Особенности регуляции экспрессии генов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Регуляция экспрессии генов

1. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот

Регуляция транскрипции в клетках осуществляется на уровне индивидуальных генов, их блоков и даже целых хромосом. Возможность управления многими генами, как правило, обеспечивается наличием у них общих регуляторных последовательностей нуклеотидов, с которыми взаимодействуют однотипные факторы транскрипции. В ответ на действие специфических эффекторов такие факторы приобретают способность с высокой точностью связываться с регуляторными последовательностями генов. Следствием этого является ослабление или усиление транскрипции (репрессия или активация) соответствующих генов.

Три основных этапа транскрипции - инициация, элонгация и терминация, используются бактериальными клетками для регуляции синтеза РНК. То же, по-видимому, характерно и для остальных живых организмов. Ниже приведены примеры регуляторных воздействий на транскрипцию.

1.1 Регуляция на уровне инициации транскрипции

Активность многих генов прокариот регулируется с помощью белковых факторов, взаимодействующих с регуляторными участками промоторов генов. При этом происходят как активация транскрипции генов, так и подавление считывания генетической информации РНК-полимеразами. В первом случае регуляторные белковые факторы называют активаторами, осуществляющими позитивную регуляцию транскрипции, а во втором - репрессорами. Регуляцию, связанную с подавлением транскрипции, называют негативной.

Механизмы, при помощи которых активаторы стимулируют инициацию транскрипции, могут быть рассмотрены с двух точек зрения - кинетической и структурной. Поскольку активация промоторов путем образования открытых комплексов является лимитирующей стадией на пути активации транскрипции в целом, действие различных активаторов может быть охарактеризовано по изменению (увеличению) значений кинетических параметров реакций, происходящих на разных этапах активации. Так, при действии активирующего комплекса Crp-cAMP на lac-промотор происходит десятикратное увеличение равновесной константы ассоциации K_B РНК-полимеразы с промотором с образованием закрытого комплекса. Активация промотора P_RM фага л, опосредованная cI-белком, характеризуется пяти-десятикратным увеличением константы скорости k_f перехода закрытых комплексов в открытые. Активирующее действие белка л-cII на промотор Р_RE сопровождается изменением обоих вышеупомянутых кинетических параметров. Активация транскрипции может быть также опосредована увеличением скорости освобождения промотора РНК-полимеразой после инициации синтеза РНК.

Многие активаторы транскрипции, в том числе и Crp-cAMP, сгибают молекулу ДНК после взаимодействия с ней, причем центр такого изгиба находится в сайте связывания активатора. Однако с использованием мутантных белков было установлено, что изгибание ДНК и связывание активаторов с ДНК как таковое еще не обеспечивают активацию транскрипции. В большинстве случаев абсолютно необходимым условием активации является наличие контакта между специфическими областями поверхностей молекул активатора и РНК-полимеразы, часто с ее б-субъединицами. Важным следствием образования контактов между активаторами и холоферментом РНК-полимеразы является часто наблюдаемый синергизм в связывании обоих белков с соответствующими промоторами. При этом мутации в сайтах связывания активаторов или промоторе как таковом могут предотвращать активацию транскрипции путем изменения конформации молекулы связанного активатора или контактного участка на РНК-полимеразе.

Последовательности нуклеотидов промоторных участков генов, с которыми взаимодействуют молекулы репрессора, получили название операторов. Во многих случаях репрессор связывается с оператором только в присутствии низкомолекулярного лиганда, специфически взаимодействующего с репрессором. Такие низкомолекулярные эффекторы получили название корепрессоров. Они часто требуются и для функционирования белков-активаторов транскрипции. Простейший механизм репрессии заключается в стерическом блокировании связывания РНК-полимеразы с промотором. Это происходит в том случае, если последовательности нуклеотидов мест посадки РНК-полимеразы на промотор и репрессора на оператор перекрываются. Некоторые бактериальные белки-репрессоры могут оказывать свое негативное действие на этапы инициации, происходящие после связывания РНК-полимеразы с промотором. Например, молекулы репрессора gal-оперона E. coli, связавшиеся с операторами O_E и O_I, центры последовательностей которых расположены соответственно на расстояниях -60,5 и +53,5 по отношению к точке инициации транскрипции, вызывают образование петли участка ДНК, заключенного между ними, но не препятствуют взаимодействию РНК-полимеразы с промотором. Они оказывают свое действие на последующие этапы инициации, предшествующие образованию первой фосфодиэфирной связи. В том случае, если лишь одна молекула репрессора связывается с внешним оператором O_E, он частично ингибирует транскрипцию путем взаимодействия с б-субъединицей РНК-полимеразы. Это сопровождается понижением уровня, но не полным прекращением синтеза РНК gal-оперона, т.е. более тонким изменением уровня экспрессии соответствующих генов.

Распространенным механизмом активации транскрипции с помощью белков-активаторов является облегчение ее инициации РНК-полимеразой после образования контакта между ферментом и белком-активатором, связанными с регуляторной областью промотора, что сопровождается конформационными изменениями РНК-полимеразы. У бактерий имеются белки-регуляторы, обладающие активностью как репрессора, так и активатора транскрипции. Такими "амфотерными" свойствами обладает, в частности, репрессор cI фага л. Белок-активатор катаболитных оперонов (Crp-белок) активирует транскрипцию бактериальных генов, продукты которых участвуют в расщеплении (катаболизме) различных органических соединений (преимущественно сахаров), используемых растущей бактериальной клеткой в качестве источника углерода. Свои свойства активатора Crp-белок приобретает лишь в комплексе с циклическим AMP (сAMP). Внутриклеточная концентрация сAMP возрастает у бактерий, растущих на бедных питательных средах, и понижается в условиях избытка легко усвояемых источников углерода, например глюкозы. Поэтому система Crp-сAMP обеспечивает включение экспрессии катаболитных оперонов лишь на бедных питательных средах. Crp-белок может выступать и в роли репрессора транскрипции генов галактозного оперона E. coli. Если все гены катаболитных оперонов активируются Crp-белком в присутствии сAMP, то негативная регуляция их транскрипции происходит индивидуально. Хорошо известными примерами такого рода являются регуляции транскрипции lac-оперона E. coli под действием Lac-репрессора, а также галактозного и арабинозного оперонов специфическими белками-репрессорами этих оперонов.

