Генетика как наука

- в первом случае активную роль играет наличие или отсутствие одной из половых хромосом;

- во втором, определенный баланс между аутосомами и половыми хромосомами.

Гермафродитизм -- одновременное или последовательное наличие у организма мужских и женских половых признаков и репродуктивных органов. Различают: естественный гермафродитизм, присущий различным видам животных и растений (однодомность) и аномальный (патологический) гермафродитизм нормально раздельнополых животных.

Гинандроморфизм -- аномалия развития организма, выражающаяся в том, что в одном организме крупные участки тела имеют генотип и признаки разных полов. Является результатом наличия в мужских и женских клетках организма наборов половых хромосом с разным количеством последних, как например, у многих насекомых. Гинандроморфизм происходит как результат неправильного распределения половых хромосом по клеткам в ходе нарушенного созревания яйцеклетки, её оплодотворения или дробления. Особи -- гинандроморфы наиболее ярко выражены у насекомых с четко проявляющимися признаками полового диморфизма. У позвоночных животных и у человека вследствие действия половых гормонов подобные явления приводят к половым аномалиям, при которых секториальное распределение мужских и женских тканей обычно проявляется не так резко

18. Наследование признаков, сцепленных с полом. Наследование" "крисс-кросс". Наследование ограниченных полом и зависимых от пола признаков

В том случае, когда гены ответственны за формирование какого-либо признака, расположены в аутосомах, наследование осуществляется независимо от того какой из родителей является носителем изучаемого признака. Но ситуация резко изменяется, когда признаки определяются генами, лежащими в половых хромосомах. Х и У-хромосомы гомологичны, поскольку обладают общими сходными участками, где находятся локусы аллельных генов. Но эти хромосомы различаются по морфологии. Помимо общих участков они несут большой набор различающихся генов. В Х-хромосоме лежат гены, которых нет в У-хромосоме, а некоторые гены У-хромосомы отсутствуют в Х-хромосоме. В таком случае признак определяется не парой аллельных генов, а только одним аллелем. Подобное состояние гена называют гемизиготными. Признаки, развитие которых обусловлено одиночным аллелем, расположенным в одной из альтернативных половых хромосом, получили название сцепленных с полом. Признаки, сцепленные с Х-хромосомой, могут быть рецессивными и доминантными. К рецессивным относятся: атрофия зрительного нерва, гемофилия, дальтонизм. К доминантным - рахит, не поддающийся лечению витамином D, темная эмаль зубов.

Если назвать основные характеристики Х- сцепленного рецессивного наследования, то они будут таковыми: обычно заболевание поражает мужчин; фенотипически здоровые женщины являются гетерозиготными носительницами; среди сыновей гетерозиготных матерей соотношение больных и здоровых составляет 50/50. Такое наследование получило название "крисс-кросс"(крест-накрест): сыновья наследуют признак матери, а дочери - признак отца. Помимо Х-сцепленных, у мужчин имеются У-сцепленные признаки. Они проявляются только у мужчин и передаются ко всем сыновьям. Например, волосатость ушей, перепонки меду пальцами ног, ихтиоз.

Признаки, ограниченные полом - это наследственные признаки, которые проявляются только у одного пола (например, удой у коров, яйценоскость у кур, плодовитость свиней). Ограниченные полом признаки могут определяться генами, находящимися как в половых хромосомах, так и в аутосомах. Поэтому понятие «признак, ограниченный полом» не связано с хромосомным механизмом их наследования и указывает лишь на характер проявления признака у разных полов. Есть ограниченные полом признаки, которые проявляются только у самцов (например, крипторхизм) или только у самок (например, молочность, или яйценоскость). При этом носителями соответствующих аллелей могут быть животные обоих полов. Признаки, зависимые от пола - это признаки, характер доминирования которых зависит от пола организма. Типичными примерами признаков, зависимых от пола является наследование рогатости и ко молости у некоторых пород овец, наследование окраса у айрширских молочных коров и раннее облысение у людей.

19. Сцепление генов и кроссинговер. Эксперименты Т. Моргана с дрозофилой. Полное и неполное сцепление генов. Группы сцепления и число хромосом

Как и в других законах наследственности, в законе о сцеплении генов сразу же обнаружили исключения. Морган в 1911 году нашел, что в гомологичной паре хромосом регулярно происходит обмен генами. В скрещивании организмов, различающихся по паре признаков, в F₁ получаются дигетерозиготы АВ/аb. В скрещивании потомков F₁ с родительской формой ab/ab в случае полного сцепления получалось бы расщепление АВ/ab и ab/ab в соотношении 1:1. Однако, всегда появляются новые сочетания признаков, например, Ab/ab и aB/ab. Значит, во время гаметогенеза образовались новые сорта гамет за счет перекреста хромосом и обмена их фрагментами. Т.Х. Морган с сотрудниками скрещивал линии дрозофил, содержащие гены a - черное тело, b - зачаточные крылья). Далее, ставились реципрокные скрещивания: в одном дигетерозиготой была самка, а дигомозиготой - самец, в другом скрещивании - наоборот. Если дигетерозиготой был самец, в потомстве 1 часть имеет фенотип Ab, другая часть - aB. Эти классы расщепляются в соотношении 1:1. В реципрокном скрещивании получено четыре класса потомков, два из которых имеют сцепленные гены, в том порядке, в каком они наблюдались у родителей, а два других класса возникли в результате нарушения сцепления - это кроссоверы. Эти результаты неопровержимо показывают, что в ходе гаметогенеза произошел обмен фрагментами хромосом - кроссинговер. В каждом из классов число мух было в определенных числовых сотношениях: Ab/ab и aB/ab составляли по 41,5%, т.е. некроссоверов было 83%. Два кроссоверных класса по числу особей были также одинаковыми (8,5%) и сумма их равна 17%. Процент кроссинговера определяется как отношение числа гамет с зарегистрированными обменами между двумя определенными парами аллелей к общему числу гамет. Значение частоты кроссинговера между двумя генами, выявляемое в опыте, не может быть более 50 %, т.к. эта частота составляет вероятность нормального, т.е. без кроссинговера, расхождения хромосом.

