Розробка та застосування засобів специфічної профілактики сказу тварин

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Сказ - одна з найбільш поширених у світі зооантропонозних нейроінфекцій свійських і диких тварин. На сьогодні благополучними щодо сказу залишаються лише Австралія і декілька острівних країн та держав Європи (Нова Зеландія, Японія, Норвегія, Швеція, Іспанія, Португалія). Щорічно від сказу гинуть понад 1 млн. тварин (Недосеков В.В. з співавт., 2003), 50000 людей (Шестопалов А.М. з співавт., 2001), серед яких частка дитячої смертності сягає 30-50% (Rotavel J. і ін., 1998).

Боротьба зі сказом залишається однією з найскладніших проблем, котра може бути вирішеною тільки загальними зусиллями адміністративно-господарчих служб, органів державної ветеринарної та гуманної медицини, спрямованими на упорядкування утримання свійських тварин, перш за все, собак і кішок, своєчасну вакцинацію, відловлювання бездоглядних тварин, регуляцію чисельності популяції диких м'ясоїдних у природних умовах.

Однією з важливих складових проблеми контролю сказу є специфічна профілактика, особливо серед диких тварин, індивідуальне застосування вакцин котрим неможливе. У зв'язку з цим важко переоцінити досягнення з оральної імунізації диких м'ясоїдних тварин, яка була запропонована наприкінці 70-х років минулого сторіччя. Досвід, накопичений за час впровадження оральної імунізації, свідчить про її ефективність при викорененні сказу навіть в умовах росту популяції диких тварин, якщо проводиться системна їх вакцинація впродовж декількох років (Aubert М.Т., 1999).

Останнім часом епізоотична ситуація щодо сказу ускладнюється зростанням ролі диких тварин у поширенні хвороби, серед яких лисиця займає провідне місце, особливо в країнах Європи, у тому числі в Україні. Аналізуючи проблему так званої “європейської моделі” рабічної інфекції, Макаров В.В. з співавт. (2002) також пов'язують зростання за останнє десятиріччя на території пострадянських країн кількості неблагополучних пунктів із розширенням ареалу мешкання диких тварин, особливо лисиці, яких вважають хазяїном-резервуаром і переносником інфекції.

Ситуація, що склалася внаслідок поширення сказу серед диких м'ясоїдних, сприяє залученню в епізоотичний процес свійських тварин, перш за все, собак і, що особливо турбує, кішок. Ріст популяції бездоглядних собак і кішок, скупчення цих тварин у великій кількості на околицях міст та смітниках, з одного боку, і процес синантропізації диких м'ясоїдних тварин внаслідок доступності корму в цих місцях, з іншого боку, робить неминучим контакт цих тварин і можливість інфікування. В зв'язку з цим виникає проблема щодо організації заходів боротьби з бездоглядними собаками і кішками та дикими м'ясоїдними тваринами шляхом скорочення популяції.

Другим аспектом у системі боротьби зі сказом є вакцинопрофілактика. Нині для імунотерапії і профілактики цієї хвороби запропоновані досить ефективні засоби вітчизняного і зарубіжного виробництва. В багатьох країнах світу застосовуються як живі, так й інактивовані вакцини, проте, їхня якість, як відзначають Недосеков В.В. і Хухоров И.Ю. (2003), не завжди забезпечує необхідний рівень стійкості до зараження вірусом сказу, що негативно відбивається на ефективності системи антирабічних заходів. Успіхи і невдачі при щепленні диких тварин залежать в значній мірі від імуногенності вакцин. Проте є ряд причин загально-організаційного порядку, що негативно впливають на профілактичну ефективність застосування антирабічних препаратів.

Одним із факторів, що впливають на ступінь захисту при вакцинації тварин, є знижена імунобіологічна реактивність організму. Як відомо, на фоні вторинних імунодефіцитів у тварин, що супроводжуються порушенням клітинного імунітету і в більшості випадків залишаються не діагностованими, вакцинація буває недостатньо ефективною, оскільки не забезпечує формування напруженого імунітету (Красочко П.А. з співавт., 2001). Підвищення ефективності вакцинації у таких випадках можливе при використанні засобів, підсилюючих протективну імунну відповідь організму на введений препарат. У зв'язку з цим існує необхідність не тільки у розробці більш ефективних в імуногенному відношенні вакцин, а й в пошукові та застосуванні нових імуномодуляторів.

Розробка специфічних засобів боротьби зі сказом зараз спрямована на створення інактивованих вакцин для щеплення свійських м'ясоїдних і сільськогосподарських тварин, а також живих антирабічних вакцин для імунізації диких м'ясоїдних. Загальними вимогами до цих біопрепаратів є їхня небезпечність та імуногенна ефективність. Небезпечність залежить від біологічних властивостей виробничих штамів вірусу сказу, на основі яких виготовляється вакцина, дози і кратності застосування (Жестерев В.И., Лаптева О.Г., 2004). Оптимізація цих показників, що має важливе значення у плані розробки науково обґрунтованих технологій виготовлення і застосування вакцини проти сказу, дозволяє конструювати біопрепарати із заданими властивостями. Сучасна технологія виготовлення антирабічних вакцин тісно пов'язана з процесом культивування клітин і вірусу (Жестерев В.И., Юрков С.Г., 2003). Інтенсивний розвиток і широке застосування клітинних систем обумовлюються станом і можливостями ринку біопрепаратів. На підставі цього є доцільною розробка та удосконалення наукових основ технологій культивування виробничих штамів вірусу сказу і виготовлення високоефективних антирабічних вакцин.

Актуальність і перспективи розвитку цих досліджень зумовлені рядом технологічних аспектів виготовлення специфічних засобів профілактики сказу. Визначальною умовою виконання цієї роботи було, зокрема, вибір виробничих штамів, вивчення технології їхнього культивування, репродуктивної активності в різних клітинних культурах, способів очистки, інактивації, розробка препаративних форм вакцин, доз і кратності застосування та імуногенності.

Мета і завдання досліджень. Мета досліджень - розробка живої антирабічної культуральної та удосконалення технології виготовлення інактивованої антирабічної сухої культуральної вакцини на основі виробничих штамів вірусу сказу, репродукованих в культурі перещеплюваних клітин, та засобу, підсилюючого імуногенну ефективність інактивованого біопрепарату.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі завдання:

- вивчити особливості та тенденції розвитку епізоотичного процесу щодо сказу в Україні;

- випробувати і дати оцінку продуктивності в залежності від способів вирощування та визначити перспективну клітинну систему для культивування виробничих штамів вірусу сказу;

- вивчити біологічні властивості виробничих штамів вірусу сказу в умовах інтенсивної технології напрацювання біомаси;

- розробити живу антирабічну культуральну вакцину, провести лабораторне і виробниче випробування імуногенних властивостей;

- удосконалити спосіб виготовлення інактивованої антирабічної культуральної вакцини і вивчити її імуногенні властивості;

- визначити теоретичні і практичні основи використання імуномодулятора для корекції поствакцинального імунітету при щепленні тварин з імунодефіцитним станом;

- розробити і видати регламенти промислового виготовлення живої та інактивованої антирабічних культуральних вакцин.

