые предложено фиксирование генотипа кукурузы в виде генетических (буквенно-цифровых) формул, отражающих аллельный состав микросателлитных локусов. Создана электронная база данных ДНК-типирования линий и гибридов кукурузы, пригодных для распространения в Украине, включающая генетические формулы, информацию о локусах, их хромосомной локализации, количестве и длине аллелей, частоте их встречаемости, условиях проведения ПЦР-анализа и позволяющая осуществлять хранение, пополнение и сравнение результатов как в направлении генотипов, так и в направлении анализируемых локусов.

Выявлена статистически достоверная корреляция между значениями генетических дистанций в наборе инбредных линий, использованных для скрещивания по диаллельной схеме, и уровнем гетерозиса соответствующих простых гибридов. Получена достоверная корреляционная связь аллельного состава микросателлитных локусов инбредных линий и уровнем их комбинационной способности. Разработана ДНК-технология прогнозирования уровня гетерозиса простых гибридов кукурузы по значениям генетических дистанций между родительскими формами и аллельному составу микросателлитных локусов.

Изучен внутривидовой молекулярно-генетический полиморфизм Fusarium moniliforme как представителя наиболее вредоносных грибов для кукурузы. Анализ различных регионов генома показал 96 % уровень полиморфизма данного вида грибов, что свидетельствует о высокой степени приспосабливаемости патогена как к различным условиям окружающей среды, так и различным по степени устойчивости растениям-хозяевам. Кластеризация отличающих уровнем патогенности штаммов F. moniliforme по значениям генетических дистанций, рассчитанным по данным ПЦР-анализа, совпала с группировкой по уровню патогенности.

Проанализированы геномные регионы, специфичные для рода Fusarium и вида F. moniliforme. Разработана ДНК-технология детекции зараженности зерна кукурузы грибами рода Fusarium, показана высокая чувствительность и специфичность тест-системы.

Выявлен кодоминантный ДНК-маркер RGA11 к локусу, отвечающему за устойчивость кукурузы к фузариозной гнили, вызываемой F. moniliforme, на расстоянии 18,3 сМ. Провели секвенирование аллеля локуса RGA11 длиной 240 п.н., который маркирует устойчивые генотипы. Определили, что нуклеотидная последовательность 240 п.н.-RGA11-аллеля является комплементарной ретротранспозону Grande (ZDGRANDE1).

Полученная информация о структуре генома кукурузы использована для разработки систем молекулярных маркеров для применения в генетико-селекционных исследованиях кукурузы. Продемонстрирована универсальность и комплексность разработанных маркерных систем для оценки генотипа как с точки зрения его уникальности, так и пригодности для практического использования. Показана роль молекулярных маркеров в генетической характеристике генотипа и их особенности для решения различных задач генетики, селекции и семеноводства кукурузы.

Ключевые слова: полиморфизм, геном, ДНК-маркеры, кукуруза.

SUMMARY

Kozhukhova N. Molecular markers in maize (Zea mays L.) genome research. - Manuscript.

Тhesis for scientific degree of Doctor of biological sciences, speciality 03.00.22 - molecular genetics. - Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2008.

The dissertation contains theoretical and experimental material on molecular-genetic polymorphism analysis of maize genome, development of marker systems and usage them in maize genetics and plant-breeding researches. Analysis of SSR-loci allelic composition for maize genotypes of Ukrainian and world breeding was realized, 20 SSR-markers test-panel with high discriminatory ability was created. Verification of lines and hybrids genetic purity by these markers was carried out. Differentiation, authentication and registration as genetic formulas of maize genotypes were conducted. DNA-typing database of lines and hybrids cultivated in Ukraine was created. Correlations of genetic distances values between lines on DNA-typing data and heterosis level of proper hybrids were analyzed. SSR-loci allelic composition of lines and hybrids were defined and models formulas related to combination ability of lines were formed.

Locus of resistance to fusarium rot was marked and located on maize chromosome 1. STS-marker RGA11 on 18,3 cM distance is developed for using in breeding for selection of maize resistant genotypes.

Keywords: polymorphism, genome, DNA-markers, maize.

Размещено на Allbest.ru

...