Полное сцепление генов. Если гены расположены в хромосоме непосредственно друг за другом, то кроссинговер между ними практически невероятен. Они почти всегда наследуются вместе, и при анализирующем скрещивании наблюдается расщепление в соотношении 1:1. Неполное сцепление генов. Если гены в хромосомах расположены на некотором расстоянии друг от друга, то частота кроссинговера между ними возрастает и, следовательно, появляются кроссоверные хромосомы, несущие новые комбинации генов: Аb и аВ. Их количество прямо пропорционально расстоянию между генами. При неполном сцеплении в потомстве появляется некоторое количество кроссоверных форм, причем их количество зависит от расстояния между генами. Процент кроссоверных форм указывает на расстояние между генами, расположенными в одной хромосоме.

Группа сцепления -- совокупность генов, находящихся в одной хромосоме. Число групп сцепления равно числу пар гомологичных хромосом данного организма (иными словами, оно равно гаплоидному числу его хромосом). Например, у гороха число хромосом 14 (2n = 14, n = 7), следовательно, он имеет 7 групп сцепления.

20. Генетические карты. Работы А. Стертеванта по картированию генов. Трехфакторное скрещивание. Одиночный и множественный перекресты хромосом. Интерференция и коэффициент коинциденции

Стёртевант (сотрудник Моргана) предположил, что частота кроссинговера на участке между генами, локализованными в одной хромосоме, может служить мерой расстояния между генами. Иными словами, частота кроссинговера, выражаемая отношением числа кроссоверных особей к общему числу особей, прямо пропорциональная расстоянию между генами. Тогда можно использовать частоту кроссинговера для того, чтобы определять взаимное расположение генов и расстояние между генами. Генетическое картирование - это определение положения какого-либо гена по отношению к двум (как минимум) другим генам. Постоянство процента кроссинговера между определенными генами позволяет локализовать их. Единицей расстояния между генами служит 1 % кроссинговера; в честь Моргана эта единица называется морганида (М), или сантиморганида (сМ). На первом этапе картирования необходимо определить принадлежность гена к группе сцепления. Чем больше генов известно у данного вида, тем точнее результаты картирования. Все гены разбивают на группы сцепления. На основании генетического картирования составляются генетические карты. На генетических картах крайнему гену (т.е. наиболее удаленному от центромеры) соответствует нулевая (исходная) точка. Удаленность какого-либо гена от нулевой точки обозначается в морганидах.

Трехфакторное скрещивание -- метод генного картирования с использованием варианта трансформации, при котором донор несет два аллеля дикого типа и один мутантный, а реципиент -- два мутантных и один дикий; при этом частота котрансформации оказывается пропорциональной расстоянию между селектируемым и неселектируемым маркерами.

Приняв положения, что 1) генов в хромосоме может быть много, 2) гены расположены в хромосоме в линейном порядке и 3) каждая аллельная пара занимает определенные и идентичные локусы в гомологичных хромосомах, Т. Морган предположил, что перекресты между двумя гомологичными хромосомами могут происходить одновременно в нескольких точках. Это предположение было им доказано на дрозофиле. Позже оно было подтверждено в экспериментах на других животных, а также растениях и микроорганизмах.

Кроссинговер, происходящий лишь в одном месте, называют одинарным, в двух точках одновременно - двойным, в трех - тройным и т. д., т.е. кроссинговер может быть множественным.

Интерференция - это подавление кроссинговера на участках, непосредственно прилегающих к точке происшедшего обмена.

Для количественных оценок уровня интерференции используется коэффициет коинциденции - C, который равен отношению реальной частоты двойных обменов к теоретически ожидаемой частоте (т.е. при условии, что обмены в соседних участках хромосом являются независимыми)

21. Хромосомная теория наследственности Т. Моргана Основные положения хромосомной теории наследственности

Хромосомная теория наследственности -- теория, согласно которой передача наследственной информации в ряду поколений связана с передачей хромосом, в которых в определённой и линейной последовательности расположены гены. Эта теория сформулирована в начале XX века, основной вклад в её создание внесли американский цитолог У. Сеттон, немецкий эмбриолог Т. Бовери и американский генетик Т. Морган со своими сотрудниками К. Бриджесом, А. Стёртевантом и Г. Мёллером.

Анализ явлений сцепленного наследования, кроссинговера, сравнение генетической и цитологической карт позволяют сформулировать основные положения хромосомной теории наследственности:

1.Гены локализованы в хромосомах. При этом различные хромосомы содержат неодинаковое число генов. Кроме того, набор генов каждой из негомологичных хромосом уникален.

2.Аллельные гены занимают одинаковые локусы в гомологичных хромосомах.

3.Гены расположены в хромосоме в линейной последовательности.

4.Гены одной хромосомы образуют группу сцепления, то есть наследуются преимущественно сцепленно (совместно), благодаря чему происходит сцепленное наследование некоторых признаков. Число групп сцепления равно гаплоидному числу хромосом данного вида (у гомогаметного пола) или больше на 1 (у гетерогаметного пола).

5.Сцепление нарушается в результате кроссинговера, частота которого прямо пропорциональна расстоянию между генами в хромосоме (поэтому сила сцепления находится в обратной зависимости от расстояния между генами).

6.Каждый биологический вид характеризуется определенным набором хромосом -- кариотипом.