1. Матеріали і методи досліджень

Робота виконувалась впродовж 2000-2005 років на базі цеху противірусних препаратів Державної Сумської біофабрики, лабораторій епізоотології та біотехнології Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Центральної та обласних і районних лабораторій ветеринарної медицини, а також Білоруського науково-дослідного інституту експериментальної ветеринарії імені Вишелеського С.В. за договором з творчої співдружності.

Епізоотичний стан щодо сказу в Україні і суміжних країнах вивчали за даними Міжнародного епізоотичного бюро та Державного департаменту ветеринарної медицини України і Центральної Державної лабораторії ветеринарної медицини, а також шляхом особистого аналізу епізоотичної ситуації зі сказу в Полтавській та Сумській областях.

У процесі розробки антирабічних вакцин використали фіксований вірус сказу, зокрема, штам РБ-71 (БілНДІЕВ-ВГНКІ), адаптований до ембріонів курей і культур первинно трипсинізованих клітин нирки свиней та фібробластів ЕК, вірулентність якого для мишей при інтрацеребральному зараженні складала 3,63-5,47 lg ЛД50/0,03 мл; штам Щелково-51, що підтримується на білих мишах і кролях, титр вірулентності - 4,8-5,2 lg ЛД50/0,03 мл та штам CVS (Challеnqe virus standart) - надійшов у 1971 році із лабораторії профілактики сказу Інституту полімієліту і вірусних енцефалітів РАМН, підтримується на білих мишах, кролях, собаках і вівцях, титр вірулентності - 4,6-5,4 lg ЛД50/0,03 мл.

Штами РБ-71 і Щелково-51 вірусу сказу культивували у первинних і перещеплюваних клітинних системах. Первинні культури клітин отримували за модифікованим Younqner J. (1954) методом Dulbecco R.(1954). Вихідним матеріалом для трипсинізації були нирки плодів собак та ембріони курей і перепілок. Із перещеплюваних клітин використовували лінії Vero, Frhk, ВНК-21/13, ПС, МДСК.

Культури клітин вирощували в 1,5-літрових матрасах та ролерних бутлях ємністю 0,5 і 3-5 л на живильних середовищах 199, Ігла МЕМ і ДМЕМ та їх суміші з додаванням 5-10% сироватки крові великої рогатої худоби. Живильні середовища готували з імпортних наборів компонентів на Державній Сумській біофабриці. Перещеплювані клітини підтримували шляхом серійних пересівів та зберігали в замороженому стані у рідкому азоті. Життєздатність клітинної популяції у процесі культивування, а також після дефростаціі визначали фарбуванням трипановим синім. Ступінь життєздатності клітин оцінювали за проліферативною активністю, а репродуктивну спроможність - за приростом їхньої біомаси на визначеній площині культуральних посудин та терміном формування моношару.

Штами РБ-71 і Щелково-51 вірусу сказу адаптували до нових умов культивування шляхом послідовно зростаючих пасажів. В якості вихідного вірусовміщуючого матеріалу штаму РБ-71 використали мозок заражених ним овець, а штаму Щелково-51 - клітино-культуральну суспензію. Вірулентність виробничих штамів НФ-2 і Щелково-51 та імуногенність вакцин вивчали на мишах, кролях, собаках, вівцях і великій рогатій худобі. У дослідах використано більше 12000 білих мишей - масою 18-20 г і мишей-сисунів масою 6-8 г, 180 кролів породи Шиншила масою 1,8-2,0 кг, 60 морських свинок, 340 безпорідних собак віком 4-24 місяців, 57 лисиць, 66 овець 1,5-2-річного віку та 146 голів великої рогатої худоби. Інфекційність культурального вірусу сказу визначали титруванням на білих мишах, для чого готували десятикратні розведення, що вводили інтрацеребрально, а імуногенність - за титром вірусонейтралізуючих антитіл в сироватках крові щеплених вакцинами тварин. Реакцію нейтралізації вірусу сказу проводили на білих мишах за загальноприйнятною методикою з робочими двократними розведеннями досліджуваних сироваток з постійною дозою вірусу (30 ЛД50/0,03 мл). Радіоактивне мічення культурального вірусу для оральної імунізації при вивченні патотропності здійснювали 5Н3-уридином у БілНДІЕВ. Вірусовміщуючу культуральну суспензію очищали за допомогою природної седиментації та центрифугування. Одержаний вірус інактивували фенолом, формальдегідом, теотропіном, етанолом, в-пропіолактоном при 3-х температурних режимах (4-10 єС, 20-22 єС і 37±0,5 єС).

Після завершення кожного технологічного циклу напівфабрикати перевіряли на стерильність та залишкову інфекційність, яку визначали шляхом 3-разового послідовного інтрацеребрального зараження білих мишей, стерильність контролювали за ГОСТ 28085-89 ("Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности") висіванням на МПБ, МПА, тіоглікольове середовище та середовище Сабуро. Нешкідливість та авірулентність вакцини контролювали внутрішньом'язовим введенням мишам (по 30-40 голів на кожен зразок або серію) у дозі 0,5 мл/гол з подальшим наглядом за тваринами впродовж 14 діб. Імуногенність визначали кількісним методом, випробовуючи захисні властивості нерозбавлених і в розведеннях вакцин при контрольному інтрацеребральному зараженні імунізованих тварин штамом CVS вірусу сказу у дозі 30 ЛД50/0,03 мл/гол. Оцінку стану клітинного імунітету проводили за методикою Чеботкевича М.Н. і Лютинского С.И. (Методы оценки состояния иммунной системы и факторов неспецифической резистентности в ветеринарии, С.-П.-1998).

Статистичний аналіз даних здійснювали за допомогою редактора електронних таблиць Microsoft Excel XP (2002) та пакету програм Statistika v 6.1 (Rus). Щодо статистичної обробки даних експериментальних досліджень продуктивності клітинних систем варіаційний знак досліджуваних тканин (числа клітин, одержаних при трипсинізації, або кількості знятих із посудин при пересівах перещеплюваних клітин) визначали, використовуючи елементи математичного аналізу (Меркур'єв Є., 1964). Квадратичні відхилення і середнє арифметичне вираховували для сукупності поставлених дослідів. За таблицею Стьюдента знаходили рівень вірогідності (р).

Дані з вивчення інфекційності вірусу та імуногенності вакцин піддавали статистичній обробці за методом Кербера у модифікації Ашмаріна І. (1962).