Низкомолекулярные эффекторы могут изменять активность РНК-полимеразы не только опосредованно через белки-регуляторы, но и непосредственно при взаимодействии с ферментом. С помощью гуанозинтетрафосфата (ppGpp) в клетках E. coli осуществляется координация экспрессии генов рибосомных РНК (рРНК) и белков. Этот необычный нуклеотид (известный также под названием "магического пятна") синтезируется бактериальными клетками в условиях внутриклеточного недостатка аминокислот, что приводит к значительному снижению интенсивности транскрипции генов рРНК и белков и одновременной стимуляции синтеза РНК оперонов, контролирующих биосинтез аминокислот. В присутствии ppGpp очищенная РНК-полимераза прекращает синтез рРНК с одного из двух промоторов этих оперонов, что приводит к ослаблению, но не полному прекращению их транскрипции. Известны мутации, локализованные в гене в-субъединицы РНК-полимеразы E. coli, приводящие к прекращению влияния ppGpp на синтез РНК, что подтверждает наличие непосредственного контакта между нуклеотидом и ферментом в процессе транскрипции.

Некоторые регуляторные элементы бактерий, участвующие в активации транскрипции, так же как и энхансеры эукариот, могут располагаться на большом расстоянии (нескольких сотен нуклеотидов) от промоторов, на которые они оказывают свое действие. В этом случае контакт активатора с РНК-полимеразой обеспечивается благодаря выпетливанию участка ДНК, расположенного между данными регуляторными элементами, что приводит к пространственному сближению двух белков. Прямое доказательство образования таких петель на ДНК E. coli было, в частности получено с помощью электронной микроскопии для белков NtrC и NifA, действующих соответственно на промоторы генов glnA и nifH. Другим путем достижения белком-активатором молекулы РНК-полимеразы на удаленном промоторе (например промоторе поздних генов бактериофага Т4) является его перемещение вдоль отрезка ДНК, разделяющего эти два регуляторных элемента. Процесс такого перемещения может быть инициирован последовательностями нуклеотидов, расположенными выше или ниже промотора на расстоянии нескольких сотен пар оснований.

Одним из давно обсуждающихся вопросов является необходимость изменения структуры ДНК в окрестностях промоторов под действием белков-активаторов для активации транскрипции. В ряде случаев такие доказательства были получены. Так, в mer-локусе E. coli, обеспечивающем устойчивость бактериальных клеток к ионам ртути, связывание Mer-белка с регуляторным участком промотора (merT) в присутствии ртути сопровождается раскручиванием спирали ДНК в районе промотора на ~ 50°. Это приводит к образованию правильного расстояния между сайтами связывания активатора и промотором, так как первый расположен необычно - между нуклеотидами в положениях -35 и -10 промотора. Без такого изменения структуры ДНК связавшийся с ним активатор не может образовать правильного контакта с РНК-полимеразой.

В заключение следует еще раз подчеркнуть, что у активируемых бактериальных промоторов образование открытых комплексов в отсутствие активаторов является лимитирующей стадией при инициации транскрипции. Первичная структура активируемых промоторов весьма слабо соответствует каноническим структурам. При этом мутации, обеспечивающие функционирование таких промоторов без активации, увеличивают скорость образования открытых комплексов РНК-полимеразой.

1.2 Регуляция синтеза РНК на уровне элонгации и терминации

Выше было отмечено, что РНК-полимераза в процессе элонгации цепей РНК перемещается неравномерно вдоль матричной ДНК и во время ее движения имеют место остановки (паузы). Время задержки молекул РНК-полимеразы в определенных участках транскрибируемых генов меняется под воздействием различных белковых факторов. При этом эффективность транскрипции соответствующих фрагментов ДНК зависит от последовательностей нуклеотидов, окружающих транскрибируемые участки генов.

Основная регуляторная роль терминаторов транскрипции заключается в прекращении синтеза РНК на границе гена и освобождении полученной РНК из транскрипционного комплекса. Однако терминаторы встречаются не только на границах одиночных генов, но и в конце генов, входящих в состав оперонов. Эффективность терминации транскрипции на таких внутренних терминаторах может регулироваться, что сопровождается изменением скорости синтеза РНК на последовательностях нуклеотидов оперонов, расположенных за терминаторами.

Функционирование аттенюаторов - регулируемых терминаторов транскрипции бактерий сопряжено с синтезом лидерного пептида рибосомами. Этот тип регуляции используется грамотрицательными бактериями для изменения уровня транскрипции многих оперонов, контролирующих биосинтез аминокислот. Как уже упоминалось, отличительной чертой такого типа регуляции является образование альтернативных вторичных структур РНК, которые формируются под влиянием рибосом, прекращающих трансляцию на кодонах аминокислот, которые клеткам необходимо синтезировать. В дополнение к этому, как прокариоты, так и эукариоты обладают способностью реагировать на многие внеклеточные и внутриклеточные процессы изменением скорости элонгации транскриптов.

Влияние условий роста бактериальных клеток на элонгацию цепей РНК.

Механизмы преждевременной терминации транскрипции и антитерминации интенсивно используются бактериями для регуляции внутриклеточного метаболизма при изменении условий роста клеток. В частности, скорости синтеза рРНК и тРНК строго координированы со скоростью роста, и наоборот, число делений клеток в единицу времени прямо зависит от скорости транскрипции соответствующих оперонов. Совокупность событий, развивающихся у бактерий в ответ на изменение скорости их роста, например при изменении содержания питательных веществ в среде, получила название строгого ответа (stringent response). Первичной сигнальной молекулой строгого ответа является гуанозинтетрафосфат - ppGpp, который уменьшает скорость элонгации РНК-полимеразой и вызывает преждевременную терминацию транскрипции в rrnB-опероне.