22. Цитологическое доказательство кроссинговера. Генетическое доказательство кроссинговера на уровне четырех хроматид. Тетрадный анализ. Соматический мозаицизм. Влияние факторов внешней среды на кроссинговер

После того как генетическими методами удалось установить явление кроссинговера, необходимо было получить прямое доказательство обмена участками гомологичных хромосом, сопровождающегося рекомбинацией генов. Чтобы сопоставить цитологические карты гигантских хромосом с генетическими, Бриджес предложил воспользоваться коэффициентом кроссинговера. Для этого он разделил общую длину всех хромосом слюнных желез (1180 мкм) на общую длину генетических карт (279 единиц). В среднем это отношение оказалось равным 4,2. Следовательно, каждой единице перекреста на генетической карте соответствует 4,2 мкм на цитологической карте (для хромосом слюнных желез). Зная расстояние между генами на генетической карте какой-либо хромосомы, можно сравнить относительную частоту перекреста в разных ее районах. Например, в Х-хромосоме дрозофилы гены у и ec находятся на расстоянии 5,5%, следовательно, расстояние между ними в гигантской хромосоме должно быть 4,2 мкм Х 5,5 = 23 мкм, но непосредственное измерение дает 30 мкм. Значит, в этом районе Х-хромосомы кроссинговер идет реже средней нормы. В силу неравномерного осуществления обменов по длине хромосом гены при нанесении их на карту распределяются на ней с разной плотностью. Следовательно, распределение генов на генетических картах можно рассматривать как показатель возможности осуществления перекреста по длине хромосомы.

Имеются многочисленные и убедительные экспериментальные доказательства того, что кроссинговер происходит на стадии 4-х хроматид. В качестве одного из таких доказательств можно привести результаты тетрадного анализа у хлебной плесени - Neurospora crassa. Тетрадный анализ возможен на тех видах, у которых продукты одного мейотического деления остаются жизнеспособными и не перемешиваются. Это происходит благодаря тому, что веретена двух мейотических делений ориентированы одинаково. Так организован мейоз у многих грибов и печеночных мхов. Расположение генетических маркеров в аске существенно зависит от того, когда происходит кроссоверный обмен: до или после репликации ДНК. В первом случае обмениваются гомологичные хромосомы, а во втором случае сестринские хроматидыгомологичных хромосом. Было показано, что распределение генетических маркеров в аске всегда соответствует схеме, по которой кроссинговер происхо дит на стадии 4-х хроматид. Итак, мейотический кроссинговер у эукариот происходит после репликации ДНК, но перед первым мейотическим делением, причем в кроссоверный обмен вовлекаются две хроматиды из 4-х. Это приводит к тому, что доля рекомбинантных потомков не может превышать 0.50. Если между данными генами всегда возникает два кроссоверных обмена, то в генетическом анализе это проявляется как одиночный обмен, а не как его отсутствие.

Соматический мозаицизм -- присутствие генетически отличающейся популяции соматических клеток в данном организме -- часто замаскирован, но он может вызывать и существенные фенотипические изменения и выявлять экспрессию в других отношениях летальных генетичеких мутаций. Мозаицизм может быть вызыван мутациями ДНК, эпигенетическими изменениями ДНК, хромосомными аномалиями и спонтанными реверсиями наследуемых мутаций. Механизмы мозаицизма связаны со структурными аномалиями ДНК, эпигенетическими изменениями и аномальным распределением хромосом и митохондрий между дочерними клетками.

На частоту кроссинговера могут влиять различные факторы внешней среды: температура, ионизирующие излучения, концентрация солей, химические мутагены, лекарства, гормоны. При большинстве указанных воздействий частота кроссинговера повышается. По частоте различных типов рекомбинаций (мейотический и митотический кроссинговер, сестринские хроматидные обмены) можно судить о мутагенном действии лекарственных препаратов, канцерогенов, антибиотиков и т.д.

23. Нехромосомная наследственность. Плазмон. Внехромосомные генетические элементы. Пластидная наследственность

Нехромосомная наследственность -- передача в ряду поколений генов, локализованных вне ядра. Для нехромосомного наследования нередко характерны сложные картины расщепления, не согласующиеся с законами Менделя. Часто этот тип наследования также называют цитоплазматическим наследованием, понимая под этим наследование генов, расположенных не только в самой цитоплазме, но и органеллах клетки, имеющих собственную ДНК (пластид, митохондрий), а также инородных генетических элементов (например, вирусов), поэтому его следует отличать от собственно цитоплазматического наследования, при котором наследственные признаки детерминируются не органеллами, а самой цитоплазмой.

Плазмон -- совокупность генов, расположенных вне ядра, то есть геномы митохондрий (совокупность генов митохондрий также называют хондриомом) и пластид (хлоропластов). В современной клеточной биологии вместо о термина плазмон в настоящее время принято употреблять понятие «цитоплазматические гены», то есть противопоставлять их ядерному геному.

Наряду с основной, хромосомной, ДНК, бактерии могут иметь в своем составе внехромосомные генетические ДНК-элементы, - плазмиды, обусловливающие различные свойства, например, устойчивость к антибиотикам, сульфаниламидам, способность синтезировать бактериоцин, гемолизин и т.д. При этом часть плазмид передается от одной бактериальной клетки к другой при конъюгации (так называемые конъюгативные плазмиды). Плазмиды другой группы (неконъюгативные) неспособны к конъюгативному переносу. Именно к конъюгативным относятся наиболее известные F- и R-плазмиды Escherichia coli. Пластидная наследственность - внехромосомный способ наследования пластидных признаков, осуществляемый посредством самих пластид (хлоропластов). В зависимости от условий оплодотворения при пластидной наследственности пластидные признаки наследуются или только по материнской линии, или от обеих родительских форм (в случае переноса пластид в зиготу и через пыльцевые трубки. Совокупность пластид клетки как структур, способных передавать наследственную информацию, названа пластидомом (О. Реннер, 1934). Из всех структурных элементов цитоплазмы растений, с которыми можно связать передачу некоторых свойств и признаков материнского организма потомству, пластиды наиболее удобны для анализа, т.к. в большинстве случаев они четко различимы в цитоплазме благодаря целому ряду морфологические особенностей. Кроме того, они способны к скачкообразным изменениям -- пластидным мутациям, которые впоследствии четко воспроизводятся.

