Фітопатогенні і сапрофітні бактерії агроекосистем пшениці та вівса

ізольовані з уражених тканин вівса бактерії за морфологічними, культуральними і біохімічними властивостями ідентифіковані як P. syringae pv. Coronafaciens.

Установлено гетерогенність штамів збудника ореольного бактеріозу за морфологією колоній, деякими біохімічними властивостями та агресивністю. агресивність штамів була різною і становила 1 - 4 бали. Більшість ізолятів були високоагресивними - 3 - 4 бали і складали 80% від загальної кількості ізолятів бактерій, та незначний відсоток слабоагресивних - 2%.

за морфологією колоній, розрідженням желатини і використанням молока досліджувані бактерії відрізнялись від колекційного штаму P. syringae pv. coronafaciens 499 і типового штаму P. syringae pv. syringae 8511. Але такі відмінності не виходять за межі біологічних властивостей групи P. syringae. те, що у деяких патоварів P. syringae - syringae та atrofaciens - не виявлено відмінностей за фізіолого-біохімічними, патогенними властивостями і за профілем жирних кислот, відзначено і в роботах інших дослідників (Jacobellis et al., 1997). Це свідчить про умовний поділ групи P. syringae на патовари, де основним критерієм є рослина-хазяїн, з якої виділено патоген.

За штучного зараження вівса в польових умовах розвивались некрози, подібні до тих, які спостерігали у природних умовах. в місці введення бактеріальної суспензії спочатку утворювалися невеликі некротичні плями. З часом ураження збільшувалися в розмірі - від декількох міліметрів до декількох сантиметрів. Вони залишались круглими або, що траплялося частіше, витягувалися вздовж листа чи стебла і ставали продовгуватими. тканина в центрі плями всихала, набувала бежевого, бурого чи буро-коричневого кольору з коричнево-червоною облямівкою.

виділені нами ізоляти із вівса за штучного зараження викликали інфекційний процес на рослинах пшениці і жита, але симптоми захворювання були слабші, ніж на рослинах вівса.

Використання в сільськогосподарському виробництві сортів, стійких до збудників захворювань, має велике значення, оскільки це знижує втрати уражаю від захворювань. У зв'язку з цим ми досліджували районовані в Україні 11 сортів вівса методом штучного зараження в польових умовах. За даними чутливості до трьох штамів P. syringae pv. coronafaciens 9235, 9221 та 9185 імунних чи стійких сортів не виявлено. Слабо сприйнятливими є сорти Кубанський, Львівський 1, Льговський 78, Льговський 1026, які можуть бути рекомендовані для сільськогосподарського виробництва та селекційної роботи.

Вивчено жирнокислотний склад штамів бактерій роду Pseudomonas, які ізолювали з зернових культур - пшениці, жита, вівса, а також бур'янів. Штами відрізнялись за екологічною нішею, рослиною-хазяїном, агресивністю, були виділені з різних органів уражених і здорових рослин, відносились до різних серологічних груп.

За ідентичних умов культивування на КА в жирнокислотному спектрі штамів були виявлені насичені, ненасичені та оксизаміщені жирні кислоти від 10 до 18 атомів вуглецю. У клітинах штамів P. syringae pv. сoronafaciens, P. syringae pv. atrofaciens та P. syringae pv. lachrymans переважають жирні кислоти з парним числом вуглецевих атомів - гексадеканова (30 - 37%), гексадеценова (32 - 39%) і октадеценова (20 - 25%). сумарний вміст їх становить більше 80% від усіх виявлених жирних кислот, у тому числі 52 - 69% становлять ненасичені жирні кислоти (С 16:1 і C 18:1). у всіх досліджених штамів, як і у типового штаму P. syringae pv. syringae 8511, сумарний вміст гексадеканової (С16:1) та гексадеценової (С 18:1) кислот був майже однаковим.

Як мінорні компоненти (0,1 - 5%) виявляли тетрадеканову (С14:0) і октадеканову (С18:0) кислоти. У деяких штамів P. syringae pv. atrofaciens, виділених з жита, було ідентифіковано незначну кількість пентадеканової кислоти (15:0), якої не було у типового штаму P. syringae pv. syringae 8511 та штамів P. syringae pv. atrofaciens, виділених з пшениці.

Як відомо, найбільше значення для систематики бактерій роду Pseudomonas мають оксизаміщені жирні кислоти. В усіх досліджених штамів виявлено 3-гідроксидеканову, 2- гідроксидодеканову та 3-гідроксидодеканову кислоти. Отримані нами дані про вміст оксикислот відповідають даним літератури (Stead, 1992) про те, що патовари P. syringae належать до групи 1 підгрупи 1a, усі члени якої містять оксикислоти в кількостях, менших за 5-6%. У досліджених нами штамів P. syringae pv. сoronafaciens, P. syringae pv. atrofaciens, P. syringae pv. lachrymans та P. syringae pv. syringae 8511 вміст 3- гідроксидеканової кислоти становив 0,28 - 2,75 %, 2- гідроксидодеканової - 0,5 - 4,41%, та 3-гідроксидодеканової - 0,25 - 2,94%

не виявлено істотної різниці у складі жирних кислот серед штамів, що належать до різних патоварів і штамів одного патовару, ізольованих із уражених або здорових рослин, агресивністю та антигенним складом. Спостерігали незначні коливання у кількісному вмісті жирних кислот як серед штамів одного патовару, так і між патоварами. На основі математичного аналізу складу жирних кислот всі штами P. syringae pv. atrofaciens та P. syringae pv. coronafaciens, які спричиняють захворювання зернових культур, і типовий штам P. syringae pv. syringae 8511 об'єднуються у близькоспоріднену групу.

Розділ 5. Гетерогенність популяції фітопатогенних бактерій

Гетерогенність мікробних популяцій є наслідком як модифікаційної мінливості, так і процесів адаптації мікроорганізмів до умов навколишнього середовища.

Оскільки з уражених рослин вівса нами ізольовані різні за агресивністю штами P. syringae pv. coronafaciens, важливо було дослідити, як розподіляються за агресивністю, біохімічними та антигенними властивостями штами збудника в його природній популяції. Для цього з 4-х уражених зразків вівса сорту Черкаський 1 (П1, П2, П3, П4) з симптомами, типовими для ореольного бактеріозу ізольовано 200 клонів (по 50 колоній з кожного зразка). За морфологією всі колонії, ізольовані з одного ураження були однорідними, але відрізнялись між типами симптомів. Колонії зразків П1 і П2 - сірі, злегка опуклі, з трохи темнішим центром, тьмяні, краї хвилясті. Колонії зразка П3 - сірі з металевим блиском, центр припіднятий, слизові. Колонії зразка П4 - сірі, блискучі, слизові з нерівними краями.