2. Результати досліджень

Епізоотологічний стан щодо сказу в Україні. У соціальному відношенні сказ залишається однією із найважливіших медико-ветеринарних проблем, з якою людство стикається на п'яти материках планети. Вивченням проблеми поширення, діагностики, профілактики та розробки заходів боротьби зі сказом займались і продовжують займатися багато дослідників як за кордоном, так і в країнах пострадянського простору (Ведерников А.А. з співавт., 1974; Селимов М.А., 1978; Stцhr K. et al, 1990; Прискока В.А. з співавт., 1996; Котенко М. з співавт., 1997; Павленко М., Троценко З.Р., 2000; Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001; Гришок Л.П. з співавт., 2002; Макаров В.К., 2002; Скибицький В.Г., 2003 та ін.).

В Україні захворювання на сказ має значне поширення, проте заходи боротьби поки що проводяться безсистемно, тільки в неблагополучних осередках. Між тим в багатьох країнах світу розроблено національні програми з ліквідації сказу на таких принципах, як всебічний епізоотологічний моніторинг та керування епізоотичним процесом на основі постійного нагляду, аналізу і оцінки епізоотичної ситуації та оперативного комплексного впливу на нього шляхом розриву усіх ланок епізоотичного ланцюга, з подальшим блокуванням і повним знешкодженням на рівні популяції, епізоотичного осередку, конкретної адміністративної території.

Нами встановлено, що епізоотичний стан щодо сказу в Україні продовжує залишатися напруженим і обумовлено це в першу чергу збільшенням кількості неблагополучних пунктів. На сьогодні сказ зареєстровано в усіх природно-географічних зонах України, у т. ч. і в АР Крим, в той час як до 2004 року неблагополучними були лише 23 області.

При аналізі сучасної епізоотичної ситуації щодо сказу в Україні за одиницю епізоотичного обліку нами обраний неблагополучний пункт, а не хвора тварина, оскільки у нашій країні сказ характеризується низьким індексом вогнищевості. Так, за період 1994-2004 рр. він дорівнював 1,2 (11121:9332). За останні десять років виявлено 9332 неблагополучних пункти із сказу. Особливо значне збільшення спостерігали у 2002 році, коли кількість їх досягла - 1312, що перевищило у 5,1 рази рівень 1994 року.

Як у 1994, так і у 2004 роках загальна кількість неблагополучних територій в цілому по країні не змінилася, а абсолютне зростання неблагополучних пунктів досягло 819, тобто збільшилось на 318,6%, в той час як на долю неблагополуччя серед сільськогосподарських тварин приходиться 208,7% (з 386 до 768 випадків). Таке просторове поширення сказу характерне для ензоотичного неблагополуччя і відсутності єдиного первинного вогнища. При аналізі розподілу кількості випадків сказу по географічних зонах України виявлені значні відмінності.

Так, середньостатистична кількість 502±135,5 неблагополучних пунктів щодо сказу усіх видів тварин у лісостеповій зоні перевищувала цей показник у 2 рази в поліссі (227±120,5) і в 1,4 рази в степовій зоні (355±87,2). Відповідно кількість уражених тварин (580) була вищою, ніж у 2 рази в поліссі і в 1,4 рази в степовій зоні (459).

Результати визначення взаємозв'язку між кліматичними та ландшафтними особливостями природно-географічних зон і напруженістю епізоотичного процесу підтверджують важливість співвідношення свійських і диких тварин у підтриманні епізоотичного процесу сказу в Україні. Результати порівняння видової структури тварин, котрі захворіли на сказ в різних зонах, переконливо свідчать, що питома вага свійських і диких тварин у неблагополучних пунктах степу і лісостепу істотно не відрізняються, де кількість захворілих на сказ диких м'ясоїдних була в межах - 33%, сільськогосподарських - 21-23% і свійських м'ясоїдних - 43-45%. У зоні полісся кількість випадків сказу серед диких тварин досягала - 60% від загальної кількості виявлених. Отримані дані вказують, що основним резервуаром рабічної інфекції є звичайна лисиця, яка мешкає не тільки в місцях дикої природи, а й в культурних ландшафтах, включаючи околиці міст і сіл. Це також пояснює різницю у співвідношенні неблагополучних пунктів щодо сказу диких і свійських тварин у поліссі, степу та лісостепу, де концентрація поголів'я лисиць вище.

Між тим, позитивна кореляція між випадками сказу лисиць і свійських м'ясоїдних складає всього - 0,85, а коефіцієнт кореляції сказу лисиць і сільськогосподарських тварин - 0,37, на підставі чого можна припустити, що у даному ланцюзі передачі сказу лисиці не відіграють провідної ролі. Це підтверджується високим коефіцієнтом - 0,86 кореляції випадків захворювання на сказ свійських м'ясоїдних і сільськогосподарських тварин. Отримані дані свідчать, що проміжною ланкою передачі вірусу сказу від лисиць сільськогосподарським тваринам є свійські м'ясоїдні, контроль за якими і проведення своєчасної профілактичної імунізації сприяло б забезпеченню значного зниження захворюваності сільськогосподарських тварин.

Порівнюючи динаміку поширення сказу в Україні за останні 11 років, ми встановили, що загальний тренд неблагополуччя і тренди за видами тварин збігаються за спрямованістю (виражене наростання кількості неблагополучних пунктів у 2000, 2001 і 2003 роках), але розрізняються за вираженістю кореляції, яка складає - 0,58 для диких і свійських м'ясоїдних і 0,86 для свійських м'ясоїдних і сільськогосподарських тварин. Таким чином, останні дані вказують на провідну роль у поширенні сказу свійських м'ясоїдних (кішки, собаки).

Що стосується сезонності сказу, яка вивчалась в Полтавській та Сумській областях, нами встановлено її зв'язок з життєвою активністю диких тварин. Максимальна кількість випадків сказу у цих тварин припадає на листопад-березень (період гону і виплоду) і мінімальна на літній період. Серед свійських тварин максимум напруженості епізоотичного процесу спостерігається в травні-червні, що співпадає з пасовищним періодом.

На благополуччя щодо сказу в Україні суттєво впливав епізоотичний стан у суміжних з Україною країнах. При аналізі епізоотичної ситуації щодо сказу встановлено, що в Росії епізоотія сказу теж мала два піки підйому (1999 і 2003 роки), у розвитку яких найбільше значення належало диким тваринам. Показник кореляції кількості неблагополучних пунктів щодо сказу диких і свійських м'ясоїдних складав - 0,98, сільськогосподарських і свійських м'ясоїдних тварин - 0,91, сільськогосподарських і диких м'ясоїдних тварин - 0,92. Він свідчить, що в Росії, як і в Україні, епізоотичний процес сказу мав аналогічний характер.

В Білорусі в епізоотичному процесі домінують дикі м'ясоїдні, а серед сільськогосподарських тварин не встановлено зростання випадків захворювання на сказ. Не виключено, що це обумовлено системним широкомасштабним щепленням проти сказу. Показник кореляції між кількістю неблагополучних пунктів щодо сказу диких і свійських м'ясоїдних складав - 0,94, сільськогосподарських і диких м'ясоїдних тварин - 0,43, а сільськогосподарських і свійських м'ясоїдних тварин - 0,63.