24. Митохондриальиая наследственность. Цитоплазматическая мужская стерильность

У большинства многоклеточных организмов митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии. Яйцеклетка содержит на несколько порядков больше копий митохондриальной ДНК, чем сперматозоид. В сперматозоиде обычно не больше десятка митохондрий (у человека -- одна спирально закрученная митохондрия), в небольших яйцеклетках морского ежа -- несколько сотен тысяч, а в крупных ооцитах лягушки -- десятки миллионов. Кроме того, обычно происходит деградация митохондрий сперматозоида после оплодотворения. При половом размножении митохондрии, как правило, наследуются исключительно по материнской линии, митохондрии сперматозоида обычно разрушаются после оплодотворения. Кроме того, большая часть митохондрий сперматозоида находятся в основании жгутика, которое при оплодотворении иногда теряется. Так как митохондриальная ДНК не является высококонсервативной и имеет высокую скорость мутирования, она является хорошим объектом для изучения филогении (эволюционного родства) живых организмов. Для этого определяют последовательности митохондриальной ДНК у разных видов и сравнивают их при помощи специальных компьютерных программ и получают эволюционное древо для изученных видов. Исследование митохондриальных ДНК собак позволило проследить происхождение собак от диких волков. Исследование митохондриальной ДНК в популяциях человека позволило вычислить «митохондриальную Еву», гипотетическую прародительницу всех живущих в настоящее время людей. Для некоторых видов показана передача митохондриальной ДНК по мужской линии, например, у мидий. Наследование митохондрий по отцовской линии также описано для некоторых насекомых, например, для дрозофилы, медоносных пчел и цикад. Существуют также данные о митохондриальном наследовании по мужской линии у млекопитающих.

Цитоплазматическая мужская стерильность -- это наследование признаков, ограничивающих или сводящих на нет фертильность мужских растений (например, из-за образования дефектной пыльцы или даже полное её отсутствие, морфологические особенности цветка и т. п.), по материнскому типу через цитоплазму. Следует отметить, что вообще мужская стерильность у растений может определяться и рецессивным аллелем соответствующего ядерного гена. У кукурузы существует особый ядерный ген -- восстановитель фертильности (Rf/rf). Находясь в доминантном состоянии, он обеспечивает развитие нормального фертильного растения даже при наличии в цитоплазме фактора стерильности, а рецессивная аллель влияет на репродуктивную функцию при нормальной цитоплазме. Поэтому стерильными будут только растения, гомозиготные по рецессивному аллелю rf и имеющие в цитоплазме фактор стерильности. У кукурузы (Zea mays) плазмогены (то есть цитоплазматические факторы) мужской стерильности производят плейотропное действие: уменьшается число листьев, снижается устойчивость к некоторым болезням. Явление восстановления фертильности пыльцы используется на практике для появления гетерозисных двойных межлинейных гибридов кукурузы. Так как кукуруза самосовместима, то, чтобы исключить самоопыление, у некоторых растений приходилось обламывать мужские метёлки, то есть чтобы сделать их исключительно женскими особями. Так что гибриды CytSrf/rf (CytS -- стерильная цитоплазма, CytN -- нормальная цитоплазма) являются решением этой проблемы, поскольку имеют цитоплазматическую мужскую стерильность и неспособны к самооплодотворению.

25. Генетический анализ у микроорганизмов. Выявление и анализ биохимических мутаций у микроорганизмов (метод отпечатков, метод селективных сред)

Использование микроорганизмов в качестве объекта генетических исследований дало более широкие возможности изучения гена. Во-первых, в работе с микроорганизмами при относительно простом оборудовании есть все возможности анализировать практически неограниченное число особей. Во-вторых, микроорганизмы имеют, как правило, гаплоидный набор хромосом и совмещают в себе функции гаметы и особи. В-третьих, каждая особь представляет отдельную биохимическую лабораторию, в которой под генным контролем происходит синтез живого вещества. Изучение генетики микроорганизмов позволило обнаружить ранее неизвестные способы передачи наследственной информации. Открытие таких явлений, как трансформация, трансдукция, половой процесс у бактерий и парасексуальный цикл у грибов, раскрыли поистине сказочные возможности анализа основ наследственности.