За морфологічними, фізіологічними, біохімічними властивостями та антигенним складом всі клони ідентифіковані як P. syringae pv. coronafaciens. За деякими біохімічними властивостями клони виявились гетерогенними, навіть в межах одного зразку. Усі клони, ізольовані зі зразка П1 однорідні за здатністю засвоювати цукри та амінокислоти, але гетерогенні за розрідженням желатини. Клони зразків П2, П3, П4 гетерогенні за використанням цукрів. Винятком є клони зразка П2, які вибірково споживають ксилозу, інулін та дульцитол. Клони зі зразків П3 і П4 гетерогенні щодо використання мальтози, рафінози, а клони П3 - і інозитолу. Всі клони зразків П3 і П4 розріджують желатину, тоді як лише 10% клонів зразка П2 і 36% зразка П1 її гідролізують. Більшість клонів P. syringae pv. coronafaciens патогенні для вівса і відмінні за агресивністю.

У популяції патогену є різні за агресивністю, а також авірулентні клони (2-4%), за винятком клонів зразка П3, де кількість авірулентних клонів становила 18%. У популяціях усіх зразків переважали середньоагресивні клони з агресивністю 2 та 3 бали.

Оскільки нами виявлено, що природна популяція збудника ореольного бактеріозу P. syringae pv. coronafaciens гетерогенна за деякими ознаками, то з'ясовували, чи гетерогенна популяція патогену після довготривалого зберігання в колекції. Для цього досліджували 50 клонів, одержаних після зберігання протягом семи років в колекції штаму P. syringae pv. atrofaciens 8281, ізольованого з ураженого колосся жита (с. Харківське 60), і P. syringae pv. atrofaciens 9005, виділено із ззовні здорових листків жита (с. Белта). Виявлено, що всі 50 клонів обох штамів бактерій були оксидазо- та нітратредуктазонегативними, на лакмусовій сироватці утворювали луг, із джерел вуглецевого живлення використовували глюкозу, не ферментували лактозу і інулін. Усі клони штаму P. syringae pv. atrofaciens 8281, як і вихідний штам належали до серогрупи I, а P. syringae pv. atrofaciens 9005 - до серогрупи II.

Клони гетерогенні за використанням мальтози, ксилози, рафінози, дульцитолу, інозитолу та сорбітолу. Так, штам P. syringae pv. atrofaciens 8281 не використовував мальтозу, а 32 % його клонів мають здатність її використовувати, в той час як 4 % клонів втратили здатність засвоювати такі джерела вуглецевого живлення як ксилоза і сорбітол. Вихідний штам розріджував желатину, а 66 % клонів - ні. Всі клони в популяції були однорідними за використанням амінокислот і не відрізнялись від вихідного штаму P. syringae pv. atrofaciens 8281.

Два відсотки клонів P. syringae pv. atrofaciens 9005 розріджували желатину, в той час як вихідний штам бактерій її не розріджував. Лише 12 % клонів P. syringae pv. atrofaciens 9005 засвоювали мальтозу, 4 % рафінозу і 2 % - інозитол, тоді як вихідний штам бактерій P. syringae pv. atrofaciens 9005 зазначені джерела вуглецевого живлення використовував.

Дослідження патогенних властивостей відібраних клонів P. syringae pv. atrofaciens 8281 показало, що популяція неоднорідна за цією ознакою. Так, у популяції більшість клонів (46 %) мали агресивність 3 бали, менше (32 %) - 2 бали. 12 % клонів були слабоагресивними (1 бал). Авірулентних клонів в популяції штаму P. syringae pv. atrofaciens 8281 не виявлено.

Отже, показана значна неоднорідність клонів популяції збудника ореольного бактеріозу вівса P. syringae pv. coronafaciens та збудника бактеріальної плямистості жита P. syringae pv. atrofaciens 8281.

Таким чином, деякі біологічні властивості колекційних штамів є незмінними і постійні в усіх клонах, інші з'являються або зникають у певних клонів. Це слід враховувати при ідентифікації виділених ізолятів.

Розділ 6. Екологічні ніші епіфітного виживання фітопатогенних бактерій

Відомо, що серед багаточисельної епіфітної мікрофлори сільськогосподарських рослин, крім сапрофітних мікроорганізмів, які становлять основну її частину, можуть зустрічатися і фітопатогенні бактерії, з якими пов'язують потенційну можливість виникнення епіфітотій (Voloudakis et al., 1991; Georgakopoulos, Sands, 1992). Тому важливо було дослідити епіфітне виживання фітопатогенних бактерій, які уражують зернові культури, та вивчити їхні біологічні властивості.

Нами встановлені екологічні ніші епіфітного виживання фітопатогенних бактерій роду Pseudomonas на рослинах-хазяїнах і імунних рослинах. Так, збудник P. syringae pv. atrofaciens виявлений на ззовні здорових рослинах пшениці, а P. syringae pv. coronafaciens - на вівсі і бур'янах, які ростуть в його посівах (щириці звичайній (Amarantus rebroflexus), лободі запашній (Chenopodium botrуs), молочаї плосколистому (Euphorbia platyphylla), осоті польовому (Сirisium arvense), ромашці запашній (Matricaria matricarioides), кульбабі (Taraxacum officinale), мати-й-мачусі (Tussilago farfara), виці (Vicia faba).

Вивчення культуральних та біохімічних властивостей ізолятів із бур'янів і вівса показало, що досліджувані ізоляти гетерогенні за використанням мальтози, рамнози, рафінози, целобіози. Варто відзначити, що і природна популяція збудника ореольного бактеріозу вівса гетерогенна за цими джерелами вуглецевого живлення. Ізоляти P. syringae pv. atrofaciens з поверхні пшениці не відрізнялися за біологічними властивостями від неотипового штаму P. syringae pv. atrofaciens 4394 і типового - P. syringae pv. syringae 8511.

Виділені ізоляти із здорових рослин вівса і бур'янів були патогенними для вівса, з агресивністю 1-3 бали, залежно від штаму. За штучного зараження рослин вони спричинювали патологічний процес з утворенням уражень, подібних до тих, які спостерігаються в природних умовах, і характерні для збудника ореольного бактеріозу. агресивність цих ізолятів нижча, ніж у штамів, виділених із некротичних тканин вівса. Всі ізоляти із бур'янів викликали реакцію надчутливості в листках тютюну, але деякі - із затримкою на 24-48 годин.

Отже, нами доведено, що фітопатогенні бактерії P. syringae pv. atrofaciens і P. syringae pv. coronafaciens, які уражують зернові культури, можуть виживати на ззовні здорових рослинах-хазяїнах і бур'янах, які ростуть в їхніх посівах. Таким чином, бур'яни можуть бути резерватором первинної інфекції і нести загрозу посівам вівса.

