Особенности регуляции экспрессии генов

Для разных органов и тканей организма характерны специфические наборы (паттерны) метилированных последовательностей ДНК. Такой мозаицизм в метилировании последовательностей генома не является следствием одних только ошибок функционирования системы метилирования, поскольку паттерны метилирования ДНК в гомологичных тканях разных индивидуумов обладают большим сходством. В этой связи можно говорить о тканеспецифическом характере метилирования ДНК, которое обеспечивается координированным функционированием системы метилаз и деметилаз в онтогенезе организма.

В экспериментах на культурах клеток было показано, что изменение паттернов метилирования под действием веществ, вызывающих деметилирование ДНК, например 5-азацитидина, может изменять дифференцированное состояние клеточных линий. В частности, инкубация эмбриональных фибробластов мышей с 5-азацитидином сопровождается их превращением в миобласты, адипоциты и хондроциты. Точно так же дифференцировка клеток эритролейкемии Френд может быть запущена с помощью деметилирующих агентов. Полагают, что в этих случаях в процессе деметилирования ДНК происходит активация генов-регуляторов, детерминирующих дифференцированное состояние клеток, которые, в свою очередь, индуцируют экспрессию всех остальных генов, необходимых для поддержания дифференцированного состояния. Экспрессия конкретных доминантных генов, ответственных за дифференцировку отдельных групп клеток в определенном направлении, должна жестко контролироваться и быть блокированной в клетках других типов. Метилирование ДНК может обеспечивать такое установление неактивного состояния генов дифференцировки и его поддержание в ряду клеточных поколений, т.е. контролировать стабильность дифференцированного состояния соматических клеток организма.

Отцовский импринтинг и аллельное исключение

При отцовском импринтинге, как об этом уже упоминалось выше, экспрессия некоторых генов в дочерних соматических клетках зависит от того, локализованы ли они на отцовских или материнских хромосомах. При этом часто наблюдают различный характер метилирования отцовских и материнских хромосом. У мышей известны ~15 областей хромосом, подвергнутых импринтингу. У многих генов с таким эпигенетическим наследованием обнаружены прямые повторы, которые, как полагают, могут быть задействованы в установлении и поддержании импринтинга. Локализация нескольких генов, в регуляции экспрессии которых задействован импринтинг, в одном и том же участке хромосомы 16 указывает на то, что в установление импринтинга могут быть вовлечены целые домены хромосом.

При аллельном исключении происходит инактивация одного из аллелей, приводящая к функциональной гемизиготности соответствующего гена независимо от его происхождения со стороны родителей. Под гемизиготностью диплоидных организмов или отдельных соматических клеток понимают представленность одного или нескольких генов только одним аллелем, что может быть следствием анеуплоидии (потери одной или нескольких хромосом), делеции или функциональной инактивации второго аллеля. Гемизиготное состояние характерно, в частности для генов X-хромосом самок млекопитающих отдельных соматических клеток, где одна из X-хромосом инактивирована случайным образом. Феномен аллельного исключения описан для генов иммуноглобулинов животных, лишь один из аллелей которых претерпевает продуктивную перестройку под действием V-D-J-рекомбиназы в отдельных лимфоцитах развивающегося организма. Метилирование ДНК оказывает влияние на объединение V-D-J-сегментов генов и, возможно, играет ключевую роль в их аллельном исключении.

Обычно аллельное исключение тонко регулируется в онтогенезе. Однако теоретически аналогичный механизм может реализовываться в результате постепенно накапливаемых случайных ошибок метилирования на протяжении жизни организма. Накопление ошибок метилирования сверх определенного уровня должно сопровождаться выключением соответствующего аллеля на фоне нормального функционирования другого аллеля в конкретной соматической клетке. Происхождение часто обнаруживаемых частично метилированных CpG-сайтов в ДНК различных тканей объясняют такими ошибками метилирования, получившими название эпимутаций. На фоне эпимутаций может легко произойти инактивация единственного оставшегося аллеля дикого типа под действием обычных мутаций или в результате гиперметилирования, что приведет к полному подавлению экспрессии соответствующего гена.

Метилирование как механизм инактивации чужеродной и повторяющейся ДНК у эукариот

Т. Бестором (1990 г.) было высказано предположение о том, что метилирование ДНК у эукариот может выполнять защитную функцию, предохраняя организм от чужеродной ДНК и избытка эндогенных повторяющихся последовательностей. Поскольку у эукариот не описано ферментов рестрикции, специфичных в отношении GpC- последовательностей, предполагается, что такие защитные механизмы осуществляют инактивацию чужеродной ДНК, а не ее деградацию, как это имеет место у бактерий. Экспериментально установлено, что ДНК из внешних источников, например вирусная ДНК или ДНК, введенная в клетки с помощью трансфекции, а также эндогенная ДНК ретротранспозонов и повторяющихся последовательностей (в частности LINE и SINE) могут быть объектом метилирования de novo, приводящего к их генетической инактивации. Например, интеграция ДНК аденовирусов в эукариотический геном сопровождается ее постепенным метилированием. То же характерно и для латентного состояния некоторых других вирусов, которое поддерживается через метилирование остатков цитозина в ДНК их геномов Мтазами клетки-хозяина. Другим примером функционирования этого механизма является гиперметилирование трансгенов, интегрированных в геном организма-реципиента в большом числе копий.

Механизмы, которые позволяют высшим эукариотическим организмам избирательно распознавать и инактивировать чужеродную и повторяющуюся ДНК, не совсем понятны. Полагают, что Мтазы преимущественно распознают молекулы ДНК, формирующие необычные пространственные структуры, например петли или ошибочно спаренные нуклеотиды. В случае повторяющихся последовательностей мишенями Мтаз при метилировании de novo могут быть интермедиаты, образующиеся во время их рекомбинации друг с другом. У гриба Ascobulus immersus повторяющиеся последовательности эффективно распознаются и инактивируются в результате метилирования под действием механизма, получившего название премейотически индуцированного метилирования (methylation induced premeiotically - MIP). Аналогичный механизм у гриба Neurospora crassa назван мутагенезом, индуцированным повторяющимися последовательностями (repeat induced point mutations - RIP). В этом случае остатки цитозина в повторах либо метилируются ферментными системами гриба, либо превращаются в мутантные остатки тимина. Вообще, остатки С, которые являются мишенями для Мтаз, мутируют в геноме эукариот по механизму дезаминирования и превращения в остатки тимина гораздо чаще, чем другие остатки цитозина. Это позволяет рассматривать метилирование как постоянно функционирующий механизм эукариот, инактивирующий чужеродные и повторяющиеся последовательности ДНК с помощью таких мутаций. Все рассмотренные выше регуляторные механизмы, контролирующие экспрессию генов, функционируют на одном из самых важных этапов реализации генетической информации - на уровне транскрипции. Однако и другие этапы передачи генетической информации являются важными объектами многочисленных регуляторных воздействий.

3. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов

Регуляция экспрессии генов на уровне уже синтезированной РНК играет исключительно важную роль в онтогенезе многоклеточных и особенно высших организмов. Среди различных способов посттранскрипционной регуляции наибольшее значение имеют механизмы внутриклеточной локализации и депонирования РНК с последующим специфическим вовлечением ее в трансляцию, а также разные формы процессинга предшественников мРНК, избирательной деградации мРНК и ее ковалентных посттранскрипционных модификаций.

3.1 Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРНК

По завершении регулируемого синтеза РНК в процессе транскрипции она должна быть доставлена к месту трансляции, где сценарий координированной экспрессии генов получает свое дальнейшее развитие. При этом многие виды мРНК оказываются асимметрично распределенными в цитоплазме родительских клеток, пролиферация которых сопровождается избирательным попаданием (доставкой) мРНК в дочерние клетки. В итоге на ранних стадиях эмбриогенеза в зиготе и дочерних клетках происходит образование набора белков без соответствующей транскрипции их собственных генов, что обеспечивает их дальнейшую дифференцировку. Такой тип регуляции экспрессии генов через асимметричное распределение их РНК в цитоплазме играет исключительно важную роль в оогенезе животных, завершаемом образованием зрелых яйцеклеток.

Структура и образование комплекса ооцит-питающие клетки у дрозофилы

Каждый из двух симметрично расположенных яичников дрозофилы содержит ~16 овариол, в передней части каждой из которых находится гермарий. В гермарии происходит асимметричное деление стволовых клеток, сопровождаемое воспроизводством стволовых и образованием коммитированных клеток, называемых цистобластами. Каждый цистобласт делится четыре раза с образованием 16 цистоцитов - группы клеток, связанных друг с другом цитоплазматическими мостиками, которые проходят через специализированные, связанные с цитоскелетом структуры, называемые кольцевыми каналами (ring canals). Лишь один из 16 цистоцитов становится ооцитом, остальные 15 - питающими клетками (nurse cells). Каждая из 16-клеточных зародышевых цист окружена соматическими фолликулярными клетками, что образует яйцевую камеру (1-я стадия развития). Задние части овариол составлены серией яйцевых камер, возраст которых уменьшается по мере удаления от оси тела насекомого. Наиболее удаленные от оси яйцевые камеры находятся в стадии развития 1, а ближайшие к оси - на конечной, 14-й, стадии развития. Для созревания яйцеклетки в яйцевой камере требуется три дня. В это время питающие клетки синтезируют большое количество РНК и белков, которые переносятся в созревающий ооцит. Большинство этих молекул бывают необходимы в первые два часа эмбрионального развития дрозофилы, до начала транскрипции в зиготе.

Выбор клетки, которая становится ооцитом среди 16 цистоцитов, не происходит случайно. Лишь две из 16 клеток связаны кольцевыми каналами с четырьмя другими, и одна из этих двух клеток всегда дифференцируется в ооцит. Большая цитоплазматическая структура, названная фьюсомой (fusome), в формировании которой участвует несколько белков цитоскелета, проходит через кольцевые каналы, объединяющие цистоциты, и участвует в детерминации ооцита. Единственный в 16-клеточном комплексе центр, организующий микротрубочки (microtubule organizing center - MTOC), расположен в проооците. MTOC объединяет нити микротрубочек, исходящих из всех 15 питающих клеток, которые проходят через кольцевые каналы. Поскольку в MTOC сходятся минус-концы микротрубочек, основанный на микротрубочках цитоскелет 16-клеточной конструкции структурно поляризован.

Такая направленность микротрубочек играет ключевую роль в упорядоченном транспорте РНК из питающих клеток в созревающий ооцит и специфическом распределении РНК в самом ооците, а следовательно, лежит в основе регулируемой экспрессии генов развивающегося организма.

Упорядоченное распределение РНК в ооцитах и ранних эмбрионах дрозофилы

Большинство РНК, которые позднее локализуются в растущем ооците, первоначально синтезируются во всех 16 клетках зародышевой линии. При этом временные различия аккумуляции РНК в ооцитах коррелируют с различиями в начале их синтеза, но не с различиями механизмов внутриклеточного и межклеточного транспорта.

Правильную локализацию РНК в ооците во многом обеспечивают микротрубочки его цитоскелета. Например, мутация в гене homeless, сопровождающаяся образованием ооцитов с двумя передними полюсами, приводит на стадии 7 к перемещению минус-концов микротрубочек к обоим полюсам, а их плюс-концов - в центр клетки. Это имеет следствием перераспределение РНК внутри мутантных ооцитов. РНК bicoid накапливается на обоих полюсах ооцитов, а РНК oskar - в центре клетки.

По мере созревания ооцита (стадии 7-8) могут происходить упорядоченные внутриклеточные перемещения импортированной РНК, например между его полюсами. На заключительных стадиях созревания (10-14) питающие клетки усиливают синтез РНК и их перенос в ооциты на фоне перетекания ооплазмы, что сопровождается их специфическим внутриклеточным распределением.

Активация ооцитов после оплодотворения сопряжена с упорядоченными перестройками цитоскелета. Ядра зиготы дрозофилы претерпевают 13 синхронных делений без цитокинеза, образуя зародыш с несколькими тысячами ядер, окруженными общей цитоплазмой. Такой синцитий существует до конца 14-го клеточного цикла, в котором ~6000 ядер локализованы вблизи оболочки - кортекса. Затем впячивания мембраны формируют индивидуальные клетки бластодермы, в которой переднезадняя и дорсовентральная полярность положения клеток уже определена, и они содержат требуемые для дальнейшего развития материнские РНК. На стадии синцития и клеточной бластодермы начинается основной зиготный синтез РНК.