Одним из начальных условий успешного проведения генетического анализа является овладение методами обнаружения мутаций и накопления возможно большего числа мутаций, касающихся различных признаков и свойств микроорганизмов. Анализ мутаций является одновременно и методом изучения наследственности. Для учета и выделения мутаций у микроорганизмов были разработаны специфические методы, отличные от таковых для высших животных. Дж. Ледерберг предложил усовершенствованный метод выделения биохимических мутаций у микроорганизмов -- метод отпечатков. Для облегчения пересева колоний, применяют специальную печатку, имеющую размер чашки Петри. Плоскость печатки покрывают бархатом. Сначала к печатке с бархатом прикладывают чашку с анализируемыми колониями, выросшими на полной среде. На ворсинках бархата остаются клетки отдельных колоний. Затем к этой печатке прикладывают две чашки -- с минимальной и полной средой. После инкубации таких отпечатков сопоставляют колонии, выросшие на полной и на минимальной среде. Практически это делают таким образом: чашку с минимальной средой ставят на чашку с полной средой так, чтобы идентичные колонии совпали. Просматривая две совмещенные чашки в проходящем свете, на чашке с полной средой отмечают колонии, которые не выросли на минимальной среде. Это дает возможность обнаружить мутантные колонии. Далее из мутантной колонии, выросшей на полной среде, делают отсевы на специальные среды, содержащие 1) только аминокислоты, 2) только витамины и 3) только основания нуклеиновых кислот. Колонии, не выросшие на одной из этих трех сред, относятся к мутантам, нуждающимся в одном из трех типов метаболитов. В дальнейшем проводят испытание на потребность в отдельном метаболите: определенной аминокислоте, витамине и т. д. Так обнаруживают прямые биохимические мутации у микроорганизмов. Для учета обратных биохимических мутаций, т. е. от ауксотрофного к прототрофному типу, применяют метод селективных сред. Селективной называется полная среда без какого-либо определенного метаболита, на которой могут расти лишь клетки определенного генотипа. На такой среде из большой популяции клеток отбираются единичные мутантные клетки. Например, высевая культуру кишечной палочки Е. coli, нуждающуюся в витамине -- биотине, на среду, лишенную его, можно отбирать мутации, восстанавливающие способность синтезировать биотин, так как к росту способны только клетки, претерпевшие обратные мутации, т. е. возвратившие способность синтезировать биотин. Среда, лишенная биотина и, следовательно, не пригодная для роста прямой мутантной формы, может служить селективной для обнаружения обратных мутаций. Кроме обратных биохимических мутаций, методом селективных сред легко обнаруживаются также мутантные клетки, устойчивые к различным ядовитым веществам и антибиотикам. Зная исходное разведение суспензии клеток, можно подсчитать концентрацию мутантов в исходной популяции.

26. Особенности процессов, ведущих к рекомбинации у прокариот. Конъюгация

Мутационный процесс и поток генов могут создать в популяции изменчивость по единичным генам. Если в результате таких первичных процессов возникает аллельная изменчивость по двум или большему числу генов, то создаётся почва для действия вторичного процесса -- рекомбинации, В результате рекомбинации новые аллели, носителями которых первоначально, вероятно, были разные особи, могут сочетаться в одном генотипе. За счет рекомбинации число различающихся генотипов в популяции может увеличиться; этот процесс превращает небольшой первоначальный запас изменчивости по множественным генам в гораздо более значительное количество генотипической изменчивости. Конъюгацией называется непосредственный контакт между клетками бактерий, сопровождаемый переносом генетического материала из клеток донора в клетки реципиента. Процесс конъюгации у бактерий E. coli (кишечной палочки) был открыт в 1946 г. Дж. Ледербергом и Е. Тэйтумом на основании генетического подхода. В основе полового процесса у бактерий лежит конъюгация клеток. Это явление выражается в появлении временной связи между клетками бактерий посредством образования цитоплазматического мостика. Такая связь создает условия для проникновения генетического материала из одной клетки бактерий в другую. При явлениях рекомбинаций у бактерий одна из линий служит донором, а другая реципиентом. донорные клетки (мужские клетки бактерий) характеризуются наличием у них особого фактора F+. При конъюгации бактерий фактор F+ может переходить в pеципиентную женскую клетку F, превращая ее в мужскую клетку. Бактерии F, т. е. лишенные полового факторы, являются реципиентами. При конъюгации клеток F+ и F в последнюю часто переходит только половой фактор. Однако когда фактор F+ в клетки донора интегрируется с ее хромосомой, то конец хромосомы донора начинает регулярно проникать через цитоплазматический мостик в клетку реципиента, обусловливая появление клеток, способных к особо высокой частоте рекомбинаций, которые были обозначены символом Hfr. Генетическая рекомбинация у бактерий происходит не только при половом процессе. Обнаружены также рекомбинации ДНК, идущие при трансформации и трансдукции.

27. Генетическая рекомбинация при трансформации. Исследования Ф.Триффитса на пневмококках

Изучение бактерий открыло целый ряд явлений, осветивших с новой стороны источники наследственной изменчивости и механизмы наследственной передачи. Одним из первых успехов в этой области было открытие явления трансформации у бактерий в 1928 г. Известно несколько штаммов пневмококка Diplococcus pneumoniae: штамм S -- с полисахаридной капсулой и гладкими колониями и штамм R -- без капсулы и с шероховатыми колониями. Оба эти признака наследственны. Бактериолог Ф. Гриффитс инъецировал мышам вместе с убитым нагреванием штаммом пневмококка, обладающим капсулой (S), штамм живого пневмококка, лишенного капсулы (R). Спустя некоторое время ему удалось выделить из зараженных мышей живых пневмококков, обладающих капсулой. Таким образом, оказалось, что свойство убитого пневмококка -- способность образовывать капсулу -- перешло к живой бактерии. Поскольку признак наличия капсулы является наследственным, то следовало предположить, что какая-то часть наследственного вещества от бактерий штамма S перешла к клеткам штамма R. Но как это могло произойти, если клетки штамма S были убиты? Можно было предполагать, что в этом случае либо возникла мутация, либо произошла своеобразная гибридизация между живыми и мертвыми бактериями. Первое объяснение было наиболее вероятным, однако вопреки здравому смыслу второе объяснение оказалось ближе к истине. В 1944 г. О. Эвери с сотрудниками удалось выяснить природу этого загадочного явления. Они взяли те же два штамма -- R и S. Перед началом решающих опытов было изучено спонтанное мутирование обеих форм. Оказалось, что гладкая S-форма хотя и очень редко, но спонтанно мутирует в R-форму, а R-форма практически вовсе не мутирует в S-форму, т. е. мутации происходят почти исключительно в одном направлении: S->R. Но если R-форму помещали в экстракт из убитых клеток S-формы, то частота изменений R->S увеличивалась в 10 000 раз. Стало очевидным, что признак одного штамма (S) через какое-то вещество экстракта передавался другому штамму (R), т. е. возникало направленное наследственное изменение. Далее была произведена тщательная очистка -- выделение этого вещества из экстракта клеток S-формы. Вещество было названо трансформирующим фактором (ТФ), а само явление -- трансформацией. Трансформирующий фактор по своей биохимической природе представлял собой не что иное, как дезоксирибонуклеиновую кислоту, входящую в состав хромосом. При этом было установлено, что он обладает некоторыми характерными свойствами. Его можно экстрагировать из клеток, очищать, воздействовать на него in vitro химическими и физическими факторами и затем снова вводить в живые клетки и изучать вызываемые им изменения. Явление трансформации стало одним из основных доказательств роли ДНК как носителя наследственной информации. Теперь термином «трансформация» обозначают особый способ гибридизации бактерий, при котором происходит включение ДНК из клетки одного генотипа (донора) в клетку другого генотипа (реципиента), приводящий к рекомбинации генов. Иначе говоря, трансформация представляет включение вещества хромосомы донора в хромосому реципиента.