Розділ 7. Антигенні властивості збудників бактеріальних захворювань зернових культур

Основними збудниками бактеріальних захворювань зернових культур є представники патоварів P. syringae - pv. atrofaciens і pv. coronafaciens, які не відрізняються за основними фізіолого-біохімічними властивостями, а лише за спеціалізацією до рослини-хазяїна. Відомо, що P. syringae pv. atrofaciens, ізольований із різних рослин-хазяїв гетерогенний за серологічними властивостями (Gvozdyak, Pasichnik, 1991). Тому мета цього розділу - вивчити антигенний склад штамів патоварів P. syringae, ізольованих з різних екологічних ніш і провести їхнє серогрупування.

показано, що штами патоварів P. syringae, які є збудниками захворювань зернових культур, гетерогенні за антигенним складом, а серотипи приурочені до видів рослини-хазяїна. За наявністю групоспецифічних термостабільних антигенних комплексів штами P. syringae pv. coronafaciens з вівса гетерогенні і належать до двох серологічних груп (I i V), з переважанням штамів серогрупи V тому важливо було вивчити серологічні властивості епіфітних популяцій цих збудників.

Виявлено, що штами-епіфіти P. syringae pv. atrofaciens за реакцією преципітації в гелі були віднесені до серогрупи II у той час як виділені з уражених рослин пшениці були віднесені раніше до чотирьох серогруп (II, IV, V, VI) серед яких найчисельнішою була серогрупа IV.

штами P. syringae pv. coronafaciens, виділені із ззовні здорових рослин вівса, за наявністю групоспецифічних антигенних комплексів віднесені до серогруп І і V, із домінуванням штамів серогрупи I, в той час як штами, виділені з некрозів

переважали в серогрупі V. Штами P. syringae pv. coronafaciens з бур'янів належать до тих самих серологічних груп, що і фітопатогени, які уражують зернові культури (І та ІІ), причому більша частина їх належить до серогрупи II. Слід відзначити, що штами P. syringae pv. coronafaciens серогрупи II не виявлені нами на вівсі. Це свідчить про те, що сільськогосподарська культура агробіоценозу не визначає обов'язкову належність ізолятів P. syringae із бур'янів до тих серогруп, які домінують на культурних рослинах даної агроекосистеми.

Антигенний склад штамів P. syringae гетерогенний і залежить від рослини-хазяїна, з якої вилучено патоген. Як нами виявлено, штами P. syringae pv. coronafaciens з вівса розподілені на дві серологічні групи - I i V, а P. syringae pv. atrofaciens із пшениці - на чотири - II, IV, V, VI (Пастушенко, Симонович, 1979). P. syringae pv. atrofaciens із жита - на п'ять - I, II, IV, V, VI (Пасичник и др., 1991). Штами P. syringae pv. atrofaciens, ізольовані із некротичних тканин пшениці в Болгарії, розподілені нами на три серологічні групи - II, IV і VI.

Отже, спостерігається вплив екологічної ніші на локалізацію штамів із певними антигенними детермінантами. Крім цього, нами виявлено, що штами P. syringae серогруп II і IV зустрічаються на зернових культурах у різних країнах і континентах, що, можливо, пов'язано із більшою пристосованістю і виживанням штамів цих серогруп у несприятливих умовах і визначається рослиною-хазяїном. На користь приуроченості патогенів деяких серогруп до рослини-хазяїна свідчить те, що ці серогрупи репрезентовані, як правило, більшою кількістю штамів, а також те, що і серед штамів-епіфітів P. syringae pv. atrofaciens, більшість належить до серогрупи II.

Штами патоварів P. syringae, виділені як епіфіти, домінують в інших серологічних групах, порівняно з штамами, які ізольовані з уражених рослин зернових культур.

Установлено наявність слабо виражених спільних антигенів у P. fluorescens 7769 зі збудником захворювання зернових культур P. syringae pv. atrofaciens.

Таким чином, одержані нами дані за серогрупуванням штамів P. syringae pv. coronafaciens i P. syringae pv. atrofaciens, доповнюють раніше розроблену схему серогрупування фітопатогенних бактерій групи P. syringae (Пастушенко, Симонович, 1979).

Оскільки ліпополісахариди (ЛПС) - основні компоненти зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій - відіграють важливу роль у взаємовідносинах бактеріальної клітини з рослиною-хазяїном, а також із навколишнім середовищем важливо було дослідити їхній склад та структуру.

Склад досліджуваних ЛПС характерний для ЛПС P. syringae. У складі ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens виявлено 32,6 - 42% вуглеводів, 17,4 - 22,0% білка, від 5,4 до 8,7 % нуклеїнових кислот (від сухої маси ЛПС). Кількість 2-кето-3-дезоксіоктонової кислоти (КДО) складає 0,56% для ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і 0,87% для ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030. КДО зв'язує ліпід А з полісахаридною частиною молекули і завжди присутня в ЛПС грамнегативних бактерій, наявність якої є своєрідним маркером, який свідчить про ліпополісахаридну природу виділеної речовини.

Вперше встановлено структуру О- полісахаридного ланцюга штаму P. syringae pv. coronafaciens 9030 і уточнено з використанням сучасних методів (ГРХ, ЯМР-спектроскопія, хромато-масспектрометрія та ін.) для P. syringae pv. atrofaciens 8281. Установлено, що їхня структура є гетерогенною і складається з трьох типів повторювальних ланцюгів. Основний ланцюг О-специфічного полісахариду ЛПС обох штамів містить залишки L- рамнози, а боковим замісником є 3-ацетамідо-3,6-дидезокси-D-галактоза. Для штаму P. syringae pv. coronafaciens 9030 основними повторювальними одиницями є лінійний трисахарид (ланцюг 1) і тетрасахарид (ланцюг 3), а також в мінорних кількостях - пентасахарид (ланцюг 2). Для штаму P. syringae pv. atrofaciens 8281 всі повторювальні одиниці розгалужені і відрізняються за розміром і положенням заміни одного із останків рамнози. досліджувані штами належать до однієї серогрупи і у своїй структурі О-ПС мають повністю ідентичні ланцюги (структура 2).

Установлено, що структура 1 раніше не зустрічалась у досліджених ЛПС представників патоварів P. syringae, тоді як структура 2 ідентична з основною структурою О-ПС типового штаму P. syringae pv. syringae 8511(Книрель и др., 1988), який, як і досліджені нами штами, належить до серогрупи I.

Розділ 8. Антимутагенна активність ліпополісахаридів pseudomonas syringae pv. atrofaciens i pseudomonas syringae pv. coronafaciens і їхня роль у розвитку пухлиноутворення у рослин

значне місце серед біологічних чинників мутагенезу належить мікроорганізмам і їх метаболітам, які зумовлюють значну кількість порушень в геномі макроорганізмів. Проте, деякі мікроорганізми можуть виявляти і антимутагенні властивості щодо організму, з яким вони взаємодіють.

фітопатогенні бактерії та їхні ліпополісахариди (ЛПС) на наявність цих властивостей не досліджувались. Для вивчення геномодулювальних властивостей досліджуваних штамів патоварів P. syringae було використано бактеріальну тест-систему, де тест-культурами були ауксотрофні за гістидином штами Salmonella typhimurium ТА98 і S. typhimurium ТА100.

ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 у досліджених концентраціях (0,1 - 1000,0 мкг на чашку) не виявляють мутагенної активності щодо використаних тест-штамів S. typhimurium. кількість His⁺- ревертантів обох тест-штамів S. typhimurium, які утворюються при внесенні ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 від 0,1 до 100,0 мкг/чашка, вірогідно не відрізняються від спонтанного фону мутацій відповідного тест-штаму. Але в концентрації 1000,0 мкг/чашка (50 мкг/мл) ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 вірогідно знижує показники спонтанного мутагенезу у обох тест-штамів S. typhimurium ТА100 і ТА98 на 18% та 39% відповідно.

Установлено, що ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 у великих концентраціях вірогідно знижує спонтанний фон мутацій лише тест-штаму S. typhimurium ТА100. У концентраціях 1000,0 та 100,0 мкг/чашка ЛПС зменшує кількість ревертантів S. typhimurium ТА100 на 23 та 19% відповідно.

Таким чином, експериментально встановлено відсутність мутагенної активності ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281та ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030. У досліджених ЛПС виявлено антимутагенну активність.

Для вивчення впливу ЛПС на індукований мутагенез як модельний мутаген використали біхромат калію з відомими мутагенними властивостями (Калинина, Минсеитова, 1983). для індукції мутацій використовували оптимальну концентрацію біхромату калію (200 мкг на чашку), за якої утворюється найбільше His⁺-ревертантів (155,6 5,8 колоній на чашку).

Виявлено, що ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 пригнічують появу індукованих біхроматом калію ревертантів обох тест-штамів S. typhimurium. Антимутагенна активність ЛПС щодо тест-штамів S. typhimurium залежить від концентрації ЛПС і знижується зі зменшенням концентрації ЛПС.

Таким чином, нами виявлено антимутагенну активність ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030. вони зменшують частоту як індукованих біхроматом калію, так і спонтанних мутацій тест-штамів S. typhimurium. Проте ні одна з досліджуваних концентрацій ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 не приводила до повного знешкодження мутагенної дії біхромату калію на тест-культури S. typhimurium ТА98 та S. typhimurium ТА100. Найбільш активним був ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281, який інгібував мутагенез, зумовлений біхроматом калію, на 57 -78% залежно від концентрації. Антимутагенна активність ЛПС досліджених патоварів P. syringae є найвищою в разі одночасного внесення ЛПС і мутагену до суспензії клітин тест-штамів S. typhimurium, що може бути пов'язано з перешкоджанням проникненню біхромату калію в клітини. Однак здатність ЛПС зменшувати кількість ревертантів у клітин тест-штаму, попередньо оброблених мутагеном, може свідчити про вплив ЛПС на процеси репарації передмутаційних пошкоджень ДНК.

У навколишньому середовищі накопичується істотна кількість речовин з мутагенними властивостями, через це надзвичайно актуальним є пошук речовин з антимутагенними властивостями. Скринінг речовин з антимутагенними властивостями як потенційного джерела антимутагенів проводять серед рослин.

Виявлено, що соки, водні, ацетонові, фенольні та спиртові екстракти багатьох сільськогосподарських культур мають генопротекторні властивості (Бариляк, Исаева, 1994; Cardador-Martinez et al., 2006; Pedreshi, Cisneros-Zevallos, 2006). концентрація зазначених речовин та співвідношення між ними змінюються під впливом патогену при інфекційному процесі. Але невідомо, який вплив мають збудники захворювань на антимутагенну активність рослин. Адже при розвитку інфекційного процесу під дією фітопатогенних бактерій утворюються токсичні речовини.

Для дослідження антимутагенних властивостей уражених бактеріями рослин використовували пшеницю у фазі сходів, яку інокулювали збудником бактеріальної плямистості P. syringae pv. atrofaciens 8281. Результати цих дослідів показали, що у спиртових екстрактах із листків пшениці у фазі сходів з ознаками ураження, спричиненого P. syringae pv. atrofaciens 8281, та здорових листків, мутагенна активність відсутня. Кількість колоній His⁺-ревертантів при внесенні екстрактів із листків пшениці вірогідно не відрізняється від спонтанного фону мутацій тест-штамів S. typhimurium.

соки з листків пшениці у фазі сходів не виявляють мутагенної активності в експериментах з тест-штамом S. typhimurium ТА98. При цьому було отримано майже однакову кількість колоній His⁺-ревертантів, якщо використовували соки рослин як з ознаками ураження, так і здорових рослин. За використання тест-штаму S. typhimurium ТА100 виявлено антимутагенну активність соків із листків пшениці у фазі сходів. сік із листків з ознаками бактеріального ураження виявляє таку саму активність, як і сік із здорових рослин пшениці. сік із листків пшениці, на яких розвивались некрози, спричинені P. syringae pv. atrofaciens 8281, інгібує мутагенез на 21% порівняно зі спонтанним фоном мутацій S. typhimurium ТА100. Сік із неінфікованих листків пшениці зменшує кількість спонтанних His⁺-ревертантів S. typhimurium ТА100 на 22%. Тобто, інфікування рослин пшениці збудником бактеріальної плямистості P. syringae pv. atrofaciens 8281 не призводить до синтезу сполук з мутагенною активністю.

антимутагенна активність щодо індукованого біхроматом калію мутагенезу соку із здорових рослин у тест-штаму S. typhimurium ТА100 майже не відрізняється від такої із листків пшениці з симптомами бактеріального ураження. сік із листків пшениці, інокульованої P. syringae pv. atrofaciens 8281, зменшує мутагенну дію біхромату калію на тест-штам S. typhimurium ТА100 на 39%, а сік із здорового листя пшениці - на 38%.

Отже, нами виявлена антимутагенна активність соку з неуражених листків пшениці в бактеріальній тест-системі. Він зменшує кількість спонтанних та індукованих біхроматом калію мутацій у тест - штаму S. typhimurium ТА100. При цьому сік із уражених збудником бактеріозу рослин не втрачає антимутагенні властивості.

Відомо, що процеси мутагенезу та канцерогенезу мають багато спільного. речовини з антимутагенними властивостями часом мають також протипухлинну активність. Тому у ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 було досліджено протипухлинну активність на моделі пухлиноутворення, зумовленого штамами A. tumefaciens на експлантатах бульб картоплі. Адже відомо, що бактерії A. tumefaciens є легковідтворюваною моделлю пухлинного росту, якій притаманні всі ознаки пухлин тварин (Сарнацкая, 1993).

Установлено, що ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 запобігають утворенню пухлин та зменшують інтенсивність їхнього розвитку на експлантатах картоплі в разі використання їх в період інокуляції експлантатів, за 20 хв до інокуляції та через 20 хв після інокуляції штамами A. tumefaciens. Протипухлинна дія залежить від концентрації розчину ЛПС для оброблення експлантатів та від штаму A. tumefaciens, використаного для індукції пухлиноутворення.