Транскрипция оперонов рибосомных белков также контролируется на уровне элонгации. В частности, у E. coli транскрипция оперона, кодирующего рибосомный белок S10 и десять других рибосомных белков, контролируется через задержку транскрипции, для реализации которой используется продукт третьего гена оперона - рибосомный белок L4. Этот белок взаимодействует со шпилькой синтезируемой РНК, вызывая преждевременную терминацию транскрипции в лидерном участке гена S10 - первом гене оперона. В отличие от классической аттенюации альтернативные вторичные структуры РНК в этом случае не являются причиной изменения эффективности транскрипции соответствующего участка ДНК. Белок L4 связывается со шпилькой на 70-80 нуклеотидов выше сайта терминации транскрипции. Шпилька в синтезируемой РНК образуется выше сайта терминации независимо от присутствия белка L4, однако без него молекула РНК-полимеразы не замечает сигнала терминации транскрипции. Этот механизм предотвращает накопление в клетке свободных рибосомных белков, не включившихся в состав рибосомных субчастиц.

Транскрипция оперона биосинтеза пиримидинов у E. coli регулируется как на уровне элонгации, так и на этапе освобождения промотора. Первый тип регуляции является еще одним примером классической аттенюации, тогда как во втором случае реализуется нетривиальный механизм. Оперон индуцируется в присутствии низких внутриклеточных концентраций UTP. При повышении ее содержания транскрипционный комплекс продолжает эффективно формироваться на промоторе, однако во время инициации РНК-полимераза начинает реитеративный синтез гомополимера. Синтезируются длинные цепи поли(U), а в продуктивную фазу синтеза РНК фермент не вступает, потому что не может покинуть промотор. Недавно тот же механизм контроля был описан для оперона codBA E. coli. По мнению М. Чамберлина (1997 г.) аналогичный механизм может функционировать и у эукариот.

В отличие от только что рассмотренного механизма контроля пиримидинового оперона регуляция транскрипции оперона purB E. Coli осуществляется на уровне элонгации РНК с помощью пуринового репрессора - ДНК-связывающего белка, взаимодействующего со специфической последовательностью нуклеотидов. Оперон purB является одним из девяти pur-оперонов, и два других гена также контролируются пуриновым репрессором. Однако только в опероне purB репрессор взаимодействует с ДНК значительно ниже сайта инициации транскрипции и создает препятствие элонгирующей РНК-полимеразе. Этот эффект не зависит от purB-промотора и не сопряжен с трансляцией.

У B. subtilis регуляция транскрипции оперонов биосинтеза пуринов и пиримидинов также связана с задержкой синтеза РНК, однако используемый при этом механизм отличается от такового у E. coli. В этом случае первичными регуляторами транскрипции являются уже не рибосомы, а новые белки, которые распознают другие элементы вторичной структуры РНК. В частности, было предсказано образование альтернативных шпилек в РНК пуринового оперона под действием РНК-связывающего белка, ассоциированного с гуанином. Реализуемый механизм оказался аналогичным механизму репрессии биосинтеза триптофана.

Из общих соображений можно предположить, что биосинтез предшественников РНК, необходимых для синтеза пуринов и пиримидинов, должен оказывать прямое влияние на транскрипцию через изменение уровней соответствующих нуклеотидов. Действительно, у дрожжей, дефектных по фактору элонгации EFIIS, стимулирующему элонгацию РНК у эукариот, наблюдается повышенная чувствительность к 6-азаурацилу, который уменьшает внутриклеточный пул GTP и UTP. К такому же фенотипу приводили и некоторые мутационные изменения субъединиц РНК-полимеразы II S. cerevisiae. Для некоторых, хотя и не для всех мутантных РНК-полимераз этого типа, были характерны нарушения в элонгации транскриптов или взаимодействии с факторами элонгации in vitro. Все это еще раз указывает на универсальный характер тонкой координации в клетках метаболизма нуклеотидов и синтеза РНК.

Регуляция транскрипции не всех бактериальных оперонов биосинтеза аминокислот у бактерий следует сценарию аттенюации, характерному для trp-, his-, leu- и ilv-оперонов E. coli. В частности, транскрипция trp-оперона B. Subtilis также регулируется на уровне элонгации, однако в этом случае в регуляции участвует РНК-связывающий белок TRAP, который, кроме того, взаимодействует с триптофаном. После образования комплекса с триптофаном белок TRAP приобретает способность связываться с РНК оперона в ее лидерном участке. Такое взаимодействие модифицирует вторичную структуру РНК, что способствует терминации транскрипции. Более того, белок TRAP может оказывать негативное влияние на трансляцию полицистронной мРНК оперона при повышении внутриклеточного содержания триптофана. В отличие от E. coli на процесс транскрипции trp-оперона у B. subtilis рибосомы не оказывают прямого влияния.

Сопряжение транскрипции и репарации ДНК

Многие повреждения ДНК вызывают прекращение элонгации транскриптов у бактерий и эукариот, вызывая переход элонгирующего транскрипционного комплекса в неактивное состояние. При этом преимущественно репарируются транскрибируемые цепи ДНК. Обнаружены белковые факторы, осуществляющие сопряжение транскрипции с репаративным синтезом ДНК. В частности, бактериальный белковый комплекс UvrAB, участвующий в репаративной эксцизии (вырезании) нуклеотидов может непосредственно взаимодействовать с в-субъединицей РНК-полимеразы, а также с одноцепочечными участками ДНК в составе открытых промоторных и тройных элонгирующих комплексов. У E. coli некоторые из этих воздействий обеспечивают контакты между молекулами РНК-полимеразы, прекратившей элонгацию цепей РНК, и репарирующим комплексом, который с помощью фактора, сопрягающего транскрипцию и репарацию, выводит элонгирующий комплекс из состояния прекращения транскрипции. Не все повреждения ДНК оказывают влияние на элонгацию транскриптов РНК-полимеразой. Например, РНК-полимеразы как фага SP6, так и E. coli эффективно преодолевают в ДНК бреши, не содержащие азотистых оснований. При прохождении таких участков ДНК молекулы РНК-полимераз обычно включают остатки AMP в элонгируемую РНК независимо от матрицы.

