Таблиця 4

Визначення ЛД₅₀ ЛПС P. fontium

Примітка: 20125^* - ЛПС, одержаний вирощуванням культури при 4⁰С;

20125^** - ЛПС, одержаний вирощуванням культури при 36⁰С;

всі інші - ЛПС, одержані вирощуванням культур при 25⁰С

Пірогенність. Для проведення порівняльної оцінки пірогенних характеристик була встановлена мінімальна пірогенна доза ЛПС, яка складала 7,5Ч10^-3 мкг/мл апірогенного ізотонічного розчину. Результати термометрії (рис. 5) показали, що підвищення температури у експериментальних тварин більш ніж на 0,45^оC, що виходить за межі фізіологічної норми здорових тварин, викликали розчини ЛПС всіх досліджуваних штамів, введення яких протягом перших двох год приводило до різкого підвищення температури тіла у тварин. Як свідчать результати, ЛПС всіх досліджуваних штамів P. fontium виявляли значно більшу пірогенну активність ніж “Пірогенал” - фармацевтичний препарат, діючим компонентом якого є ЛПС Shigella typhi.

Рис. 5. Пірогенна дія ЛПС P. fontium

Примітка: 20125^* - ЛПС, одержаний вирощуванням культури при 4⁰С;

20125^** - ЛПС, одержаний вирощуванням культури при 36⁰С; всі інші - ЛПС, одержані вирощуванням культур при 25⁰С.

Фактором, який кардинально змінює у бактерій експресію ряду ознак, є температура їх інкубації. Хоча температурнозалежні зміни носять регуляторний характер, вони відображаються на синтезі конститутивних біополімерів клітини і, зокрема, на хімічній структурі ЛПС, що, в свою чергу, впливає на його ендотоксичні властивості. При дослідженні ендотоксичних властивостей встановлено (табл. 4, рис.5), що ЛПС, виділені з клітин P. fontium, які вирощували при низькій температурі (4⁰С), були більш токсичні і пірогенні, ніж ЛПС, одержані з клітин, вирощування яких проводили при більш високих (36⁰С) в порівнянні із звичайними (25⁰С) температурами. Аналогічні результати були одержані раніше дослідниками (Тынянова, 2003), які показали, що ЛПС, виділений із Yercinia pestis EV 76, яка вирощена при 28⁰С, проявляє токсичність щодо білих мишей в дозах 300-1000 мкг/кг. Препарати ЛПС, одержані шляхом вирощування бактерій при температурі 37⁰С, були нетоксичними при внутрішньочеревинному введенні їм 3000 мкг/кг.

Таким чином, вивчення токсичності і пірогенності ЛПС P. fontium показало, що вони менш токсичні, ніж ЛПС E. coli, але деякі з них більш пірогенні, ніж “Пірогенал”.

Одним із шляхів зміни біологічних властивостей ЛПС є хімічна модифікація. Як модифікатори, були використані комплекси германію (IV) з 2-амінобензоїл-, 2-гідроксибензоїл- і нікотиноїлгідразонами саліцилового альдегіду. Одержання модифікованих ЛПС було доведено шляхом порівняння ІЧ спектрів нативних і модифікованих ЛПС (рис. 6). На відміну від спектру нативного ЛПС, ІЧ спектри модифікованих були набагато складніші. Крім смуг, характерних для молекули ЛПС зокрема (OH) + (NH) = 3431 см^-1_, (СH) = 2925 и 2854см^-1 (як, наприклад в спектрі 28203(I)), які свідчать про присутність ОН- NH- і СН- груп, в спектрах модифікованих ЛПС спостерігається значне збільшення кількості характерних частот в області 1570-1150см^-1, які відповідальні за валентні коливання зв'язків (P=O), (P-O-C), (С - O) і (OH). Це відбувається внаслідок взаємодій коливань цих груп, які найбільш чутливі до змін характеру водневих зв'язків.

