Фітопатогенні і сапрофітні бактерії агроекосистем пшениці та вівса

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. Заболотного

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

УДК 579.84: 632.35:633.1

ФІТОПАТОГЕННІ І САПРОФІТНІ БАКТЕРІЇ АГРОекосистем ПШЕНИЦІ ТА ВІВСА

03.00.07 - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

ПАСІЧНИК Лідія Анатоліївна

Київ - 2009



Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, Гвоздяк Ростислав Ілліч, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

НАН України, провідний науковий співробітник відділу фітопатогенних бактерій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, КУРДИШ Іван Кирилович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях

доктор біологічних наук, професор, НАДКЕРНИЧНА Олена Володимирівна, Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН України, завідувач лабораторії біологічного азоту

доктор сільськогосподарських наук, професор, ГОЙЧУК Анатолій Федорович, Національний університет біоресурсів і природокористування України Кабінету Міністрів України, завідувач кафедри біології лісу і мисливствознавства

Захист відбудеться 17 червня 2009 р. о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий «____» травня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л.М.



Анотація

Пасічник Л.А. Фітопатогенні і сапрофітні бактерії агроекосистем пшениці та вівса. - Рукопис. зерновий фітопатогенний сапрофітний бактерія

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2009.

Дисертація присвячена вивченню взаємовідносин між фітопатогенними та сапрофітними бактеріями (епіфітними і ендофітними) in vitro та in vivo та встановленню закономірностей розповсюдження основних збудників захворювань зернових культур на прикладі пшениці і вівса. екологічними нішами сапротрофного виживання фітопатогенів є поверхня рослини-хазяїна та імунних рослин. Взаємовідносини між сапрофітами та патогенами складні та багатовекторні. Так, сапрофітні бактерії пшениці виявляють більшу конкурентоспроможність порівняно з фітопатогенними бактеріями. Вони послаблюють прояв симптомів захворювання та перебіг інфекційного процесу, спричиненого фітопатогенними бактеріями. В свою чергу фітопатогени індукують у P. agglomerans утворення сигнальних молекул - ацилгомосеринлактону.

молекулярно-генетичними методами за допомогою gusA-гена доведено здатність епіфітних ізолятів нарівні з ендофітними колонізувати внутрішні тканини рослин. Встановлено гетерогенність природних та колекційних популяцій P. syringae за деякими біологічними властивостями. Однак, умови існування бактерій в різних екологічних нішах, не впливають на жирнокислотний склад їхній ліпідів.

Виявлено приуроченість окремих серогруп у пристосованості бактерій до умов існування. встановлено структури О- полісахаридного (О-ПС) ланцюга штамів P. syringae pv. coronafaciens 9030 і P. syringae pv. atrofaciens 8281, які є гетерогенними і включають 3 типи О-ланцюгів, де основний ланцюг являє собою залишки L- рамнози, а боковим замісником є 3-ацетамідо-3,6-дидезокси-D-галактоза.

Ліпополісахариди P. syringae pv. coronafaciens 9030 і P. syringae pv. atrofaciens 8281 виявляють антимутагенні (у тесті Еймса) та протипухлинні властивості щодо A. tumefaciens.

Прояв реакції надчутливості в листках тютюну залежить від віку P. syringae, часу ін'єкції протягом доби та солей важких металів. ЛПС P. syringae не приймають участі в реакції надчутливості.

Ключові слова: фітопатогенні і сапрофітні бактерії, пшениця, овес, патогенність, антигенний склад, ліпополісахариди, антимутагенна та протипухлинна активність.



АнНотацИя

Пасичник Л.А. Фитопатогенные и сапрофитные бактерии агроэкосистем пшеницы и овса. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвящена изучению взаимоотношений между фитопатогенными и сапрофитными бактериями (эпифитными и эндофитными) в системе растение - патоген - сапрофит и установлению закономерностей распространения основных возбудителей заболеваний зерновых культур на примере пшеницы и овса. Экологическими нишами сапрофитного выживания патогенов P. syringae pv. atrofaciens и P. syringae pv. coronafaciens является поверхность растения-хозяина и иммунных растений (сорняков).

Обнаружено, что поверхность и внутренние ткани пшеницы колонизируют сапрофитные бактерии, видовой состав которых идентичен, в частности Pantoea agglomerans, Pseudomonas fluorescens и родов Bacillus и Erwinia. Отличия наблюдаются только в их соотношении. На поверхности зерна пшеницы преобладает Pantoea agglomerans (80 - 90%), а во внутренних тканях - бактерии рода Bacillus (55%) от общей бактериальной микрофлоры.

Сапрофитные эпифитные и эндофитные бактерии проявляют большую конкурентоспособность в сравнении с фитопатогенными бактериями in vivo и in vitro. Они ослабляют проявление симптомов заболевания и протекание инфекционного процесса, вызванного фитопатогенными бактериями.

Молекулярно-генетическими методами с помощью gusa-гена, кодирующего в-глюкуронидазу, доказана способность эпифитных изолятов наравне с эндофитными колонизировать внутренние ткани растений. Обнаружена способность P. agglomerans образовывать сигнальные молекулы - ацилгомосеринлактон под воздействием некоторых фитопатогенов - Burkholderia gladioli pv. alliicola и Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Показано, что условия существования бактерий в разных экологических нишах не влияют на их жирнокислотный состав: изменения происходят только в пределах вида. Установлена гетерогенность свежевыделенных и коллекционных популяций основных возбудителей заболеваний зерновых P. syringae pv. atrofaciens и P. syringae pv. coronafaciens по агрессивности, морфологии колоний, некоторым биохимическим и физиологическим свойствам, антигенному составу.

Обнаружена приуроченность отдельных серогруп бактерий к условиям существования. Установлено, что структуры О- полисахаридной (О-ПС) цепи штаммов P. syringae pv. coronafaciens 9030 и P. syringae pv. atrofaciens 8281 являются гетерогенными и включают три типа О-цепей, основная цепь О-ПС представляет собой остатки L- рамнозы, а боковым заместителем является 3-ацетамидо-3,6-дидезокси-Д-галактоза.

Липополисахариды (ЛПС) P. syringae pv. coronafaciens 9030 и P. syringae pv. atrofaciens 8281 проявляют антимутагенную активность относительно спонтанного и индуцированного бихроматом калия мутагенеза у тест-штаммов Salmonella typhimurium. Исследуемые ЛПС обладают противоопухолевыми свойствами относительно A. tumefaciens. Они предотвращают образование опухолей и уменьшают интенсивность их развития на эксплантатах картофеля, инокулированных штаммами A. tumefaciens. Противоопухолевое действие зависит от концентрации раствора ЛПС для обработки эксплантатов. Проявление реакции сверхчувствительности в листьях табака зависит от возраста P. syringae, времени инокуляции на протяжении суток и солей тяжелых металлов.