Контроль элонгации РНК у бактериофагов

Во время вирусной инфекции размножающиеся вирусы овладевают контролем над экспрессией генов клетки-хозяина и используют ее для своих собственных нужд, что является общим свойством всех внутриклеточных паразитов и симбионтов. Многие из бактериофагов осуществляют контроль транскрипции на уровне элонгации.

Бактериофаг л.

Механизмы контроля транскрипции на уровне элонгации РНК у этого бактериофага изучены лучше, чем у других вирусов. Ключевые регуляторные фаговые белки N и Q контролируют транскрипцию всего фагового генома, обеспечивая антитерминацию транскрипции в местах обычного прекращения синтеза вирусных РНК, т.е. на терминаторах транскрипции. В результате происходит транскрипция всех генов, необходимых для размножения бактериофага, и он вступает на вирулентный путь развития, приводящий к лизису бактериальных клеток и выходу зрелых фаговых частиц в окружающую среду. Механизм антитерминации, обеспечиваемой N-белком, отличается от механизма Q-зависимой антитерминации. N-Белок осуществляет свои функции при прохождении элонгирующей РНК-полимеразой особых последовательностей ДНК (бокс А и бокс В), обеспечивающих сборку комплекса элонгирующей РНК-полимеразы и N-белка. Белок N сам по себе является РНК-связывающим белком, и его взаимодействие с РНК стабилизируется Nus-белками E. coli. Его объединение с РНК и комплексом сопутствующих белков заставляет элонгирующую РНК-полимеразу не замечать сигналы терминации на ДНК, как зависимые, так и не зависимые от факторов терминации транскрипции.

Во время антитерминации транскрипции, опосредуемой Q-белком, последний взаимодействует с нетранскрибируемой цепью ДНК промоторного или элонгирующего комплексов в пределах первых 20-25 нуклеотидов ниже точки инициации транскрипции позднего фагового промотора. При этом белок Q не образует комплекса с РНК и оказывает свое действие на транскрипцию через регуляторную субъединицу РНК-полимеразы у⁷⁰. Для реализации Q-зависимой антитерминации in vivo необходимо, чтобы произошла задержка в перемещении элонгирующей РНК-полимеразы вдоль матрицы вскоре после инициации транскрипции. В это время уже освободившаяся из транскрипционного комплекса у-субъединица входит в контакт с нетранскрибируемой цепью ДНК в открытом участке (транскрипционном пузырьке), расположенном на 15 нуклеотидов ниже точки инициации транскрипции. Таким образом, у-субъединица остается ассоциированной с транскрибирующим комплексом и опосредует антитерминирующее действие Q-белка на больших расстояниях (несколько тысяч пар оснований) от промотора. В этом случае совместное действие фактора инициации транскрипции (у-субъединицы) и ДНК-связывающего белка-антитерминатора изменяют свойства элонгирующей РНК-полимеразы, которая освобождает промотор после кратковременной паузы в элонгации. Эти необычные свойства у-субъединицы, проявляемые во время вирусной инфекции, позволяют высказывать предположение о ее возможном участии в контроле транскрипции бактериальных генов на уровне освобождения промотора и элонгации синтеза РНК.

Лямбдоидный бактериофаг HK022

При заражении клеток E. coli этим бактериофагом происходит исключение (подавление развития) фага л, в котором участвует вирусный белок nun. Этот белок, родственный белку N фага л, также участвует в контроле элонгации РНК у бактериофага HK02 Во время л-инфекции Nun-белок нарушает функционирование N-белка, предотвращая антитерминацию синтеза РНК и вызывая его терминацию. При этом оба белка взаимодействуют с одними и теми же последовательностями РНК, однако оказывают противоположное действие на элонгирующий транскрипционный комплекс. Бактериофаг HK022 обладает собственной регуляторной системой антитерминации транскрипции, для функционирования которой не требуется белок Nun, но необходима его мРНК. В этом случае элонгирующий комплекс перестает узнавать терминаторы транскрипции после прямого взаимодействия Nun-РНК с в-субъединицей РНК-полимеразы. Для осуществления антитерминации по такому механизму не требуется участия других вирусных белков.

Бактериофаг Т4

Бактериофаг Т4 использует бактериальную РНК-полимеразу для транскрипции своего собственного генома, ингибируя синтез РНК бактериальной клетки-хозяина. В подавлении транскрипции участвует фаговый белок Alc, взаимодействующий с в-субъединицей РНК-полимеразы E. coli, что сопровождается прекращением транскрипции матричных ДНК, содержащих остатки цитозина. Т4-ДНК содержит вместо остатков С остатки 5-гидроксиметилцитозина и эффективно транскрибируется РНК-полимеразой как в присутствии Alc-белка, так и без него. В отличие от этого матричные ДНК, содержащие немодифицированные остатки С, не транскрибируются бактериальной РНК-полимеразой только в присутствии белка Alc, и даже простое метилирование остатков цитозина в положении С5 обеспечивает защиту транскрипции от преждевременной терминации, вызываемой этим белком.

Координация элонгации транскриптов с метаболизмом ДНК.