Механизмы регулируемой локализации РНК в клетках животных.

Механизмы, обеспечивающие специфическую локализацию РНК в клетках многоклеточных организмов, весьма разнообразны. Прежде всего, после завершения синтеза РНК имеет место ее направленная доставка из ядра в цитоплазму к месту хранения или трансляции. Однако часть внутриклеточных РНК не синтезируется в ядрах этих клеток, а экспортируется в цитоплазму из митохондрий или соседних клеток другой специализации. Кроме того, специальные механизмы контролируют направленное перемещение РНК в цитоплазме и ее избирательную деградацию.

Направленный ядерно-цитоплазматический транспорт РНК

Одним из самых ранних посттранскрипционных событий, связанных с их направленной доставкой к месту внутриклеточной локализации и трансляции, является векторизованный экспорт РНК из ядра в цитоплазму. Несмотря на то что наличие механизма направленного переноса синтезированной РНК из одной части ядра к другой с последующим упорядоченным выходом в цитоплазму кажется очевидным, имеется мало экспериментальных свидетельств этому явлению. Большинство экспериментальных данных такого рода относится к ранним эмбрионам дрозофилы. В частности, направленный перенос продемонстрирован для транскриптов генов hairy и fushi tarazu в эмбрионах на стадии бластодермы, а также для мРНК гена gurken, которая на стадии 8 ооцитов в их цитоплазме располагается по отношению к ядру строго упорядоченно. Помимо всего прочего, результаты этих экспериментов позволили предположить, что ядра как таковые обладают собственной полярностью, независимой от цитоплазматического цитоскелета.

Перенос РНК из клеток одного типа в клетки другого типа

Второй класс механизмов направленной доставки мРНК впервые обнаружен во время оогенеза дрозофилы. В этом случае РНК, синтезированная в питающих клетках, переносится в ооциты по кольцевым каналам. Питающие клетки связаны только с передними полюсами ооцитов, и часть поступающих из них РНК (например bicoid) специфически удерживается после их вхождения и остается в этой зоне ооцитов. У мутантов дрозофилы, для которых характерно взаимодействие питающих клеток с передним и задним полюсами ооцита, транскрипты гена bicoid локализованы на обоих полюсах ооцитов. В отличие от РНК, которые удерживаются на переднем полюсе ооцитов, другие РНК, преимущественно располагающиеся на заднем полюсе, активно переносятся внутри клетки к месту своей локализации. Такой перенос и внутриклеточная локализация транскриптов тесно связаны с цитоскелетом или обеспечиваются другими механизмами, например посредством их избирательной защиты от распада и деградации.

Импорт РНК из митохондрий

Цитоплазма заднего полюса ооцитов дрозофилы содержит большие, не связанные с клеточными мембранами органеллы - полярные гранулы, которые участвуют в образовании и дифференцировке клеток зародышевой линии. С полярными гранулами тесно ассоциированы митохондрии, осуществляющие экспорт в эти органеллы большой митохондриальной 16S рРНК, которая кодируется митохондриальным геномом. Функции этой РНК в ооците не ясны. Полагают, что она требуется для образования клеток переднего полюса.

Массовая деградация РНК, сопряженная с ее локальной защитой

Гетерогенное внутриклеточное распределение и депонирование РНК могут достигаться за счет ее избирательной защиты от деградации. Например, материнские транскрипты генов nanos, cyclin B и Hsp83 концентрируются в плазме переднего полюса ранних эмбрионов дрозофилы, однако часть РНК остается нелокализованной. РНК переднего полюса переходит в отпочковывающиеся клетки во время дробления ооцита, тогда как остающаяся РНК деградирует. Избирательную защиту РНК в плазме переднего полюса ооцитов обеспечивают вышеупомянутые полярные гранулы.

Другим примером избирательной дестабилизации и защиты мРНК является метаболизм материнской РНК гена PCNA в ооцитах асцидий. В цитоплазме этих ооцитов различают три основные зоны: центральную эктоплазму и периферийные участки, прилегающие к кортексу, между которыми находится миоплазма. Во время оогенеза не кодирующая белок РНК гена YC локализована вокруг ядра в перинуклеарном пространстве и постепенно переносится к кортексу. После оплодотворения эта РНК переходит в миоплазму и ассоциирует с цитоскелетом. 3'-Концевая последовательность YC-РНК комплементарна 3'UTR PCNA-РНК, а также 5'UTR РНК рибосомного белка L5. Вначале синтезируемая PCNA-РНК распределена равномерно в цитоплазме, однако постепенно миоплазма становится свободной от нее. Предполагают, что дестабилизация происходит в результате образования в миоплазме двухцепочечных YC-PCNA РНК-РНК-гибридов. В отличие от этого L5-РНК, несмотря на значительную гомологию с YC-РНК, не дестабилизируется, а накапливается в миоплазме. Истинные механизмы, лежащие в основе различий поведения этих двух транскриптов, остаются неизвестными.

Направленный транспорт РНК в цитоплазме

Многочисленные данные указывают на то, что направленный перенос РНК к специфическим внутриклеточным микрокомпартментам осуществляется при участии и микротрубочек, и микрофиламентов цитоскелета эукариотических клеток. Такие выводы основаны, прежде всего, на результатах, полученных с использованием агентов, специфически нарушающих нормальное формирование частей цитоскелета, построенных из микротрубочек (колхицин, нокодазол, таксол) или микрофиламентов (цитохолазины). Информативными оказались и мутанты дрозофилы, и Sacharomyces с измененными компонентами цитоскелета.