Ключевые слова: фитопатогенные и сапрофитные бактерии, пшеница, овес, патогенность, антигенный состав, липополисахариды, антимутагенная и противоопухолевая активность.



SUMMARY

Pasichnyk L.A. Phytopathogenic and saprophytic bacteria of wheat and oat agroecosystems. - Manuscript.

Dissertation to obtaine a scientific degree of the doctor of biological sciences in speciality 03.00.07 - microbiology. - Zabolotny Institute of microbiology and virology National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

Dissertation is devoted the study of interactions between phytopathogenic and saprophytic bacteria (both epiphytic and endophytic) in vitro and in vivo, and to establish the mechanism of main cereal crops pathogens distribution based on wheat and oat analysis. The surface of host and immune plants is the ecological niche of saprotrophic existence of phytopathogens. The interactions between phytopathogenic and saprophytic bacteria is complex and multivector. Saprophytic bacteria of wheat are more competitive compared to phytopathogenic ones. Saprophytes reduce symptoms of development of disease and course of the infectious process caused by phytopathogenic bacteria. In turn, phytopathogens induce in P. agglomerans production of signaling molecules - acylhomoserinlactone.

The capability of epiphytic isolates, so as endophytes, to colonize internal plant tissue was proved by molecular-genetic analysis of gusA-gene. The heterogeneity of biological properties of P. syringae natural and collection populations is established. Nevertheless, the bacterial living conditions in different econiches do not influence on fatty-acid composition of their lipids.

It was shown that certain serogroups influence the bacterial adaptation to living conditions. The structure of O-polysaccharide (O-PS) chains of P. syringae pv. coronafaciens 9030 and P. syringae pv. atrofaciens 8281 was established. There are 3 types of O-chains. The main chain consists of L-rhamnose remains with 3-acetamido-3,6-dideoxy-D-galactose as side substituent.

Lipopolysaccharides (LPS) of P. syringae pv. coronafaciens 9030 and P. syringae pv. atrofaciens 8281 possess antimutagenic (in the Ames test) and antitumor (against A. tumefaciens) properties.

The exhibition of hypersensitive reaction on tobacco leaves is depended on P. syringae age, the day time of injection and salts of heavy metals. LPS of P. syringae does not influence on hypersensitive reaction.

Key words: phytopathogenic and saprophytic bacteria, wheat, oat, pathogenicity, antigenic composition, lipopolysaccharides, antimutagenic and antitumor activity.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Зернові культури - найважливіша група культурних рослин, яка займає головне місце в сільськогосподарському виробництві не тільки України, а й усього світу (Статистичний збірник, 2008). Виробництво сільськогосподарської продукції - це область найжорсткішої конкуренції на світовому ринку і тому конкурентоспроможність у цій галузі безпосередньо пов'язана із благополуччям держави, її економічною і продовольчою незалежністю і стабільністю. Поняття «золотого мільярда людства», що складається з населення розвинених країн, здатних забезпечити високий рівень життя і, перш за все, повноцінне харчування для своїх громадян - один із проявів цієї конкурентної боротьби, наслідок якої для країни важко недооцінювати.

Проблеми агропромислового комплексу, які пов'язані з використанням мінеральних добрив і засобів захисту рослин, ведуть до незворотних порушень в агроекологічних системах, розбалансованості колообігу речовин і потоків енергії, внаслідок чого відбувається катастрофічне падіння родючості ґрунтів та зниження продуктивності рослин.

Ситуація, що склалася, виникла через безліч причин, переважно економічного характеру. Але криза могла б не носити настільки глобального характеру, якби не існуюча недооцінка біологічних закономірностей, а часто їх повне незнання або ігнорування.

Протягом останнього часу в усьому світі і, передусім, у розвинених країнах, переважає напрям, пов'язаний з інтенсифікацією сільськогосподарського виробництва. Успіхи, досягнуті в біологічній науці, особливо в живленні рослин, створили уявлення про можливість регулювання і “поліпшення” основних властивостей сільськогосподарських рослин шляхом максимального задоволення їх потреб за рахунок землеробства (Кандыбин и др., 2009).

серед чинників, що визначають продуктивність складної системи “ґрунт - рослина - мікроорганізми”, саме останні відіграють важливу, багато в чому ще не повністю вивчену і відому роль. Хоча перші дані щодо користі мікроорганізмів для підвищення родючості ґрунтів відомі вже багато років, основний погляд на взаємовідношення рослин і мікроорганізмів зводився до встановлення між ними трофічних зв'язків, що значною мірою вірно і нині. Але саме дослідження останніх років показали, що ці зв'язки набагато складніші, багатогранніші і незамінні для нормального функціонування рослин. За допомогою сучасних молекулярно-біологічних методів показано, що рослинам притаманна генетична система, що визначає успіх взаємодії, у тому числі і з мікроорганізмами (Патика та ін., 2007).

Мікроорганізми, зі свого боку, також містять генетичні чинники, які функціонують лише за взаємодії з рослинами. співіснування мікроорганізмів та рослин невипадкове. У процесі еволюції саме цей шлях сформувався і визначає різні взаємини між рослинами і мікроорганізмами, забезпечуючи їхню життєдіяльність (Кандыбин и др., 2009).

