Ліпополісахариди Pragia fontium: хімічна характеристика, функціональна та біологічна активність

Размещено на http://www.allbest.ru/

НаціональнА академіЯ наук України

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного

УДК 579.841.11.22

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ЛІПОПОЛІсахарИДИ PRAGIA FONTIUM: ХІМІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ТА БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ

03.00.07 - мікробіологія

ШУБЧИНСЬКИЙ ВОЛОДИМИР ВОЛОДИМИРОВИЧ

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Дисертаційна робота виконана у відділі біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, завідувач лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів

кандидат біологічних наук Моложава Ольга Станіславівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, доцент кафедри мікробіології і загальної імунології

Захист відбудеться „17” грудня 2008 р. о 12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д 03680 МСП, Київ, вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680 МСП, Київ, вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий „14” листопада 2008р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

АНОТАЦІЯ

Шубчинський В.В. Ліпополісахариди Pragia fontium: хімічна характеристика, функціональна та біологічна активність. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ, 2008.

Дисертація присвячена дослідженню ліпополісахаридів (ЛПС) Pragia fontium. З восьми штамів Pragia fontium 20125, 29671, 28203, 28652, 97U116, 27480, 96U101, 97U124 виділено ЛПС, проведена хімічна ідентифікація, яка свідчить, що вони містять всі характерні для цих біополімерів компоненти. Макромолекулярна організація ЛПС у досліджуваних штамів відрізнялася і представлена S-, R- і SR-формами. Встановлена дивергенція властивостей ЛПС у порядку: ліпід А - О-ПС - олігосахарид кору. Найбільші розходження спостерігались в моносахаридному складі олігосахаридів кору (5 хемотипів), менші - О-специфічного полісахариду (4 хемотипи), в той час як жирнокислотний склад ліпідів А всіх восьми вивчених штамів P. fontium є аналогічним і представлений одним хемотипом.

Досліджувані ЛПС були токсичними і пірогенними. При модифікації ЛПС відбулася втрата серологічної активності. В імунохімічних дослідженнях ЛПС представників P. fontium в гомологічних системах проявляють активність антигену. В гетерологічних системах виявлена наявність перехресних серологічних реакцій у штамів (20125 і 29761), відповідно інші штами (28203, 28652, 97U116, 27480, 96U101, 97U124) відрізняються і відносяться до окремих серогруп. Показано, що ЛПС P. fontium приймають активну участь у адгезивних процесах. ЛПС отримані з штаму 20125 за різних температур вирощування відрізняються за хімічним складом та біологічними властивостями.

Ключві слова: Pragia fontium, ліпополісахарид, О-специфічний полісахарид, олігосахарид кору, ліпід А, токсичність, пірогенність, адгезія, модифікований ЛПС.

АННОТАЦИЯ

Шубчинский В.В. Липополисахариды Pragia fontium: химическая характеристика и биологическая активность. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, г. Киев, 2007.

Диссертация посвящена исследованию липополисахаридов (ЛПС) P. fontium. Из 8 штаммов P. fontium 20125, 29671, 28203, 28652, 97U116, 27480, 96U101, 97U124 водно-фенольным методом выделены и химически охарактеризованы ЛПС. Выход ЛПС составлял от 9 до 22 %, аналогично выходу ЛПС Rahnella aquatilis ( 5,2 - 19,8 %), но певышает средние показатели (5 %) других представителей семейства Enterobacteriaceae. В очищенных от нуклеиновых кислот препаратах ЛПС присутствуют углеводы (42 - 81 %), незначительное количество нуклеиновых кислот (1 - 7 %) и следовые количества белка.

Анализ моносахаридного состава ЛПС P. fontium показал, что исследованные штамы можно отнести к 4 хемотипам. В ЛПС представителя первого хемотипа (шт. 97U124) выявлена глюкоза (94,1 %), второго (штаммы 20125, 29671 та 28652) - глюкоза (70,1, 50,3 і 74,6 %) и галактоза (24,7, 34,8 і 18,3 %), третьего (штаммы 97U116, 27480, 96U101), глюкоза (28,8, 27,9 і 49,8 %), галактоза (31,2, 18,6 і 18,4 %) и рамноза (35,1, 45,2 і 23,9 %), четвертого (шт. 28203) - глюкоза (38,5 %), галактоза (25,5 %), рамноза (10,0 %) и манноза (19,5 %). В составе всех исследованных ЛПС присутствует гептоза от 4,9 до 14,9 %, 2-кето-3-дезоксиоктоновая кислота от 0,6 до 2,7 % и глюкозамин от 5,8 до 18,85 %.

Установлено, что изолированные из P. fontium ЛПС содержали все характерные для этих биополимеров компоненты.

В результате мягкого кислотного гидролиза получены структурные компоненты молекулы ЛПС: липид А, олигосахарид кора (ОГ-кора) и О-специфический полисахарид (О-ПС). По составу дифференцирующих для липидов А жирных кислот, 8 исследуемых штаммов можно отнести к одному хемотипу: они содержат 3-окситетрадекановую (42,1 - 49,6 %), тетрадекановую (19,7 - 28,9 %), гексадеценовою (7,5 - 17,9 %), гексадекановою (7,3 - 15,4 %) и додекановую (1,5 - 4,9 %) жирные кислоты.

Водорастворимые продукты гидролиза ЛПС разделяли гель-хроматографией. Показано, что профили элюции углеводной части деградированных ЛПС 5 исследованных штаммов (20125, 28203, 97U116, 27480, 97U124) являются типичными для S-форм и представляют смесь S- и R- форм молекул ЛПС. Макромолекулярная организация ЛПС 3 других штаммов P. fontium представлена R- (29671) или SR- (28652 та 96U101) формами ЛПС. Гетерогенность ЛПС была подтверждена также ДСН-ПААГ электрофорезом.

При изучении ОГ-коров показано, что гептозы и КДО присутствовали во всех исследуемых штаммах. Доминирующими моносахаридами ОГ-коров всех исследуемых штаммов была глюкоза (13,41 - 62,40%) и галактоза (5,02 - 32,16 %). ОГ-кора также содержали рамнозу (1,33 - 32,07 %) (97U116, 27480, 96U101), рибозу (0,79 - 46,63 %) (27480, 96U101) и арабинозу (4,58 %) (шт. 28203). По моносахаридному составу ОГ-кора можно отнести к 5 хемотипам.