В Молдові також основні піки епізоотії сказу припадали на 1999 і 2003 роки, проте на відміну від України там відбулося значне зниження кількості випадків захворювання на сказ у 2000 році. Кореляція між кількістю неблагополучних пунктів щодо сказу диких і свійських м'ясоїдних становила - 0,99, сільськогосподарських і диких тварин - 0,97 та сільськогосподарських тварин і свійських м'ясоїдних - 0,99.

За видовим складом тварин, що захворіли на сказ, показники були фактично однаковими в Україні та суміжних країнах пострадянського простору. Кількість випадків сказу серед диких тварин знаходилась у межах 39-46% і лише в Білорусі - 68%, а сільськогосподарських тварин в Україні - 21%, Росії - 29%, Молдові - 24%, в Білорусі лише 9%. Встановлена також відмінність щодо участі в епізоотичному процесі свійських м'ясоїдних (собак і кішок), кількість яких в Україні становила - 40%, Росії - 31%, Молдові - 23%, тобто коефіцієнт співвідношення цих тварин - 1,8; 0,8; та 0,7 відповідно. В Україні та Росії кількість випадків захворювання на сказ кішок майже у 2 рази перевищувала цей показник у собак, а в Білорусі та Молдові навпаки переважала кількість випадків сказу серед собак.

Порівнюючи динаміку епізоотичного процесу зі сказу в Україні та в Словаччині, Румунії, Польщі і Угорщині, ми встановили аналогічну тенденцію щодо його розвитку, хоча вона відрізнялась за термінами реєстрації. В Словаччині пік епізоотії сказу припадав, як в Україні і Росії, на 1999 і 2003 роки, коли кількість неблагополучних пунктів складала 354 і 237, відповідно, а показник кореляції між їхньою кількістю серед диких і свійських м'ясоїдних був на рівні - 0,51, сільськогосподарських і диких тварин - 0,21 та сільськогосподарських і свійських м'ясоїдних тварин - 0,67.

В Румунії пік епізоотії сказу приходився на 2001 рік (324 неблагополучних пункти), що перевищує в 6,9 разів цей показник 1999 року (47 пунктів). Проте, показник кореляції між кількістю неблагополучних щодо сказу пунктів у Румунії серед диких і свійських м'ясоїдних порівняно з Україною становив 0,56, сільськогосподарських і свійських м'ясоїдних тварин - 0,96.

В Польщі, незважаючи на її природно-географічні особливості території, динаміка епізоотичного процесу в період з 1996 по 2000 роки характеризувалася зниженням напруженості. І тільки в 2001-2004 роках кількість неблагополучних щодо сказу пунктів зросла з 1148 до 2569, причому в основному за рахунок захворювання серед диких тварин. Це підтверджується показником кореляції між кількістю неблагополучних пунктів щодо сказу серед диких і свійських м'ясоїдних тварин, який складав 0,91, сільськогосподарських і диких тварин - 0,56, а сільськогосподарських і свійських м'ясоїдних - 0,54.

В Угорщині напруженість епізоотичного процесу щодо сказу на відміну від України в останні 10 років менша, але динаміка та тенденція його розвитку дещо схожа. Як і в Україні, в Угорщині спостерігалося збільшення кількості неблагополучних пунктів щодо сказу у 2000 році. Проте, показник кореляції цих пунктів захворювання диких і свійських м'ясоїдних був на рівні - 0,85, сільськогосподарських і свійських м'ясоїдних тварин - 0,68, а сільськогосподарських і диких м'ясоїдних тварин лише 0,23.

За видовим складом тварин, які уражались у Словаччині, питома вага сільськогосподарських тварин знаходилась на рівні 1%, Румунії - 12%, Польщі - 8%, Угорщині - 5%, свійських м'ясоїдних (кішок і собак) - 10 та 7%, 11 та 12%, 6 та 4% і 11 та 4% відповідно. В той же час, як і в Україні, в цих країнах найвища питома вага у підтриманні епізоотичного процесу щодо сказу належала диким тваринам, зокрема, в Словаччині вона складала - 81%, Румунії - 64%, Польщі - 82% та Угорщині - 80%.

Таким чином, можна припустити, що в період спаду напруженості епізоотичного процесу свійські м'ясоїдні та сільськогосподарські тварини перестають включатися в епізоотичну ланку і збудник сказу знаходиться в своїй природній екологічній ніші - популяції диких тварин. У зв'язку з цим однією з проблем контролю сказу є постійний облік і аналіз ситуації в неблагополучних пунктах та проведення профілактичної вакцинації. На підставі зазначеного ми зосередили свої зусилля на розробці живої антирабічної культуральної вакцини для імунізації диких м'ясоїдних та удосконаленні технології виготовлення інактивованої культуральної вакцини проти сказу сільськогосподарських і свійських м'ясоїдних тварин.

Вибір і вивчення репродуктивних властивостей виробничих штамів вірусу сказу. При розробці нових вакцин наші дослідження були спрямовані, перш за все, на вибір клітинних систем для культивування і накопичення біомаси виробничих штамів, оскільки вони є головною ланкою біотехнологічного процесу виготовлення біопрепаратів.

На сьогодні в практичній вірусології та біотехнології набули широкого застосування дві клітинні системи: первинно трипсинізованих та перещеплюваних клітин. Розмаїття засобів отримання та культивування створюють сприйнятливі умови для їхнього використання.

Отримані нами дані стосуються порівняльної оцінки цих систем, в результаті якої встановлена залежність накопичення клітинної біомаси від способу культивування і вихідної концентрації. При вивченні культуральних властивостей первинно трипсинізованих клітин, зокрема, нирки собак та фібробластів ембріонів курей і перепілок встановлено, що вони зберігають характерну для них в організмі морфологію і є придатною тест-системою для накопичення вірусу сказу. Разом з тим, недовгочасний термін життєздатності і необхідність поповнення донорської тканини для трипсинізації обмежують їхнє використання в біотехнології виготовлення біопрепаратів. Перещеплювані клітини Vero, Frhk, ПС та ВНК-21, клон 13/04, МДСК мають значні переваги. На відміну від первинних культур клітин вони не потребують складних умов отримання і культивування. У серії дослідів з вивчення умов культивування первинних і перещеплюваних клітин показано, що як при стаціонарному (в матрасах), так і ролерному (в бутлях) культивуванні зі збільшенням висівної концентрації підвищується щільність клітин від 105 до 5х105/см2 ростової поверхні культуральних посудин. Скорочуються терміни формування моношару з 5-6 до 2-3 діб. Проте подальший приріст клітинної біомаси зменшується не тільки за рахунок підвищеної концентрації, але також внаслідок контактної інгібіції росту і пригнічення функціональної життєдіяльності клітин продуктами метаболізму, що накопичуються навколо них у середовищі, особливо в матрасах.