Водночас накопичені знання щодо бактеріальних хвороб, які наносять значну шкоду сільськогосподарським культурам, знищують або знижують кількість і якість вирощеної продукції (Чумаевская и др., 1985). Але, крім збудників захворювань, поверхню та внутрішні тканини рослин колонізують різноманітні сапрофітні мікроорганізми (Hallmann et al., 1997; Beattie, Lindow, 1999; Andrews, Harris, 2000; Lindow, Leveau, 2002). Характерною особливістю епіфітних мікроорганізмів є те, що вони використовують мінеральні і органічні речовини, які виділяються рослинами. В останні роки все більшу увагу вчених привертає ендофітне виживання мікроорганізмів, які локалізовані всередині тканин різних органів рослин і не викликають явних ознак інфекційного процесу. Від видового складу епіфітної та ендофітної популяцій може залежати ураженість рослин фітопатогенами. Незважаючи на те, що сапрофітні бактерії, які колонізують поверхню та внутрішні тканини рослин, інтенсивно досліджуються, багато питань ще й досі не вивчено. На сьогодні недостатньо даних щодо розповсюдження ендофітів у тканинах різних рослин, їхнє систематичне положення, шляхи проникнення в рослину, роль їх в розвитку рослин, у стійкості до збудників хвороб та перебігу інфекційного процесу. Відсутні доробки вчених стосовно механізмів регулювання чисельності ендофітної мікрофлори у тканинах рослин. Не визначено роль ендофітів у системі „рослина - патоген - сапрофіт”. дослідники одностайні лише в тому, що вивчення ендофітних мікроорганізмів є перспективним через позитивний вплив ендофітної мікрофлори на ріст рослин і зменшення випадків прояву деяких захворювань (Hallmann et al., 1997).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано за планами комплексних тем науково-дослідної роботи Інституту мікробіології і вірусології НАН України за напрямами: “Вивчення молекулярних основ серологічної і фагової специфічності фітопатогенних бактерій з метою встановлення природи їх вірулентності і створення діагностичних препаратів” (шифр 2.28.9.1.); “Вивчення гетерогенності популяції і роль біополімерів клітин в патогенності фітопатогенних бактерій” (шифр 2.28.9.1.); “Дослідження взаємовідносин між фітопатогенними, ендофітними та епіфітними бактеріями з метою виявлення їх ролі в стійкості рослин до хвороб” (номер держреєстрації 01970012033, шифр 2.28.9.1.); “Дослідження фітопатогенних бактерій фітоценозу та їх генопротекторних, мутагенних та протипухлинних властивостей” (номер держреєстрації 0101U009312, шифр 2.28.9.1.).

Мета і завдання дослідження. Мета досліджень - теоретичне та експериментальне обґрунтування ролі патогенних і сапрофітних бактерій (епіфітних і ендофітних) в системі рослина - патоген - сапрофіт, встановлення закономірностей розповсюдження та біологічних особливостей основних збудників бактеріальних захворювань зернових культур.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

· теоретично обґрунтувати необхідність вивчення епіфітного та ендофітного виживання бактерій, визначити якісний і кількісний склад епіфітних та ендофітних бактерій пшениці, дослідити взаємовідносини між патогенами і сапрофітами in vivo та in vitro;

· дослідити вплив сапрофітних епіфітних і ендофітних бактерій на інфекційний процес на прикладі збудника базального бактеріозу;

· виявити екологічні ніші епіфітного виживання фітопатогенних бактерій роду Pseudomonas, які уражують зернові культури;

· дослідити ураження посівів вівса збудниками бактеріальних хвороб в агроекосистемах України, вивчити біологічні властивості та ідентифікувати патогени;

· з'ясувати гетерогенність природної популяції фітопатогенних бактерій за біологічними властивостями на прикладі збудника ореольного бактеріозу Pseudomonas syringae pv. coronafaciens;

· виявити особливості серогрупування патоварів Pseudomonas syringae, які уражують зернові культури, приуроченість сероварів до видів рослин та географічного місця їхнього росту;

· визначити хімічний склад ліпополісахаридів та структуру О-специфічного полісахариду деяких патоварів Pseudomonas syringae;

· вивчити антимутагенну активність ліпополісахаридів бактерій роду Pseudomonas і їхню роль у розвитку пухлиноутворення, спричиненого Agrobacterium tumefaciens.

Об'єкт дослідження - ізоляти фітопатогенних та сапрофітних бактерій, виділених нами з уражених і ззовні здорових рослин вівса, пшениці та бур'янів агроекосистем зернових культур, штами колекції Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України та Інституту інтродукції і рослинних ресурсів ім. К. Малкова (Болгарія).

Предмет дослідження - біологічні властивості комплексної бактеріальної мікрофлори зернових культур та взаємовідносини між сапрофітними та фітопатогенними бактеріями in vivo та in vitro.

Методи дослідження - мікробіологічні, фітопатологічні, біохімічні, хімічні, серологічні, молекулярно-біологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне вивчення патогенних і сапрофітних бактерій зернових культур, досліджено взаємовідносини між патогенами і сапрофітами in vivo та in vitro. Показано, що домінуючі види сапрофітних бактерій, які колонізують поверхню пшениці не відрізняються від бактерій, які виявлені у внутрішніх тканинах. Різниця лише у їхньому співвідношенні. За допомогою репортерного gusA-гена, який кодує в-глюкуронідазу, спростовано гіпотезу про те, що у внутрішні тканини рослин проникають лише специфічні ендофітні бактерії. На основі одержаних даних нами запропонована гіпотеза, згідно якої численна мікрофлора, що колонізує поверхню різних сільськогосподарських рослин, за певних умов може потрапляти всередину рослин, в насіння та плоди, і ставати ендофітною.

Вперше виявлено здатність бактерій утворювати сигнальні молекули під впливом інших видів. P. agglomerans, яка не утворює сигнальних молекул, виділяє їх за сумісного культивування з деякими фітопатогенами і не впливає на утворення ацилгомосеринлактону (аГСЛ) у фітопатогенів, які його синтезують.

Установлено екологічні ніші епіфітного виживання деяких фітопатогенних бактерій, що уражують зернові культури - це поверхня рослин-хазяїнів і бур'янів, які ростуть в їхніх посівах.

Виявлена гетерогенність популяції основного збудника захворювання вівса P. syringae pv. coronafaciens за деякими біохімічними властивостями, агресивністю та антигенним складом. встановлена приуроченість штамів окремих серогруп до рослини-хазяїна залежно від географічного місця їхнього росту. Штами збудників, виділені як епіфіти, домінують в інших серологічних групах порівняно зі штамами, ізольованими з уражених тканин. Це характерно для всіх зернових культур.

Вперше встановлено структуру О- полісахаридного ланцюга штаму P. syringae pv. coronafaciens 9030 (серогрупа I) і уточнено з використанням арсеналу сучасних методів для P. syringae pv. atrofaciens 8281. О-специфічний полісахарид штамів P. syringae pv. coronafaciens 9030 і P. syringae pv. atrofaciens 8281 є гетерогенним і включає три типи О-ланцюгів, де основним ланцюгом О-специфічного полісахариду є залишки L- рамнози, а боковий замісником - 3-ацетамідо-3,6-дидезокси-D-галактоза.

