Усі вищенаведені результати свідчать про те, що вивільнення кальцію з депо эндоплазматичного ретикулуму (ЕР), як у результаті дії кофеїну, так і під дією іономіцину, перебуваючи у значно пригніченому стані за умов розвитку діабету, частково відновлюється при хронічному прикладанні нимодипіну.

Обговорення результатів.

В представленій роботі виявлено вплив тривалого введення німодипіну одночасно на симптоматичні проявлення дібетичної нейропатії та на кальцієвий гомеостаз в нейронах ДР спинного мозку. Важливим результатом є встановлення факту нормалізуючого впливу хронічного введення німодипіну на порушення кальцієвого гомеостазу та на функціонування Са депо ЕР, що корелювало з частковою компенсацією симптомів діабетичної нейропатії. Особливо слід підкреслити, що хронічне введення німодипіну призводило до значних змін в поведінкових реакціях та нейрональній кальцієвій сигналізації тільки діабетичних тварин, не впливаючи на контрольних, що вказує на існування нейрональних дигідропіридин-чутливих механізмів, що починають відігравати значну роль в проведенні ноцицептивної інформації саме під час розвитку діабету.

В методах дослідження нейропатій широко використовується формаліновий тест, як модель гострого болю з наступною фазою тонічної або інфламаторної болі (Hunskaar S., 1987, Kamei A., 2001). Больовий ефект формаліну має двофазний характер, різні фази якого мають різну анальгетичну чутливість. Вважається, що перша фаза відповідає за прямий вплив на ноцицептивні нейрони, тоді як друга зумовлена запальними процесами та біллю, викликаною запаленням, знімається дією антизапальних фармакологічних речовин (Hunskaar S., 1987). Під час СТЗ-індукованого діабету відбувається посилення больової реакції на гострий біль і одночасне послаблення больової реакції на тонічний “інфламаторний” біль, що може свідчити про те, що індукція цукрового діабету диференційовано змінює механізми, що відповідають за різні типи болю (Kruglikov et al. 2004). Ми спостерігали потужний нормалізуючий вплив німодипіну на больові реакції тільки в першій фазі формалінового тесту, в той час як достовірного впливу на інтенсивність реакцій під час другої фази взагалі не було виявлено. Ці результати можуть вказувати на те, що збільшеня впливу дигідропіридинів за умов діабету відбувається перважно в тих структурах, що відповідають за проведення сигналів госторго болю. Дослідження змін температурної чутливості дозволило встановити, що термічна гіпоалгезія, яка розвивається у СТЗ-діабетичних тварин (Fox et al. 1999, Kamei et al. 2000), може бути частково скомпенсована хронічним введенням німодипіну.

Таким чином, хронічне введення німодипіну СТЗ-діабетичним щурам супроводжується значними змінами больової чутливості. Необхідно підкреслити, що в даних ескпериментальних умовах не було знайдено жодних достовірних ознак впливу німодипінової терапії на больову чутливість контрольних тварин, що вказує на значне підсилення ролі дигідропіридин-чутливих структур в умовах розвитку цукрового діабету.

Останнім часом усе більше уваги приділяється дослідженню порушень нейронального Ca²⁺ гомеостазу, які не лише супроводжують, а й цілком імовірно, є однією з причин, що призводять до розвитку діабетичних нейропатій (Biessels and Gispen 1996,2002). Постсинаптичне збільшення [Ca²⁺]_i є важливим тригером, що може активувати швидкі або довготривалі зміни синаптичної передачі (Bliss & Collingridge 1993). Дослідження струмів через дигідропіридинчутливі кальцієві канали та оцінка їх участі в нейрональній кальцієвій сигналізації (Kostyuk P. et al 1995, Hall K. 1996, Voitenko N. 2000) продемонстрували збільшення їх внеску в кальцієву сигналізацію за умов розвитку СТЗ-діабету, але в той же час амплітуда кальцієвих транзиєнтів, викликаних деполяризацією, залишалась незмінною (Kruglikov et al. 2004). Активація L-типу Ca²⁺ каналів в нейронах ДР може мати специфічне значення для опосередкування повільних Ca²⁺ потоків, що сумуються та сприяють поступовому й тривалому підвищенню збудливості (Baranauskas G., 1998). Відповідно, корекція такого збільшення L-канал-опосередкованих кальцієвих потоків при хронічному введенні німодипіну може відігравати значну роль в виникненні корегуючого впливу німодипіну на порушення больової чутливості при діабеті. З цією гіпотезою добре узгоджується виявлене зменшення амплітуди деполяризаційних кальцієвих транзиєнтів в нейронах СТЗ-діабетичних щурів, що отримували німодипін. Таким чином, хронічне введення німодипіну здатне значно впливати на кальцієвий гомеостаз в нейронах ДР виключно діабетичних тварин. Такий вплив може пояснюватись не тільки корекцією збільшення L-канал-опосередкованих кальцієвих потоків (Biessels et al. 2002), а може бути зумовлениий нормалізуючою дією дигідропіридинів на метаболічні механізми, що опосередковують виникнення оксидативного стресу при діабеті (Cominacini et al. 2003).