Продуктивна активність клітин також залежала від складу живильного середовища. На цей час застосовують високоякісні живильні середовища, що збалансовані за амінокислотним складом, вітамінами, ферментами, котрі стимулюють ріст клітин in vitrо. Проте вітчизняна біотехнологія клітинних культур відчуває їх дефіцит, оскільки в Україні відсутнє виробництво вихідних для їхнього виготовлення компонентів. Ми використали комерційні набори сухих компонентів середовищ, що надходять із далекого зарубіжжя, котрі відрізняються за складом і якістю амінокислот, що впливає на ріст клітин. Проведені дослідження з культивування перещеплюваних клітин у різних комбінаціях живильних середовищ показали, що збагачені амінокислотами середовища, зокрема з подвійним їхнім вмістом, підвищують репродуктивну здатність клітин і вихід біомаси для зараження вірусом сказу. Вирощування клітин у суміші живильних середовищ 199 і Ігла ДМЕМ забезпечувало однорідність клітинного моношару, придатного для зараження вірусом сказу.

Найбільш оптимальні умови накопичення клітинної біомаси забезпечувало ролерне культивування. При порівняльному випробуванні перещеплюваних клітин показана можливість їхнього використання в промисловому напрацюванні вихідної біомаси клітин. Разом з тим селекціонований нами клон 13/04 перещеплюваних клітин ВНК-21 виявився більш продуктивним. Вихід клітин у бутлях порівняно з культурою в 1,5-літрових матрасах складав - 324 млн., що відповідає - 3,36х105 клітин/см2 ростової поверхні і 7,2х105 клітин/мл живильного середовища, а в матрасах відповідно 86 млн., тобто 2,86х105 клітин/см2 і 4,3х105 клітин/мл середовища. Окрім того, в ролерних бутлях на добу раніше формувався моношар клітин порівняно з матрасами, а накопичення біомаси первинних було у 3 та перещеплюваних у 3,6 рази вищим на одиницю об'єму живильного середовища.

Отримані результати з накопичення клітинної біомаси слугували підґрунтям для використання лінії перещеплюваних клітин ВНК-21, клон 13/04, у подальших експериментах з розробки живої та інактивованої антирабічних культуральних вакцин.

Адаптація і вивчення імунобіологічних властивостей виробничих штамів вірусу сказу. При конструюванні живої та удосконаленні технології виготовлення інактивованої антирабічних культуральних вакцин була приділена значна увага вивченню їхніх властивостей. Відомо, що клітинна система впливає на антигенність, імуногенність та патогенність репродукованого в ній вірусу. Обрані нами селекціоновані з фіксованого вірусу сказу "Овечий-ВГНКИ" штами РБ-71 і Щелково-51, для виготовлення вакцин при культивуванні в клітинних культурах, репродукували без проявлення цитопатичних змін, у зв'язку із чим інфекційна активність визначалася за вірулентністю для білих мишей при інтрацеребральному зараженні.

Встановлено, що у процесі адаптації до нових умов культивування дещо змінювалася репродуктивна активність обох штамів. В перших пасажах вона знижувалась, а потім підвищувалась і фактично стабілізувалась, починаючи з 3-4 пасажів. Зокрема, репродуктивна активність штаму РБ-71 у першому пасажі як у первинних, так і перещеплюваних культурах клітин була на 1,0-1,5 lg МЛД50/0,03 мл нижчою порівняно з вихідним титром (5,0 lg МЛД50/0,03 мл). У культурах перещеплюваних клітин Vero, МДСК, Frhk і ВНК-21 титр інфекційності стабілізувався на рівні 5,5-6,8 lg МЛД50/0,03 мл, а в первинних культурах клітин ФЕК і ФЕП, за винятком НС, -3,5-4,5 lg МЛД50/0,03 мл. В культурі первинних клітин нирки собаки (НС) титр штаму РБ-71 становив 5,1-5,5 lg МЛД50/0,03 мл. З перещеплюваних клітин культури ВНК-21 та Frhk, в яких вірус накопичувався у титрі 6,2-6,8 lg МЛД50/0,03 мл, виявилися найбільш чутливими до штаму РБ-71. Досить стабільні, проте дещо нижчі, титри вірусу забезпечували культури клітин МДСК (5,5-6,3 lg МЛД50/0,03 мл) і Vero (5,5-5,8 lg МЛД50/0,03 мл) впродовж послідовних 15 пасажів.

При порівняльному вивченні репродуктивних властивостей штаму Щелково-51 в культурах первинних і перещеплюваних клітин (ФЕК, ФЕП і ПС, Vero, MDCK, Frhk, ВНК-21/13 та ВНК-21, клон 13/04) виявлена така ж чітка закономірність розвитку інфекційності, яка спостерігалась при культивуванні штаму РБ-71. У першому пасажі штаму Щелково-51 інфекційна активність його в культурах первинних клітин знижувалась на 2,5-2,6 lg МЛД50/0,03 мл, а в перещеплюваних - на 1,6-2,5 lg МЛД50/0,03 мл, в залежності від їхньої видової належності. Починаючи з 3-5 пасажів репродуктивна активність штаму Щелково-51 стабілізувалась в первинних культурах клітин ФЕК і ФЕП на рівні 3,3-3,9 lg МЛД50/0,03 мл, а перещеплюваних ПС - 5,2-5,8; Vero - 4,4-5,0; МДСК - 4,6-5,2; Frhk - 4,9-5,6; ВНК-21/13 - 6,4-6,7-і, ВНК-21, клон 13/04, - 7,0-7,3 lg МЛД50/0,03 мл.

Таким чином, оптимальну репродуктивну активність штамів РБ-71 і Щелково-51 забезпечувала культура перещеплюваних клітин ВНК-21, особливо клон 13/04. Це підтверджено і результатами культивування клітин і вірусу в середовищах, збагачених за поживними речовинами. Так, при культивуванні клітин і штамів РБ-71 та Щелково-51 в суміші середовищ 199 та Ігла ДМЕМ титр інфекційності культурального вірусу був на 1 lg МЛД50/0,03 мл вищим порівняно з культивуванням на моносередовищах (199 та Ігла ДМЕМ), що обумовлено підвищенням якості клітинної культури і, як наслідок, репродуктивності вірусу. Одночасно встановлена залежність репродукції штамів РБ-71 і Щелково-51 вірусу сказу від способу культивування. В наших експериментах виявлено більш високі титри вірусу при ролерному способі культивування клітин і вірусу, що пояснюється більш вираженою продуктивністю клітин, а також механізмом поширення вірусу. В стаціонарних культурах клітин (у матрасах) інфекція розвивається і поширюється контактним шляхом, від клітини до клітини, а при ролерному ще й через середовище у процесі обертання бутлів, що прискорює процес її розвитку і репродукції вірусу.