Ліпополісахариди (ЛПС) P. syringae pv. coronafaciens 9030 і P. syringae pv. atrofaciens 8281 виявляють антимутагенну активність, унаслідок чого вони зменшують частоту як спонтанних так і індукованих біхроматом калію мутацій тест-штамів S. typhimurium. Виявлено, що ЛПС цих штамів запобігають утворенню пухлин та зменшують інтенсивність їхнього розвитку на експлантатах картоплі, уражених A. tumefaciens.

На прояв та розвиток реакції надчутливості в листках тютюну за дії P. syringae впливає вік культури, термін ін'єкції протягом доби та солі важких металів.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлені сапрофітні бактерії родів Bacillus, Pantoea, Pseudomonas, які впливають на інфекційний процес у фітопатогену, рекомендовано використовувати їх для розроблення методів біологічного контролю збудників бактеріальних хвороб.

менш уражувані збудником ореольного бактеріозу сорти вівса Кубанський, Львівський 1, Льговський 78, Льговський 1026 рекомендовано використовувати в селекційній роботі і сільськогосподарському виробництві.

Виявлену гетерогенність збудників захворювань зернових культур групи P. syringae за біохімічними, серологічними властивостями і хімічним складом необхідно враховувати під час діагностики патогенів.

Отримані результати щодо взаємодії сапрофітних і фітопатогенних бактерій та гетерогенності збудників захворювань зернових культур P. syringae за низкою властивостей можуть використовуватися в курсі лекцій з фітопатології для студентів.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора, в якій розроблено робочі гіпотези та концепцію стосовно ролі сапрофітних бактерій в системі патоген-рослина-сапрофіт, обґрунтовано і розроблено програму досліджень та методологію постановки дослідів, здійснено інформаційний пошук і аналіз даних літератури за темою дисертації, виконано експериментальну частину досліджень, проведено інтерпретацію та узагальнення експериментальних даних, підготовлено наукові статті до друку. Планування основних напрямів роботи та обговорення результатів проходили за участю наукового консультанта д.б.н., проф. Р. І. Гвоздяка.

У співавторстві виконані такі дослідження:

Характеристику бактерій роду Bacillus визначали за консультації кандидата біологічних наук А.О. Рой (Інститут мікробіології і вірусології НАН України).

Отримання ліпополісахаридів штамів P. syringae та визначення їхніх антимутагенних та протипухлинних властивостей здійснювали сумісно з кандидатом біологічних наук Л. М. Буценко (Л. М. Ващенко) (Інститут мікробіології і вірусології НАН України).

структуру О-специфічного полісахариду штамів P. syringae визначали з доктором біологічних наук Г. М. Здоровенко (Інститут мікробіології і вірусології НАН України) та доктором хімічних наук Ю. А. Кнірелем (Інститут органічної хімії Російської АН).

проникнення бактерій до тканин пшениці за допомогою репортерного gusA-гена і визначення сигнальних молекул у бактерій проведено спільно з кандидатами біологічних наук Н. О. Козировською та В. В. Негруцькою (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України).

Вищезазначені наукові співробітники є співавторами публікацій.

Усім зазначеним колегам автор висловлює щиру вдячність за неоціненну допомогу.

Апробація результатів дисертації. Результати науково-дослідної роботи були представлені на засіданні 4-ої Міжнародної робочої групи по патоварах Pseudomonas syringae (Італія, Флоренція, 1991), 8-й Міжнародній конференції по фітопатогенних бактеріях (Франція, Версаль, 1992), 5-й Міжнародній конференції по патоварах Pseudomonas syringae і близьких патогенах (Німеччина, Берлін, 1995), Міжнародному регіональному семінарі “Environment protection. Modern studies in ecology and microbiology” (Ужгород, 1997), Національній конференції “Збереження біорізноманітності в Україні” (Канів, 1997), 7-у Міжнародному конгресі по фітопатології (Шотландія, Единбург, 1998), 13 International Congress of the Hungarian Society of Microbiology (Budapest, 1999), 11-th European Carbohydrate symposium (Lisboa, Portugal, 2001), VIII-у Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), Міжнародній конференції “Микробиология и биотехнология XXI столетия” (Мінськ, 2002), 6-th International Conference on Pseudomonas syringae pathovars and related pathogens (Italy, Acquafredda di Maratea, 2002), 1^th FEMS Congress of European Microbiologist (Ljubljana, Словакія, 2003), X-у з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальные проблемы изучения фито- и микобиоты” (Мінськ, 2004), конференції “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія” (Київ, 2005), Міжнародній конференції “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Мінськ, 2006 і 2008). Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота включає вступ, 7 розділів основної частини, заключення, висновки, список використаних джерел (485 найменувань, з них 337 - латиницею). Загальний обсяг дисертації становить 357 (270) сторінок комп'ютерного тексту. Основний текст проілюстровано 92 таблицями та 11 рисунками. Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 59 наукових праць, з яких 31 статті, 29 - статей у фахових виданнях, 28 - у тезах та матеріалах конференцій.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Розділ 1. Огляд літератури

В огляді літератури подано аналіз наукових джерел вітчизняних та зарубіжних авторів щодо фітопатогенних і сапрофітних бактерій. Описано їхнє поширення у природі, біологічні і біохімічні властивості. На основі здійсненого аналізу обґрунтовано актуальність та перспективність проведення досліджень.

Експериментальна частина

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

Об'єктами досліджень були 200 ізолятів бактерій, виділених із пшениці, 250 ізолятів бактерій - з уражених і 77 із ззовні здорових рослин вівса, 8 - із бур'янів, які росли в посівах вівса. 16 штамів P. syringae pv. atrofaciens (McCulloch 1920) Young et al. 1978 із колекції Інституту інтродукції і рослинних ресурсів ім. К. Малкова (Болгарія), в т.ч. в Болгарії виділено - 14 штамів, в Англії - 1 штам і США - 1 штам.

Для вивчення антимутагенної, протипухлинної активності, хімічного складу ліпополісахаридів та структури О-специфічного полісахариду використали наступні штами фітопатогенних бактерій:

· Pseudomonas syringae pv. atrofaciens (McCulloch 1920) Young, Dye & Wilkie 1978 штам 8281 (УКМ В-1013), збудник плямистості жита.

· Pseudomonas syringae pv. coronafaciens (Elliott 1920) Young, Dye & Wilkie 1978 штам 9030, збудник ореольного бактеріозу вівса.

Для дослідження пухлиноутворення використали колекційні штами 9052 і 9054 Agrobacterium tumefaciens (Smith & Townsend 1907) Conn 1942, ізольованих із коренів хризантеми і винограду відповідно.