Новим і несподіваним результатом було встановлення факту корегуючого впливу хронічного введення німодипіну на амплітуди кальцієвих транзиєнтів при вивільненні Ca²⁺ з кальцієвих депо ЕР. З літератури відомо, що наслідком порушень нейронального кальцієвого гомеостазу може стати зменшення активності Ca²⁺ -АТФаз ЕР (Belke et al. 2004), що може приводити до зменшення вмісту Ca²⁺ в кальцієвих депо ЕР (на це опосередковано вказує зменшення амплітуди іономіцин-індукованих Ca²⁺ транзиєнтів) при діабеті. Отже, нормалізуючий вплив німодипінової терапії на амплітуди кофеїн- та іономіцин-індукованих Ca²⁺ транзиєнтів може бути результатом підвищення [Ca²⁺]_in в кальцієвих депо ЕР (Рис. 9). Таке підвищення може обумовлюватись покращенням роботи Ca²⁺ -АТФаз ЕР (SERCA) внаслідок дії німодипіну на порушення нейронального кальцієвого гомеостазу при діабеті.

Можливий і прямий вплив німодипіну на функціонцвання кальцієвих депо ЕР. В аксонах нейронів ДР було показано існування функціонального взаємозвґязку між L-типом Ca²⁺ каналів та ріанодиновими рецепторами (RyRs) (Ouardouz et al. 2003). Існування такого звґязку може призводити до постійного спустошення кальцієвих депо ЕР за рахунок „підтікання” Ca²⁺ через RyRs, опосередкованого надлишковою активністю L-типу кальцієвих каналів при діабеті (Voitenko et al. 2000; Hall et al. 2001). Тривале та регулярне введення німодипіну може прямо блокувати надлишкову активність L-каналів і, як наслідок, впливати на витік Ca²⁺ з депо ЕР, опосередкований L-канал-RyRs-комплексом. В наших експериментах прямого впливу німодипіну на вивільнення Ca²⁺ через RyRs не спостерігалось. Це може вказувати на те, що хоча L-канал-RyRs-комплекс-опосередкований витік кальцію робить незначний внесок в кальцієву сигналізацію, довготривала гіперактивність цього механізму може стати однією з причин розвитку серйозних порушень нейронального кальцієвого гомеостазу при діабеті (Biessels et al. 2002).

Приймаючи до уваги можливість непрямої дії німодипінової терапії на нервову систему внаслідок потужного вазодилаторного ефекту німодипіну (Kappelle et al. 1993a; Kappelle et al. 1994) та той факт, що за умов діабету значно зменшується кровопостачання структур ЦНС (Biessels and Gispen 1996), логічно припустити, що виявлений нормалізуючий ефект німодипіну на функціонування нейронів ДР може пояснюватись покращенням кровопостачання нервової системи в цілому. Щоб перевірити це припущення, частина піддослідних тварин отримувала еналаприл. Еналаприл токож є вазодилатором, але його вазодилаторна дія опосередковується зовсім іншими механізмами, ніж ефект німодипіну (Aihara et al. 2005, Todd and Goa 1992). Крім того, еналаприл не здатний проникати через гематоенцефалічний барґєр (Nag and Kilty 1997), що дозволяє виключити можливість його прямого впливу на нейрони. Нами встановлено, що в даних умовах хронічне введення еналаприлу СТЗ-діабетичним щурам здатне частково компенсувати порушення сенсорної чутливості та нейрональної кальцієвої сигналізації, але вираженість компенсаторних змін при використанні німодипіну була набагато вищою. Так, введення еналаприлу, на відміну від німодипіну, не впливало достовірно на поведінкові реакції під час формалінового тесту. Достовірну відмінність ефектів еналаприлу та німодипіну ми спостерігали також при дослідженні їх впливу на амплітуди кофеїн-індукованих кальцієвих транзиєнтів в нейронах СТЗ-діабетичних щурів. Схожа тенденція зберігалась і при дослідженні вивільнення кальцію з депо по ріанодин- та IP₃-незалежному механізму. Приймаючи до уваги ці спостереження, логічно припустити, що виявлений вплив хронічного введення німодипіну не може бути обумовленим виключно його вазодилаторним ефектом - відчутну роль відіграє і прямий вплив німодипіну на сенсорні нейрони.