Наиболее изученными в отношении механизмов транспорта являются транскрипты генов bicoid и oskar дрозофилы, первый из которых кодирует фактор транскрипции, а точные функции второго белка неизвестны. В процессе переноса от питающих клеток к месту своей окончательной локализации - переднему полюсу ооцита - РНК bicoid претерпевает несколько стадий ассоциации-диссоциации 74 с компонентами цитоскелета. Внутриклеточный перенос РНК в питающих клетках к кольцевым каналам осуществляется с участием минус-концевого мотора микротрубочек, так как подавляется их деполимеризующими агентами (колхицин, тубулозол С, нокодазол). Перемещение РНК через кольцевые каналы в ооцит не зависит от цитоскелета, поскольку не подавляется ингибиторами образования микротрубочек и микрофиламентов актина. Во время ранних этапов накопления транскриптов гена bicoid в ооцитах они снова ассоциируют с цитоскелетом, переходя в детергент-нерастворимую фракцию. На стадиях 8-11 развития ооцита РНК локализуются у его передней границы в неассоциированном с цитоскелетом состоянии, однако на стадии 14 транскрипты bicoid сильно компактизуются в передней части ооцита, находясь в связанном с микротрубочками состоянии. Наконец, в ранних эмбрионах эта РНК больше не ассоциирована с кортексом и цитоскелетом.

Зависимый от цитоскелета направленный перенос РНК происходит не только в оогенезе. Внутриклеточная локализация многих РНК в нейронах млекопитающих также происходит при участии микротрубочек. Функционирование того же механизма с участием микрофиламентов актина было обнаружено и при специфическом переносе ASH1-РНК в почкующиеся клетки дрожжей S. cerevisiae, а также при мембранной локализации мРНК в-актина в различных соматических клетках животных (фибробластах, миобластах и т.п.).

3.2 Сплайсинг РНК в регуляции экспрессии генов

Разнообразные механизмы процессинга РНК в клетках были уже рассмотрены выше. Как оказалось, созревание мРНК играет важную роль и в регуляции экспрессии тех генов, транскриптами которых эти РНК являются. Одними из первых доказательства такого рода регуляции экспрессии генов были получены для морских ежей. Транскрипты, обнаруживаемые в цитоплазме клеток на стадии бластулы, можно видеть с помощью специфических ДНК-зондов в ядрах клеток кишечника. В ядрах клеток бластулы и дифференцированных клеток кишечника морских ежей синтезируются похожие наборы РНК, однако наборы цитоплазматических РНК, участвующих в трансляции, у этих типов клеток сильно различаются вследствие разного процессинга предшественников мРНК в ядрах.

Убедительные данные о контроле экспрессии генов на уровне процессинга РНК получены в экспериментах с вирусами клеток животных. Вирусы полиомы и SV40 не способны размножаться в недифференцированных стволовых клетках тератокарциномы. Однако, если стволовые клетки дифференцируются в клетки соматических типов, они становятся пермиссивными (чувствительными) к этим вирусам. Одной из причин исходной непермиссивности стволовых клеток к указанным вирусам является их неспособность осуществлять процессинг (сплайсинг) вирусных РНК в ядрах. Это сопровождается накоплением в ядрах стволовых клеток гигантских предшественников вирусных РНК, которые в конце концов разрушаются. Данные такого рода в совокупности свидетельствуют о зависимости развития соматических клеток от образования в них специфических ферментов сплайсинга, которые отвечают за процессинг предшественников клеточных мРНК, необходимых для функционирования и дифференцировки соматических клеток.

Альтернативный сплайсинг

Одним из примеров посттранскрипционных модификаций РНК, имеющих большое значение в регуляции экспрессии генов эукариот, является альтернативный сплайсинг. Сущность его заключается в том, что в результате посттранскрипционного процессинга предшественника мРНК, из которого в результате сплайсинга вырезаются некодирующие последовательности нуклеотидов, соответствующие интронам транскрибированного гена, образуются зрелые мРНК, различающиеся по своей первичной структуре. В результате в разныхклетках и тканях из одного и того же предшественника получаются молекулы зрелых мРНК, которые объединяют в различных комбинациях последовательности экзонов транскрибированного гена.

Рис. 15 Схема формирования активаторов и репрессоров транскрипции, кодируемых геном CREM и образующихся в результате альтернативного сплайсинга

В верхней части рисунка изображена схема гена CREM, включающая альтернативные промоторы Р1 и P2, кодоны альтернативной инициации и терминации трансляции, а также экзоны, кодирующие различные домены факторов. Внизу представлены комбинации последовательностей экзонов, объединяющихся в зрелые мРНК, которые кодируют разных представителей групп репрессоров и активаторов транскрипции, а также ICER-белков

На Рис. 15 представлена схема экзонной структуры гена модулятора cAMP-респонсивного элемента человека (CREM), кодирующего целое семейство позитивно и негативно действующих изоформ фактора транскрипции, связывающихся с cAMP-респонсивными регуляторными элементами ДНК - CRE. Данное семейство факторов вовлечено в регуляцию экспрессии генов, участвующих в обеспечении эндокринных функций организма и сперматогенезе. Ген построен из функциональных модулей, заключающих в себе информацию двух промоторов, двух альтернативных ДНК-связывающих доменов, а также нескольких транс-действующих доменов этих факторов. Пре-мРНК транскрибируется с неиндуцируемого промотора P1 и подвергается альтернативному сплайсингу, специфичность которого определяется типом ткани, в которой он происходит. Например, во время сперматогенеза происходит переключение с синтеза репрессоров транскрипции CREMб, CREMв и CREMг на образование CREMф, который содержит в своей полипептидной цепи две дополнительные последовательности, обогащенные Gln (Q1 и Q2), необходимые для транс-активации транскрипции. Более короткий транскрипт, синтез которого инициируется на промоторе P2, процессируется с образованием зрелых мРНК, которые кодируют группу небольших молекул репрессоров (ICER). Инициация синтеза РНК на промоторе P2 активируется под действием ритмических гормональных сигналов эпифиза мозга.

Рассмотренный пример показывает важную роль альтернативного сплайсинга в расширении кодирующего потенциала генов эукариот, поскольку в результате использования такого механизма одна и та же последовательность нуклеотидов гена может кодировать несколько разных белков.

Комбинаторика объединения последовательностей нуклеотидов пре-мРНК в процессе альтернативного сплайсинга может быть очень сложной, поскольку в него вовлекаются интроны и экзоны, а их объединение происходит с использованием различных точек сплайсинга, локализованных в этих последовательностях. Распознавание участков ДНК, в которых находятся точки сплайсинга, участвующие в конкретном акте посттранскрипционного процессинга пре-мРНК, происходит с участием специфических белков в результате белково-нуклеинового взаимодействия.