Анализ моносахаридного состава свидетельствует, что О-ПС ЛПС всех исследованных штаммов можно разделить на 4 хемотипа. ЛПС 4-х штаммов P. fontium (20125, 28652, 96U101 и 97U124) содержали только один моносахарид - глюкозу, то-есть, они, вероятно, представлены глюканами. О-ПС также содержали глюкозу от 8,94 до 93,7 % (97U116, 28203) галактозу от 2,25 до 63,11% (97U116, 28203), рамнозу от 1,48 до 92,79%(97U116, 28203) и манозу 2,48 і 23,97% (28203).По моносахаридному составу О-ПС.

В реакциях двойной иммунодиффузии в агаре по Оухтерлони и имуноэлектрофорезе ЛПС P. fontium в гомологичных системах проявляли активность антигена, а в гетерологичних системах выявлены перекрестные серологические реакции у штаммов P. fontium 20125 и 29671.

Исследуемые ЛПС были токсичны и пирогенны. Модификация ЛПС штаммов 20125 и 96U101комплексом германия с 2-гидроксибензоилгидразоном салицилового альдегида приводила к потере их серологической активности и снижению пирогенности.

Показано, что ЛПС P. fontium и их структурные компоненты могут конкурировать с адгезинами E. coli и фитогемаглютинином за связывание с рецепторами на поверхности эритроцитов кролика. Сравнительный анализ влияния разных структурных компонентов свидетельствует, что наибольшее ингибирующее действие на адгезивные процессы проявляют липиды А всех исследованных штаммов P. fontium.

ЛПС, выделенные из клеток P. fontium, которые выращивали при низкой температуре (4⁰С), были более токсичными и пирогенными, но хуже ингибировали адгезивные процессы, чем ЛПС, полученные из клеток, которые выращивали при более высоких температурах (25 и 36⁰С).

Ключевые слова: Pragia fontium, липополисахарид, О-специфический полисахарид, олигосахарид кора, липид А, токсичность, пирогенность, адгезия, модифицированный ЛПС.

SUMMARY

Shubchynskyy V.V. Lipopolysaccharides Pragia fontium: chemical characterization and biological activity. - Manuscript.

The thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.07 - microbiology. - Institute of microbiology and virology named D.K. Zabolotny of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2008.

The dissertation is devoted to investigations of Pragia fontium lipopolyssaccharides (LPS). LPS were isolated by water-phenol procedure from 8 strains of P. fontium 20125, 29671, 28203, 28652, 97U116, 27480, 96U101, 97U124 and its yields varied from 9 to 22 % (depending on strain tested), that a little higher than in other representatives of family Enterobacteriaceae (5%). Purified preparations of LPS contained significant amounts of carbohydrates (42 - 81%), minor amounts of nucleic acids (1 - 7%) and minute amounts of proteins (depending on strains). Their chemical identification showed that LPS tested contain all components which are characteristic for this type of polymers. Macromolecular organization of LPS investigated strains were represented by S-, R- і SR-forms. Divergence of P. fontium LPS properties was established in order: lipid A - O-specific polysaccharides (O-PS) - core oligosaccharides (1, 4 and 5 chemotypes corresponding).

The LPS tested were toxic, pyrogenic and participated in adhesion processes. Modifications of LPS lead to the loss of their serological activity and decrease pyrogenicity. In reactions of double diffusion in agar by Ouhterlony it was established that LPS of strains 28203, 97U116, 27480, 96U101, 97U124 reacted only with homological O-antiserum, which denoted on lacking of common antigenic determinant, which were complementary to antibodies of another strains tested. LPS of type strain 20125 and strain 29671 were cross reacted with antisera to these strains that can be evidence of belonging to one of the same serogroup.

LPS isolated from strain 20125 that cultivated in different temperatures were differed by composition of fatty acids, level of toxicity, pyrogenicity and participation in adhesion processes.

Key words: Pragia fontium, lipopolyssaccharide, O-specific polysaccharide, core oligosaccharide, lipid A, toxicity, pyrogenicity, adhesion, modified LPS.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Незважаючи на те, що Enterobacteriaceae відносяться до родини мікроорганізмів найбільш вивчених фено- і генотипно, тим не менш їх систематика постійно змінюється і вдосконалюється. Так, в останні роки різними дослідниками із застосуванням як традиційних, так і сучасних методів хемо- і геносистематики були відкриті нові роди Enterobacteriaceae, які характеризуються різною спорідненістю з типовим родом - Escherichia. Одним з таких родів є Pragia, представлений видом Pragia fontium. В 1988 р. E. Aldova із співавт., проаналізувавши фенотипні і генотипні характеристики 18 штамів сірководеньпродукуючих атипових ентеробактерій, дійшли до висновку, що вони є представниками нового роду родини Enterobacteriaceae. Вони характеризуються низькою спорідненністю з Escherichia (5% гомології ДНК), але на рівні різних родів однієї родини. В останні роки P. fontium все активніше досліджується мікробіологами різних галузевих напрямків. Це обумовлено тією роллю, яку відіграють ці бактерії в процесах кругообігу речовин в природі, їх значенням як співчлена біоценозів різних екологічних систем (ґрунту, води, відкритих водойм тощо). P. fontium виділяють також при бактеріологічних дослідженнях продуктів харчування, питної води, проб клінічного матеріалу (випорожнень, виділень зіва, гною ран, тощо) від хворих і здорових людей.