Транскрипция происходит координированно с репликацией бактериальной ДНК и сегрегацией хромосом в дочерние клетки. Транскрибирующая РНК-полимераза часто встречается в процессе синтеза РНК с репликативным бактериальным комплексом. Для сведения к минимуму отрицательного эффекта такой встречи активно транскрибируемые гены E. coli, других бактерий и бактериофагов ориентированы на хромосомах таким образом, чтобы синтез ДНК и РНК происходил в одном направлении. Но даже в этом случае встреча двух работающих комплексов неизбежна, поскольку репликация ДНК происходит в 10-20 раз быстрее транскрипции тех же ее участков. Теоретически отрицательные последствия такого столкновения заключаются в том, что в отличие от ДНК-полимераз, которые функционируют по дистрибутивному механизму, т.е. способны продолжать синтез ДНК после его временного прекращения и отделения фермента от матрицы, РНК-полимеразы являются процессивными ферментами. Они не могут продолжить синтез РНК после распада элонгирующего комплекса и для вовлечения в новый цикл транскрипции требуют инициации синтеза РНК на промоторе. При этом энергия, затраченная на синтез недостроенного фрагмента РНК, безвозвратно теряется. Данная проблема особенно актуальна для больших эукариотических генов, например гена дистрофина, размер которого превышает 2000 т.п.о. Тем не менее, методом электронной микроскопии показано, что у E. coli репликативная вилка может смещать с ДНК элонгирующий транскрипционный комплекс. Установлено также, что элонгация транскриптов оказывает влияние на правильную терминацию репликации.

У бактериофага Т4 репликативный аппарат может функционировать без разрушения элонгирующих транскрипционных комплексов независимо от направления транскрипции по отношению к направлению синтеза ДНК. В опытах Б. Лиу и Б.М. Албертса (1995 г.) с высокоочищенными компонентами аппаратов транскрипции и репликации бактериофага Т4 было установлено, что при одновременно происходящих транскрипции и репликации оба работающих комплекса не мешают друг другу выполнять свои функции. При прохождении репликативной вилки через транскрибируемый участок ДНК этого вируса положение РНК-полимеразы на матрице не изменяется. Во время контакта работающей репликативной вилки с РНК-полимеразой в составе тройного комплекса не было обнаружено изменений его стабильности как во время активного синтеза РНК, так и в состоянии задержки транскрипции. Неожиданно оказалось, что при столкновении репликативного и транскрипционного комплексов друг с другом РНК-полимераза переключается на использование в качестве матрицы вновь синтезированной дочерней цепи ДНК. Во время такой смены матриц РНК-полимераза сохраняет связь с растущим транскриптом, остается в активном состоянии и продолжает безошибочно синтезировать правильную цепь РНК. Этот пример указывает на возможный механизм координации репликации и транскрипции у других, более сложноустроенных организмов.

Белковые факторы, регулирующие элонгацию РНК у бактерий

Белковые факторы и небольшие молекулы, изменяющие свойства элонгирующих РНК-полимераз, столь же разнообразны, как и упомянутые выше механизмы регуляции транскрипции на уровне элонгации РНК. Это особенно относится к эукариотам, о которых речь пойдет в следующем разделе книги. Некоторые факторы стимулируют элонгацию через супрессию временной задержки РНК-полимераз на транскрибируемых матрицах или путем активации комплексов, полностью прекративших транскрипцию. Другие факторы обеспечивают терминацию или антитерминацию транскрипции. У эукариот имеются белки, изменяющие активность белковых компонентов элонгирующих комплексов, а также структуру транскрибируемого хроматина. Некоторые регуляторные белки осуществляют свое действие, связываясь непосредственно с растущим транскриптом или матричной ДНК, другие - через белок-белковые взаимодействия. Во многих случаях механизм действия регуляторных белков остается невыясненным.

У E. coli имеются уже упоминавшиеся выше белковые факторы GreA и GreB, которые выводят элонгирующий комплекс РНК-полимеразы из состояния полного прекращения синтеза РНК путем стимуляции эндонуклеазного отщепления 3'-концевой части элонгируемого транскрипта. Ген, кодирующий белок GreA, впервые был обнаружен генетическими методами как ген-супрессор температурно-чувствительной мутации в в'-субъединице РНК-полимеразы E. coli. Инактивация генов greA или greB по отдельности с помощью мутаций не сопровождается выраженным изменением фенотипа мутантных бактерий, однако двойная мутация делает бактериальные клетки температурно-чувствительными. Для таких мутантных клеток была характерна быстрая реверсия к обычному нетемпературно-чувствительному фенотипу. На этом основании делается вывод о значительном преимуществе в росте бактериальных клеток, обладающих функциональными белками GreA и GreB, даже при пермиссивной температуре. Те же генетические свойства характерны и для фактора элонгации транскрипции TFIIS(SII) S. cerevisiae - функционального (но не структурного) гомолога вышеупомянутых бактериальных факторов.

Среди регуляторов элонгации транскрипции, действующих по типу терминации-антитерминации синтеза РНК, для полноты картины следует упомянуть уже обсуждавшиеся выше фактор терминации транскрипции с, а также белки-антитерминаторы транскрипции N и Q бактериофага л.

1.3 Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот

Несмотря на то, что основные принципы регуляции транскрипции генов у прокариотических и эукариотических организмов остаются неизменными - через специфические взаимодействия белков и нуклеиновых кислот друг с другом, а также между собой, данный процесс у эукариот характеризуется рядом существенных особенностей. Это связано, прежде всего, с необходимостью поддержания координированной экспрессии эукариотических генов в более сложноорганизованной генетической системе. Достаточно вспомнить, что в организме человека гистологически различают, по крайней мере, 100 типов клеток, формирующих его органы и ткани. Для любого типа клеток характерен свой уникальный набор экспрессирующихся генов, которые начинают функционировать во время дифференцировки клеток-предшественников. Кроме того, сам процесс формирования органов и тканей сопровождается пролиферацией строго определенных групп клеток, а также упорядоченным во времени и пространстве перемещением клеток. Все эти особенности жизнедеятельности клеток высших организмов обеспечиваются функционированием их генов.