Позитивная и негативная регуляция альтернативного сплайсинга в клетках животных

У животных описано много генов, пре-мРНК которых подвергаются альтернативному сплайсингу. Однако механизмы регуляции этого процесса не так ясны, как в только что рассмотренном примере с генами дрозофилы. Основную роль в выборе альтернативных сайтов сплайсинга у животных, по-видимому, играют общие факторы сплайсинга. В частности, установлено, что простое повышение концентрации SR-белков способствует предпочтительному выбору для сплайсинга проксимально расположенных, т.е. сближенных друг с другом, сайтов сплайсинга во многих пре-мРНК.

Механизм этого явления представлен на примере гипотетической пре-мРНК, содержащей два альтернативных одинаково эффективных 5'-концевых сайта сплайсинга. Для простоты показано связывание с РНК только U1-мяРНП и SR-белка. В условиях недостатка U1-мяРНП (Рис. 16а) не все 5'-концевые сайты сплайсинга заполнены мультибелковыми комплексами. Поскольку наиболее эффективно в альтернативном сплайсинге используется внутренний сайт, максимально сближенный со своим 3'-концевым партнером, альтернативный 5'-концевой сайт вовлекается только в том случае, если ниже расположенный сайт не занят. Повышение концентрации U1-мяРНП приводит к тому, что оба 5'-концевых сайта сплайсинга взаимодействуют с белковыми комплексами и сплайсинг происходит преимущественно с участием его максимально сближенных сайтов (Рис. 16б). В этом случае SR-белки усиливают взаимодействие между расположенными по соседству U1-мяРНП-комплексами.

Рис. 16. Механизм действия белков SR при обеспечении выбора сплайсомой альтернативных сайтов сплайсинга

U1 ? U1-мяРНП. Эффективность вырезания интронов: а - 40% проксимальных, 40% дистальных; б - 80% проксимальных, 20% дистальных

У многих генов животных и их вирусов обнаружены последовательности нуклеотидов, блокирующие сплайсинг. Некоторые из этих последовательностей способствуют формированию в пре-мРНК характерной вторичной структуры, которая маскирует сайты сплайсинга. Поскольку многие белковые факторы сплайсинга обладают ДНК-расплетающей активностью и вызывают локальное плавление спирализованных участков РНК, то дифференциальная экспрессия таких факторов оказывает влияние на выбор белками сплайсинга определенных сайтов. Другие негативные регуляторные элементы альтернативного сплайсинга требуют для своего функционирования наличия транс-действующих факторов. Например, белок вируса иммунодефицита человека взаимодействует с последовательностью RRE пре-мРНК и, блокируя ее сплайсинг, обеспечивает экспорт непроцессированной пре-мРНК. Описаны экзоны, также оказывающие негативное влияние на сплайсинг. Кроме того, показано, что белки гетерогенных ядерных РНП A1, A1b, A2 и B1 выступают антагонистами SR-белков при взаимодействии последних с дистальными 5'-концевыми сайтами сплайсинга. Для индивидуальных белков этой группы (A и B) характерна субстратная специфичность, и они оказывают существенное влияние на выбор конкретных сайтов сплайсинга во время процессинга пре-мРНК, что в ряде случаев обеспечивается наличием высокоаффинных сайтов связывания для таких белков между конкурирующими 5'-концевыми сайтами сплайсинга. Например, наличие участка сильного связывания для белка А1, входящего в состав гяРНП, между двумя 5'-концевыми сайтами сплайсинга приводит к преимущественному участию в процессинге дистального сайта сплайсинга (более удаленного от 3'-концевого сайта). Такое взаимодействие не оказывает влияния на связывание обоими 5'-концевыми сайтами сплайсинга U1-мяРНП.

Рассмотренные механизмы позитивной и негативной регуляции альтернативного сплайсинга во многом гипотетичны. Однако существование внутриклеточных механизмов, с высокой точностью регулирующих этот процесс, в настоящее время доказано. Такая специфичность может достигаться за счет контролируемых изменений внутриядерной концентрации индивидуальных SR-белков и белков гетерогенных ядерных РНП-частиц, функционирующих в сочетании с регуляторными последовательностями нуклеотидов (энхансерами сплайсинга) и с сайтами сплайсинга определенной эффективности, локализованными в самих пре-мРНК. В некоторых случаях подобная регуляция требует участия дополнительных специфических факторов.

Переключение классов иммуноглобулинов

В процессе дифференцировки B-лимфоцитов происходит смена классов иммуноглобулинов, синтезируемых этими клетками. В начале дифференцировки образуются иммуноглобулины, обладающие способностью как секретироваться в окружающую среду, так и интегрироваться в плазматическую мембрану B-лимфоцитов. Поверхностные иммуноглобулины выполняют здесь роль рецепторов антигенов и принадлежат к одному из двух классов белков: IgM или IgD. Белки этих двух классов обладают одинаковыми аминокислотными последовательностями в N-концевых частях, взаимодействующих с антигенными детерминантами, и различаются по С-концам. В начале процесса дифференцировки поверхностные иммуноглобулины представлены белками только класса IgM, а после первой стимуляции антигеном появляются белки обоих классов; далее, после завершения дифференцировки B-лимфоцитов, на поверхности клеток остаются иммуноглобулины только класса IgD. Именно они продолжают синтезироваться зрелыми B-лимфоцитами.

В основе феномена переключения классов иммуноглобулинов у B-лимфоцитов лежит механизм альтернативного сплайсинга. На любой стадии дифференцировки B-лимфоцитов синтезируются транскрипты генов иммуноглобулинов, в состав которых входят экзоны вариабельных частей иммуноглобулинов, а также их константных частей, как м, так и д, определяющих класс иммуноглобулинов (IgM или IgD соответственно). В результате альтернативного сплайсинга с последовательностями экзонов вариабельных частей в зрелой мРНК соединяются последовательности экзонов м или д, что и определяет, в конечном счете, класс иммуноглобулинов, образующихся в результате трансляции этих мРНК рибосомами. С помощью альтернативного сплайсинга B-лимфоциты решают вопрос и о том, какая из форм IgM - секретируемая или интегрирующаяся в мембраны - образуется в клетках. Так же как и в случае обсуждавшихся выше классов иммуноглобулинов, секретируемая и ассоциированная с мембранами формы IgM различаются по С-концевым аминокислотным последовательностям. Последовательности, кодирующие эти С-концевые домены иммуноглобулинов, добавляются в зрелые мРНК или удаляются из их предшественников в результате альтернативного сплайсинга.