значне зниження інтенсивності пухлиноутворення внаслідок оброблення експлантатів ЛПС через добу після зараження A. tumefaciens свідчить про те, що ЛПС впливає на перебіг інфекційного процесу, оскільки прикріплення клітин A. tumefaciens відбувається переважно протягом перших 15 хв контакту.

Таким чином, досліджені ЛПС патоварів P. syringae виявляють антимутагенні (у тесті Еймса) та протипухлинні властивості щодо A. tumefaciens.

Розділ 9. Розвиток реакції надчутливості в рослинах тютюну

Реакція надчутливості (РНЧ) рослин широко використовується для визначення патогенності ізолятів фітопатогенних бактерій роду Pseudomonas та виявлення закономірностей розвитку патологічного процесу.

Для швидкого визначення патогенності бактерій З. Клементом запропонована РНЧ в листках тютюну (Klement, 1963).

нами розроблено наступну 10 - бальну шкалу для обліку РНЧ рослин під впливом досліджуваних бактерій:

0- реакція надчутливості відсутня;

1- слабка зміна кольору листка в місці інфільтрації;

2- на світло зеленому тлі рідко світло-коричневі смуги;

3- на зеленому тлі світло-коричневі дрібні некротичні плями, слабко окреслені;

4- коричневі нечіткі штрихи;

5- 25% коричневих некрозів на інфільтрованій площі;

6- 50% коричневих некрозів на інфільтрованій площі;

7- 75% коричневих некрозів на інфільтрованій площі;

8- чітка некротична тканина на всій поверхні інфільтрованої площі листка;

9- чіткі коричнево-іржаві некротичні плями, тканина витончена по всій інфільтрованій поверхні.

виявлено, що інтенсивність розвитку РНЧ залежить від штаму бактерій. найбільш чітко і швидко РНЧ проявляється і протікає за використання 1 - 3 -добових культур P. syringae pv. atrofaciens та P. syringae pv. lachrymans, що відповідає фазам експоненційного росту та стаціонарної фази. активність 5- добової культури зменшується, а культурою бактерій віком 10 - 14 діб викликати РНЧ нам не вдалося. Нездатність 10 - 14 - денної культури викликати РНЧ можливо пов'язана з недостатньою кількістю живих клітин в інокулюмі або пригнічення РНЧ зумовлене впливом мертвих клітин та продуктів їхнього розкладу.

клітини бактерій, інактивовані нагріванням до 90- 100 ⁰С та 55 ⁰С протягом однієї години та оброблення УФ-променями не викликають РНЧ. Це можна пояснити необхідністю безпосереднього впливу живих клітин на ініціацію РНЧ, тобто за їхнього розмноження у тканині, або термолабільними речовинами, які є в суспензії. При цьому такі речовини не повинні витримувати нагрівання навіть до 55 ⁰С та дії УФ-променів. При температурній інактивації бактеріальної культури зберігаються термостійкі речовини, до них належить і ЛПС. Але термічно інактивовані культури не спричинюють РНЧ. Тому логічно допустити, що ЛПС безпосередньо не ініціюють РНЧ, і в цьому процесі їм відводиться лише допоміжна роль.

На збудників захворювання та патологічний процес, який вони викликають, впливають солі важких металів. Тому перевіряли, чи зберігається така закономірність відносно РНЧ. Для цього використовували сірчанокислі солі - міді, цинку, свинцю та кадмію. Виявлено, що оброблення листків тютюну 10,0% розчинами всіх солей металів викликали появу значних некротичних плям. Часом невеликі ознаки опіків з'являлись за оброблення листків 1%-ми розчинами солей, але в жодному випадку не виявлено в дослідах із 0,1 % солями та в контролі (вода).

Сумісна дія високої температури і важких металів сприяли гальмуванню розвитку РНЧ у P. syringae. За використання 0,1% - х солей через добу РНЧ не розвивалася за внесення солей цинку та свинцю, через дві доби - лише свинцю. Солі міді і цинку гальмували РНЧ. Особливо чітко ця залежність спостерігається за використання 1 % - х розчинів солей. Солі міді та цинку повністю гальмували розвиток РНЧ. При використанні свинцю та кадмію пригнічення реакції спостерігали тільки в перші дні обліку. Але через три доби РНЧ проявлялась на рівні контролю (контроль - суспензія патогена).

Отже, індукція та перебіг РНЧ у рослинах тютюну під впливом штамів P. syringae залежить від віку культури та концентрації клітин в інфільтрованій суспензії. РНЧ розвивається під впливом живих бактерій. Не спричинюють РНЧ бактерії, інактивовані температурою та УФ-променями і метаболіти, що залишилися після осадження бактеріальних клітин. Інгібують РНЧ солі важких металів у концентраціях 0,1 - 1% та висока температура навколишнього середовища (+30^оС).

Усі живі організми мають добові ритми чутливості. Це підтверджено на людині, рослинах, комахах та тваринах. Відомо, що ріст рослин, їхні фізіолого-біохімічні процеси істотно змінюються протягом доби і мають чітку добову залежність. Відомо, що всі або майже всі біохімічні процеси у рослин змінюються впродовж доби, в тому числі й ті, від яких залежить стійкість рослин до фітопатогенних бактерій. Тому у нас виникла ідея щодо різної добової чутливості рослин до бактерій під час розвитку РНЧ.

Показано, що РНЧ розвивається максимально за інокуляції бактеріальною суспензією патогену у вечірні і нічні години. Максимум її розвитку спостерігається за ін'єкції о 21 годині, мінімум - о 9 - 12-й годині. Результати прояву реакції залежать від тривалості контакту бактерії з рослиною. Так, після 12-15 - годинного контакту РНЧ розвивається інтенсивніше за введення патогену о 3 і 6 - й годині, тоді як при 18, 21 і 24-годинній експозиції найкраще РНЧ проявляється за ін'єкції о 21 годині. Через 33 і більше годин після введення бактеріальної суспензії в листках тютюну не виявлено розбіжності в розвитку РНЧ залежно від часу інокуляції. Тобто, через дві доби після інокуляції сумарний розвиток РНЧ вирівнюється і на її прояв не впливає час ін'єкції. Через 48 годин можна побачити лише різницю в кольорі некротичної тканини.

пояснити, чому саме за нічної інокуляції найкраще проявляється РНЧ, можна антибактеріальною або фітонцидною дією рослин на фітопатогени.

Таким чином, ми дійшли висновку, що на розвиток РНЧ у рослин впливає як період доби внесення інфекційного матеріалу, так і інші чинники. Одним із таких чинників, як показали результати наших дослідів, є різна інтенсивність некротизації рослинної тканини протягом доби. За видимими ознаками через добу найінтенсивніше некротизується тканина від 12-ї до 18-ї години, незалежно від часу інокуляції. Саме ці два фактори - інтенсивність розвитку некрозу та час ін'єкції впродовж доби зумовлюють сумарний розвиток РНЧ.