Гены высших организмов подразделяют по функциональному признаку на две большие группы: "гены домашнего хозяйства" (housekeeping genes) и "гены роскоши" (luxury genes). К первой группе относятся гены, функционирующие повсеместно, на всех стадиях жизненного цикла организма. Они обеспечивают процесс гликолиза, биосинтез аминокислот и нуклеотидов, катаболизм белков и т.п. Гены, относящиеся ко второй группе, экспрессируются лишь в специализированных клетках и являются маркерами дифференцированных состояний этих клеток.

Сложность жизненного цикла многоклеточных организмов накладывает свои требования на особенности функционирования их генов. В частности, большое число генов и даже целые блоки их функционируют лишь на определенных стадиях эмбриогенеза и не транскрибируются в клетках взрослого организма. У человека к ним относятся, например гены б-фетопротеина. Экспрессия этих генов в клетках взрослого организма свидетельствует о развитии патологического процесса, в частности злокачественных новообразований в печени. Еще более ярким примером такого рода является избирательная инактивация одной из X-хромосом у самок млекопитающих.

Тканеспецифический характер экспрессии генов роскоши обеспечивается различными механизмами. В этом случае ключевую роль играют специфические взаимодействия белковых факторов транскрипции с регуляторными последовательностями нуклеиновых кислот. Транскрипцию генов высших организмов осуществляют, по крайней мере, три различные РНК-полимеразы. При этом для промоторов каждой из них характерны специфические регуляторные последовательности нуклеотидов, с которыми взаимодействуют свои факторы транскрипции, изменяющие уровень транскрипции соответствующих генов (Рис. 1).

В свою очередь, сами эукариотические факторы транскрипции реализуют новый, известный (в таком масштабе) только у эукариот механизм регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции так называемого комбинаторного типа. Молекулы факторов транскрипции обладают консервативными доменами, которые дают им возможность осуществлять высокоспецифические белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия. В результате, in vivo происходит объединение факторов транскрипции и других регуляторных белков, обладающих соответствующими доменами, в разных сочетаниях в большие регуляторные комплексы. Каждое новое сочетание факторов, число которых хотя и велико, но ограничено, придает комплексу уникальные регуляторные свойства, обеспечивая изменение специфичности его взаимодействия с регуляторными последовательностями ДНК и другими регуляторными белками аппарата транскрипции. В результате реализации такого механизма достигается беспрецедентная гибкость в модуляции уровней транскрипции эукариотических генов и соответственно в контроле экспрессии фенотипических признаков клетки и организма.

Не менее уникальна способность эукариот использовать для регуляции транскрипции своих генов изменения структуры хроматина. С помощью таких эффективных механизмов осуществляется репрессия и дерепрессия генов во время дифференцировки клеток, и соответствующее функциональное состояние отдельных генов, их больших массивов и даже целых хромосом может поддерживаться на протяжении всей жизни организма.

Рис. 1. Структурные и функциональные домены больших субъединиц эукариотической РНК-полимеразы I (а) и особенности структуры промоторов эубактерий и эукариот (б)

а - Полипептидные цепи двух больших субъединиц изображены в виде горизонтальных прямоугольников, в которых черным цветом и латинскими буквами отмечены участки, консервативные у большинства известных РНК-полимераз. Кислая область и участки Iб-Iд характерны для РНК-полимераз I. Обозначены зоны полипептидных цепей, формирующие активный центр фермента и необходимые для выполнения соответствующих функций (например связывания Mg2+). Пунктирные стрелки указывают на участки субъединиц, контактирующие друг с другом.

б - Незаштрихованными прямоугольниками обозначены известные структурные элементы промоторов, необходимые для инициации или активации транскрипции. Внутри прямоугольников приведены названия факторов транскрипции, взаимодействующих с соответствующими элементами промоторов, а также названия сайтов или взаимодействующих с ними белков, находящихся над сайтами. Стрелки - обозначают фиксированные расстояния между элементами промоторов, а > - 5?-концевые части элонгируемых транскриптов. Черными прямоугольниками обозначены участки промоторов, защищаемые от действия ДНКазы I или других агентов Eу70, а также эукариотическими транскрипционными комплексами, обеспечивающими базальный уровень транскрипции. tss - точка инициации транскрипции.

Перестройки хроматина в окрестностях регуляторных участков генов происходят и в связи с более тонкой регуляцией их транскрипции. Несмотря на то, что изменение уровней транскрипции генов является одним из важнейших способов регуляции их экспрессии, такая стратегия - лишь одна из многих, используемых эукариотическими организмами для контроля биосинтеза, содержания и функционирования соответствующих продуктов генов: белков или нуклеиновых кислот. В процессе синтеза и после его завершения первичный транскрипт подвергается многочисленным посттранскрипционным модификациям и процессингу. Таким образом, генетической информации, заключенной в конкретном гене, недостаточно для полноценной экспрессии, и чтобы ген правильно функционировал, требуется координированная работа дополнительных генов, многие из которых активны не вблизи регулируемых генов, а в других тканях, удаленных от клеток-мишеней. Для осуществления такой передачи регуляторных сигналов на большие расстояния в организме присутствуют специальные системы, осуществляющие генерацию сигналов, перенос их к клеткам-мишеням, а также специфическое распознавание сигналов клетками, которым они адресованы.