Відомо, що багато процесів, які визначають біологічні особливості мікроорганізмів, характер взаємовідносин між ними, а також мікро- та макроорганізмами в біоценозах, здійснюються за участю компонентів поверхневих структур бактеріальної клітини, які безпосередньо контактують з навколишнім середовищем. Серед них особливий інтерес викликають ліпополісахариди (ЛПС) - основні компоненти зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій. ЛПС характеризуються широким спектром біологічної активності, в тому числі і ендотоксичної, зокрема пірогенністю, летальною токсичністю, реакцією Шварцмана, тощо. Розміщуючись на поверхні мікробної клітини і взаємодіючи з іншими біополімерами, вони стабілізують зовнішню мембрану, виконуючи в ній конструктивну роль; здійснюють бар'єрну функцію, перешкоджаючи проникненню в мікробну клітину отрут, детергентів, антибіотиків та інших лікарських препаратів; служать рецепторами бактеріоцинів і фагів, тощо. Як основні термостабільні антигени і ендотоксини мікробної клітини, ЛПС визначають її серологічну специфічність, О-антигенність, беруть участь у здійсненні інфекційного процесу в різних біологічних системах. Оскільки ЛПС є біологічно активними речовинами, вони відомі як трансформуючі агенти, неспецифічні стимулятори захисних сил макроорганізму, тощо. Тому інформація про їх властивості важлива для формування науково обґрунтованих підходів створення на їх основі лікувальних, вакцинних, діагностичних препаратів, розробки біотехнологій отримання рідкісних вуглеводів. Завдяки специфічності ЛПС для таксонів різних рангів, їх склад та будова - один із визнаних в останній час хемотаксономічних критеріїв при створенні класифікаційних схем мікроорганізмів. Завдяки особливостям еволюційного розвитку, склад і будова окремих частин макромолекул ЛПС ліпіду А, олігосахариду кору (ОГ-кор) та О-специфічного полісахаридного ланцюга (О-ПС) характеризують таксони різних рівнів, оскільки їм притаманна різна ступінь консервативності. Що стосується P. fontium, то на сьогодні в літературі відсутні роботи стосовно ізолювання, хімічної характеристики ЛПС, оцінки їх біологічної активності. Разом з тим такі дослідження дозволять зрозуміти механізм розвитку й індукції біологічної дії ЛПС, а також їх функціонування на молекулярному рівні. Дані щодо будови ЛПС складають хімічну основу внутрішньовидових класифікаційних схем бактерій, необхідних для епідеміологічних цілей, а також для ідентифікації штамів, які викликають інфекції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України і включає дослідження, виконані згідно плану науково-дослідних робіт інституту за темами:

· “Дослідження молекулярних основ функціональної та біологічної активності полімерів (ліпо-, полісахаридів, ферментів) мікробної клітини ” (2002-2007 рр. № держ. реєстр., 0103U0005876, шифр теми за планом інституту 07.80);

· “Мембранні та позаклітинні глікополімери мікроорганізмів: біохімічні і молекулярно-біологічні властивості” (2008-2012 рр. № держ. реєстр., 0108U002094 шифр теми за планом інституту 07.84).

Мета та завдання досліджень. Метою дослідження було вивчення особливостей складу, молекулярної організації, а також деяких аспектів біологічної активності ліпополісахаридів та їх структурних компонентів восьми штамів P. fontium - представників нового виду Enterobacteriaceae.

Відповідно до поставленої мети були сформульовані такі задачі:

· виділити, здійснити очистку і хімічну ідентифікацію (моносахаридний, гексозамінний, амінокислотний і жирнокислотний склад) ЛПС;

· одержати в індивідуальному стані і дослідити складові молекули ЛПС: липідів А, олігосахаридів кору і О-специфічних полісахаридів;

· оцінити гетерогенність макромолекули ЛПС;

· встановити вплив температури культивування мікроорганізмів на хімічний склад і біологічні властивості ЛПС;

· одержати О-антисироватки до досліджуваних культур, вивчити серологічні взаємозв'язки між ними на основі О-антигенності ЛПС;

· вивчити біологічні властивості ЛПС (токсичність, пірогенність, адгезивність);

· отримати хімічно модифіковані форми ЛПС;

· провести порівняльне вивчення біологічної активності нативних та модифікованих ЛПС.

Об'єкт дослідження - ліпополісахариди представників нового мало вивченого виду ентеробактерій P. fontium.

Предмет дослідження - хімічний склад ЛПС, їх структурних компонентів, антигенна, токсична, пірогенна, адгезивна дії.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували мікробіологічні, біохімічні, фізико-хімічні, імунологічні та статистичні методи, а також методи контролю пірогенності і токсичності досліджуваних ЛПС.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше вивчені ЛПС представників нового, раніше не дослідженого виду ентеробактерій P. fontium. Виявлена гетерогенність штамів за компонентним складом ЛПС, яка для більшості з них корелює з відсутністю серологічних взаємозв'язків між ними. Вперше на основі О-антигенності ЛПС, досліджувані штами P. fontium віднесені до 7 серогруп, що свідчить про імунохімічну гетерогенність виду P. fontium. Показана здатність гідразонових комплексів германію блокувати вільні гідроксильні групи моносахаридів О-ПС, які приймають участь в серологічній активності ЛПС.

При порівняльному вивченні окремих структурних компонентів макромолекули ЛПС досліджуваних бактерій показана дивергенція їх властивостей в порядку: ліпід А - О-ПС - олігосахарид кору. Найбільші розходження спостерігались в моносахаридному складі олігосахаридів корів (5 хемотипів). На рівні компонентного складу О-ПС виявлено менше розходжень (4 хемотипи). Препарати ліпідів А всіх восьми вивчених штамів P. fontium характеризувалися практично однаковим набором жирних кислот (1 хемотип).

Вперше показано, що ЛПС досліджуваних штамів характеризуються різним ступенем прояву токсичності і пірогенності. Токсичність ЛПС P. fontium на три порядки нижча, ніж у ЛПС E.coli O55:B5, в той час як пірогенність більша, ніж у “Пірогенала” - фармацевтичного препарату на основі Shigella typhi. Вперше показано, що модифікація ЛПС гідразоновими комплексами германію (IV) не призводить до втрати пірогенності.

Вперше встановлено, що ЛПС, отримані при різних температурах вирощування досліджуваних штамів, відрізняються за хімічним складом та біологічними властивостями.

Вперше показано, що ЛПС P. fontium беруть активну участь в адгезивних процессах.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати мають особливу цінність для таксономії представників гетерогенного виду P. fontium, а також можуть бути використані при подальших розробках внутрішньовидової класифікаційної схеми виду P. fontium та встановленні його спорідненності з іншими видами Enterobacteriaceae на основі О-антигенності ЛПС. Дані щодо складу ліпіду А, олігосахариду кору і О-специфічного полісахариду можуть бути корисними при встановленні ролі ЛПС в організації і функціонуванні зовнішньої мембрани клітинної оболонки грамнегативних бактерій, для виявлення філогенетичних взаємозв'язків між ними, а також можуть бути фундаментом для практичного використання ЛПС, зокрема, при створенні й удосконаленні на їх основі вакцинних, імуномодулюючих і інших медичних препаратів.