Таким чином, проведені дослідження вказують на можливі клітинні механізми, функціонування яких лежить в основі змін передачі ноцицептивної інформації сенсорними нейронами та впливає на больові поведінкові реакції щурів зі СТЗ-індукованим діабетом (Рис. 9). Одержані результати свідчать про можливість часткової корекції порушень больової чутливості, функціонування внутрішньоклітинних Ca²⁺-модулюючих структур у сенсорних нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом уже на ранніх етапах захворювання за допомогою хронічного введення німодипіну.

Висновки

1. Здійснено аналіз змін больових поведінкових реакцій і кальцієвої сигналізації в нейронах дорсального рогу спинного мозку щурів, що були викликані хронічним прикладанням німодипіну в умовах розвитку стрептозотоцин-індукованого діабету.

2. В експериментах, проведених з використанням формалінового тесту, показано, що хронічне прикладання німодипіну призводить до достовірних змін у больовій чутливості щурів зі стрептозотоцин - індукованим діабетом. Інтенсивність реакцій у першій фазі формалінового тесту, фізіологічно відповідальної за гострий біль, у діабетичних тварин, що одержували німодипін, була достовірно нижче, ніж у діабетичних, але достовірно вище, ніж у контрольних. Інтенсивність реакції в другій "тонічній" фазі у таких тварин не відрізнялась достовірно від діабетичних, залишаючись достовірно вищою, ніж у контрольних.

3. В експериментах, проведених з використанням методу "гаряча поверхня", не виявлено достовірних відмінностей больового порогу у відповідь на термічний стимул у щурів зі стрептозотоцин - індукованим діабетом, що одержували німодипін, від контрольних і діабетичних тварин. Швидкість больової реакції при температурі 48 С у діабетичних щурів, що одержували німодипін, була достовірно менше, ніж у контрольних, що свідчить про наявність у них термічної гіпоалгезії; однак даний параметр у цих тварин достовірно вище, ніж у діабетичних, що говорить про часткове відновлення термальної чутливості.

4. Показано, що базальний рівень [Ca²⁺]_і не відрізняється достовірно в нейронах тварин усіх досліджених груп. Хронічне введення німодипіну не впливало на рівень залишкового Ca²⁺ після деполяризації. Амплітуда [Ca²⁺]_і транзієнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією, у нейронах щурів із групи тварин зі СТЗ-індукованим діабетом, що одержували німодипін, була достовірно менше, ніж у нейронах тварин з усіх інших досліджених груп.

5. Показано достовірне збільшення амплітуди кальцієвого транзиєнту, викликаного аплікацією кофеїну у нейронах діабетичних щурів, що одержували німодипін. Разом з тим, амплітуда такого транзиєнту була достовірно менше, ніж у нейронах контрольних тварин.

6. Показано, що в нейронах контрольних і діабетичних щурів пряма аплікація німодипіну на нейрони дорсального рогу спинного мозку не впливає на вивільення кальцію з ріанодин - чутливого депо ЕР.

7. Показано достовірне збільшення амплітуди кальцієвого транзиєнту, викликаного аплікацією іономіцину в безкальцієвому розчині в нейронах діабетичних щурів, що одержували німодипін. Разом з тим, амплітуда такого транзиєнту достовірно менша, ніж у нейронах контрольних тварин.

8. Здійснено аналіз змін больових поведінкових реакцій і кальцієвої сигналізації в нейронах дорсального рогу спинного мозку щурів, що були викликані хронічним введенням вазодилатору еналаприлу в умовах розвитку стрептозотоцин-індукованого діабету. Показано, що хронічне введення еналаприлу діабетичним тваринам сприяло частковому відновленню термальної чутливості. Водночас, еналаприл не впливав на больові поведінкові реакції під час формалінового тесту. Показано, що хронічне введення еналаприлу СТЗ-діабетичним щурам здатне частково компенсувати порушення нейрональної кальцієвої сигналізації, але вираженість компенсаторних змін була меншою, ніж при використанні німодипіну.

9. Блокатор дигідропіридин-чутливих кальцієвих каналів німодипін можна розглядати як один з можливих фармакологічних агентів, здатних полегшувати симптоми діабетичної нейропатії шляхом корекції порушень нейронального кальцієвого гомеостазу, яка може бути опосередкованою впливом на підвищену активність L-типу Ca²⁺ каналів та на функціонування L-канал-ріанодин-рецепторного комплексу. Разом з тим, позитивна дія німодипіну може бути опосередкована процесами, повґязаними як з прямим впливом на нейрони так і з його вазодилаторним ефектом.

Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації

Kruglikov I., Gryshchenko O., Shutov L., Kostyuk E., Voitenko N. Diabetes-induced abnormalities in ER calcium mobilization in primary and secondary nociceptive neurons // Pfluger Archive. 2004. Vol. 448, №4. P. 395-401.

Shutov L., Kruglikov I.,.Shishkin V,.Borisovskaya M,.Kostyuk E, Voitenko N. Calcium release from the internal stores as a possible target for antinociceptive treatment in rats with experimentally-induced diabetes // Neurophysiology. 2002. Vol.34, №2/3. P. 242-244.

Kruglikov I., Shutov L., Potapenko E., Voitenko N., Kostyuk P. Metabotropic purinoreceptors in rat dorsal horn neurones: predominant dendritic location // Neuroreport. 2001. Vol.12, №16. P. 3503-3507.

Kruglikov I., Shutov L., Voitenko N. Involvement of the intracellular Ca²⁺ stores in Ca²⁺ signalling of rat laterodorsal thalamic neurones // Neurophysiology. 2001. Vol. 33, №2. P. 106-110.

Kruhlykov I., Shutov L., Shyshkin V., Kostiuk O., Potapenko Ie., Voitenko N. Changes in intracellular mechanisms in sensory neurons in experimental diabetes mellitus // Fiziol Zh. 2001. Vol.47, №5. P. 18-25.

Тези доповідей:

1. Shutov L., Gryshchenko O., Kruglikov I., Kostyuk P., Voitenko N. Effect of nimodipine treatment on thermal hypoalgesia and calcium signalling in nociceptive neurones in streptozotocin-diabetic rats. IASN 2004. Yalta (Ukraine). 2004.

2. Shutov L., Kruglikov I., Voitenko N. Functioning of intracellular calcium stores is impared in dorsal horn neurones under experimental diabetes, 3 rd Ukrainean Biophysical Society Congress. Lviv (Ukraine). 2002.

3. Shutov L., Kruglikov I., Potapenko E., Voitenko N., Kostyuk P. Predominant dendritic location of metabotropic purinoreceptors in rat dorsal horn neurones. 3-rd Forum of European Neuroscience Societies. -Paris (France). 2002.

анотаціЯ

Шутов Л.П. - Ефект хронічного прикладання німодипіну на кальцієвий гомеостаз у нейронах дорсального рогу спинного мозку щурів за умов розвитку діабетичної нейропатії. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофизика. Інститут фізіології ім.О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2006.

Дисертацію присвячено дослідженню змін кальцієвoї сигналізації у нейронах дорcального рогу (ДР) спинного мозку стрептозотоцин-діабетичних щурів під впливом хронічного введення німодипіну. Виявлено нормалізуючий вплив хронічного введення німодипіну на больові поведінкові реакції діабетичних щурів, а саме доведено зменшення больової чутливості при реакції на гострий біль під час формалінового тесту та часткову компенсацію термічної гіпоалгезії. Доведено нормалізуючий вплив хронічного введення німодипіну на діабет-індуковані порушення Ca²⁺ гомеостазу у нейронах ДР. Так, встановлено достовірне збільшення вивільнення Ca²⁺ з кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму нейронів ДР спинного мозку СТЗ-діабетичних щурів. Показано, що виявлені ефекти від хронічного введення німодипіну мають місце тільки в умовах експериментального діабету. Шляхом порівняння ефектів від хронічного введення німодипіну та еналаприлу показано, що позитивна дія німодипіну опосередкована процесами, повґязаними як з прямим впливом на нейрони так і з його вазодилаторним ефектом.

Ключові слова: діабет, нейропатії, Ca²⁺ канали, ріанодин, дигідропіридини.

АННОТАЦИЯ

Шутов Л.П. - Влияние хронического введения нимодипина на кальциевый гомеостаз в нейронах дорсального рога спинного мозга крыс в условиях развития диабетической нейропатии. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины. Киев-2006.