у наших дослідах перші видимі ознаки РНЧ з'являлися через 12 год. Можливо, що неоднакова інтенсивність розвитку РНЧ протягом 24-годинного циклу і час (12 год) розвитку перших ознак РНЧ свідчить про різну чутливість рослини до інфекційного навантаження.

Порівнюючи РНЧ з перебігом інфекційного процесу на рослині-хазяїні, можна дійти висновку, що їхньою основою є різні біохімічні процеси.

Більшість даних літератури свідчать про те, що РНЧ спричинюють тільки живі клітини бактерій (Klement et al., 1990). Відповідно до наших спостережень інактивація клітин бактерій призводить до втрати ними спроможності викликати РНЧ в листках тютюну. Не викликали РНЧ і клітини бактерій, які інактивовані нагріванням при 55 і 100 С протягом однієї години і за дії УФ-променів. Якщо при 100 С інактивуються термолабільні полімери клітини, то при 55 С и УФ-опроміненні вони здебільшого зберігаються. Ці дані наводять на думку, що біополімери клітини, тим більше такі стійкі до температури, як ЛПС, не мають вирішального значення у відповідній реакції рослини на ін'єкцію бактеріями. Відомо, що РНЧ це відповідь на розмноження у тканинах рослин бактерій, а, можливо, на постійну присутність (чи накопичення) у тканині бактеріальних метаболітів, а не одноразове введення їх.

Ми вивчили вплив ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 на утворення видимих ознак РНЧ у листках тютюну. Використовували різні концентрації ЛПС (від 0,02 до 200 мкг/мл) та різного ступеня очищення. Вибір зазначених концентрацій було обумовлено необхідністю охопити ті концентрації ЛПС, що містяться в суспензії клітин титром 10⁷-10⁸, яку використовували для ін'єкції в паренхімну тканину листків тютюну.

Водні розчини ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281, незалежно від ступеня очищення і концентрації не викликали РНЧ.

ЛПС різних штамів не спричинювали РНЧ в листках тютюну Попереднє введення ЛПС бактерій (за 18 год. до інокуляції фітопатогенними бактеріями) не впливало на розвиток РНЧ за внесення як гомологічного, так і гетерологічного штаму. Відзначено розвиток слабкої РНЧ (через добу) за введення штамів P. syringae pv. atrofaciens 8281 та P. syringae pv. coronafaciens 9030 при попередній інокуляції ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281.

Складові компоненти ЛПС Оспецифічний полісахарид (ОПС), кор і ліпід А - були неактивними: вони не викликали утворення некротичних зон в листках тютюну. Проте, за інфільтрації компонентів ЛПС кору, ОПС і ліпіда А -водонасиченість зберігалася, хоча і неоднаковий час.У процесі роботи ми виявили штам P. fluorescens 7769, що містить О-ПС, ідентичний ЛПС P. syringae pv. tabaci. Незважаючи на таку подібність, P. fluorescens 7769 не викликав РНЧ в листках тютюну, що підтверджує висновок щодо неучасті ЛПС у розвитку РНЧ.

ВИСНОВКИ

1. Теоретично обґрунтовано та експериментально доведено доцільність комплексного вивчення патогенних і сапрофітних бактерій зернових культур, що дозволяє встановити низку закономірностей. Зокрема, доведено вищу конкурентну спроможність сапрофітних епіфітних та ендофітних бактерій порівняно з фітопатогенами за їхньої взаємодії in vivo та in vitro.

2. Установлено, що поверхня та внутрішні тканини здорової пшениці заселені сапрофітними бактеріями, видовий склад яких ідентичний, зокрема бактеріями Pantoea agglomerans, Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Erwinia sp. На поверхні зерна пшениці переважає Pantoea agglomerans (80 - 90%), а у внутрішніх тканинах - Bacillus sp. (55% ) від загальної бактеріальної мікрофлори.

3. епіфітні і ендофітні сапрофітні та авірулентні штами фітопатогенних бактерій послаблюють на 10% і більше прояв симптомів захворювання та перебіг інфекційного процесу, спричиненого фітопатогенними бактеріями.

4. Вперше молекулярно-генетичними методами за допомогою gusA-гена, який кодує в-глюкуронідазу, доведено здатність епіфітних ізолятів нарівні з ендофітними колонізувати внутрішні тканини рослин. Одержані дані спростовують гіпотезу про те, що у внутрішні тканини рослин проникають лише специфічні ендофітні штами бактерій.

5. Вперше показано, що екологічні умови існування бактерій не впливають на їхній жирнокислотний склад. Бактерії P. agglomerans за умов ендофітного і епіфітного існування мають однаковий набір жирних кислот, але відрізняються лише їхнім кількісним вмістом. Ендофітні штами видів роду Bacillus характеризуються наявністю розгалужених жирних кислот та відсутністю оксикислот. У складі жирних кислот P. fluorescens виявлені характерні для виду 3 оксикислоти - 3-гідроксидеканова, 2-гідроксидодеканова і 3- гідроксидодеканова.

6. Вперше виявлено здатність бактерій утворювати сигнальні молекули - ацилгомомосеринлактон (аГСЛ) під впливом інших видів. P. agglomerans, яка не утворює сигнальних молекул, виділяє їх у присутності деяких фітопатогенів - Burkholderia gladioli pv. alliicola та Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, хоча не впливає на утворення аГСЛ у фітопатогенів, які його синтезують.

7. Свіжовиділені та колекційні популяції основних збудників захворювань зернових - P. syringae pv. atrofaciens та P. syringae pv. coronafaciens - гетерогенні за агресивністю, вірулентністю, морфологією колоній, деякими біохімічними та фізіологічними властивостями, антигенним складом тощо. Гетерогенність клонів популяцій завжди обмежена рамками виду.

8. Вперше показано, що екологічними нішами сапрофітного виживання фітопатогенів є поверхня рослини-хазяїна та імунних рослин. Так, P. syringae pv. atrofaciens сапрофітно існує на ззовні здорових рослинах пшениці; P. syringae pv. coronafaciens - на поверхні листків вівса, щириці звичайної, лободи запашної, молочаю плосколистого, осоту польового, ромашки запашної, кульбаби, мати-й-мачухи та вики.

9. показано приуроченість окремих серогруп у пристосованості бактерій до умов існування. В Україні на уражених рослинах пшениці виявлені штами II, IV, V, VI серогруп, з домінуванням серогрупи IV, на вівсі - I i V з переважанням штамів серогрупи V, у Болгарії на пшениці - II, IV, VI. Штами збудників захворювань зернових культур, виділені як епіфіти, домінують в інших серологічних групах, ніж штами, ізольовані з уражень.

