Ефект хронічного прикладання німодипіну на кальцієвий гомеостаз у нейронах дорсального рогу спинного мозку щурів за умов розвитку діабетичної нейропатії

Під час експериментів було використано шість груп тварин:

- інтактні (далі - контрольні) тварини відповідного віку (група 1);

- контрольні тварини, що одержували німодипін у тім же режимі, що й діабетичні (група 2)

- контрольні тварини, що одержували еналаприл у тім же режимі, що й діабетичні (група 3);

- тварини з СТЗ-індукованим діабетом (група 4);

- тварини з СТЗ-індукованим діабетом, що одержували з їжею протягом трьох тижнів блокатор дигідропіридинчутливих кальцієвих каналів, що вільно проникає через гематоенцефалічний бар'єр - німодипін (група 5);

- тварини з СТЗ-індукованим діабетом, що отримували протягом трьох тижнів вазодилатор, що не проникає через гематоенцефалічний бар'єр - еналаприл (група 6).

У розділі 3 „Результати досліджень” визначено особливості впливу хронічного введення німодипіну на поведінкові реакції СТЗ-діабетичних та контрольних тварин, здійснено аналіз впливу німодипіну на зміни в нейрональній кальцієвій сигналізації, що супроводжують розвиток порушень больової чутливості. Для прояснення питання щодо ролі вазодилаторного ефекту німодипіну в опосередкуванні цього впливу, було вивчено ефект хронічного введення еналаприлу, який має потужний вазодилаторний ефект і не проникає через гематоенцефалічний бар'єр. В експериментах брали участь 21 контрольна тварина, 5 контрольних тварин, що одержували німодипин; 6 контрольних тварин, що одержували еналаприл, 26 тварин зі СТЗ-індукованим діабетом; 12 СТЗ-діабетичних тварин, що одержували німодипин і 8 СТЗ-діабетичних тварин, що одержували еналаприл. Під час проведення експериментів не було виявлено достовірного впливу хронічного введення німодипіну чи еналаприлу на концентрацію глюкози в плазмі крові піддослідних тварин, яка складала 6.90.2 мM (n=21), 7.11.5 мM (n=5), 82 мM (n=6), 29.5 6.5 мM (n=26), 266 мM (n=12), 25 4 мМ(n=8) для тварин з груп I-VI відповідно.

Вимірювання змін больової чутливості. Формаліновий тест. Як основні больові реакцій було обрано лизання та самочинне посмикування кінцівки, в яку проведено ін'єкцію. При цьому характер розвитку реакції посмикування мав яскраво виражений двофазний характер (перша, “гостра” фаза, тривалістю близько 10 хв., та друга, “тонічна” фаза, перебіг якої, відбувався без яскраво виражених максимумів та припинявся до 85-90 хв.) (Рис. 1). За умов розвитку СТЗ-індукованого діабету інтенсивність реакції в першій фазі достовірно зростала у порівнянні з контрольними тваринами (від 19±6 с (n=13) в контролі до 72±8 с (n=12) в діабеті, р<0.05), а у другій фазі достовірно зменшувалась (з 444±27 с в контролі до 369±25 с при діабеті, p<0.05). Введення німодипіну діабетичним тваринам зменшувало інтенсивність реакції в першій фазі (до 40±8 с (n=6), p<0.05), не досягаючи контрольних значень (p<0.05); при цьому інтенсивність реакції в другій фазі достовірно не змінювалась (355±87 с). Введення еналаприлу діабетичним тваринам доствовірно не впливало на інтенсивність реакції як в першій, так і в другій фазі (76±26 с та 371±53 с (n=5)).

Друга больова реакція - лизання вколотої кінцівки, також характерна при виникненні больового рефлексу. Характер розвитку даної реакції був дуже схожий на перебіг реакції посмикування (Рис. 2). За умов розвитку СТЗ-індукованого діабету інтенсивність реакції в першій фазі також достовірно зростала у порівнянні з контрольними тваринами (від 18±3 с (n=13) в контролі до 62±13 с (n=12) в діабеті, р^*<0.05), а у другій фазі достовірно зменшувалась (з 384±25 с в контролі до 253±25 с при діабеті, p^*<0.05). Введення німодипіну діабетичним тваринам зменшувало інтенсивність реакції в першій фазі (до 24±14 с (n=6), p^#<0.05), достовірно не досягаючи контрольних значень (p^*<0.05); при цьому інтенсивність реакції в другій фазі достовірно не змінювалась (244±46 с). Введення еналаприлу діабетичним тваринам доствовірно не впливало на інтенсивність реакції як в першій, так і в другій фазі (75±25 с та 240±34 с (n=5)).