· Для порівняльних досліджень використали колекційні штами Pseudomonas syringae pv. syringae van Hall 1902 штам 8511 (NCPPB 281, ATCC 19310, УКМ B-1027) типовий штам виду P. syringae і Pseudomonas syringae pv. atrofaciens (McCulloch 1920) Young, Dye & Wilkie 1978 штам ІСМР 4394 (УКМ В-1011).

Для виявлення епіфітної колонізації тканин бактеріями аналізували здорові рослини пшениці, вівса та бур'яни, які росли в посівах вівса. Ізоляцію епіфітних бактерій проводили описаними методами (Ercolani et al., 1974; Daub, Hagedorn, 1981). Виділення ендофітних бактерій здійснювали за розробленою нами методикою поверхневої стерилізації насіння пшениці. Послідовно промивали 15 хв водогінною водою, 1 хв стерильною водогінною водою, 5 хв витримували в 70%-ному етиловому спирті та 20 хв у 16,5%-ному пероксиді водню, після чого двічі змочували у спирті і обпалювали. Метод дозволяє максимально звільнити насіння пшениці від поверхневих мікроорганізмів. продезинфіковане насіння розтирали асептично у ступці з наступним посівом розтертої маси на КА, а також пророщували стерильне зерно у вологій камері в чашках Петрі. Відбирали бактерії, які виросли після 4-5 діб культивування. висівали на КА ексудати, які утворювались на коренях чи проростках пшениці. В отриманих ізолятів вивчали морфологічні, культуральні, фізіологічні, біохімічні властивості методами, описаними в роботах Ф. Герхард (1983, 1984), К. Бельтюкової зі співавторами (1968) та З. Клемента (1990). Реакцію надчутливості в листках тютюну проводили методом, запропонованим З. Клементом (1963). Ідентифікацію досліджуваних бактерій здійснювали, порівнюючи їхні морфологічні, культуральні, біохімічні, серологічні, патогенні властивості з властивостями колекційних штамів P. syringae pv. coronafaciens ІМВ 499, P. syringae pv. syringae 8511 (NCPPB 281), P. syringae pv. atrofaciens ІСМР 4394 та по Визначнику бактерій (1984, 1997).

Патогенні властивості ізолятів, виділених із насіння і рослин, визначали в польових умовах на чутливих до патогену сортах вівса Буг і Черкаський та пшениці сорту Харківська 37. Патогенність встановлювали шляхом штучного зараження пшениці у фазі виходу колоса у трубку методом введення бактеріальної суспензії до стебла (Пересыпкин и др., 1978), після чого через 14 діб визначали середній бал прояву захворювання десяти інокульованих рослин. Антагоністичну дію епіфітів щодо фітопатогенних бактерій вивчали методом відстроченого антагонізму (Егоров, 1965). Тест-культурами слугували штами фітопатогенних бактерій - P. syringae pv. syringae 8511 (NCPPB 281, УКМ В-1027), P. syringae pv. atrofaciens 8281 (УКМ В-1013), P. syringae pv. coronafaciens 9030, Agrobacterium tumefaciens 8628 (ICMP 10441, NCPPB 3787, УКМ В-1000), Pectobacterium carotovorum pv. carotovorum 8982, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis 13a, Xanthomonas campestris pv. campestris 8003b і Xanthomonas campestris pv. translucens 5752.

Чутливість бактерій до антибіотиків досліджували методом комерційних паперових дисків, які дозовано насичені відповідним антибіотиком. Через 24 год. проводили облік розмірів зон затримання росту бактерій навколо диска. Відсутність таких зон свідчила про резистентність до антибіотика.

Антигенні властивості ізолятів бактерій вивчали за реакціями аглютинації та преципітації в агарі по Оухтерлоні (Иммунологические методы, 1987; Klement et al., 1990). Для цього використовували антисироватки, одержані загальноприйнятим методом (Пастушенко, Симонович, 1971), до штамів -представників дев'яти серогруп : P. syringae pv. atrofaciens 8511 (PDDCC 281, УКМ В-1027) та P. syringae pv. atrofaciens 8281 (УКМ B-1013) - серогрупа I; P. syringae pv. atrofaciens 8122, К-1025 і 7864 - серогрупа II; P. syringae pv. syringae Р-55 - серогрупа III; P. syringae pv. atrofaciens 7836 і ICMP 4394 (УКМ В-1011) - серогрупа IV; P. syringae pv. atrofaciens 8116 (УКМ В- 1117) і 948 - серогрупа V; P. syringae pv. coronafaciens 499 - серогрупа V; P. syringae pv. atrofaciens 7194 (УКМ В -1115) і P. syringae pv. syringae 8299 - серогрупа VI; P. syringae pv. tabaci 223 - серогрупа VII; P. syringae pv. tabaci 225 - серогрупа VIII, P. syringae pv. lachrymans 7595 (УКМ В-1039) і 7591 (УКМ В - 1040) - серогрупа IX.

Для визначення належності штамів до конкретних серогруп використовували специфічну серологічну реакцію подвійної дифузії в агарі (ПДА) (Klement et al., 1990). У реакціях ПДА застосовували О- і ОН - антигени, отримані модифікованим Л. Пастушенко та І. Симонович (1971) методом Грасе. Для серогрупування штамів використувавали антигенно-діагностичну схему, розроблену Л. Пастушенко та І. Симонович (1979).

Жирнокислотний склад клітин патоварів P. syringae вивчали методом газорідинної хроматографії метилових ефірів жирних кислот (Жеребило, Вишталюк, 1987).

Розділення метилових ефірів жирних кислот проводили на газовому хроматографі Chrom-5 з полум'яно-іонізаційним детектором, колонка (1,2 м 3 мм) з 5% SE-30 на хромосорбі N-AW-DMSC, температура 130 230єС, 3єС/хв, газ-носій гелій та хромато-мас-спектрометричній системі Agilent 6890N/5973 inert.

Ідентифікацію жирних кислот проводили шляхом порівняння тривалості їхнього утримання з часом утримання стандартних жирних кислот фірми "Serva". Вміст жирних кислот виражали у відсотках від загальної площі піків. Всі досліди проводили в трьохразовій повторності.