1.4 Передача сигнала и вторичные мессенджеры

Жизнь любой клетки, включая глобальные процессы ее роста, деления и даже гибели, зависит от внешних регуляторных сигналов, которые она воспринимает. Такими сигналами могут быть физические воздействия (температура, ионизирующее и другое электромагнитное излучение) или многочисленные химические соединения. Хорошо изученными веществами, которые организм использует для регуляции жизнедеятельности клеток, являются, например стероидные гормоны, цитокины или факторы роста, которые, достигая клеток-мишеней, вызывают в них специфические метаболические изменения, связанные в том числе и с изменением экспрессии больших групп генов. Не менее сильный и часто также специфический ответ вызывают различные физиологически активные вещества экзогенного происхождения, например феромоны или токсины. Все эти сигналы, передающиеся через соответствующие сигнальные молекулы, являются первичными по отношению к тем каскадам биохимических реакций, которые запускаются в клетках в ответ на их воздействие. Первичные сигналы распознаются клетками благодаря наличию у них специальных молекул-рецепторов белковой природы, взаимодействующих с первичными сигнальными молекулами или воздействиями физической природы. Первичный сигнал, как правило, не действует прямо на те метаболические процессы в клетке, для регуляции которых он предназначен. Вместо этого воспринимающий его рецептор инициирует образование в клетке промежуточных химических соединений, запускающих внутриклеточные процессы, воздействие на которые было целью первичного внеклеточного сигнала. Поскольку такие промежуточные соединения несут в себе информацию о первичном регуляторном сигнале и являются вторичными его переносчиками, они получили название вторичных мессенджеров. Ими могут быть различные ионы, циклические нуклеотиды, продукты деградации липидов и целый ряд других химических соединений биогенного происхождения.

Использование эукариотами системы вторичных мессенджеров переводит их на новый уровень интеграции всех метаболических и катаболических процессов, что необходимо для существования многоклеточных организмов. В частности, вторичные мессенджеры позволяют многократно усиливать первичный регуляторный сигнал от внеклеточных регуляторных молекул, которые благодаря этому осуществляют свое действие, находясь в небольших концентрациях во внеклеточном пространстве. Кроме того, многие группы клеток и тканей приобретают способность к однотипной и одновременной реакции на первичный регуляторный сигнал, например на действие гормона какого-либо органа эндокринной системы. Это обеспечивает возможность быстрой адаптации многоклеточного организма к изменяющимся условиям внутренней и окружающей среды.

Трансмембранный перенос первичных сигналов

Для того чтобыьпервичный регуляторный сигнал достиг ядра и оказал свое воздействие на экспрессию генов-мишеней, он должен пройти через двухслойную мембрану именно тех клеток, которым он предназначен. Как правило, это достигается благодаря наличию на поверхности клеток рецепторов белковой природы, специфически выбирающих из окружающей среды сигналы, распознать которые они в состоянии (Рис. 2). В простейшем случае, когда в качестве низкомолекулярных регуляторов выступают гидрофобные химические соединения, растворимые в липидах мембран (например стероидные гормоны), для их переноса не используются рецепторы, и они проникают в клетку путем радиальной диффузии. Внутри клеток такие соединения специфически взаимодействуют с белковыми рецепторами, а образующийся комплекс переносится в ядро, где оказывает свое регуляторное воздействие на транскрипцию соответствующих генов (Рис. 2а). В отличие от этого рецепторы мембран, ориентированные во внеклеточное пространство, обладают способностью осуществлять транспорт лиганда-регулятора внутрь клеток посредством эндоцитоза (поглощения путем втягивания мембраны) комплекса лиганд-рецептор в составе мембранных везикул. Такой механизм используется, в частности, для переноса внутрь клеток молекул холестерина, ассоциированных с рецепторами липопротеинов низкой плотности (Рис. 2б). Другой тип рецепторов, ориентированных на внеклеточные лиганды, - это трансмембранные молекулы или группа молекул. Взаимодействие с лигандом внешней части таких молекул сопровождается индукцией ферментативной активности, ассоциированной с внутриклеточной частью того же самого полипептида (Рис. 2в). Примерами подобных рецепторов, обладающих активностью тирозиновых протеинкиназ, являются рецепторы инсулина, эпидермального фактора роста или фактора роста тромбоцитов. В синапсах нейронов и местах контакта нейромышечных тканей лиганды-нейромедиаторы (например ацетилхолин или г-аминомасляная кислота) взаимодействуют с трансмембранными ионными каналами (Рис. 2г). В ответ на это происходит открытие ионных каналов, сопровождаемое перемещением ионов через мембрану и быстрым изменением трансмембранного электрического потенциала. Другие трансмембранные рецепторы осуществляют связь белков внеклеточного матрикса с микрофиламентами цитоскелета клеток и регуляцию формы клеток, зависящую от внеклеточного матрикса, их подвижности и роста (Рис. 2д). Наконец, большая группа внеклеточных сигналов распознается рецепторами, ассоциированными на внутренней поверхности мембраны с GTP-связывающими белками, которые, в свою очередь, в ответ на первичный сигнал начинают синтез вторичных мессенджеров, регулирующих активность внутриклеточных белков (Рис. 2е). Классификация по структурному признаку рецепторов, осуществляющих перенос сигнала в клетки через мембраны, приведена в Табл. 1.

Все рецепторы, участвующие в трансмембранной передаче сигнала, подразделяют на три класса. При этом, как правило, учитывается сходство или различие вторичных структур субъединиц, а не особенности их аминокислотных последовательностей.

Рис. 2 Способы передачи внеклеточных регуляторных сигналов через мембраны эукариотических клеток (а-е)

Y и Y-P - нефосфорилированные и фосфорилированные остатки Tyr в белках соответственно. Показано также превращение предшественника X во вторичный мессенджер Z

Таблица 1. Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала

Рецепторы 1-го класса образуют олигомерные структуры вокруг пор в мембранах. Перенос сигнала в этом случае происходит в результате открытия или (в одном случае) закрытия ионных каналов. Основная часть рецепторов 2-го класса погружена в мембраны, и каждая из субъединиц содержит последовательности, распознаваемые G-белками. Для всех субъединиц этого класса характерно наличие трансмембранной (ТМ) последовательности, которая 7 раз пересекает мембрану. Субъединицы рецепторов 3-го класса минимально погружены в мембраны, что обеспечивает подвижность рецепторов и возможность их интернализации (перехода в цитоплазму клеток в составе мембранной везикулы). Большая часть полипептидных цепей этих субъединиц экспонирована наружу клеток.