Исследования последних лет показали, что регуляция экспрессии генов с помощью альтернативного сплайсинга широко распространена в клетках высших организмов. Использование такого изящного механизма позволяет одному и тому же гену кодировать несколько полипептидов, различающихся по своим биологическим функциям, и контролировать их биосинтез во времени (на разных этапах дифференцировки клеток) и в пространстве (в различных органах и тканях). Все это повышает информационную емкость генома высших организмов без существенного увеличения его размеров.

Транс-сплайсинг

Из рассмотренных выше примеров следует, что во время постоянного или альтернативного сплайсинга интроны удаляются из предшественников мРНК в результате нескольких сложных реакций при участии крупного РНП-комплекса, называемого сплайсомой. Обычно 5'- и 3'-концевые сайты сплайсинга, участвующие в таком процессе, расположены на одной молекуле пре-мРНК, т.е. в цис-положении по отношению друг к другу. В отличие от этого в процессе транс-сплайсинга сплайсома выбирает для объединения 5'-сайт и 3'-сайт сплайсинга, которые располагаются на разных молекулах РНК. В настоящее время транс-сплайсинг обнаружен у простейших (трипаносом), евглен, круглых нематод и плоских червей, а также в митохондриях, хлоропластах и безрибосомных пластидах высших растений. Наиболее хорошо изучен механизм транс-сплайсинга у нематоды Caenorhabditis elegans, который подробнее будет рассмотрен ниже. Только у этих групп организмов (за исключением трипаносом, гены которых не содержат интронов) механизмы цис- и транс-сплайсинга функционируют в клетках на одних и тех же молекулах РНК.

Интересной особенностью транскрипции у нематод, сближающих их с трипаносомами, является то, что их РНК синтезируются в виде полицистронных предшественников, которые далее расщепляются до моноцистронных единиц, полиаденилируются и подвергаются транс-сплайсингу. Однако в отличие от трипаносом, у которых транс-сплайсинг ограничивается присоединением к акцепторному 3'-концевому сайту сплайсинга одной и той же лидерной РНК SL1 (spliced leader 1), нематоды обладают еще одним донорным сайтом сплайсинга, ассоциированным с SL2-РНК, молекулы которой присоединяются к внутренним сайтам полицистронных транскриптов. Таким образом, в клетках C. Elegans сплайсинг осуществляется по трем механизмам (Рис. 17). Это обычный цис- и транс-сплайсинг, в результате которых SL1-РНК присоединяется вблизи 5'-концов первичных транскриптов-предшественников зрелых мРНК, и, наконец, транс-сплайсинг с участием молекул SL2-РНК, которые объединяются с внутренними последовательностями нуклеотидов полицистронных транскриптов. Все три типа сплайсинга проходят в основном с участием одних и тех же компонентов РНП-комплекса, представляющего собой сплайсому, которая использует одни и те же 3'- и 5'-концевые канонические последовательности сайтов сплайсинга. Подобно высшим организмам в состав сплайсомы нематод входят U1-U6-мяРНК, из которых U2-U6 участвуют в транс-сплайсинге. Молекулы SL-РНК, содержащие донорные сайты сплайсинга, также входят в состав РНП-комплекса.

Рис. 17. Цис- и транс-сплайсинг ядерной полицистронной пре-мРНК у нематоды C. elegans

AAUAAA - сайты полиаденилирования

Последовательности нуклеотидов сайтов транс- и цис-сплайсинга идентичны и взаимозаменяемы в генно-инженерных экспериментах. Интроноподобные последовательности, расположенные на 5'-концах транскриптов, названные аутронами, подвергаются транс-сплайсингу, тогда как внутренние интроны вырезаются по механизму цис-сплайсинга. Единственным отличием гена, транскрипт которого подвергается транс-сплайсингу, является наличие на его 5'-конце последовательности аутрона, а не экзона. При перемещении интрона одного гена из внутреннего положения на 5'-конец другого или того же самого гена он начинает функционировать в качестве аутрона, т.е. подвергается транс-сплайсингу. Если размер такого аутрона превышает 50 п.о., то он нормально функционирует в транс-сплайсинге. При искусственном введении 5'-концевого сайта сплайсинга в аутрон на расстояние более 50 п.о. от его сайта транс-сплайсинга заключенная между этими сайтами последовательность нуклеотидов в РНК подвергается обычному цис-сплайсингу. Таким образом, единственным сигналом, разрешающим транс-сплайсинг, является положение последовательности нуклеотидов вблизи 5'-конца пре-мРНК.

Зрелые, полностью процессированные РНК C. elegans содержат SL1- и SL2-РНК на 5'-концах, причем соблюдаются пропорции в содержании маркированных таким способом РНК внутри клеток. Следовательно, процесс транс-сплайсинга, в результате которого происходит выбор лидерной SL-РНК, каким-то образом регулируется. Предполагается, что белки, взаимодействующие с сайтами полиаденилирования соответствующих РНК, специфически взаимодействуют с белками мяРНП, в состав которых входят SL-РНК, и тем самым осуществляют их выбор.

Функциональная роль транс-сплайсинга в жизненном цикле нематод неизвестна. Экспериментами in vivo продемонстрирована взаимозаменяемость генов, продукты которых подвергаются цис- или транс-сплайсингу. Известно, что сайты транс-сплайсинга часто располагаются непосредственно перед инициирующими AUG-кодонами мРНК. Это позволяет предположить, что SL-последовательности играют определенную роль в инициации трансляции. В частности, с помощью транс-сплайсинга могут удаляться лишние AUG-кодоны, находящиеся не в одной рамке считывания с основной кодирующей последовательностью нуклеотидов мРНК, или создаваться контексты нуклеотидов, которые обеспечивают эффективную инициацию синтеза белка рибосомами. Это, в свою очередь, может допускать определенную эволюционную гибкость в расположении соответствующих промоторов и создавать условия для возникновения новых сайтов инициации транскрипции на ДНК нематод.