Для вивчення проникнення бактерій до рослинної тканини маркували досліджувані штами геном в-глюкуронідази. Перенос гена в-глюкуронідази (gusA-гена) із донорного штаму Escherichia coli S17-1 (pCAM120) у хромосому штамів P. agglomerans, які не мають gusA-гена, здійснювали методом кон'югації (Wilson et al., 1995). Суспензією клітин маркованих штамів бактерій обробляли стерильне насіння пшениці сорту Деснянка (експозиція обробки 20 хв.) і добу пророщували в термостаті, потім - у люмінестаті. Корінці пшениці занурювали у розчин глюкуроніду, і за блакитним забарвленням виявляли бактерії в зрізах. Контролем слугувало насіння, оброблене водою (негативний контроль) і суспензією Klebsiella oxytoca ІМБГ 26 GUS⁺ (позитивний контроль).

Для вивчення локалізації бактерій у внутрішніх тканинах пшениці були отримані спонтанні мутанти, стійкі до рифампіцину. Для цього бактеріальну суспензію, концентрацією 2х10⁹ КУО/мл висівали на МПА з внесенням рифампіцину в концентрації 50 мкг/мл. Колонії бактерій, які виросли на цьому середовищі три рази пересівали і використовували як рифампіцинстійкі мутанти. Бактеріальною суспензією отриманих мутантів обробляли здорове, повноцінне простерилізоване насіння пшениці (добова культура на МПБ з 50 мкг/мл рифампіцину, чисельність - 10⁹ КУО/мл, експозиція 20 хв). Насіння розкладали на чашки Петрі (по 25 штук на чашку, в чотирьохразовій повторності). Проростки (по 10 штук, 3 см довжиною) і корінці (по 10 штук) промивали в стерильній воді, потім розтирали і висівали на два середовища КА і МПБ+Rif. Кожний проросток розрізали на три частини (по 1 см) - біля зерна, центральна частина, кінець проростка. Розтирали окремо всі три частини і висівали на КА і МПБ+Rif.

Синтез сигнальних молекул визначали з використанням тест-системи, яка здатна виявити широкий спектр ацилгомосеринлактонів (аГСЛ) (Cha et al., 1998). негативним контролем слугував штам A. tumefaciens, позитивним - штам A. tumefaciens, до якого було перенесено ген аГСЛ-синтетази.

Вирощування культур для отримання мікробної маси досліджуваних штамів проводили на КА при 28^оС протягом 24 год. Ліпополісахариди одержували із сирої маси клітин бактерій екстракцією 0,85%-м водним розчином хлориду натрію (з розрахунку на кожні 10 г сирих бактеріальних клітин 100 мл розчину NaCl) протягом 4 - 5 год. на магнітній мішалці при температурі 4С (Здоровенко и др. 1982; Варбанец и др., 2006).

Структурні частини макромолекули ЛПС - О-специфічний полісахарид (О-ПС), коровий олігосахарид і ліпід А - одержували шляхом 3-годинної деградації макромолекули 1%-м розчином оцтової кислоти на киплячій водяній бані. Ліпід А, який випав в осад, відділяли центрифугуванням. Вуглеводну частину (супернатант) фракціонували на колонці із сефадексом G-50 і отримували препарати О-ПС і корового олігосахариду.

Кількість білка визначали методом O. Lowry et al. (1952), вуглеводів - за реакцією з фенолом та сірчаною кислотою, 2-кето-3-дезоксіоктонової кислоти (КДО) - за реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Захарова, Косенко, 1982). сумарний вміст нуклеїнових кислот у складі ЛПС визначали спектрофотометричним методом (Спирин, 1958).

Мутагенні та антимутагенні властивості досліджували у стандартному напівкількісному тесті Еймса (Фонштейн, 1983; Бариляк та ін., 1996). Як тест-культури використовували ауксотрофні за гістидином штами Salmonella typhimurium TA100 і ТА98 (Ames et al., 1975). Протипухлинну активність вивчали in vitro за допомогою експлантатів бульб картоплі (Сарнацкая, 1993).

Статистичне оброблення експериментальних даних здійснювали загальноприйнятими методиками (Рокицкий, 1973; Лакин, 1980; Войцицький, и др., 2006) і використовуючи комп'ютерну програму STATISTICA 5.5.

Розділ 3. Бактеріальна мікрофлора пшениці озимої

проведені нами дослідження свідчать, що поверхня ззовні здорового насіння 10 сортів пшениці, які використовуються в сільському господарстві України, заселена різною кількістю мікроорганізмів. залежно від сорту пшениці виявлено від 7,8 х 10⁵ до 9,2 х 10⁶ колонієутворювальних одиниць (КУО) бактерій на поверхні 1 г зерна. основна частина бактерій - це P. agglomerans, кількість якої досягала 80-90% від всіх епіфітних мікроорганізмів. Якщо на зерні домінували жовтопігментні бактерії, то на здорових рослинах пшениці якісний склад залежав від фази її розвитку. Із поверхні листків пшениці у фазах кущіння і виходу колосу у трубку ізолювали переважно бактерії, колонії яких мали сіро-біле забарвлення і зрідка - P. agglomerans. Загальна кількість бактерій на листках пшениці становила від 4,2 х 10⁴ до 1,7 х 10⁵ КУО/г залежно від сорту. У фазі колосіння збільшувалась кількість жовтопігментованих бактерій та загальна кількість бактерій (5,5 х 10⁵ -3 х 10⁸ КУО/г). По мірі дозрівання зерна зменшується якісний склад бактерій на рослинах. Якщо у фазі виходу колосу у трубку ізольовано вісім морфотипів бактерій, то у фазі цвітіння - наливу зерна - чотири-п'ять.

За стабільними патогенними, морфологічними, культуральними, фізіологічними, біохімічними і серологічними властивостями ізоляти з поверхні здорового зерна і вегетуючих рослин пшениці віднесено до шести систематичних груп. Це P. syringae pv. atrofaciens, Pseudomonas sp., P. fluorescens, Erwinia sp., P. agglomerans, B. subtilis.

Оскільки в останні роки все більшу увагу вчених привертає ендофітне виживання мікроорганізмів, які локалізовані всередині тканин різних органів рослин, але не спричинюють явних ознак інфекційного процесу (Hallmann et al., 1997), нами було досліджено наявність внутрішньої бактеріальної мікрофлори пшениці. встановлено, що бактерії колонізують не тільки поверхню, а й внутрішні тканини здорових органів пшениці. Кількість їх у внутрішніх тканинах пшениці незначна - від 10 до 100 КУО/г насіння. Хоча з даних літератури відомо, що загальна кількість бактерій-ендофітів у різних органах рослин може досягати 1 мільйона КУО/г (Bell et al., 1995; McInroy, Kloepper, 1995; Elvira-Recuenco, van Vuurde, 2000; Garbeva et al., 2001).