28. Трансдукция у бактерий. Использование трансформации и трансдукции для картирования бактериальных генов. Кольцевая карта хромосом прокариот

Трансдукция -- процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую вирусом бактериофагом. Общая трансдукция используется в генетике бактерий для картирования генома и конструирования штаммов. К трансдукции способны как умеренные фаги, так и вирулентные, последние, однако, уничтожают популяцию бактерий, поэтому трансдукция с их помощью не имеет большого значения ни в природе, ни при проведении исследований.

Трансформация служит хорошим инструментом для картирования хромосом, поскольку трансформированные клетки включают различные фрагменты ДНК. Определение частоты одновременного приобретения двух заданных характеристик (чем ближе расположены гены, тем более вероятно, что они оба включатся в один и тот же участок ДНК) даёт информацию о взаиморасположении соответствующих генов в хромосоме.

Феномен трансдукции может быть использован для картирования бактериальной хромосомы, если следовать тем же принципам, что и при картировании с использованием феномена трансформации

Основу генома прокариот - бактерий и др. составляют кольцевые молекулы ДНК: прокариотические хромосомы и плазмиды. Множество молекул ДНК образует две взаимосвязанные подсистемы: хромосомную и плазмидную.

Основу хромосомной подсистемы прокариотического генома составляет прокариотическая (бактериальная) хромосома (генофор), входящая в состав нуклеоида - ядерноподобной структуры. Нуклеоид по морфологии напоминает соцветие цветной капусты и занимает примерно 30% объема цитоплазмы. Бактериальная хромосома представляет собой кольцевую двуспиральную правозакрученную молекулу ДНК, которая свернута во вторичную спираль. Вторичная структура хромосомы поддерживается с помощью гистоноподобных (основных) белков и РНК. Точка прикрепления бактериальной хромосомы к мезосоме (складке плазмалеммы) является точкой начала репликации ДНК (эта точка носит название сайта OriC). Бактериальная хромосома удваивается перед делением клетки. Репликация ДНК идет в две стороны от сайта OriC и завершается в точке TerC. Молекулы ДНК, способные себя воспроизводить путем репликации, называются репликоны.

В прокариотических хромосомах число сайтов OriC может быть увеличено, например, у сенной палочки Bacillus subtilis их не менее двух.

Длина прокариотической хромосомы составляет несколько миллионов нуклеотидных пар (мпн); например, минимальная длина ДНК прокариотической хромосомы E. coli штамма MG1655 составляет 4639221 пн (физическая длина около 1,5 мм).

29. Функциональный и рекомбинационный критерии аллелизма. Ступенчатый аллеломорфизм. Цис- транс-тест на аллелизм. Центровая теория

Ступенчатый аллелизм. В истории изучения структуры гена ведущее место занимал вопрос о природе аллелизма. Сравнивая эффекты аллелей в гетерозиготах, пришли к выводу о том, что ген представляет собой элементарную неделимую структуру, которая при мутациях изменяется целиком, т.е. сложилось впечатление, что ген является единицей функции мутации и рекомбинации (кроссинговер). Это предложение опроверглось при открытии множественного аллелизма. 1929-1930 г. Серебровский и Дубинин использовали серию множественных аллелей, которые контролировали наличие или отсутствие щетинок на различных поверхностях у дрозофил. Каждая линия характеризуется наличием нескольких щетинок. Скрещивая несколько линий в F1, получили гетерозиготных самок. Оказалось, что компаунды (гетерозиготы по разным рецессивным или доминантным аллелям) не имеют щетинок на BC, а на полях AD щетинки имеются. Проводя скрещивание с 13 разными линиями они наблюдали одну и ту же закономерность восстановления признака у компаунда. Авторы выдвинули гипотезу, что ген, представлен как основа и называется базиген (ABCDEFG), и состоит из частей - трансгенов. Обнаружилось, что ген дробим и мутирует не целиком, а по трансгенам. Следовательно, он не является единицей мутации.

1. Функциональный критерий (Морган). Основан на том, что при скрещивании двух мутантов в результате изменения различных генов, возникают гибриды первого поколения, имеющие нормальный генотип. Морган применил свой критерий для несцепленных генов.

2. Рекомбинационный критерий. Основан на том, что аллельные гены расщепляются (расхождение аллелей в потомстве гетерозигот), неаллельные гены - рекомбинируют. Аллельные гены тоже могут рекомбинировать, поэтому для рекомбинационного критерия требуется исключить аллельные гены. Для использования рекомбинационного критерия необходимо, чтобы один родитель обладал двумя генотипическими изменениями, а второй не имел ни одного.