Результати дисертаційної роботи можуть бути використані при викладанні студентам біологічних факультетів курсу “Основи глікобіології”, а також при підготовці курсових і дипломних робіт студентами цих факультетів.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Дисертантом особисто зібрана і проаналізована література з теми дисертації, розроблені методичні підходи щодо виконання поставленої мети, експериментального її обґрунтування, узагальнення одержаних результатів. Основні експериментальні дані були одержані здобувачем особисто: напрацьована бактеріальна маса 8 досліджуваних штамів P. fontium, з яких виділені ЛПС і їх структурні компоненти. В одержаних ЛПС визначений вміст вуглеводів, нуклеїнових кислот, білку, неорганічного фосфору. Проведений аналіз моносахаридного, амінокислотного, гексозамінного та жирнокислотного складу виділених препаратів ЛПС. Вивчена пірогенна та токсична дія нативних і модифікованих ЛПС. Здобувач самостійно одержав антисироватки до досліджуваних штамів P. fontium і провів імунохімічні дослідження із застосуванням методів кільцепреципітації, аглютинації, імуноелектрофорезу, подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні. Одержання модифікованих ЛПС здійснено спільно з д.х.н. Сейфулліною І. Й., кандидатами х.н. Шматковою Н. В., Самбурським С. Е. (Одеський національний університет), які є співавторами публікацій дисертанта.

Автор висловлює особливу подяку науковому керівнику д.б.н., проф. Л.Д. Варбанець за всебічну допомогу при інтерпретації та формулюванні основних положень і висновків, підготовці публікацій за результатами досліджень та представленні їх на наукових конференціях.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались та обговорювались на конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ (Київ, 2006, 2007 рр.); Міжнародній науковій конференції "Мікробні біотехнології" Одеса. 2006; 14^th European Carbohydrate symposium (Lubeck, Germany, 2007); The young scientists and students international scientific conference "Modern problems of microbiology and biotechnology" (Odesa, 2007); 2 міжнародній конференції молодих учених "Біологія: від молекули до біосфери" (Харків, 2007); 3 міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів "Молодь та поступ біології" (Львів, 2007), 24 International Carbohydrate Symposium (Oslo, Norway, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових робіт, з яких 4 статті у фахових виданнях та 6 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках машинописного тексту і складається з розділів: вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати досліджень, який включає 3 розділи власних досліджень, узагальнення результатів, висновки та список використаних джерел. Дисертаційна робота містить 25 таблиць та 45 рисунків. Бібліографічний список складає 212 джерел.

Розділ 1. Огляд літератури

Огляд літератури представлений двома підрозділами. Перший містить аналіз біологічних властивостей представників P. fontium, а також питань таксономії і підходів щодо їх розв'язання. У другому підрозділі обговорюються дані щодо складу, будови та біологічної активності ліпополісахаридів грамнегативних бактерій. Висвітлено роль ЛПС, як ендотоксинів і детермінант патогенності.

Розділ 2. Матеріали і методи

Об'єктом дослідження було 8 штамів Pragia fontium, виділених з води різного походження (табл. 1). Штами були люб'язно надані завідуючим відділом нових та маловивчених інфекцій Інституту мікробіології та імунології АМН України, к.м.н. Сергієм Івановичем Похилом, за що висловлюємо йому щиру вдячність.

Таблиця 1

Походження досліджених штамів P. fontium

Штам	Джерело та місце виділення	Автор, який ізолював штами
20125 DRL (типовий)	Питна вода, м. Frydek-Mistek, Чехія	Aldova E., Пражський інститут гігієни та епідеміології
27480 DRL	Вода з водогону, м. Vlachovo Brezi, Чехія	Aldova E., Пражський інститут гігієни та епідеміології
29671 DRL	Колодязна вода, м. Zoikov, Чехія	Aldova E., Пражський інститут гігієни та епідеміології
28203 DRL	Питна вода, м. Pelhrimov, Чехія	Aldova E., Пражський інститут гігієни та епідеміології
28652 DRL	Питна вода, м. Trutnov, Чехія	Aldova E., Пражський інститут гігієни та епідеміології
97U116 ЛЕПМД	Вода з річки Ворскла, Полтавська обл., Україна	Похил С.І., Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України
96U101 ЛЕПМД	Колодязна вода, Полтавська обл., Україна	Похил С.І., Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України
97U124 ЛЕПМД	Вода з річки Сіверський Донець, Харківська обл., Україна	Похил С.І., Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України

Вирощування бактерій здійснювали методом періодичного культивування на кругових качалках з використанням синтетичного середовища N (Vidaver, 1967).

Виділення та очищення ЛПС із сухої бактеріальної маси проводили за водно-фенольним методом Вестфаля і Янна. ЛПС очищали від нуклеїнових кислот шляхом ультрацентрифугування. Деградацію молекули ЛПС здійснювали м'яким кислотним гідролізом в 1-2 % оцтовій кислоті (100 ⁰С, 3-5,5 год в залежності від штаму). Гідрофільну та гідрофобну частини деградованого ЛПС відділяли центрифугуванням (25000 g, 40 хв). Вуглеводні компоненти деградованої молекули ЛПС фракціонували на колонці (70,0 Ч 3,0 см) з сефадексом G-50, використовуючи 0,025 N піридин-ацетатний буфер pH 4,5. Визначення кількості вуглеводів здійснювали за Dubois (1956), нуклеїнових кислот - за Спіріним (1958), білку - за Lowry et al. (1951), загального фосфору (метод Фіске-Суббароу), 2-кето-3-дезоксиоктонову кислоту (КДО) - реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Droge, 1970), гептози - реакцією з цистеїном та сірчаною кислотою (Davies, 1957).