Введення як німодипіну, так і еналаприлу інтактним тваринам не справило достовірного впливу на больові поведінкові реакції.

Метод “гаряча поверхня. Було встановлено, що поріг больової чутливості для всіх піддослідних тварин складав 42С. При підвищенні температури поверхні від 43 до 46С не спостерігалося достовірних відмінностей у швидкості больової реакції у тварин, однак уже при 47-48С ці розбіжності досягали достовірності. (Рис. 3) Так, у СТЗ-діабетичних щурів, поміщених на гарячу поверхню з температурою 48С, час виникнення больової реакції достовірно зростав у порівнянні з контрольними тваринами (8,5±0,5 с (n=15), p^*<0.05) і складав 67±7 с (n=12). Введення німодипіну діабетичним тваринам достовірно зменшувало час виникнення больової реакції (19±6 с (n=8), p^#<0.05). Введення еналаприлу діабетичним тваринам також достовірно зменшувало час виникнення больової реакції при 48С (26±4 с (n=6), p^#<0.05). Час виникнення больової реакції у діабетичні тварини після введення як німодипіну, так і еналаприлу достовірно відрізнявся (p^*<0.05) від часу контрольних (інтактних) тварин. Таким чином, введення німодипіну і еналаприлу діабетичним тваринам сприяє частковій компенсації у них термічної гіпоалгезії. Введення як німодипіну, так і еналаприлу інтактним тваринам не справило достовірного впливу на час виникнення больової реакції.

Зміни кальцієвої сигналізації в ноцицептивних нейронах за умов стрептозотоцин-індукованого діабету. Вплив німодипіну на порушення больової чутливості в СТЗ-діабетичних тварин, виявлений в ході спостереження за поведінковими реакціями під час тесту „гаряча поверхня” та формалінового тесту, міг бути опосередкованим змінами в функціонуванні структур, що відповідають за проведення ноцицептивної інформації. Той факт, що на реакції контрольних тварин введення німодипіну не впливало, дає підстави припустити, що ефект німодипіну повґязаний, в першу чергу, з його впливом виключно на структури, функціонування яких зазнавало порушень під час розвитку діабету. Моніторинг коливань внутрішньоклітинної концентрації [Ca²⁺]_i в сенсорних нейронах набуває особливого значення не тільки для прояснення механізмів дії німодипіну на сенсорну чутливість, але й для більш детального розуміння ролі окремих нейрональних структур в виникненні різних типів болю.

Характер змін кальцієвих сигналів у вторинних сенсорних нейронах під впливом хронічного введення німодипіну. В ході досліджень [Ca²⁺]_i у вторинних ноцицептивних нейронах, розташованих в ділянках ламіни I та substantia gelatinosa дорсального рога спинного мозку, не було виявлено достовірних відмінностей рівня базального кальцію в нейронах тварин усіх досліджених груп. Деполяризацію клітин викликали аплікацією гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів К⁺ - 50 мМ. Введення німодипіну діабетичним тваринам достовірно зменшувало пікову амплітуду деполяризаційних транзієнтів в нейронах діабетичних тварин, що отримували німодипін (448±23 нМ (n=51), p^*<0.05, p^#<0.05). Істотної різниці значень пікових амплітуд кальцієвих транзиєнтів, викликаних деполяризацією, у тварин з інших груп виявлено не було (636±36 (n=28), 593±43 (n=30), 610±44 (n=22) для тварин з груп І, ІІ і ІІІ та 564±51 (n=38) 607±39 (n=20) для тварин з груп ІV та VI) (Рис. 4).

При аналізі кінетики спаду деполяризаційних [Ca²⁺]_i транзиєнтів у нейронах ДР спинного мозку СТЗ-діабетичних тварин було виявлено суттєве збільшення рівню залишкового [Ca²⁺]_i, який реєстрували на 60-тій секунді після початку деполяризації (збільшення від 147±16нМ (n=22) в контролі до 176±19 (n=24) в нейронах діабетичних тварин (p^*<0.05)). Введення як німодипіну, так і еналаприлу діабетичним тваринам не призводило до достовірних змін рівню залишкового [Ca²⁺]_i (161±16 (n=39), та 155±40 нМ (n=20)) (Рис.5). Введення як німодипіну, так і еналаприлу контрольним тваринам також не справило достовірного впливу на рівень залишкового [Ca²⁺]_i.