Виникає нова система водневих зв'язків між OH^-, СOOH^-, H₂PO₄ ^- функціональними групами ЛПС і донорними центрами досліджуваних комплексів, яка призводить до утворення нових супрамолекулярних ансамблей, які характеризуються набагато меншою симетрією в порівнянні з ЛПС.

Результати порівняльних досліджень пірогенної дії нативних і модифікованих ЛПС (рис. 7) показали, що координаційні сполуки ЛПС P. fontium штамів 20125 і 96U101 з комплексом германію (IV) з 2-гідроксибензоїлгідразоном саліцилового альдегіду втратили пірогенну дію. Це може свідчити про те, що, ймовірно, в утворенні координаційних сполук германію з 2-гідроксибензоїлгідразином саліцилового альдегіду і ЛПС P. fontium шт. 20125 і 96U101 приймають участь не основні компоненти ліпіду А, а якісь інші сполуки, що є замісниками при С1 або С4 молекул глюкозаміна. Результатом такої модифікації може бути зміна конформації ліпіду А, внаслідок чого молекула ЛПС втратила свою ендотоксичну конформацію, яка відповідає за пірогенність.

Рис. 7. Пірогенна дія нативних і модифікованих ЛПС досліджуваних штамів P. fontium.

Примітка: I - комплекс германію (IV) з 2-амінобензоїлгідразоном саліцилового альдегіду; II - комплекс германію (IV) з 2-гідроксибензоїлгідразоном саліцилового альдегіду; III - комплекс германію (IV) з нікотиноїлгідразоном саліцилового альдегіду

Адгезія. Відомо, що ліпополісахариди є основними адгезинами в клітинах грамнегативних бактерій. Участь ЛПС в процесах адгезії досліджували на двох моделях. В першій моделі вивчали вплив різних концентрацій ЛПС P. fontium на адгезію клітин E. coli до нативних еритроцитів кроля (розгорнутий метод Бріліса та співавторів), де аналізували індекси адгезивності. Виявлено, що усі досліджені ЛПС P. fontium знижували індекс адгезивності: чим вища концентрація ЛПС P. fontium в реакційній суміші, тим менше відбувалося вдалих взаємодій між поверхневими структурами еритроцитів та клітинами E. coli. Найбільше інгібування адгезії спостерігалось під впливом ЛПС P. fontium шт. 27480, який в концентрації 3,3 мг/мл знижував середню кількість клітин E. coli О-55 на одному еритроциті, задіяному в адгезивному процесі (ІАМ), до 2,42. ЛПС штамів 20125, 29671, 28203, 97U116 та 96U101 при концентрації в реакційній суміші 3,3 мг/мл виявили приблизно однакову здатність до інгібування: показник ІАМ був близько 2,7. Вплив ЛПС штамів 97U124 та 28652 на процес адгезії був незначним: ІАМ в максимально досліджуваній концентрації складав приблизно 3,0. ЛПС P. fontium шт. 20125, отриманий при температурі вирощування 36 °С, ігібував адгезивні процеси активніше (ІАМ 2,36), ніж препарати, отримані з цього ж штаму при температурі 25 °С (ІАМ 2,81) та 4 °С (ІАМ 3,18) відповідно. У другій моделі дослідження процесів адгезіїї, для виявлення дії ЛПС P. fontium використовували чутливу реакцію аглютинації нативних еритроцитів кроля фітогемаглютиніном. Встановлено, що усі досліджені ЛПС P. fontium здатні інгібувати реакцію аглютинацію еритроцитів фітогемаглютиніном. ЛПС P. fontium штамів 28203, 27480 та 96U101 виявляли високу інгібуючу дію на адгезію еритроцитів фітогемаглютиніном, концентрація ЛПС, при якій спостерігався даний ефект, становила 0,206 мг/мл. Концентрація ЛПС, яка викликала подібну реакцію для штамів P. fontium 20125, 29671 та 97U116, становила 0,412 мг/мл, а для ЛПС штамів 28652 та 97U124 0,825 мг/мл. Порівняльне вивчення впливу окремих структурних компонентів досліджуваних ЛПС P. fontium свідчить, що по силі інгібування адгезії еритроцитів ФГА вони розташувалися наступним чином (в порядку зменшення впливу): ліпіди А > О-ПС > ОГ-кору. Мінімальна концентрація ліпідів А, яка ще викликала інгібування, складала 0,103 - 0,025 мг/мл, О-полісахаридів 1,65 - 0,206 мг/мл, олігосахаридів кору 3,3 - 0,825 мг/мл. Дещо вища інгібуюча дія ліпідів А, ймовірно може бути пов'язана з можливістю їх встроювання в клітинну мембрану еукаріотичних клітин (Warren, 1982). Оскільки більшість досліджуваних ЛПС містили по дві фракції О-ПС та ОГ-кору, був проведений порівняльний аналіз їх впливу на інігібування аглютинації еритроцитів кроля фітогемаглютиніном, який виявив деякі відмінності в їх дії. Так, О-ПС 1 штамів 97U116 та 97U124 сильніше інгібував адгезію, ніж О-ПС 2 цих же штамів , теж саме спостерігалося із з ОГ-кору 1 та ОГ-кору 2 шт. 27480. Показано, що ЛПС, одержаний вирощуванням P. fontium шт. 20125 при 36 °С, інгібував реакцію аглютинацію еритроцитів кроля ФГА при більш низьких концентраціях (0,0516 мг/мл), ніж ЛПС, одержані при температурі вирощування 25 та 4°С (0,4125 мг/мл).