Ідентифікацію нейтральних моносахаридів (ЛПС і його структурних компонентів) у вигляді ацетатів поліолів проводили на хромато-мас-спектрометричній системі Agilent 6890N/5973 inert (США), колонка DB-225 з використанням комп'ютерної бази даних ChemStation. Жирнокислотний склад ліпіду А визначали, аналізуючи препарати у вигляді метилових ефірів жирних кислот на хромато-мас-спектрометричній системі Аgilent 6890N/5973 inert (США), колонка НР-5MS з використанням персонального комп'ютера та стандартної суміші метилових ефірів жирних кислот. Визначення вмісту амінокислот проводили на аналізаторі амінокислот KLA (“Hitachi”, Японія). Аналіз аміносахаридів методом газорідинної хроматографії (ГРХ) без дезамінування здійснювали на хромато-мас-спектрометричній системі Аgilent 6890N/5973 inert (США), колонка DB-225 з використанням персонального комп'ютера.

Чутливість бактерій до поліміксину виявляли диско-дифузійний методом.

Участь ЛПС в процесах адгезії досліджували на двох моделях. В першій моделі вивчали вплив різних концентрацій ЛПС P. fontium на адгезію клітин E. coli до нативних еритроцитів кроля (розгорнутий метод Бріліса та співавт.), яку виражали в індексах адгезивності (ІАМ). У другій моделі, для виявлення дії ЛПС P. fontium на адгезію використовували чутливу реакцію аглютинації нативних еритроцитів кроля фітогемаглютиніном.

Антисироватки до грітих впродовж 2,5 год при 100 ⁰С клітин P. fontium отримували шляхом 5 внутрішньовенних імунізацій кролів зростаючими дозами суспензії мікробних тіл (10 - 80 Ч 10⁶ кл/мл), з інтервалом між ін'єкціями 7 діб. Кров у тварин відбирали на сьомий день після останньої імунізації. Вивчення антигенної активності ЛПС проводили методами кільцепреципітації, аглютинації, подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні.

Імуноелектрофоретичний розподіл ЛПС проводили у вигляді мікроелектрофорезу в 1 % агарозному гелі в 0,025 М в трис-гліциновому буфері, рН 8,3, при напрузі 80-95 V на пластину (12 mА). Електрофорез здійснювали в системі ДСН-ПААГ (Laemmli, 1970) із застосуванням 5 % акриламідному концентруючому та 12 % акриламідному розділяючому гелях при силі струму в 12 mA та 25 mA відповідно. Гелі фарбували за допомогою азотнокислого срібла (Tsai, 1982).

Пірогенну дію вивчали на кролях шляхом внутрішньовенного введення встановленої мінімальної пірогенної дози ЛПС з подальшою термометрією тварин протягом 3 год. Токсичність (ЛД₅₀) досліджували при внутрішньочеревинному введенні ЛПС мишам, сенсибілізованих D-галактозамінгідрохлоридом.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили з використанням t-критерію Ст'юдента.

Розділ 3. виділення лПС P. fontium ТА ДОСЛІДЖЕННЯ ЇХ КОМПОНЕНТНОГО СКЛАДУ

Характеристика ЛПС. Із восьми досліджуваних штамів P. fontium були

одержані сухі бактеріальні клітини, з яких водно-фенольним методом виділені ЛПС. Необхідно відзначити, що досліджувані штами характеризувалися різним виходом ЛПС до сухої маси клітин, який варіював в залежності від штаму (9 - 22 %). За цим показником ЛПС досліджених штамів можна умовно поділити на дві групи: до першої входять штами, у яких вихід становить близько 10% від сухої маси клітин; до другої групи - близько 20 %. Таким чином, вихід ЛПС у P. fontium аналогічний до Rahnella aquatilis (від 5,2 до 19,8 %), але перевищує середні показники, характерні для інших представників родини Enterobacteriaceae - 5 %, але менше ніж у деяких штамів роду Pseudomonas, вихід ЛПС у яких становив до 32%.

Оскільки препарати містили значну кількість нуклеїнових кислот (до 30 %), що не дивно, зважаючи на особливості методу екстракції ЛПС, було проведено їх очищення шляхом ультрацентрифугування, осадження трихлороцтовою (ТХО) кислотою та гель-фільтрацією на колонці з Сефарозою 2В. Найбільш ефективним методом виявилось ультрацентрифугування, в той час як при очищенні ЛПС шляхом осадження нуклеїнових кислот ТХО кислотою спостерігалася значна його втрата, а гельфільтрацією на колонці з Сефарозою 2В не був досягнутий достатній рівень очистки. Очищені препарати ЛПС містили значну кількість вуглеводів від 42 до 81 % в залежності від штаму, незначну кількість нуклеїнових кислот (1 - 7 %), слідові кількості білка. Вміст загального фосфору складав 0,2 - 0,42 %.

Вивчення моносахаридного складу ЛПС показало (табл. 2), що досліджувані штами можна віднести до 4 хемотипів. ЛПС, віднесені до першого хемотипу (шт. 97U124) містять у своєму складі лише глюкозу (94,1 %), до другого хемотипу (штами 20125, 29671 та 28652) - глюкозу (70,1, 50,3 і 74,6 % відповідно) та галактозу (24,7, 34,8 і 18,3 % відповідно), до третього (штами 97U116, 27480, 96U101), глюкозу (28,8, 27,9 і 49,8 %), галактозу (31,2, 18,6 і 18,4 %) і рамнозу (35,1, 45,2 і 23,9 %), до четвертого (шт. 28203) - глюкозу (38,5 %), галактозу (25,5 %), рамнозу (10,0 %) і манозу (19,5 %). В складі всіх досліджуваних ЛПС присутня гептоза, вміст якої коливався в залежності від штаму від 4,9 до 14,9 % та 2-кето-3-дезоксиоктонова кислота від 0,6 до 2,7 % в залежності від штаму (табл. 2), які є специфічними компонентами ЛПС грамнегативних бактерій.

В складі ЛПС всіх 8 досліджуваних штамів P. fontium виявлено глюкозамін (5,8 - 18,85 %). Згідно даних літератури він входить до складу більшості досліджених на сьогодні ліпідів А. Але не рідко поряд з іншими аміносахарами він може бути структурним компонентом полісахаридної частині молекули ЛПС.

Таким чином, ізольовані з P. fontium ЛПС містять усі характерні для цих біополімерів компоненти.