Е. Льюис предложил так называемый цис-транс-тест на аллелизм. Смысл этого теста сводится к тому, что при скрещивании двух особей, несущих мутации в негомологичных участках хромосомы, возникает зигота с транс-конфигурацией этих мутаций a1/a2. Если мутации комплементарны, т. е. появляется гибрид дикого типа, то мутации относят к разным геном. Если же гибрид оказывается мутантным, то обе мутации относят к одному гену, т. е. считают их аллельными. При скрещивании двух особей, одна из которых несет два генотипических изменения, а другая представляет собой дикий тип, образуется зигота с реконфигурацией мутаций. Гибрид дикого типа возникает и тогда, когда обе мутации затрагивают один ген и когда оказываются мутантными два разных гена. Таким образом, цис-транс-тест сводится фактически к транс-тесту, т.е. к функциональному критерию аллелизма, предложенному еще Морганом.

Центровая теория генов - теория, согласно которой ген состоит из отдельных функциональных участков (центров), которые могут независимо изменяться при мутациях. Другими словами, центровая теория гена -- теория о дробимости гена на части. Центровая теория гена позволяет линейно картировать части гена внутри гена в целом. Открытие центровой теории гена (Дубинин Н. П., 1928) позволило впервые обосновать идею о сложной структуре гена.

30. Экзон-интронная структура гена. Образование про-мРНК у эукариот. Сплайсинг. Альтернативный сплайсинг. Механизм сплайсинга. Нарушения экзон-интронной структуры гена и наследственные болезни

Открытие явления прерывности гена эукариот способствовало формированию представления о мозаичном строении гена - когда кодирующие последовательности ДНК в пределах того же гена разделяются некодирующими вставками с неинформационной, "молчаливой" ДНК. Кодирующие участки получили название - экзонов, а неинформационный материал - интронов. Первичный РНК-транскрипт, или про-мРНК, синтезированный на транскрипционной единице, в большинстве случаев длиннее, чем последовательность нуклеотидов, соответствующая конечному продукту (полипептиду, тРНК, рРНК). У эукариот первичный транскрипт может быть в 10 раз длиннее, чем мРНК, поступающая для трансляции. Первичный РНК-транскрипт претерпевает изменения в совокупности называемые процессингом.

Сплайсинг -- процесс вырезания определенных нуклеотидных последовательностей из молекул РНК и соединения последовательностей, сохраняющихся в «зрелой» молекуле, в ходе процессинга РНК. Наиболее часто этот процесс встречается при созревании матричной, или информационной, РНК (мРНК) у эукариот, при этом путём биохимических реакций с участием РНК и белков из мРНК удаляются участки, не кодирующие белок (интроны) и соединяются друг с другом кодирующие аминокислотную последовательность участки -- экзоны. Таким образом незрелая пре-мРНК превращается в зрелую мРНК, с которой считываются (транслируются) белки клетки.

Механизм сплайсинга - некодирующий белок участок РНК, интрон вырезается с образованием лариата, экзоны сшиваются. Сплайсосомные интроны часто находятся в генах, кодирующих белки. Для сплайсинга необходимо наличие специальных 3'- и 5' -- последовательностей. Сплайсинг катализируется сплайсосомой. Про-мРНК некоторых генов эукариот могут подвергаться альтернативному сплайсингу. При этом интроны в составе про-мРНК вырезаются в разных альтернативных комбинациях, при которых вырезаются и некоторые экзоны.. Биологический смысл альтернативного сплайсинга для многоклеточных эукариот состоит в том, что он, по-видимому, является ключевым механизмом увеличения разнообразия белков, а также позволяет осуществлять сложную систему регуляции экспрессии генов, в том числе тканеспецифической. Нарушения экзон-интронной структуры гена могут вызвать различные наследственные болезни.

31. Нуклеиновые кислоты. Модель ДНК Уотсона-Крика. Типы РНК в клетке

Нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды) - биополимеры, осуществляющие хранение и передачу генетической информации во всех живых организмах, а также участвующие в биосинтезе белков. Первичная структура нуклеиновых кислот представляет собой последовательность остатков нуклеотидов. Последние в молекуле нуклеиновых кислот образуют неразветвленные цепи. В зависимости от природы углеводного остатка в нуклеотиде (D-дезоксирибозы или D-рибозы) нуклеиновые кислоты подразделяют на дезоксирибонуклеиновые (ДНК) и рибонуклеиновые (РНК) кислоты. В молекуле ДНК гетероциклы, входящие в остаток нуклеотида, представлены двумя пуриновыми основаниями - адeнином (А) и гуанином (G), и двумя пиримидиновыми основаниями - тимином (Т) и цитозином (С); РНК вместо Т содержит урацил (U). Отдельные нуклеотидные остатки связаны между собой в полинуклеотидных цепях 3'-5'-фосфодиэфирными связями. Трехмерная модель пространственного строения двухцепочечной ДНК была описана в апрельском журнале Nature в 1953 г. Дж.Уотсоном, Френсисом Криком и Морисом Уилкинсом. Структура ДНК - полимер, структурной единицей которого является нуклеотид. Нуклеотид состоит из азотистого основания пуринового: аденин (А) или гуанин (Г) или пиримидинового: цитозин (Ц) или тимин (Т), углевода дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты. Фосфатные группировки находятся снаружи спиралей, а основания - внутри и расположены с интервалом 34 нм. Двойная спираль ДНК правосторонняя. 10 пар оснований составляют полный оборот 360 градусов, следовательно, каждая пара оснований повернута на 36 градусов вокруг спирали относительно следующей пары. Цепи удерживаются вместе водородными связями между основаниями и закручены одна вокруг другой и вокруг общей оси. В разработке модели ДНК важную роль сыграли наблюдения Чаргаффа о том, что количественные отношения гуанина всегда равны содержанию цитозина, а содержание аденина соответствует содержанию тимина.

Существуют три типа РНК, каждый из которых выполняет свою особую роль в синтезе белка.

1. Матричная РНК переносит генетический код из ядра в цитоплазму, определяя таким образом синтез разнообразных белков. Представляет собой длинную одноцепочечную молекулу, присутствующую в цитоплазме, содержит до нескольких тысяч нуклеотидов РНК, образующих кодоны, строго комплементарные триплетам ДНК.