3.3 Избирательная деградация мРНК

Время полужизни мРНК в клетках является важным фактором регуляции экспрессии генов. Феномен деградации мРНК как регуляторного явления впервые обнаружен у бактерий на заре развития молекулярной генетики. Уже тогда все РНК бактериальной клетки были разделены на два класса: стабильные и нестабильные. К первым до сих пор относятся рибосомные и транспортные РНК, тогда как вторую, наиболее гетерогенную по составу группу образуют матричные РНК. Быстрая деградация мРНК после прекращения ее биосинтеза в результате регуляторных воздействий на транскрибируемые гены позволяет бактериальным клеткам легко адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды и дает им ощутимые селективные преимущества перед клетками, которые не обладают таким регуляторным механизмом. Быстрая адаптация особенно актуальна для бактерий - одноклеточных организмов с коротким жизненным циклом.

Как было упомянуто, клетки эукариотических организмов способны выводить мРНК из трансляции, не разрушая ее. Это часто достигается регуляцией процессинга предшественников мРНК, образованием рибонуклеопротеидных комплексов - информосом, или специфической модификацией регуляторных последовательностей мРНК. Тем не менее, селективная деградация мРНК является распространенным механизмом регуляции экспрессии генов в клетках высших организмов. В эукариотических клетках время полужизни стабильных мРНК, таких как глобиновая мРНК, составляет ~17 ч, а время функционирования мРНК факторов роста не превышает 30 мин. Физиологические последствия таких различий очевидны. Если глобиновые мРНК продолжают транслироваться на протяжении всей жизни предшественников эритроцитов, то потребность в факторах роста ограничивается фазами клеточного цикла, непосредственно связанными с делением клеток. В частности, известно, что увеличение стабильности мРНК протоонкогена c-fos под действием мутаций сопровождается непрерывным делением мутантных клеток и образованием опухолей.

Время жизни эукариотических мРНК в цитоплазме чаще всего контролируется их 3'-концевыми нетранслируемыми последовательностями (UTR). Лабильные мРНК содержат в этой области одну или несколько AU-богатых последовательностей длиной около 50 нуклеотидов, называемых ARE-элементами (adenylate/uridylate-rich elements), которые придают полирибонуклеотиду конформации, делающие его высокочувствительным к расщеплению нуклеазами. Искусственное введение таких последовательностей в 3'-концевые области стабильных мРНК приводит к их дестабилизации, что сопровождается резким уменьшением внутриклеточного времени полужизни гибридных мРНК. ARE-элементы были впервые обнаружены у генов цитокинов, участвующих в воспалительных реакциях организма, и в настоящее время описаны для мРНК генов c-fos, c-myc, nur77, junB, в-интерферона, интерлейкина 3, гранулоцит-макрофагового колонийстимулирующего фактора (GM-CSF) и ряда других мРНК. Длина ARE-элементов варьирует от 50 до 150 нуклеотидов, они содержат несколько копий пентануклеотида AUUUA и много остатков U, перемежающихся остатками A.

Различают, по крайней мере, три класса ARE-элементов. Элементы 1-го класса (характерные, в частности для мРНК гена c-fos) содержат одну-три копии последовательности AUUUA, ассоциированные с U-богатой областью или гомополимером U. Для элементов 2-го класса (тип GM-CSF) характерно наличие двух копий перекрывающихся нонануклеотидных последовательностей UUAUUUA(U/A)(U/A), включенных в U-богатую последовательность. Наконец, элементы, принадлежащие к 3-му классу (тип c-jun), совсем не содержат последовательности AUUUA.

В соответствии с современной моделью ARE-зависимая деградация мРНК происходит двумя различными путями (Рис. 18). Как уже упоминалось выше, этот процесс начинается с деаденилирования 3'-концевых поли(A)-последовательностей мРНК. Процесс деаденилирования проходит с разной скоростью в зависимости от класса ARE-последовательностей, присутствующих в мРНК. При наличии ARE-элементов 2-го класса (тип GM-CSF) деаденилирование отдельных молекул протекает асинхронно по процессивному механизму и заканчивается образованием молекул мРНК, не содержащих 3'-концевых поли(А)-последовательностей (поли(А)?-РНК). В отличие от этого ARE-элементы 1-го и 3-го классов направляют

Рис. 18. Этапы ARE-зависимой деградации мРНК эукариот

Закрашенные геометрические фигуры - белки и факторы, специфически взаимодействующие с ARE-последовательностью. Их возможное влияние на деаденилирование показано волнистыми стрелками. Толщина стрелок указывает на интенсивность реакции

деаденилирование по дистрибутивному механизму. При этом отдельные молекулы деаденилируются синхронно, и на концах мРНК остаются поли(А)-последовательности длиной в 30-60 нуклеотидов. Скорость дальнейшей деградации процессированных мРНК может быть различной и зависит от регулируемой на уровне деградации мРНК экспрессии генов.

Таким образом, наличие в структуре мРНК различных классов специфических ARE-последовательностей, а также множественных белков-регуляторов, взаимодействующих с этими последовательностями, контролирует кинетику деградации мРНК в клетках. Аналогичные механизмы имеют место, в частности в селективной защите или дестабилизации мРНК в ответ на изменение внутриклеточных условий, например при гормональных воздействиях.

Изменение длины поли(А)-последовательностей мРНК

Выше было отмечено, что кэпирование и полиаденилирование процессированных эукариотических мРНК повышают эффективность их трансляции рибосомами. В некоторых случаях эффективность трансляции мРНК, содержащих 3'-концевые поли(A)-последовательности, регулируется путем специфического изменения длины таких гомополимеров. В частности, у слизневиков Dictyostelium этот механизм играет ключевую роль в жизненном цикле. При переходе слизневиков от стадии вегетативного роста (амеба) к образованию плодового тела в клетках синтезируется новый набор мРНК. Одновременно резко укорачивается длина поли(A)-последовательностей мРНК, синтезированных и используемых в вегетативной стадии развития организма. В результате происходит переключение трансляции с мРНК, запасенных в вегетативной фазе роста, на вновь синтезированные мРНК. Аналогичные эффекты наблюдаются в слюнных железах личинок дрозофилы, в процессе развития двустворчатого моллюска Spisula, а также в ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus.