ЛПС представляє собою складну комплексну молекулу, в якій вуглеводна частина приєднана до ліпіду А глікозидним зв'язком через залишок КДО. Цей зв'язок характеризується високою кислотолабільністю, тому може бути вибірково розщеплений в умовах м'якого кислотного гідролізу. Завдяки цьому ЛПС можна легко розділити на розчинний у воді вуглеводний матеріал, який містить О - специфічний полісахаридид і олігосахарид кору, та нерозчинний- ліпід А.

Ліпід А виявляли в осаді при центрифугуванні гідролізату. Аналіз жирнокислотного складу показав присутність жирних кислот, які містять в ланцюгу від 12 до 16 атомів вуглецю (табл. 3). Домінуючою в ліпідах А всіх досліджених штамів була 3-гідрокситетрадеканова кислота, від 42,1 до 49,6 % в залежності від штаму. Також виявлені тетрадеканова (19,7 - 28,9 %), гексадеценова (7,5 - 17,9 %), гексадеканова (7,3 - 15,4 %) та додеканова (1,5 - 4,9 %) жирні кислоти. За жирнокислотним складом ліпіди А всіх досліджуваних штамів можна віднести до одного хемотипу. Своєрідність жирнокислотного складу ліпіду А, найбільш консервативної частини молекули ЛПС, може бути використана як додатковий таксономічний критерій при диференціації видів. І дійсно, як і для інших представників Enterobacteriaceae, для ліпіду А P. fontium характерна присутність тільки однієї диференціюючої жирної кислоти - 3-гідрокситетрадеканової, яка, згідно даних літератури, ацилює як аміно-, так і гідроксильні групи глюкозаміну. Отже, отримані нами дані є додатковим показником, який підтверджує правильність віднесення досліджуваних штамів до представників ентеробактерій.

Вивчення жирнокислотного складу ліпіду А ЛПС типового штаму 20125, який вирощували при різних температурах: 4, 25 і 36°С свідчить, що якісних змін не спостерігається, але виявлено зміни в кількісному складі. Так, з підвищенням температури збільшувався вміст насичених жирних кислот - додеканової, тетрадеканової та зменшувалась кількість ненасиченої жирної кислоти - гексадеценової (табл. 3). Це свідчить про наявність у мікроорганізмів регулювального механізму контролю плинності мембран для збереження її цілісності і функціональної активності.

В ліпідах А деяких бактерій можуть бути присутні замісники, які змінюють біологічні властивості не тільки ЛПС, але всієї бактеріальної клітини. Для виявлення деяких замісників, зокрема 4-аміно-4-дезокси-L-арабінози (L-Ara4N), нами був використаний непрямий метод. Відомо (Breazeale, 2005), що при наявності такого замісника в молекулі ліпіда А, клітини бактерій є резистентними до деяких полікатіонних антибіотиків, зокрема поліміксину В. Оскільки всі 8 досліджених штамів P. fontium виявилися чутливими до дії поліміксину В, що відображалося у значних зонах затримки росту (17 - 24 мм), можна зробити висновок, що ЛПС, отримані з цих штамів, не містять в складі ліпіду А L-Ara4N, тому поліміксин В має можливість приєднуватись до молекули глюкозаміну.

Гетерогенність ЛПС. Водорозчинні продукти м'якого кислотного гідролізу ЛПС, які представляють вуглеводну частину макромолекули, розділяли гель хроматографією на колонці з сефадексом G-50 (рис. 1). На основі присутності фракцій О-специфічного полісахариду (1, 1) і фракцій, які належать олігосахариду кора (2, 3), можна стверджувати, що криві елюції 5 досліджуваних штамів (20125, 28203, 97U116, 27480, 97U124) є типовими для S-форм і представляють суміш S- та