10. Вперше встановлено структуру О- полісахаридного (О-ПС) ланцюга штаму P. syringae pv. coronafaciens 9030 і уточнено для P. syringae pv. atrofaciens 8281. О-ПС досліджуваних штамів є гетерогенним і містить 3 типи О-ланцюгів, у яких основний ланцюг О-ПС являє собою залишки L- рамнози, а боковим замісником є 3-ацетамідо-3,6-дидезокси-D-галактоза. Досліджувані штами належать до однієї серогрупи (I) і у своїй структурі О-ПC мають один повністю ідентичний ланцюг.

11. P. syringae pv. coronafaciens 9030 і P. syringae pv. atrofaciens 8281 не утворюють метаболітів із мутагенними властивостями. Їх ліпополісахариди (ЛПС) виявляють антимутагенну активність, зменшуючи частоту як спонтанних, так і індукованих біхроматом калію мутацій тест-штамів S. typhimurium.

12. Виявлено, що ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 запобігають утворенню пухлин, зменшують інтенсивність та перебіг їхнього розвитку на експлантатах картоплі в разі використання їх у період інокуляції A. tumefaciens. Протипухлинна дія залежить від концентрації ЛПС.

13. встановлено вплив на прояв та розвиток реакції надчутливості в листках тютюну за дії P. syringae віку культури, її життєздатності, терміну ін'єкції протягом доби та солей важких металів. ЛПС P. syringae не приймають участі в реакції надчутливості.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Pasichnik L. A. Heterogeneity of the natural population of Pseudomonas syringae pathovars / L. A. Pasichnik, R. I. Gvozdyak, S. F. Khodos // Developments in Plant Pathology. - 1997. - v. 9. - p. 40-44 (Здобувачем здійснено планування експерименту, виконано основну частину експериментальних досліджень, узагальнено результати, підготовлено публікацію).

2. Пасічник Л. А. Епіфітна фаза існування Pseudomonas syringae pv. coronafaciens - збудника ореольного бактеріозу вівса / Л. А. Пасічник // Мікробіол. журн. - 1999.- Т. 61, № 6. - С. 9-14.

3. Пасичник Л. А. Серологическая гетерогенность штаммов Pseudomonas syringae pv. atrofaciens и их экологические ниши / Л. А. Пасичник, Л. М. Яковлева, Р. И. Гвоздяк, В. И. Василев // Микробиология. - 2003.- Т. 72, № 6. - С. 828-833 ( Здобувачем заплановано роботу, основна роль в проведенні експерименту - отримані антигени, поставлені серологічні реакції та проведено серогрупування штамів Pseudomonas syringae pv. atrofaciens, узагальнені результати, підготовлені матеріали до публікації) .

4. Gvozdyak R. I. Difference in susceptibility of plants to pathovars of Pseudomonas syringae during the day / R. I. Gvozdyak, L. A. Pasichnik, S. F. Khodos // Developments in Plant Pathology. - 1997. - v. 9. - p. 150-154 (Здобувачем здійснено планування експерименту, проведення польових досліджень, узагальнено результати, підготовлено публікацію).

5. Гвоздяк Р. І. Ліполітична активність фітопатогенних бактерій / Р. І. Гвоздяк, Л. А. Пасічник, І. П. Галич, С. Ф. Ходос // Мікробіол. журн. - 1996. - Т. 58, № 1. - c. 22- 26 (Здобувачем проведено планування експерименту, підібрані методи та штами, опрацьовано результати та написано статтю).

6. Pasichnik L. A. Heterogeneity of natural population of Pseudomonas syringae pv. coronafaciens / L. A. Pasichnik, S. F. Khodos // Мікробіол журн. - 1996. - Т. 58, N 4. - C. 3-6 (Здобувачем проведено планування експерименту, польові дослідження, опрацювання результатів, написання статті).

7. Пасічник Л. А. Антигенні властивості бактерій патоварів Pseudomonas syringae, які уражують зернові культури / Л. А. Пасічник // Мікробіол. журн. - 2000. - Т. 62, № 5. - С. 18-22.

8. Zdorovenko E. L. Structural heterogeneity in the lipopolysaccharides of Pseudomonas syringae with O-polysaccharide chains having different repeating units / E. L. Zdorovenko, G. V. Zatonsky, G. M. Zdorovenko, L. A. Pasichnik, A. S. Shashkov, Yu. A. Knirel // Carbohydrate Research. - 2001. - 336. - P. 329-336 (Здобувачеві належить ідея, спільно із Здоровенко Г.М. отриманий ЛПС штамів P. syringae, проведена його деградація, досліджені серологічні властивості отриманих препаратів, проведено узагальнення результатів)

9. Гвоздяк Р. І. Генопротекторна активність ліпополісахариду Pseudomonas syringae pv. coronafaciens 9030 / Р. І. Гвоздяк, Л. М. Ващенко, Л. А. Пасічник // Доп. НАН України. - 2003. - № 4. - С. 159-162. (Здобувачем здійснено планування та керівництво експериментом, підібрані методи та отримано ЛПС, узагальнено результати, підготовлено публікацію).

10. Гвоздяк Р. І. Відділ фітопатогенних бактерій на порозі нового тисячоліття / Р. І. Гвоздяк, Л. А. Пасічник // Мікробіол. журн.- 1998.- Т. 60, № 6.- с. 26-37 (Здобувачем проведений збір експериментальних і літературних даних, їх аналіз; Р.І. спільно з Гвоздяком - узагальнення та написання статті).

11. Гвоздяк Р. І. Ендофітна мікрофлора зерна пшениці та її взаємодія з фітопатогенними бактеріями / Р. І. Гвоздяк, Л. В. Кабашна, Л. А. Пасічник, Є. А. Макарчук // Доп. НАН України. - 2001. - № 1. - С. 173-177 (Здобувачем здійснено керівництво роботою, планування, проведено аналіз та узагальнення результатів, підготовлено публікацію до друку).

12. Макарчук Є. А. Мікробіота зерна пшениці та перспективи її використання для захисту рослин / Є. А. Макарчук, Л. В. Кабашна, Л. А. Пасічник // Аграрний вісник Причорномор'я. - 1999.- Вип. № 3 (6), Ч. II. - с. 139-143 (Здобувачем здійснено керівництво роботою, планування, проведено аналіз та узагальнення результатів, підготовлено публікацію до друку).

13. Пасічник Л. А. Серологічна характеристика штаму 7769 Pseudomonas fluorescens, ізольованого з жита / Л. А. Пасічник, Н. Я. Губанова, Р. І. Гвоздяк // Мікробіол. журн. - 2001. - Т. 63, № 1. - с. 34-40 (Здобувачеві належить ідея, основна роль в проведенні експерименту - отримання антисироваток, проведення серологічних реакцій, узагальнення результатів та підготовка статті до друку).

14. Гвоздяк Р. І. Вплив фізіологічного стану бактерій та важких металів на реакцію надчутливості на листі тютюну / Р. І. Гвоздяк, Л. А. Пасічник, С. Ф. Ходос, Л. М. Ващенко // Мікробіол. журн. - 2001.- Т. 63, № 6. - С. 25-31 ( Здобувачем здійснено планування експерименту, підібрані штами бактерій, збір літературних даних і їх аналіз, узагальнено результати, підготовлено публікацію).