Таким чином, вперше досліджено вплив ЛПС та їх структурних компонентів (ліпіди А, О - специфічні полісахариди та олігосахариди кору) 8 штамів P. fontium на процеси адгезії. Показано, що ЛПС P. fontium та їх структурні компоненти можуть конкурувати з адгезинами E. coli та фітогемаглютиніном за зв'язування з рецепторами на поверхні еритроцитів кроля. Порівняльний аналіз впливу різних структурних компонентів свідчить, що найбільшу інгібуючу дію на адгезивні процеси проявляють ліпіди А всіх досліджуваних штамів P. fontium. Оскільки вони не відрізнялись між собою складом жирних кислот, ймовірно, їх різна дія може бути обумовлена або наявністю замісників при С4 фосфату залишку глюкозаміну, або різною конформацією молекули ліпіду А. На користь останнього, свідчить те, що ліпід А P. fontium 27480, який інгібував адгезію при найменшій концентрації, проявляв найбільшу токсичну дію.

ВИСНОВКИ

Дисертаційна робота містить наукові положення і результати щодо особливостей складу, молекулярної організації, а також деяких аспектів біологічної активності ЛПС 8 штамів нового виду ентеробактерій - P. fontium, а також науково-прикладні аспекти щодо створення і розробки на їх основі імуномодулюючих препаратів із заданими властивостями.

Головні наукові результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Вперше виділено і хімічно охарактеризовано ЛПС 8 штамів P. fontium. Показано, що ЛПС 5 досліджуваних штамів (20125, 28203, 97U116, 27480, 97U124) є типовими для S-форм і представляють суміш S- та R- форм молекул ЛПС. Макромолекулярна організація ЛПС трьох інших штамів P. fontium відрізняється і, ймовірно, є R- (29671) або SR- (28652 та 96U101) формами ЛПС.

2. При порівняльному вивченні окремих структурних компонентів макромолекули ЛПС досліджуваних бактерій встановлена дивергенція їх властивостей у порядку: ліпід А - О-ПС - олігосахарид кору. Найбільші розходження спостерігаються в моносахаридному складі олігосахариду кору (5 хемотипів), менші - О-специфічного полісахариду (4 хемотипи), в той час як жирнокислотний склад ліпідів А всіх восьми вивчених штамів P. fontium є аналогічним і представлений одним хемотипом.