Таблиця 2

Моносахаридний склад ЛПС P. fontium та їх структурних компонентів

Штам	Препарат	у % до загальної суми площ піків	% до сухої маси препарату
		Рамноза	Рибоза	Арабіноза	Ксилоза	Маноза	Галактоза	Глюкоза	Гептоза	КДО	Гептози
20125	ЛПС	-	-	-	-	-	24,7±1,1	70,0±1,7	5,3±0,54	1,02±0,08	9,1±0,5
	О-ПС	-	-	-	-	-	-	100	-	-	-
	ОГ-кор	-	-	-	-	-	18,98±0,72	45,02±1,71	36±1,37	2,5±0,09	20,1±1,4
29671	ЛПС	-	-	-	-	-	34,8±1,5	50,3±1,7	14,9±1,94	2,46±0,13	6,2±0,5
	ОГ-кор 1	-	-	-	-	-	18,7±0,77	44,46±1,82	36,84±1,51	2,7±0,07	18,3±1,5
	ОГ-кор 2	-	21,37±0,94	-	-	-	17,42±0,77	38,12±1,68	23,09±1,02	2,2±0,11	14,2±1,2
28203	ЛПС	10±2,1	-	-	-	19,5±2,4	25,5±1,4	38,5±2,0	6,5±1,02	2,73±0,09	5,9±0,9
	О-ПС 1	1,48±0,09	-	-	-	2,48±0,15	2,25±0,13	93,79±1,03	-	-	-
	О-ПС 2	3,99±0,15	-	-	-	23,97±0,91	63,11±2,4	8,94±0,34	-	-	-
	ОГ-кор 1	1,33±0,06	0,79±0,04	4,58±0,22	0,93±0,04	2,6±0,12	5,02±0,24	48,32±2,13	36,42±1,7	2,1±0,07	22,1±1,6
	ОГ-кор 2	-	22,7±1,13	-	-	-	-	62,4±2,12	14,91±0,75	2,6±0,12	10,3±1,1
28652	ЛПС	-	-	-	-	-	18,3±1,3	74,6±1,5	7,1±0,74	0,61±0,04	8,3±0,8
	О-ПС	-	-	-	-	-	-	100	-	-	-
	ОГ-кор 1	-	-	-	-	-	18,8±1,0	38,95±2,06	42,25±2,24	1,1±0,08	28,2±1,7
	ОГ-кор 2	-	-	-	-	-	25,58±1,43	61,46±3,44	12,96±0,73	0,5±0,04	13,1±1,3
97U116	ЛПС	35,1±1,7	-	-	-	-	31,2±1,4	28,8±1,1	4,9±0,7	0,48±0,05	4,9±0,8
	О-ПС 1	33,27±1,46	-	-	-	-	51,39±2,26	15,34±0,67	-	-	-
	О-ПС 2	3,88±0,38	-	-	-	-	3,32±0,66	92,79±1,36	-	-	-
	ОГ-кор 1	4,05±0,24	-	-	-	-	6,57±0,39	45,98±1,71	43,39±1,56	0,54±0,06	34,7±2,1
	ОГ-кор 2	4,61±0,26	20,65±1,16	-	-	-	18,07±1,01	41,9±2,35	14,77±0,83	0,6±0,05	12,8±1,2
27480	ЛПС	45,2±2,0	-	-	-	-	18,6±2,1	27,9±1,9	8,3±0,92	0,31±0,04	7,9±0,8
	О-ПС 1	-	-	-	-	-	-	100	-	-	-
	О-ПС 2	60,58±1,97	-	-	-	-	-	39,42±1,97	-	-	-
	ОГ-кор 1	14,64±0,56	-	-	-	-	13,04±0,5	42,06±1,6	30,26±1,15	0,52±0,05	24,6±1,5
	ОГ-кор 2	-	46,63±1,91	-	-	-	8,11±0,33	40,42±1,66	4,84±0,2	0,48±0,04	6±0,5
96U101	ЛПС	23,9±1,0	-	-	-	-	18,4±1,2	49,8±1,5	7,9±0,87	0,14±0,03	8,4±0,7
	О-ПС 1	-	-	-	-	-	-	100	-	-	-
	ОГ-кор 1	19,4±0,85	3,38±0,15	-	-	-	32,16±1,42	27,96±1,23	17,1±0,75	0,8±0,04	15,7±1,7
	ОГ-кор 2	32,07±1,51	39,18±1,84	-	-	-	13,78±0,65	13,41±0,63	1,56±0,07	0,75±0,06	2,3±0,5
97U124	ЛПС	-	-	-	-	-	-	94,1±1,1	5,9±1,1	0,61±0,05	4,5±0,4
	О-ПС 1	-	-	-	-	-	-	100	-	-	-
	О-ПС 2	-	-	-	-	-	-	100	-	-	-
	ОГ-кор 1	-	4,99±0,25	-	-	-	-	53,61±2,68	41,4±2,07	1,9±0,09	38,5±1,8
	ОГ-кор 2	-	39,31±2,08	-	-	-	-	54,23±2,87	6,46±0,34	2,1±0,10	5,4±0,7

Примітка “-“ - не виявлено

Таблиця 3

Жирнокислотний склад ЛПС P. fontium

ЛПС штамів:	Вміст жирних кислот, % до загальної суми площ піків
	До-деканова	Тетра-деканова	3-Гідрокси-тетрадеканова	Гекса-деценова	Гекса-деканова	Мінорні компоненти
20125	1,6±0,1	19,7±0,5	47,3±0,8	16,9±0,4	12,1±0,3	2,4±0,4
20125*	0,8±0,2	20,3±0,3	45,9±0,5	24,1±0,7	8,9±0,4	0
20125**	7,1±0,1	29,5±0,4	39,9±0,6	8,2±0,5	11,3±0,3	4,0±0,7
29671	1,5±0,1	20,7±0,3	49,6±0,7	17,9±0,6	7,7±0,4	2,6±0,6
28203	1,5±0,2	23,6±0,4	48,7±0,5	17,6±0,4	7,3±0,3	1,3±0,7
28652	2,2±0,2	23,5±0,3	42,1±0,6	13,4±0,3	15,4±0,4	3,4±0,5
97U116	4,9±0,2	23,5±0,4	45,8±0,4	8,6±0,4	12,6±0,1	4,6±0,3
27480	4,2±0,3	28,9±0,1	45,1±0,3	7,5±0,2	7,9±0,4	6,4±0,5
96U101	4,3±0,2	24,5±0,4	47,8±0,5	8,7±0,3	10,8±0,1	4.0±0,6
97U124	3,9±0,2	22,5±0,2	44,7±0,9	13,2±0,2	11,5±0,4	4,2±0,7

Примітка: 20125^* - ЛПС, одержаний вирощуванням культури при 4⁰С;

20125^** - ЛПС, одержаний вирощуванням культури при 36⁰С;

всі інші - ЛПС, одержані вирощуванням культур при 25⁰С.

адгезивний гетерологічний fontium

R- форм молекул ЛПС. Макромолекулярна організація ЛПС трьох інших штамів P. fontium відрізняється і, ймовірно, є R- (шт. 29671) або SR- (штами 28652 та 96U101) формами ЛПС (рис. 1). На користь цього припущення свідчать результати аналізу вмісту КДО і гептози, які вважаються характерними компонентами олігосахаридів кору. Як свідчать наведені в табл. 2 дані, КДО і гептози присутні в ОГ-кору всіх досліджуваних штамів P. fontium, але не знайдені ні в одному О-ПС.

Гетерогенність ЛПС, тобто наявність S-, SR-, R- типів була підтверджена також ДСН-ПААГ електрофорезом (рис. 2). Присутність як повільно-, так і швидко- рухливих фракцій корелює з даними, отриманими в результаті гель-хроматографії, і свідчать, що швидко рухливі зони відповідають не заміщеному ОГ-кору, а повільно рухливі - ОГ-кору, заміщеному О-специфічними ланцюгами. Гетерогенність повільно рухливих компонентів можна пояснити присутністю в молекулі ЛПС декількох бічних ланцюгів, які відрізняються за молекулярною масою, тому що містять широкий діапазон різних за довжиною молекул. Ця особливість обумовлює утворення класичного профілю у вигляді драбини на електрофореграмах. Результати ДСН-ПААГ електрофорезу корелюють з даними гель хроматографії, щодо макромолекулярної організації ЛПС.