Якісний та кількісний склад ендофітних бактерій залежить від сорту пшениці. Серед бактерій переважають споротвірні - B. pumilus, B. brevis, B. sphaericus, B. subtilis (рис. 1). рідше виділяються бактерії P. agglomerans, і зрідка - P. fluorescens, Serratia marcescens, і роду Erwinia (до 13%).

якісний склад домінуючих ендофітних бактерій не відрізняється від епіфітних. При цьому як на поверхні, так і у внутрішніх тканинах пшениці виявлені бактерії родів Pseudomonas, Bacillus, Erwinia та P. agglomerans. На поверхні зерна пшениці переважає бактерія P. agglomerans, а у внутрішніх тканинах - роду Bacillus. Кількість P. agglomerans на поверхні зерна становить 80 - 90%, а у внутрішніх тканинах - 26 - 36% загальної бактеріальної мікрофлори. Таким чином численна епіфітна бактеріальна мікрофлора може проникати до внутрішніх тканин рослин і ставати ендофітною.

За вивченими властивостями ізоляти з поверхні не відрізняються від виділених із внутрішніх тканин пшениці. всі ізольовані бактерії-ендофіти були не патогенними для рослин пшениці і не викликали реакцію надчутливості в листках тютюну.

Встановлено, що фітопатогенні бактерії становлять незначну частку серед епіфітної мікрофлори (2% від ізольованих бактерій). Хоча, як стверджують деякі дослідники, у стресових умовах навколишнього середовища фітопатогени виживають краще ніж не патогени (Wilson et al., 1999).

поверхню і внутрішні тканини рослин колонізують різноманітні мікроорганізми, взаємовідносини яких досліджені недостатньо. З'ясування складних взаємовідносин у системі рослина-патоген-сапрофіт значно наблизить до регулювання появи захворювань рослин і розвитку у них інфекційного процесу. При дослідженні взаємовідносин патогенних і сапрофітних бактерій в польових (у системі патоген-сапрофіт-рослина) умовах виявлено, що непатогенні ізоляти бактерій родів Erwinia, Bacillus, Pseudomonas і Pantoea, які не виявляють антагоністичних властивостей до фітопатогенних бактерій, впливають на патологічний процес, спричинений P. syringae pv. Atrofaciens.

Дані свідчать, що ендофіти більш активні, ніж епіфіти. Так, якщо ізоляти епіфітних бактерій за співвідношення патоген-сапрофіт 1:1 знижували агресивність патогену вдвічі, то за внесення до P. syringae pv. atrofaciens ендофітних бактерій навіть у співвідношенні 9:1 агресивність патогену значно знижувалась. за співвідношення 1:1 збудник базального бактеріозу практично втрачав здатність спричинювати інфекційний процес. Отже, нами показано, що сапрофітні бактерії впливають на інфекційний процес, який зумовлює P. syringae pv. atrofaciens, що приводить до зменшення розвитку захворювання.

зниження інтенсивності захворювання, спричиненого фітопатогеном, відбувається внаслідок впливу епіфітних і ендофітних бактерій, а не через зменшення вмісту клітин фітопатогену в інокулюмі. Таким чином сапрофітні епіфітні і ендофітні ізоляти бактерій здатні захищати рослину від фітопатогенів.

у всіх варіантах досліду, де спостерігалось сумісне штучне зараження патогена - сапрофіт виявляли здебільшого бактерії P. agglomerans, кількість яких становила 95%, а патогену - близько 5 %. У рослин пшениці, у яких інфекційний процес не розвивався, виявляли лише клітини сапрофіта. Тобто, в рослині при сумісному введенні бактерій змінюється співвідношення між досліджуваними бактеріями і домінують клітини сапрофіта. Взаємний вплив ізолятів бактерій різних видів на ріст і розвиток один одного у листках квасолі та картоплі спостерігали L. Kinkel, S. Lindow (1989).

У дослідженнях взаємодії між патогеном і сапрофітом виявлено конкуренцію між штамами бактерій на поверхні листків пшениці, яка залежала від фази їх розвитку. на сходах обприсканих рослин пшениці як суспензією окремих бактерій, так і їхньою сумішшю переважають клітини патогену (4,35 х10⁶ і 1,8х10⁷ КУО/г відповідно). Клітин P. agglomerans ізолюється значно менше. Але у варіантах досліду, де досліджували суміш штамів, кількість P. agglomerans на один-два порядки більша, порівняно з варіантом, де використовували лише один P. agglomerans. Тобто патоген стимулює ріст сапрофіта.

Кількість клітин епіфіта P. agglomerans П324 переважала на порядок у ендофіта P. agglomerans 1а, що свідчить про більшу конкурентоздатність на поверхні листків пшениці епіфіта порівняно зі штамом P. agglomerans, виділеним із внутрішніх тканин пшениці. У фазі кущіння з поверхні листків пшениці ізолювали меншу кількість P. syringae pv. atrofaciens, а в разі оброблення їх сумішшю з P. agglomerans бактерії P. syringae pv. atrofaciens взагалі не виявляли. Це узгоджується з нашими даними, що P. syringae pv. atrofaciens виділяється із зернових культур на ранніх стадіях розвитку рослин і досить важко - у фазі дозрівання зерна. Також з дозріванням зерна на вегетуючих органах пшениці збільшується кількість P. agglomerans, яка характеризує якість зерна. Це дає можливість констатувати, що у складних взаємовідносинах сапрофіт-патоген-рослина основна роль належить рослині, яка формує якісний та кількісний склад мікрофлори. Можна також припустити, що рослина регулює не тільки кількість, а й співвідношення між мікроорганізмами.

Імовірно, що це обумовлено конкуренцією за поживні речовини, що і підтвердили експериментально.

У разі окремого культивування, ендофіт P. agglomerans 1а через добу у 5 - 6 разів перевищує кількість клітин патогену, через 2 доби - у двічі. За сумісного культивування їх сумарна кількість клітин збільшується у понад 3 рази, що свідчить про стимулювання патогеном розмноження та накопичення клітин ендофіта.

За окремого культивування швидкість росту епіфіта P. agglomerans П324 значно вища ніж за таких умов штаму P. syringae pv. atrofaciens 912. За їх сумісного вирощування в культуральній рідині виявляються лише клітини P. Agglomerans.

Ми вважаємо, що за їхнього сумісного культивування відбувається не тільки конкуренція за поживні речовини, а й те, що штам епіфіта настільки пригнічує патогена, що в його присутності він втрачає здатність розмножуватися. Що і було доведено в експериментах з використанням антибіотика ампіциліну, до якого чутливий P. agglomerans i резистентний P. syringae pv. atrofaciens.