15. Гвоздяк Р. І. Динаміка досліджень фітопатогенних бактерій в Інституті мікробіології і вірусології НАН України / Р. І. Гвоздяк, Л. А. Пасічник // Мікробіол. журн. - 2003. - Т. 65, №1-2. - С. 84-103 (Здобувачем проведений збір літературних та експериментальних даних; спільно з Р.І. Гвоздяком проаналізовані дані літератури по дослідженню фітопатогенних бактерій на різних сільськогосподарських рослинах, деревних та квіткових культурах, підготовлено публікацію).

16. Гвоздяк Р. І. Вплив ліпополісахарид-білкового комплексу Pseudomonas syringae pv. atrofaciens на процес пухлиноутворення, спричинений Agrobacterium tumefaciens / Р. І. Гвоздяк, Л. А. Пасічник, Л. М. Ващенко // Мікробіол. журн. - 2003. - Т. 65, № 3. - С. 5-13 (Здобувачем здійснено планування експерименту, проведення досліджень, опрацювання результатів, написання статтіі).

17. Пасічник Л. А. Бактеріальне захворювання вівса в Україні / Л. А. Пасічник // Агроекологічний журн. - 2004. - № 1. - С. 32-35.

18. Ващенко Л. М. Вплив ліпополісахариду Pseudomonas syringae pv. atrofaciens на спонтанні та індуковані біхроматом калію мутації у Salmonella typhimurium / Л. М. Ващенко, Л. А. Пасічник, Р. І. Гвоздяк // Біополімери і клітина. - 2004. - Т. 20, № 4. - С. 295-299 (Здобувачем здійснено керівництво роботою, планування, проведено аналіз та узагальнення результатів, підготовлено публікацію до друку).

19. Пасічник Л. А. Взаємодія Pantoea agglomerans зі збудником базального бактеріозу пшениці // Мікробіол. журн. - 2005.- Т. 67, № 1. - С. 32-40.

20. Пасічник Л. А. Епіфітні бактерії пшениці та їх вплив на Pseudomonas syringae pv. atrofaciens / Л. А. Пасічник, Р. І. Гвоздяк, С. Ф. Ходос // Науковий вісник Ужгородського університету, серія Біологія. - 2001.- № 9.- с. 158-160 (Здобувачем здійснено планування експерименту, проведення досліджень, узагальнено результати, підготовлено публікацію).

21. Королева И. Б. Устойчивость сортов озимой мягкой пшеницы к базальному бактериозу / И. Б. Королева, Н. А. Жиленко, Л. А. Пасичник, Н. А. Бег // Биология и агротехника зерновых культур в условиях интенсивного сельскохозяйственного производства. Сборник научн. трудов. - Одесса, 1988. - C. 54-59 (Здобувачем виконана основна частина експерименту - проведення штучного зараження сортів пшениці, його облік, аналіз та узагальнення результатів).

22. Kovalchuk M. V. Ecologically-friendly crop production with microbial inoculants. II Biocontrol capasity of bacterial isolates, candidates for inoculant development / M. V. Kovalchuk, V. V. Negrutska, I. E. Zaetz, L. A. Pasichnik, R. I. Gvozdyak, N. O. Kozyrovska // Науковий вісник Ужгородського університету, серія Біологія. - 2001. - № 9.- с. 82-84 (Здобувачем здійснено планування експерименту, підбір об'єктів дослідження, підготовка культур до дослідження, обговорення із співавторами отриманих результатів та підготовка статті до друку).

23. Ващенко Л. М. Антимутагенні властивості ліпополісахариду Pseudomonas syringae pv. coronafaciens 9030 / Л. М. Ващенко, Р. І. Гвоздяк, Л. А. Пасічник // Науковий вісник Ужгородського університету, серія Біологія. - 2001.- № 9. - с. 145-147 ( Здобувачем здійснено планування експериментів, підібрані методи, виділений та ідентифікований штам бактерій, узагальнено результати, підготовлено статтю до друку).

24. Ващенко Л. М. Антимутагенна активність пшениці, інфікованої P. syringae pv. atrofaciens / Л. М. Ващенко, Л. А. Пасічник, Р. І. Гвоздяк // Наук. вісник Чернівецького університету: Збірник наук. праць. - 2004. - Вип. 194. - С. 42-47 (Здобувачем здійснено планування експерименту, проведено польові дослідження, узагальнено результати, підготовлено публікацію).

25. Пасічник Л. А. Епіфітна і ендофітна мікрофлора здорового зерна та вегетуючих рослин пшениці / Л. А. Пасічник, Р. І. Гвоздяк, С. Ф. Ходос // Вісник ДАУ, серія Біологія. - 2005. - № 2 (15). - С. 141-148 (Здобувачем здійснено планування експерименту, основна роль в проведенні лабораторних і польових досліджень, узагальнено результати, підготовлено публікацію).

26. Ващенко Л. М. Протипухлинна активність ліпополісахариду Pseudomonas syringae pv. coronafaciens // Л. М. Ващенко, Р. І. Гвоздяк, Л. А. Пасічник // Науковий вісник Ужгородського Університету. серія Біологія.- 2005.- Вип. 16. - С. 100-105 (Здобувачем здійснено керівництво роботою, планування, проведено аналіз та узагальнення результатів, підготовлено публікацію до друку).

27. Пасічник Л. А. Проникнення Pantoea agglomerans в коріння пшениці / Л. А. Пасічник, Р. І. Гвоздяк, Н. О. Козировська, М. В. Ковальчук, В. В. Негруцька, С. Ф. Ходос // Вісник ОНУ, серія Біологія. - 2005. - т.10, вип. 3. - С. 294-299 (Здобувачем здійснено керівництво роботою, планування, основна роль в проведенні польових експериментів, аналіз та узагальнення результатів, підготовлено публікацію до друку).

28. Ващенко Л. М. Вплив екзометаболітів фітопатогенних бактерій на частоту мутацій Salmonella typhimurium / Л. М. Ващенко, Р. І. Гвоздяк, Л. А. Пасічник, С. М. Мороз // Вісник ОНУ, серія Біологія. - 2005. - т. 10, вип. 3. - С. 324-329 (Здобувачем здійснено керівництво роботою, планування, проведено аналіз та узагальнення результатів, підготовлено публікацію до друку).

29. Гвоздяк Р. И. Бактерии рода Pseudomonas на сорняках / Р. И. Гвоздяк, Л. М. Яковлева, Л. А. Пасичник, Т. Н. Щербина, Л. Е. Огородник // Мікробіол. журн. - 2005. - Т. 67, № 2. - С. 63-69 (Здобувачем проведено планування, збір літературних і експериментальних даних, особисто виконана експериментальна частина по епіфітному виживанню патогенів, досліджені їх біологічні властивості, узагальнені результати, підготовлено статтю до друку).