Під час адаптації до нових умов культивування мінялась не тільки репродуктивна здатність штамів РБ-71 і Щелково-51 вірусу сказу. Одночасно знижувалась їхня інфекційність для тварин. Якщо вихідний штам РБ-71 спричинював 100% загибель мишей на 6-7 добу після інтрацеребрального зараження, то в інфікованих вірусовміщуючою культуральною суспензією 5 і 10 та 15 пасажів вона наставала на 10-12, 12-14 і 14-16 добу. В той же час при внутрішньом'язовому і підшкірному введенні вірус не проявляв вірулентності, заражені миші залишались живими, що також підтверджено результатами внутрішньом'язового інфікування кролів, цуценят і лисиць, у яких не спостерігали зміни загального стану організму. Вони залишились здоровими.

Що стосується вивчення впливу пасажування штаму Щелково-51 в клітинних системах на його нейротропні властивості, то в цих дослідах не встановлено значних змін. В той час, як при внутрішньом'язовому і підшкірному введенні мишам культурального вірусу 5 і 10 пасажів не спостерігалось клінічних змін у загальному стані тварин і через 30 діб, при дослідженні мозку забитих мишей, вірус не виявлявся, при інтрацеребральному зараженні зберігалась його вірулентність на рівні 2,2-2,9 lg МЛД50/0,03 мл.

Зважаючи на те, що у процесі репродукції вірусу сказу як in vivo, так in vitro біологічні тест-системи мають різну здатність синтезувати вірусні протеїни, наступним етапом наших досліджень було з'ясування антигенних властивостей адаптованих до нових умов культивування штамів РБ-71 і Щелково-51. Встановлено, що зразки суспензій вірусу сказу, отриманих при його культивуванні у вирощених в культурах перещеплюваних клітин ВНК-21 і Frhk на середовищах різного складу, не втрачають здатність продукувати в організмі імунізованих мишей вірусоспецифічні антитіла у титрах до 5 log2.

Таким чином, у процесі адаптації тканинного вірусу сказу (штам РБ-71) і пасажування штаму Щелково-51 в клітинних системах отримано атенуйовані штами, які запатентовані відповідно, як штами НФ-2 та Щелково-51С, і які мають високу репродуктивну активність, накопичуються в перещеплюваних клітинах у титрах до 6,4 і 7,2 lg МЛД50/0,03 мл, зберігають здатність щодо індукції вірусоспецифічних антитіл в організмі імунізованих тварин, і, при парентеральному введенні не спричиняють захворювання.

Розробка живої антирабічної вакцини для оральної імунізації диких м'ясоїдних. При створенні живої культуральної вакцини для імунізації м'ясоїдних тварин були вивчені імуногенні властивості виробничого штаму НФ-21 на кролях, собаках і лисицях. Встановлено, що дворазове внутрішньом'язове введення кролям 2 мл, м'ясоїдним 3 мл/гол культуральної суспензії вірусу з титром інфекційності 5,5 lg МЛД50/0,03 мл з інтервалом у 12 діб викликало індукцію нейтралізуючих антитіл у високих титрах (4,0-6,5 log2) і створення напруженого імунітету.

При інтрацеребральному зараженні через 45 діб після імунізації штамом CVS вірусу сказу тварини залишались клінічно здоровими, в той час як групи інтактних тварин після зараження контрольним штамом на 8-12 добу захворіли на сказ і загинули. При оральному введенні кролям (6 мл), собакам і лисицям (10 мл) дворазово через 24 години титри вірусонейтралізуючих антитіл були невисокими (1,5-3,0 log2), а створений імунітет недостатньо напружений. При контрольному зараженні кролів захист імунізованих тварин складав до 80%, а у собак і лисиць 50%. Це пояснюється і узгоджується з даними спеціальної літератури щодо часткового переварювання антигену вірусу сказу при пероральному застосуванні. Отримані результати спонукали до пошуку засобів підвищення імуногенності атенуйованого вірусу при оральному введенні. Експериментально нами встановлено, що вірус сказу досить чутливий до дії шлункового соку. Після 10-хвилинного контакту вірус повністю інактивувався. Під захистом випробуваних речовин інфекційна активність вірусу зберігалась, проте титри інфекційності залежали як від терміну взаємодії з шлунковим соком, так і від властивостей використаних речовин. Кращі захисні властивості встановлено у 2% пектину. Титр інфекційності вірусу під його захистом знижувався на 0,5 lg МЛД50/0,03 мл лише через 2 години взаємодії з шлунковим соком. Менше захищали вірус від дії шлункового соку інші речовини. Під захистом 1% пектину за цей термін титр інфекційності атенуйованого вірусу сказу знижувався на 1,7 lg; 3% крохмалю - на 2,2 lg; 10% желатину - на 4,1 lg МЛД50/0,03 мл. Льняний відвар виявився зовсім непридатний для захисту вірусу від шлункового соку.

На підставі отриманих даних щодо захисту за допомогою пектину антигенних властивостей атенуйованого штаму від дії шлункового соку були виготовлені 3 зразки вакцини з різною інфекційністю вірусу (4,0; 5,0 і 6,0 lg МЛД50/0,03 мл), що випробувані на білих мишах і собаках. Як свідчать результати, імуногенність зразків вакцини залежала від дози і кратності введення. Якщо в імунізованих тварин формувався напружений імунітет при оральному введенні зразків вакцини з інфекційністю вірусу 4, 5 і 6 lg МЛД50/0,03 мл, який захищав їх при контрольному зараженні штамом CVS вірусу сказу, то рівень вірусонетралізуючих антитіл, індукованих в організмі цих тварин, відрізнявся. Зокрема встановлено, що зі збільшенням одноразової дози з 0,5 до 2 мл титр вірусонейтралізуючих антитіл зростав для зразка вакцини з інфекційністю вірусу 4 lg МЛД50/0,03 мл з 1,5 до 2,5 log2,,5 lg МЛД50/0,03 мл - з 3,0 log2 до 3,6 log2 і 6 lg МЛД50/0,03 мл - з 3,4 до 4,6 log2. Дво-, три-, чотири і п'ятиразове введення вакцини сприяло більш високій індукції специфічних до вірусу сказу антитіл порівняно з одноразовою оральною імунізацією у дозі 0,5 мл у 1,6-1,9 разів. Проте суттєвої різниці щодо рівня ВН-антитіл при дво-п'ятиразовому введенні вакцини з інтервалом в одну добу у мишей не виявлено.