Отже, нами виявлена вища конкурентна здатність сапрофітів P. agglomerans порівняно з фітопатогеном P. syringae pv. atrofaciens. P. agglomerans швидше розмножується і пригнічує ріст та розвиток фітопатогену при їхньому сумісному культивуванні, і це може бути конкуренція за поживні речовини. В 2006 р. наші дані щодо конкуренції за поживні речовини сапрофіта і патогену підтвердили італійські вчені (marchi et al., 2006).

Для виявлення бактерій в певній екологічній ніші в їх геном вводять репортерні гени, екзопродукти яких постійно синтезуютьcя бактеріальними клітинами і дають інформацію про їхню локалізацію (Jefferson, 1989). Таким є gusA-ген, що кодує в-глюкуронідазу - ферменту, який перетворює безколірний субстрат 5-бром-4-хлор-3-індоліл-в-D-глюкуронід на сполуки блакитного кольору. Низка учених допускає, що до тканин рослин потрапляють тільки специфічні ендофітні бактерії. Для перевірки цієї гіпотези ми використали маркування ендофітного та епіфітного штамів P. agglomerans геном біосинтезу в-глюкуронідази. Донором gusA-гена був штам Escherichia coli S17-1 (pCAM120). Клітини як епіфітного штаму P. agglomerans П324, так і ендофітного P. agglomerans 1a виявлені в коренях пшениці при проростанні насіння, обробленого маркованими бактеріями. В наступній серії дослідів за допомогою рифампіцинстійких мутантів нами показана локалізація ендофітних бактерій роду Bacillus в проростках пшениці. Найбільшу частину бактерій виявлено біля зерна, меншу - в середній частині, і найменшу - на кінчику проростка.

Таким чином за допомогою репортерного gusA-гена, що кодує в-глюкуронідазу, було спростовано гіпотезу про те, що у внутрішні тканини рослин проникають лише специфічні ендофітні бактерії.

Наші дані і аналіз даних літератури дає змогу дійти висновку, що ендофітні сапрофіти є постійною мікрофлорою здорових рослин. Такий симбіоз рослини з ендофітами вигідний для кожного партнера. Рослина захищає бактерії від несприятливих умов навколишнього середовища і підтримує їх життєдіяльність, забезпечуючи поживними речовинами, а ендофіти захищають рослину від фітопатогенів, виділяючи біологічно-активні речовини.

Під впливом індукторів, які синтезуються залежно від чисельності клітин у популяції (кворум - чутливість) вивчається регуляція експресії генів бактерій. Кворумні регуляторні системи відіграють важливу роль у пристосуванні бактеріальних видів до факторів навколишнього середовища і збереження популяцій, у взаємодіях із клітинами одного або різних видів (Miller, Bassler, 2001; Venturi, 2006).

показано, що штами P. agglomerans, які не проявляють антибіотичних властивостей до фітопатогенних бактерій, впливають на інфекційний процес, який зумовлює P. syringae pv. atrofaciens на пшениці. Для з'ясування механізму впливу P. agglomerans на інфекційний процес у pv. atrofaciens ми дослідили наявність кворум-чутливої сигнальної молекули - ацилгомосеринлактону (аГСЛ) - сигнальної молекули, яка синтезується аГСЛ-синтетазою. Встановлено, що деякі штами утворювали аГСЛ, а інші - ні (табл.5). Дослідження впливу P. agglomerans 1а на фітопатогенні бактерії, які мали і не мали кворум-чутливості показує, що бактерії, які мають кворум-чутливість не втрачають її при сумісному культивуванні з P. agglomerans 1а, який не утворює аГСЛ.

Штами P. syringae pv. atrofaciens та P. syringae pv. coronafaciens не утворювали аГСЛ як при культивуванні окремо, так і сумісно з культурою P. agglomerans. При культивуванні фітопатогенів Burkholderia gladioli pv. alliicola та Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli сумісно з P. agglomerans спостерігали утворення аГСЛ, хоча всі культури, які росли окремо, його не продукували.

Донг з співавторами показали, що деякі грампозитивні бактерії здатні інактивувати синтез аГСЛ у представників грамнегативних бактерій і цим знижувати їхню агресивність (2000). Проте, ми спостерігали протилежний ефект, коли P. agglomerans, яка не продукує аГСЛ в чистій культурі, утворює його в присутності фітопатогенних бактерій, що свідчить про її вищу конкурентоспроможність порівняно з патогенами.

Важливою таксономічною ознакою бактерій є жирнокислотний склад клітин. Нами визначено, що бактерії роду Bacillus характеризуються наявністю розгалужених жирних кислот та відсутністю оксикислот. Зокрема, у них виявлено anteiso кислоти - а-С15:0 та а-С17:0 iso непарні - і-С15:0) та і-С17:1), iso парні - і-С14:0 та і-С16:0 жирні кислоти. Штам B. subtilis Е403 відрізняється від інших штамів роду Bacillus низьким вмістом 14-метилпентадеканової кислоти та високим вмістом гексадеканової кислоти.

Бактерії ендофітного і епіфітного штамів P. agglomerans мали однаковий набір жирних кислот, але відрізнялись кількісним складом деяких із них.

Як відомо, найбільше значення для систематики бактерій роду Pseudomonas мають оксизаміщені жирні кислоти. У складі жирних кислот P. fluorescens ЗП виявлені три оксикислоти - 3-гідроксидеканова, 2-гідроксидодеканова і 3- гідроксидодеканова, кількість яких є характерною для бактерій роду Pseudomonas.

Таким чином нами підтверджено належність епіфітних і ендофітних бактерій до родів Pseudomonas, Bacillus та Pantoea за жирнокислотним складом.

Розділ 4. Фітопатогенні бактерії вівса

Нами встановлено, що овес в основних зонах його вирощування - Житомирській, Київській, Черкаській і Закарпатській областях - уражується збудником ореольного бактеріозу P. syringae pv. coronafaciens. Основні симптоми, які спостерігали на вівсі і з яких ізолювали фітопатогенні бактерії - це бежеві, буро-бежеві чи буро-коричневі плями з темно-коричневою чи коричнево-червоною облямівкою. Захворювання виявлено на всіх фазах розвитку рослин. На листках вівса у фазі сходів спостерігається незначне ураження. З часом захворювання вівса прогресувало і кількість некрозів збільшувалась.

...