Диссертация посвящена исследованию изменений кальциевой сигнализации в нейронах дорсального рога спинного мозга СТЗ-диабетических крыс под влиянием длительного и регулярного введения нимодипина. Показано нормализующее влияние введения нимодипина на болевые поведенческие реакции диабетических животных, а именно: уменьшение болевой чувствительности при реакции на острую боль при проведении формалинового теста и частичная компенсация термической гипоалгезии. Выявлено нормализующее влияние введения нимодипина на диабет-индуцированные нарушения Ca²⁺ гомеостаза во вторичных сенсорных нейронах. В частности, обнаружено достоверное увеличение высвобождения Ca²⁺ из кальциевых депо ЭР нейронов ДР спинного мозга диабетических животных. Доказано, что обнаруженные эффекты от хронического введения нимодипина имеют место только в условиях развития экспериментального диабета. При сравнении эффектов хронического введения нимодипина и эналаприла обнаружено, что нормализующее действие нимодипина опосредовано как процессами, связанными с прямым действием на нейроны, так и с его вазодилаторным эффектом.

Ключевые слова: диабет, нейропатия, Ca²⁺ каналы, рианодин, дигидропиридины.

SUMMARY

Shutov L.P. The effect of nimodipine on calcium homeostasis in dorsal horn neurons of diabetic rats. - Manuscript.

Thesis for Ph.D. degree on specialty 03.00.02 - biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology NASc of Ukraine. Kiev-2006.

The dissertation is devoted to the investigation of influence of chronic nimodipine treatment on the calcium signaling in secondary sensory neurons from the spinal cord of rats with diabetic neuropathy. The pathogenesis of diabetic neuropathy is a complex phenomenon, the mechanisms of which are not fully understood. Our previous studies have shown that the intracellular calcium signaling is impaired in nociceptive neurons in rats with streptozotocin (STZ)-induced diabetes. Here, we investigated the effect of prolonged treatment with the L-type calcium channel blocker nimodipine on diabetes-induced changes in neuronal calcium signaling and pain sensitivity. Diabetes was induced in young rats (3-4 weeks old) by streptozotocin injection. After 3 weeks of diabetes development, the rats were treated with nimodipine (20 mg/kg daily) for another 3 weeks. Group of age-matched control rats were treated with nimodipine in the same way. The effect of treatment on calcium homeostasis in nociceptive dorsal horn (DH) neurons of spinal cord slices was examined with videoimaging techniques using Fura-2AM. Resting levels of intracellular calcium ([Ca²⁺]_I) in DH neurons did not significantly differ in nimodipine-treated diabetic rats vs. non-treated ones. However, the amplitude of either caffeine or ionomycin-induced transient elevation of [Ca²⁺]_I in calcium-free extracellular solution was significantly larger in neurons of nimodipine-treated diabetic rats. Nimodipine treatment significantly decreased the amplitudes of depolarization-induced [Ca²⁺]_i transients in DH neurons from SC slices of STZ-diabetic rats. Nimodipine treatment didn't affect calcium signaling in neurons of control rats. The ability of nimodipine treatment to improve impaired sensory reactions of STZ-diabetic rats was examined using ''Hot Plate test'' and ''Formalin test''. Nimodipine treatment partially reversed STZ-induced thermal hypoalgesia in diabetic rats and significantly reduced the intensity of the first phase of formalin response. The intensity of the second phase of formalin response was not changed and its duration was shortened by nimodipine treatement. Nimodipine treatment didn't affect sensory reactions of control rats. To clarify whether the effect of nimodipine was due to its neuronal or vasodilating action, a groups of STZ-diabetic and control rats were treated with the vasodilator enalapril (5 mg/kg daily). Resting levels of [Ca²⁺]_i and the amplitude of depolarization-induced [Ca²⁺]_i transients in DH neurons did not significantly differ in enalapril-treated diabetic rats vs. non-treated ones. The amplitudes of either caffeine or ionomycin-induced transient elevation of [Ca²⁺]_I in calcium-free extracellular solution was significantly larger in neurons of enalapril-treated diabetic rats. In tested neurons from STZ-diabetic rats the normalizing effect of enalapril treatment on amplitudes of caffeine- and ionomycine-induced [Ca²⁺]_i transients was far less significant than the normalizing effect observed following nimodipine treatment. Enalapril treatment didn't affect calcium signaling in neurons of control rats. Enalapril treatment partially reversed STZ-induced thermal hypoalgesia in diabetic rats. Enalapril changed neither the intensity nor the duration of either the first or the second phases of formalin response. Enalapril didn't affect sensory reactions of control rats. The results of this study suggest that chronic nimodipine treatment may be effective in restoring diabetes-impaired neuronal calcium homeostasis as well as reduction of diabetes-induced thermal hypoalgesia and noxious stimuli responses. The nimodipine effect may be mediated through a direct neuronal action combined with some vascular mechanism.

Key words: diabetes, nimodipine, calcium; dorsal horn neurons, endoplasmic reticulum

Размещено на Allbest.ru