Аналогічні результати з випробування цих зразків живої культуральної вакцини отримані також при оральній імунізації собак шляхом одно-, дво- і триразового згодовування принад, у якості яких використали курячі яйця, що вміщували по 5 мл вакцини з інфекційною активністю 4, 5 і 6 lg МЛД50/0,03 мл. У сироватках крові, відібраної на 21 добу, виявлені ВН-антитіла, титр яких у одноразово імунізованих знаходився на рівні 3,6-4 log2. Зі збільшенням кратності (дво- і триразово) введення встановлені більш високі титри антитіл (4,8-5,8 log2), що також залежало від вихідної інфекційності вірусу у вакцині (5 і 6 lg МЛД50/0,03 мл). Випробувана вакцина, як і вірус-вакцина з штаму ТС-80, що була взята як контроль, захищала від зараження собак штамом вірусу CVS.

Отримані результати показали, що досліджені зразки живої культуральної вакцини з атенуйованого штаму НФ-2 вірусу сказу з інфекційністю 4, 5 і 6 lg МЛД50/0,03 мл, антигенні властивості якого стабілізовані за допомогою 2% пектину, є імуногенними, викликають утворення вірусонейтралізуючих антитіл у достатньо високих титрах (до 5 log2), захищають від інтрацеребрального зараження контрольним штамом CVS, не призводять до негативних поствакцинальних наслідків, і, отже, є нешкідливими. При спостереженні впродовж 2,5 місяців за імунізованими випробуваною вакциною з штаму НФ-2 і вірус-вакциною з штаму ТС-80 тваринами жодна з них не захворіла на сказ і не загинула.

Оскільки жива культуральна вакцина з штаму НФ-2 вірусу сказу призначалась для імунізації диких м'ясоїдних тварин, необхідно було створити привабливу до поїдання форму препарату. Ми врахували видові особливості цих тварин, виживаємість яких залежить від їхньої природної здатності щодо взаємовідносин із сородичами, захисту території мешкання, пошуку корму, чому сприяє їхній орган нюху. Була створена принада, що являє собою блістер у формі пакета розміром 1,5-2х4,5 см із полівінілхлоридної плівки, в якому розміщували імунізуючу дозу вакцини. Блістер-пакет заключали в брикет м'ясної принади, здобрений зверху рибним борошном. Ці брикети були зручними до споживання твариною, не втрачалися при розжовуванні, добре зберігалися в замороженому стані і були стійкими у зовнішньому середовищі.

Зважаючи на те, що принади розкладаються в місцях заселення дикими тваринами, і можуть бути з'їденими польовими гризунами, ми змоделювали лабораторний дослід з вивчення патогенності вакцинного вірусу для мишей, яким згодовували м'ясні принади, котрі вміщували 5, 10, 15 і 20 мл, що становило 0,25; 0,5; 0,75 і 1 мл вакцини/голову. Як показали результати, миші, за винятком контрольної групи, залишались живими без проявів вакцино-індукованого сказу впродовж 30 діб спостереження. У декількох мишей контрольної групи, що отримували штам CVS вірусу сказу, на 12-15 добу були виявлені ознаки захворювання на сказ і через 3-4 доби їх загибель.

У досліджених в РН групових пробах сироваток крові вакцинованих мишей встановлені вірусоспецифічні антитіла у титрах від 3,1 до 3,8 log2. При вірусологічному дослідженні мозку забитих імунізованих досліджуваною вакциною мишей вірус не вдалося виділити.

Отже, атенуйований штам НФ-2 вірусу сказу, на основі якого виготовляється жива культуральна вакцина, є апатогенним для мишей і може з принадами без обмеження застосовуватись для імунізації диких тварин у польових умовах.

Поряд із цим на базі БілНДІЕВ були з'ясовані швидкість і шляхи проникнення вакцинного вірусу в організмі імунізованих перорально морських свинок, оскільки ці фактори впливають на процеси імуногенезу і, що важливо, на терміни формування несприйнятливості до збудника сказу. Мічений 5НЗ-уридином сконцентрований за допомогою ПЕГ-6000 до титру інфекційності 6,67-7,87 lg МЛД50/0,03 мл вірус вже через добу знаходили в усіх органах знекровлених тварин. Найбільшу його концентрацію за інтенсивністю радіометрії виявили в тонкому кишечнику, брижових лімфовузлах, селезінці та крові, що збігалося з результатами, отриманими при внутрішньом'язовому введенні вакцинного вірусу. На 4 добу спостерігали підвищення показників інтенсивності радіометрії в брижових лімфовузлах і селезінці, а при внутрішньом'язовому способі введення ще й в печінці, в той час як у крові і інших органах вона була менше вираженою. На 10 добу при пероральному введенні вірус не знаходили в стравоході, шлунку, нирках і крові, а в інших органах інтенсивність результатів радіометрії вірусу була незначною. Найбільша концентрація введеного внутрішньом'язово вірусу на 10 добу спостерігалася в регіональному лімфовузлі (стегновому) і селезінці, а в інших органах вірус не виявлявся.

За МФА вакцинний вірус встановлювали ще й на 10-й добі в кишечнику, брижових і регіональних лімфовузлах, селезінці, печінці, спинному і головному мозку. Радіонуклід із органів контрольної групи виводився впродовж перших 3-4 діб.

Таким чином, результати проведеного досліду показали, що як при пероральній, так і внутрішньом'язовій імунізації тварин проти сказу відбувається проникнення вірусу в регіональні лімфовузли, а потім через кров він розповсюджується в інші органи. Проте, динаміка розподілення вірусу дещо відрізнялася за термінами проникнення в різні органи, що підтверджується більш раннім виявленням вірусу в імунокомпетентних органах при внутрішньом'язовому введенні.

З термінами проникнення і інтенсивності накопичення вакцинного вірусу в імунокомпетентних органах співпадають дані щодо вивчення пато- та імуноморфологічних змін у них. Результати досліджень у динаміці розвитку поствакцинального імунітету при пероральному введенні живої культуральної вакцини свідчать, що на 5 добу в брижових лімфовузлах виявлені запальні процеси, які супроводжувались розширенням синусів, появою в них серозного ексудату, набряком синусного ендотелію, розширенням кровоносних судин у трабекулах і м'якотних шнурах. У фолікулах знаходили розширені центри із лімфоїдних і плазматичних клітин. Плазмоцитарна реакція була більш виражена в брижових лімфовузлах порівняно з тазовими і підколінними.

На 10 добу в брижових лімфовузлах знаходили лише виражені гіперпластичні процеси, що характеризувалися гіперплазією клітин, багатих на РНК. У віддалених лімфовузлах і селезінці морфологічні зміни мали такий же характер, проте були менш вираженими. Плазмоцитарна реакція була більш чіткою порівняно з попередніми результатами досліджень на 5 добі. Загальна кількість клітин плазматичного ряду збільшувалась у 5 разів (з 37 до 202), серед яких переважали молоді форми (55%).