Вторичные мессенджеры

Гипотеза о том, что действие гормонов на метаболизм клеток и экспрессию генов опосредуется внутриклеточными вторичными мессенджерами, впервые появилась после открытия в конце 1950-х годов Е. Сазерлендом циклического аденозин-3',5'-монофосфата (cAMP). К настоящему времени список вторичных мессенджеров расширился и включает циклический гуанозин-3',5'-монофосфат, фосфоинозитиды, ионы Ca²⁺ и H⁺, метаболиты ретиноевой и арахидоновой кислот, закись азота (NO), а также некоторые другие химические соединения биогенного происхождения.

Как было упомянуто выше, внеклеточные сигналы, воспринимаемые рецепторами на поверхности клеток, запускают цепь внутриклеточных биохимических реакций, опосредуемых вторичными мессенджерами, в которые вовлекаются десятки и даже сотни внутриклеточных белков. Для организации адекватного координированного ответа на конкретный внеклеточный сигнал эукариотическая клетка использует две основные стратегии. В соответствии с одной из них происходит изменение активности предсуществующих белков (ферментов, белков цитоскелета, ионных каналов и т.п.) как следствие аллостерических воздействий или в результате ковалентных модификаций (фосфорилирование протеинкиназами или дефосфорилирование). Индуцированные таким образом новые активности белков, в свою очередь, вызывают ответ клетки, основанный на второй стратегии - изменении уровней экспрессии конкретных генов. В результате реализации второй стратегии в клетках меняются число молекул конкретных белков и их качественный состав.

Циклический AMP в роли вторичного мессенджера

В ряде хорошо изученных случаев внеклеточные лиганды после взаимодействия с рецепторами индуцируют образование вторичных мессенджеров через участие GTP-связывающих и GTP-гидролизующих гетеродимерных белков, названных G-белками. Во всех этих системах имеет место последовательность реакций, отображенная на Рис. 3а. Внеклеточный лиганд специфически распознается трансмембранным рецептором, который, в свою очередь, активирует соответствующий G-белок, локализованный на цитоплазматической поверхности мембраны. Активированный G-белок изменяет активность эффектора (обычно фермента или белка ионного канала, в рассматриваемом случае - аденилатциклазы), который повышает внутриклеточную концентрацию вторичного мессенджера (в нашем примере - cAMP). Каждый вид рецептора взаимодействует только с определенным представителем семейства G-белков, а каждый G-белок - со специфическим классом эффекторных молекул. Таким образом, в одном конкретном случае гормон или нейромедиатор, реагируя со своим рецептором, вызывает активацию GS-белка, стимулирующего аденилатциклазу. Этот фермент-эффектор превращает внутриклеточный ATP в cAMP - классический вторичный мессенджер. Внутриклеточный уровень cAMP может специфически понижаться под действием фосфодиэстеразы, которая превращает cAMP в 5'-AMP. cAMP активирует множество cAMP-зависимых протеинкиназ, каждая из которых фосфорилирует определенные белки-субстраты. В большинстве клеток животных присутствуют, по крайней мере, две хорошо охарактеризованные cAMP-зависимые протеинкиназы, фосфорилирующие белки-мишени по остаткам Ser и Thr (серин/треониновые A-киназы). Обе A-киназы представляют собой тетрамеры, состоящие из регуляторного (R) и каталитического (C) димеров полипептидных цепей. R-димер является мишенью для cAMP, с которым он взаимодействует. Это сопровождается диссоциацией комплекса и освобождением C-цепей, обладающих протеинкиназной активностью. Образующиеся полипептиды, свободно диффундируя в цитоплазме, попадают в ядро, где могут фосфорилировать подходящие белки-мишени, в том числе, факторы транскрипции, что сопровождается их активацией и индукцией транскрипции соответствующих генов. Внутриядерными мишенями киназы A являются, в частности, факторы транскрипции CREB, CREMф, AP2, SRF, Sp1, участвующие в контроле большого числа клеточных функций, включая пролиферацию и дифференцировку клеток, метаболизм гликогена, регуляцию ионных каналов и т.д. Специфичность регуляторных воздействий cAMP обеспечивается наличием в клетках определенных типов только им присущих тканеспецифических белков, являющихся субстратами для A-киназ. Например, клетки печени обогащены фосфорилазой-киназой и гликогенсинтазой, активность которых регулируется избирательным фосфорилированием их по cAMP-зависимому механизму, что сопровождается накоплением или освобождением углеводов в гепатоцитах. Адипоциты обогащены липазой, фосфорилирование которой по тому же механизму приводит к освобождению этими клетками свободных жирных кислот. Точно также в клетках других типов, запрограммированных на определенные тканеспецифические функции, содержатся специфические наборы ферментов, активность которых регулируется через их cAMP-зависимое фосфорилирование.

Рис. 3. Механизмы передачи сигнала с участием cAMP в качестве вторичного мессенджера (а) и протеинкиназ, активируемых митогенами (MAPK) (б), а также регуляции клеточного цикла (в)

а: Rec - рецепторы, Gs - G-белок, AC - аденилатциклаза, ФДЭ - фосфодиэстераза, R и C - соответственно регуляторная и каталитическая субъединицы протеинкиназы, S и S-P - белок-субстрат протеинкиназы и его фосфорилированная форма соответственно 2С* - освобожденный димер каталитической субъединицы А-киназы, Pi - неорганический ортофосфат

б: УФ - ультрафиолетовый свет, ИР - ионизирующая радиация, MMS - метилметансульфонат, SMаза - сфингомиелиназа, MAPKK - киназы, фосфорилирующие MAPK, MAPKKK - киназы, фосфорилирующие MAPKK