2. Транспортная РНК переносит активированные аминокислоты к рибосомам для синтеза полипептидных молекул. Каждая специфическая транспортная РНК распознает «свой» кодон матричной РНК, прикрепившейся к рибосоме, и доставляет соответствующую аминокислоту на соответствующую позицию в синтезируемой полипептидной цепи. Цепь транспортной РНК гораздо короче матричной РНК, содержит всего около 80 нуклеотидов и упакована в форме клеверного листа. Код, посредством которого транспортная РНК распознает соответствующий кодон на матричной РНК, также является триплетом и его называют антикодоном.

3. Рибосомная РНК в комплексе примерно с 75 разными белками формирует рибосомы -- клеточные органеллы, на которых происходит сборка полипептидных молекул.

32. Модели удвоения молекулы ДНК. Репликационная вилка. Основные способы репликации кольцевой ДНК (тета-тап репликации, сигма-тип репликации) и линейной ДНК

Репликация -- процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Репликацию ДНК осуществляет сложный ферментный комплекс, состоящий из 15--20 различных белков, называемый реплисомой. Каждая молекула ДНК состоит из одной цепи исходной родительской молекулы и одной вновь синтезированной цепи. Такой механизм репликации называется полуконсервативным. Ранее существовали и две другие модели: «консервативная» -- в результате репликации образуется одна молекула ДНК, состоящая только из родительских цепей, и одна, состоящая только из дочерних цепей; «дисперсионная» -- все получившиеся в результате репликации молекулы ДНК состоят из цепей, одни участки которых вновь синтезированы, а другие взяты из родительской молекулы ДНК. Репликация проходит в три этапа: инициация репликации, элонгация, терминация репликации. Репликация начинается в сайте инициации репликации с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка -- место непосредственной репликации ДНК. В каждом сайте может формироваться одна или две репликационные вилки в зависимости от того, является ли репликация одно- или двунаправленной. Более распространена двунаправленная репликация

Сигма-тип репликации кольцевой ДНК (модель катящегося кольца) - процесс репликации кольцевых молекул ДНК, характерный для многих бактерий и вирусов, а также внутриклеточных органелл (митохондрий и пластид); удлинение синтезируемой цепи ДНК происходит с 5-конца, прикрепляющегося к клеточной мембране, а точка репликации расположена в месте ответвления 5-нити от исходного кольца; по завершении нескольких раундов репликации вокруг исходной ДНК образуется новая молекула ДНК, содержащая несколько копий исходной, соединенных голова к хвосту и способная служить матрицей для синтеза комплементарной цепи ДНК. Репликация тета-типа - двунаправленная полуконсервативная репликация кольцевых молекул ДНК, начинающаяся с образования вздутия, видимого под электронным микроскопом, расширяющегося в двух направлениях; перед окончанием репликации структура напоминает греческую букву тета. Репликация линейных молекул начинается в определенных точках с образования репликационных вздутий. После образования вздутия оно начинает увеличиваться по мере распространения процесса репликации ДНК в обоих направлениях от точки инициации. По ходу процесса соседние вздутия могут сливаться, а когда вздутие достигает конца молекулы, образуется характерная промежуточная Y-образная конфигурация. Когда репликация заканчивается, из одной линейной родительской молекулы образуются две линейные дочерние, каждая из которых, так же как и родительская, представляет собой двойную спираль.

33. Репарация ДНК. Типы структурных повреждений в ДНК и репарационные процессы

В любой клетке под влиянием различных факторов в ДНК ежедневно происходят тысячи случайных изменений, а за год в каждой клетке накапливается лишь очень небольшое число стабильных изменений нуклеотидной последовательности ДНК. Среди множественных случайных замен оснований в ДНК лишь одна на тысячу приводит к возникновению мутации. Все остальные повреждения очень эффективно ликвидируются в процессе репарации ДНК. Механизм репарации («залечивание» повреждений ДНК) основан на том, что молекула ДНК имеет две копии генетической информации - по одной в каждой из нитей молекулы. Основной путь репарации включает три этапа: измененный участок поврежденной цепи ДНК распознается и удаляется с помощью ДНК-репарирующих нуклеаз. В спирали ДНК в этом месте возникает брешь; ДНК-полимераза и гликозилазы заполняют эту брешь, присоединяя нуклеотиды один за другим, копируя информацию с целостной нити; ДНК-лигаза «сшивает» разрывы и завершает восстановление молекулы.

ДНК может повреждаться разнообразными мутагенами, к которым относятся окисляющие и алкилирующие вещества, а также высокоэнергетическая электромагнитная радиация -- ультрафиолетовое и рентгеновское излучение. Тип повреждения ДНК зависит от типа мутагена. Среди разных типов повреждений наиболее опасные -- это двухцепочечные разрывы, потому что они трудно репарируются и могут привести к потерям участков хромосом (делециям) и транслокациям. Многие молекулы мутагенов вставляются (интеркалируют) между двумя соседними парами оснований. Имеются 3 ферментные системы, ведущие репарацию -- прямая, эксцизионная и пострепликативная. Прямая репарация наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Эксцизионная репарация включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы. Пострепликативная репарация - тип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей поврежденные участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе гомологичной рекомбинации при помощи белка RecA. Считается, что нарушение механизмов репарации ДНК в целом приводит к различным патологическим процессам, в число которых входят канцерогенез, дефекты развития и старение. Мутации возникают тогда, когда репарационный механизм по каким-то причинам не работает или не справляется с устранением повреждений. Мутации, возникающие в генах, кодирующих белки, ответственные за репарацию, могут приводить к многократному повышению (мутаторный эффект) или понижению (антимутаторный эффект) частоты мутирования других генов.