На 15 добу після вакцинації були більш виражені гіперпластичні процеси в лімфовузлах, де виявляли реактивні центри, у цитоплазмі лімфоїдних і плазматичних клітин підвищувався вміст РНК, що свідчило про підсилення їх функціональної активності. Плазмоцитарна реакція досягала найвищого розвитку в брижових лімфовузлах, менш вираженою вона була в підколінних і тазових, а також у селезінці.

Через 30 і 45 діб у лімфовузлах і селезінці спостерігалися лише гіперпластичні процеси, що характеризувалися розмноженням лімфоїдних і частково ретикулярних клітин. Плазмоцитарна реакція помітно була слабкішою. Загальна кількість клітин плазматичного ряду порівняно з контролем збільшувалась через 30 діб у 4 рази і через 45 діб у 2 рази. Серед клітин плазматичного ряду переважали плазмоцити, менше було плазмобластів і проплазмоцитів.

При внутрішньом'язовому введенні вакцини реакція і зміни в імунокомпетентних органах виявлялися раніше і були більш вираженими порівняно з повільним розвитком при пероральній імунізації.

Як встановлено, на тривалість імунітету при пероральній імунізації м'ясоїдних тварин суттєво впливали дози і схеми введення живої антирабічної культуральної вакцини. Отримані нами результати досліджень, проведених на собаках від 4-5-місячного віку до 1-2 років, показали, що оптимальною є доза 5 мл вакцини, яка була нереактогенною, не призводила до підвищення температури тіла в імунізованих тварин, індукувала продукцію вірусонейтралізуючих антитіл на рівні з вакциною в дозі 10 мл ( 4,3-4,6 lоg2). Більш придатною виявилася схема дворазового введення по 5 мл вакцини з 12-добовим інтервалом або триразово через 1 і 12 діб. Ці дози ( 10 і 15 мл на курс імунізації) забезпечували створення напруженого імунітету. Як і в собак, одноразово імунізованих вакциною підвищеними дозами (10 і 20 мл), встановлено несприйнятливість при контрольному зараженні штамом СVS на 42 добу від початку імунізації, хоча в групах одноразово імунізованих у дозах 5 і 10 мл спостерігали захворювання і загибель по 1 тварині (25% від загальної кількості піддослідних собак).

При порівняльному вивченні динаміки вірусонейтралізуючих антитіл в організмі щеплених антирабічною культуральною вакциною собак їхня індукція дещо відрізнялась за термінами виявлення і тривалості імунітету. Зокрема, при внутрішньом'язовому щепленні вірусонейтралізуючі антитіла у титрах 6,2 lоg2 знаходили вже на 7 добу, в той час, як при пероральній імунізації - лише на 12 добу у титрі 4,3 lоg2. Проте вже на 17 добу від початку імунізації титри вірусонейтралізуючих антитіл при обох способах вакцинації вирівнювалися і знаходилися на рівні 6,4-6,8 lоg2, а починаючи з 60 доби дещо знижувались від 6,0 до 3,4 lоg2 на 120 добу, 3,2-3,0 lоg2 через 240 діб. Після зараження контрольним штамом СVS вірусу всі імунізовані собаки залишались клінічно здоровими.

Таким чином, результати цих досліджень свідчать, що розроблена жива антирабічна вакцина, яка отримала назву “Рабівак ХТТ”, з атенуйованого штаму НФ-2 вірусу сказу є імуногенною при дворазовому пероральному застосуванні у дозі 5 мл з інтервалом 12 діб, і забезпечує напружений імунітет впродовж 240 діб. У препаративній формі блістер-принад у замороженому стані Рабівак ХТТ зберігає імуногенні властивості впродовж року. Через 24 місяці імуногенна здатність вакцини знижувалась у середньому на 26,7%, проте, вона залишалась достатньо імуногенною, викликала накопичення вірусонейтралізуючих антитіл у захисному титрі у 80-83,3% імунізованих тварин.

Матеріали щодо технології виготовлення і контролю якості Рабівак ХТТ були узагальнені і представлені у вигляді нормативної документації, яка узгоджена в ДНКІБШМ і затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини України. Згідно з наказом № 75 Головного державного інспектора ветеринарної медицини України від 24 листопада 2003 року “Про широку апробацію вакцини Рабівак ХТТ для пероральної імунізації м'ясоїдних у польових умовах" на Державній Сумській біофабриці були виготовлені дослідно-промислові серії біопрепарату за технологією, яка передбачала використання атенуйованого штаму НФ-2 вірусу сказу, репродукованого в моношаровій культурі перещеплюваних клітин ВНК-21, клон 13/04, до надосадової культуральної суспензії якого після 24-годинної седиментації при 4- 10 °С додавали 2% яблучного пектину.

Інфекційність культурального штаму НФ-2 вірусу сказу у вакцині складала 6,4-6,8 lg МЛД50/ 0,03 мл. Перевірка за показниками якості вакцини (на контамінацію бактеріями, грибами і мікоплазмами за ГОСТ 28085-89, нешкідливість за ДСТУ 46.024-2002 на білих мишах, яким вводили підшкірно по 0,5 мл Рабівак ХТТ, та імуногенність за титром вірусонейтралізуючих антитіл у щеплених вакциною мишей) відповідала вимогам технічних умов і вона визнана придатною до застосування для імунізації диких м'ясоїдних тварин. З метою широкої виробничої апробації за цією технологією було виготовлено 10 серій Рабівак ХТТ загальним об'ємом 544,11 тис. доз, які за висновком комісії, в складі якої приймав участь представник ДНКІБШМ, відповідали вимогам, що наведені в нормативних документах.

Виробничі випробування Рабівак ХТТ проведені в мисливських угіддях 25 районів Полтавської області, де за період 1994-2003 років було зареєстровано 1077 неблагополучних пунктів, в яких спостерігали захворювання 1438 тварин (ВРХ - 555, ДРХ - 29, собак - 257, свиней - 2, котів - 5, лисиць - 302, куниць - 7, єнотів - 19, борсуків - 4, щурів - 2, вовків, козуль та кажанів - по 1 тварині). До цього щеплення проти сказу проводились в області безсистемно. Вакцини КАРМАК (Словенія), Синраб (Росія), РАБІФОКС - штам SAD PS (Німеччина) застосовувались локально і в невеликих об'ємах, що не сприяло поліпшенню епізоотичного стану зі сказу.

Нами поставлено 312 тисяч доз Рабівак ХТТ, котра сформованими у кожному районі групами фахівців була розкладена в мисливських угіддях, в місцях мешкання диких тварин. Щільність розкладання складала від 9,1 до 46,3, у середньому 27,7 принад-вакцини/км2 . Ефективність поїдання принад у перші 3 доби складала - 49,2%, 8 діб - 77,2% і 15 діб - 93,2%. Споживання принад у Гребінківському, Гадяцькому, Лохвицькому, Миргородському та Хорольському районах у перші доби було максимальним і завершилось за 8 діб, а в Диканському, Зінківському, Шишацькому не перевищувало 75%.