Зміни у функціонуванні кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму. Ріанодин-чутливе депо Ca²⁺. Для вивчення роботи ріанодин-чутливого депо, ми використовували той факт, що кофеїн здатний знижувати поріг активації ріанодинового рецептора кальцієм до рівня, якого достатньо щоб базальний [Ca²⁺]_i викликав його активацію та наступне вивільнення Ca²⁺ з депо. Зменшення амплітуди [Ca²⁺]_i транзиєнтів, викликаних аплікацією 30 мМ кофеїну, в нейронах діабетичних тварин (108±14 (n=19)) у порівнянні з контрольними (196±16 (n=18), p<0.05), після введення німодипіну майже повністю компенсувалось (154 12 nM (n=33), p^#<0.005, p*>0.8) (Рис.6). Введення еналаприлу діабетичним тваринам лише частково компенсувало зменшення амплітуди кофеїн-індукованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів до рівня 122±19 нМ (n=15), що достовірно відрізнявся від амплітуд кофеїн-індукованого вивільнення [Ca²⁺]_i в нейронах як діабетичних і контрольних (р^#<0.05, p*<0.05), так і діабетичних тварин, що отримували німодипін (p<0.05). Введення як німодипіну, так і еналаприлу контрольним тваринам не справляло достовірного впливу на амплітуди кофеїн-індукованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів в нейронах ДР спинного мозку.

Слід зазначити, що існує популяція нейронів ДР спинного мозку, у яких аплікація кофеїну не приводить до зміні концентрації цитозольного кальцію. Причому частка таких нейронів достовірно більше в групі діабетичних тварин, ніж у контрольній групі (р<0.05). Прикладання німодипіну і еналаприлу не змінювало достовірно частки нейронів, що генерують кальцієві відповіді на кофеїн (p>0.2). Так, якщо в контролі аплікація кофеїну не призводила до виникнення кальцієвого транзієнту в 6% досліджених нейронів, а в діабеті не „відповіли” на кофеїн 24% нейронів (р<0.05), то серед нейронів німодипін- та еналаприл- діабетичних щурів, не відреагували на аплікацію кофеїну 21% і 28% досліджених клітин. У цілому, терапія не змінювала достовірно частки нейронів, що генерують кальцієві транзиенти у відповідь на аплікацію кофеїну.

Ефект прямої дії дигідропіридинів на функціонування кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму.

Після виявлення ефекту збільшення амплітуди кофеїн-індукованого [Ca²⁺]_і транзиєнту в нейронах СТЗ-діабетичних тварин під впливом хронічного введення німодипіну, виникла необхідність перевірки існування прямої дії дигідропіридинів на функціонування кальцієвих депо. Для цього ми використовували безпосередню аплікацію німодипіну на нейрони ДР спинного мозку СТЗ-дібетичних та контрольних тварин. Присутність в зовнішньоклітинному розчині 40 мкМ німодипіну не призводила до достовірних змін амплітуди кофеїн-індукованих [Ca²⁺]_і транзиєнтів ні в нейронах контрольних, ані в нейронах діабетичних тварин (18719 nM (n=8) та 9722 nM (n=6), (Рис. 7)).

Ефект іономіцину. Для дослідження ємності Ca²⁺ депо ЕР, ми використовували антибіотик іономіцин. Іономіцин у концентраціях менших чи рівних 1 мкМ призводить до вивільнення Ca²⁺ з обох типів депо ЕР за ріанодин та InsР₃ незалежним механізмом (Smith et al. 1989).

Зменшення амплітуди [Ca²⁺]_i транзиєнтів, викликаних аплікацією 1 мкМ іономіцину в безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині в нейронах діабетичних тварин (68±6 (n=19)) у порівнянні з контрольними (120±11 (n=15), p<0.05), після хронічного прикладання німодипіну частково компенсувалось (92 9 nM (n=14), p^#<0.05, p*<0.05 (Рис.8)). Введення еналаприлу діабетичним тваринам також частково компенсувало зменшення амплітуди іономіцин-індукованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів до рівня 80±6 нМ (n=7, р^#<0.05, p*<0.05). Введення як німодипіну, так і еналаприлу контрольним тваринам не справляло достовірного впливу на амплітуди іономіцин-індукованих [Ca²⁺]_i транзиєнтів в нейронах ДР спинного мозку.