Хорошо изученным примером регуляции экспрессии генов на уровне полиаденилирования соответствующих мРНК является также дифференциальное полиаденилирование мРНК белка U1A - компонента U1-мяРНП. Установлено, что 3'-концевые нетранслируемые участки (3'-UTRs) U1A-мРНК различных организмов содержат две копии консервативных последовательностей, которые обладают способностью связывать U1A-белок. В результате синтез избытка U1A-белка ингибирует полиаденилирование мРНК in vivo. При этом происходит подавление полимеризации AMP как следствие прямых контактов белка с поли(А)-полимеразой. После такой дестабилизации U1A-мРНК наблюдается пропорциональное снижение внутриклеточного уровня U1A-белка, т.е. имеет место регулирование его биосинтеза по принципу обратной связи.

Изменения кэп-группы мРНК

Своеобразный механизм контроля трансляции мРНК используется в онтогенезе некоторых бабочек. Например, у табачного бражника Manduca sexta эффективность трансляции определенных мРНК изменяется при ковалентной модификации их 5'-концевых кэп-групп. В ооцитах бражника запасенные мРНК содержат кэп-группу в виде неметилированного остатка гуанозина. Такие мРНК не транслируются рибосомами в бесклеточной белоксинтезирующей системе. Однако после оплодотворения кэп-группы мРНК быстро метилируются с образованием остатка 7-метилгуанозина и становятся активными матрицами при трансляции.

Этим примером мы завершим рассмотрение механизмов регуляции экспрессии генов путем посттранскрипционных модификаций мРНК и их предшественников. Как видно из изложенного материала, все регуляторные модификации структуры РНК оказывают влияние на экспрессию генов, транскриптами которых они являются, через изменение эффективности трансляции этих мРНК рибосомами. Фактически все вышеперечисленные механизмы регуляции экспрессии генов направлены на изменение матричной активности РНК-посредников (мРНК), с помощью которых происходит перенос генетической информации от транскрибируемых генов к белкам. Такие механизмы оказывают регуляторное действие на уровень экспрессии регулируемых генов через изменение эффективности функционирования аппарата трансляции клеток организма. Тем не менее, среди механизмов, регулирующих экспрессию генов на уровне трансляции, многие непосредственно направлены на изменение функциональной активности самих компонентов аппарата трансляции: рибосом и многочисленных факторов трансляции, принимающих прямое участие в биосинтезе белков. Некоторые из этих механизмов будут рассмотрены в следующем разделе.

4. Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции

В процесс биосинтеза белка рибосомами вовлекается большое количество мРНК, экипированных разнообразными регуляторными элементами. Даже в случае клеток дрожжей количество транслируемых видов мРНК превышает 6000. Регуляторные последовательности мРНК влияют на эффективность трансляции двумя основными путями: 1) изменением активности компонентов системы трансляции, взаимодействующих с регуляторными доменами мРНК; 2) изменением структуры регуляторных элементов самих мРНК. Как и в случае транскрипции, механизмы регуляции экспрессии генов на уровне трансляции осуществляют контроль эффективности всех основных этапов синтеза полипептидных цепей: инициации, элонгации и терминации.

4.1 Регуляция инициации трансляции

Инициация, т.е. сборка компонентов системы трансляции на 5'-конце мРНК, завершающаяся образованием первой пептидной связи, является важнейшей точкой приложения регуляторных воздействий на уровне трансляции. Эффективность инициации биосинтеза белка изменяется под действием различных гормонов, факторов роста и цитокинов, при изменении доступности питательных веществ и в условиях стрессовых состояний эукариотических клеток. Ключевую роль в этом играют факторы инициации трансляции eIF4E и eIF

Участие фактора инициации трансляции eIF4E в регуляции биосинтеза белка .

Фактор eIF4E распознает кэп-структуры мРНК в составемногокомпонентного фактора инициации eIF4F, что является необходимым этапом объединения мРНК с 40S субчастицей рибосом. Фактор eIF4E лимитирует инициацию трансляции. В большинстве клеток он присутствует в количестве 0,01-0,2 молекулы/рибосому, тогда как внутриклеточное содержание других факторов находится в пределах 0,5-3 молекулы/рибосому. Внутриклеточное содержание и активность фактора eIF4E регулируются на уровне транскрипции, посттрансляционно и путем взаимодействия с белками-репрессорами.

Регуляция биосинтеза eIF4E на уровне транскрипции

В ответ на действие сыворотки или факторов роста происходит многократное возрастание внутриклеточного содержания eIF4E-мРНК. Промотор гена этого фактора содержит два сайта связывания фактора транскрипции Myc, которые функционируют в искусственных гибридных генах. В соответствии с этим повышенный уровень экспрессии гена c-myc сопровождается возрастанием внутриклеточного содержания eIF4E-мРНК. Известно, что белок Myc участвует в регуляции пролиферации клеток. Поскольку фактор eIF4E сам по себе является ключевым регулятором роста и деления клеток, полагают, что его ген может быть одной из основных мишеней регуляторного воздействия белка Myc.

Регулируемое фосфорилирование фактора eIF4E

Фософорилированное состояние полипептидной цепи фактора eIF4E коррелирует с повышенной скоростью трансляции. В митозе, характеризуемом низкой скоростью трансляции, уровень фосфорилирования eIF4E минимален. Количество фосфорилированных молекул фактора возрастает в ответ на внеклеточные воздействия гормонами, факторами роста, митогенами и цитокинами, а также в условиях повышенной нагрузки на сердце. У млекопитающих в ответ на все исследованные стимулы фосфорилирование полипептидной цепи происходит в основном в положении S209 (нумерация по полипептиду мышей). Остаток Thr в положении 210 фосфорилируется значительно реже. Поскольку в клетках, трансформированных онкогенами ras и src, наблюдается усиление фосфорилирования eIF4E, полагают, что в этом процессе участвуют MAP(ERK)-киназы (MAPK/ERK). Это участие может быть косвенным, так как в системах in vitro киназы ERK не обладают способностью фосфорилировать eIF4E. Недавно было показано, что общим субстратом протеинкиназ p38MAPK и ERK является протеинкиназа фактора eIF4E, названная MNK1 (MAP kinase interacting kinase 1), которая в активном состоянии фосфорилирована. Поскольку MNK1 эффективно и специфически фосфорилирует фактор eIF4E in vitro по остатку Ser в положении 209, ее рассматривают в качестве основного кандидата, модифицирующего этотфактор и в живой клетке, после активации каскадов реакций с участием киназ ERK и p38 MAPK.