Олігосахарид кору. ОГ-кору більш варіабельна в порівнянні з ліпідом А частина молекули ЛПС до недавнього часу була досліджена вкрай обмежено. І тільки в останні декілька років був досягнутий значний прогрес в структурній оцінці цього компоненту ЛПС. Препарати олігосахаридів кору ЛПС досліджуваних штамів елюювались при гель-фільтрації в області низькомолекулярних фрагментів однією або двома фракціями (рис. 1) і були гетерогенними за моносахаридним складом (табл. 2). Для олігосахаридів кору ЛПС більшості досліджуваних штамів характерна наявність глюкози (13,41 - 62,40%) і галактози (5,02 - 32,16 %), як домінуючих моносахаридів. ОГ-кору деяких штамів містили також рамнозу (1,33 - 32,07 %) (97U116, 27480 і 96U101) та/або рибозу (0,79 - 46,63 %) (27480, 96U101). ОГ-кору P. fontium шт. 28203 на відміну від інших досліджуваних штамів містив в своєму складі, крім незначних кількостей характерних моносахаридів, також і арабінозу (4,58%), яка досить рідко зустрічається в складі ОГ-корів, але нещодавно була ідентифікована в структурі ОГ-кора Hafnia alvei і в складі ОГ-корів Rahnella aquatilis. ОГ-кору шт. 97U124, крім глюкози, містив лише рибозу (4,99-39,31%). Порівняльне вивчення ОГ-кору свідчить, що у деяких штамів у другій фракції, на відміну від першої, присутня рибоза. За своїм моносахаридним складом ОГ-кору ЛПС P. fontium можна віднести до 5 хемотипів. За цим показником вони схожі з ЛПС представників іншого нового виду Enterobacteriaceae - R. aquatilis, які також характеризуються гетерогенністю, в них виявлено 9 хемотипів (Остапчук, 2005). Аналіз аміносахаридів олігосахаридів кору ЛПС досліджуваних штамів виявив у всіх фракціях, за винятком ОГ-кор 1 штамів 28652 та 96U101, глюкозамін (від 1,65 до 20, 78 %)

Результати щодо гетерогенності складу ОГ-корів ЛПС P. fontium підтверджують дані інших дослідників про значну структурну варіабельність в цій зоні, хоча раніше ОГ-корів вважались мало варіабельними компонентами ЛПС.

О-специфічні полісахариди. Найбільш варіабельною частиною молекули ЛПС є О-ПС. Аналіз моносахаридного складу свідчить, що О-ПС ЛПС 4-х досліджуваних штамів 20125, 28652, 96U101, 97U124 P. fontium містять лише один нейтральний моносахарид глюкозу, тобто ймовірно вони представлені глюканами. Причому О-ПС 1 і О-ПС 2 ЛПС P. fontium 97U124 представлені глюканами, які відрізняються за молекулярними масами (рис. 3). Глюкани з різною структурою раніше були ідентифіковані як частини ЛПС R. aquatilis (Остапчук, 2005), Helicobacter pylori (Altman, 2003). Обидві фракції О-ПС ЛПС шт. 97U116 представлені однаковими моносахаридами: галактозою, рамнозою і глюкозою, але в різному відсотковому співвідношенні (31,2 і 51,39%, 33,27 і 3,88 %, 15,34 і 92,79% відповідно). Найбільш широкий спектр нейтральних моносахаридів виявлений в обох фракціях О-ПС ЛПС P. fontium 28203: глюкоза, маноза, галактоза і рамноза, але співвідношення між ними дуже відрізняються (93,7 і 8,94 %, 2,48 і 23,97%, 2,25 і 63,11%, 1,48 і 3,99% відповідно). Тобто за моносахаридним складом О-ПС досліджуваних ЛПС можна віднести до 4 хемотипів.



Рис. 1. Профілі елюції на сефадексі G-50 вуглеводної частини деградованої молекули ЛПС P. fontium штамів: 20125 (I), 29671 (II), 28203 (III), 28652 (IV), 97U116 (V), 27480 (VI), 96U101 (VII), 97U124 (VIII);

де 1, 1 - фракції ОПС, 2, 3 - фракції ОГ-кору



Рис. 2. ДСН-ПААГ електрофорез ЛПС P. fontium штамів: 20125 (1), 29671 (2), 28203 (3), 28652 (4), 97U116 (5), 27480 (6), 96U101 (7), 97U124 (8). ЛПС шт. 20125, одержані вирощуванням культури при 4⁰С (9) і 36⁰С (10)

Вивчення структурних компонентів макромолекули ЛПС досліджуваних штамів P. fontium свідчить, що дивергенція їх властивостей відбувається в наступному порядку: ліпід А - О-ПС - олігосахарид кору (1, 4, 5 хемотипів, відповідно).

РОЗДІЛ 4. Імунохімічні дослідження ліпополісахаридів

Відомо, що серологічну специфічність мікробної клітини визначають особливості компонентного складу і структури ЛПС. Визначення імунохімічних властивостей ЛПС проводили з використанням поліклональних О-антисироваток, які одержували шляхом імунізації кролів грітими культурами досліджуваних штамів P. fontium, які слугували антигенами. Реакцією кільцеприципітації і аглютинації був визначений титр О-антисироваток досліджуваних штамів, який коливався в межах від 1,0х10^-3 мг/мл до 6,3х10^-6 мг/мл, відповідно, в залежності від штаму. В гомологічних системах при проведенні кільцеприципітації, аглютинації, подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні, імуноелектрофорезі виявлено, що досліджувані ЛПС проявляли серологічну активність щодо гомологічних О-антисироваток, характеризувалися складною антигенною будовою. Як один з підходів в класифікації різних видів бактерій, можуть бути використані перехресні серологічні реакції. Результати перехресних реакцій свідчать про серологічну різноманітність ЛПС досліджуваних штамів P. fontium. Так (рис. 3, 4), ЛПС 6-ти досліджуваних штамів (28203, 28652, 97U116, 27480, 96U101, 97U124) реагували лише з гомологічною О-антисироваткою, що вказує на відсутність в них антигених детермінант, які б були комплементарними до антитіл інших досліджуваних штамів. ЛПС типового шт. 20125 та шт. 29671 перехресно реагували з сироватками, одержаними до цих культур, що свідчить про наявність в ЛПС обох штамів загальних антигенних детермінант і може вказувати щодо їх належності до однієї серогрупи. Оскільки ЛПС шт. 20125 знаходиться в S-формі, а шт. 29671 - в R-формі, можна припустити,...