3. На основі О-антигенності ЛПС, досліджувані штами віднесені до 7 серогруп, що свідчить про імунохімічну гетерогенність виду P. fontium.

4. ЛПС P. fontium проявляють токсичність на три порядки нижчу, ніж ЛПС E. coli O55:B5, і пірогенність більшу, ніж “Пірогенал” - фармацевтичний препарат.

5. Вперше одержані модифіковані гідразоновими комплексами германію ЛПС P. fontium, які втратили серологічну активность, але зберегли таку ендотоксичну властивість, як пірогенність.

6. ЛПС P. fontium знижували кількість адгезованих клітин E. coli на еритроцитах кроля шляхом конкуренції за зв'язування з їх поверхневими структурами, а також інгібували аглютинацію еритроцитів фітогемаглютиніном.

7. Вперше при різних температурах вирощування культур P. fontium отримані ЛПС, які характеризуються різним хімічним складом, пірогенністю, токсичністю і адгезивністю.

СПИСОК РОБІТ, опублікованАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Варбанец Л.Д. Характеристика эндотоксического липополисахарида Pragia fontium DRL 27480 / Л.Д. Варбанец, В.В.Шубчинский, С.И. Похил // Современные проблемы токсикологии. - 2006. - №.2. - С.66-71. (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваного штаму, виділений ЛПС, проведені аналізи по вивченню хімічного складу та ендотоксичних характеристик).

2. Шубчинський В.В. Хімічна характеристика і серологічна активність ліпополіцукридів Pragia fontium / В.В. Шубчинський, Л.Д. Варбанець // Мікробіол. журн. - 2007. - Т.69, №6. - С.12-18. ( Здобувачем виділені ЛПС, вивчена серологічна активність).

3. Шубчинський В.В. Ендотоксична активність ліпополісахаридів Pragia fontium / В.В. Шубчинський, Л.Д. Варбанець, О.С. Броварська // Современные проблемы токсикологии. - 2007. - №.4. - С.35-38. (Здобувачем виділені ЛПС, вивчені хімічний склад, досліджено пірогенність і токсичність).

4. Шубчинський В.В. Хімічна характеристика структурних компонентів ліпополісахаридів Pragia fontium / В.В. Шубчинський, Л.Д. Варбанець // Мікробіол. журн. - 2008. - Т.70, №5. - С.13-22. (Здобувачем виділені ЛПС, отримані структурні компоненти, вивчений хімічний склад).

5. Шубчинский В.В. Перспектива использования липополисахаридов Pragia fontium DRL 27480 в разработке иммуномодулирующего препарата: тези доп. Міжнародної наукової конференції "Мікробні біотехнології" / В.В. Шубчинский - Одеса. 2006. - С.164.

6. Shubchynskyy V. Chemical characterization and serological activity of Pragia fontium lipopolysaccharides: 14^th European Carbohydrate symposium / V. Shubchynskyy - Lubeck. 2007. - P.385.

7. Shubchynskyy V. Immunochemical studies of Pragia fontium lipopolysaccharides: the young scientists and students international scientific conference "Modern problems of microbiology and biotechnology" / V. Shubchynskyy- Odesa. 2007. - P. 34.

8. Шубчинський В.В. Хімічна характеристика структурних компонентів ліпополіцукридів бактеріїї Pragia fontium: Матеріали 2 міжнародної конференції молодих учених "Біологія: від молекули до біосфери" / В.В. Шубчинський - Харків. 2007. - С.391.

9. Шубчинський В.В. Хімічна характеристика і серологічна активність ліпополіцукридів Pragia fontium: Збірник тез 3 міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів "Молодь та поступ біології"/ В.В. Шубчинський - Львів. 2007. - С.106.

10. Shubchinskiy V.V. Characterisation and serological activity of Pragia fontium lipopolysaccharides: Abstracts 24-th International Carbohydrate Symposium / L.D. Varbanets, V.V. Shubchinskiy, S.I. Pohyl - Oslo, Norway. 2008. - F-P052.

Размещено на Allbest.ru