Основы микробиологии и иммунологии

6.2 Механизм дыхания

Первым этапом дыхательных процессов является отнятие водорода от субстрата с помощью ферментов - дегидрогеназ (НАД и НАДФ).

Отнимая водород от окисляемого субстрата они переходят в восстановительную форму (НАД . Н2 и НАДФ . Н2) и переносят водород на другое вещество (акцептор).

СУБСТРАТ-Н2 + НАД(НАДФ) > окисленный субстрат + НАД .Н2(НАДФ .Н2)

АКЦЕПТОРОМ водорода для аэробов служит кислород воздуха.

АКЦЕПТОРОМ водорода для анаэробов являются другие вещества (соли азотной, серной, кислот, углекислоты).

Наибольшее практическое значение из всех типов биологического окисления имеет брожение. Оно осуществляется только микроорганизмами. В промышленности с помощью брожения получают множество полезных химических веществ - спирты, молочную кислоту, щавелевую кислоту, витамин В12.

Кроме химических веществ брожение дает нам ценные продукты питания - кисломолочные.

Рис. Типы биологического окисления

6.3 Рост и размножение микроорганизмов

Под ростом понимают увеличение массы отдельной бактериальной клетки. Под размножением - увеличение числа особей микроорганизмов.

Бактерии размножаются преимущественно простым поперечным делением пополам, которое происходит в различных плоскостях. При этом образуются многообразные сочетания клеток (кисть винограда - стафилококки, цепочки - стрептококки, соединения по парам - диплококки, тюки, пакеты - сарцины др.).

Процесс деления бактерии проходит ряд последовательных этапов. Сначала появляется перетяжка, состоящая из цитоплазматической мембраны, а затем происходит разъединение образовавшихся дочерних клеток.

Параллельно с этим синтезируется клеточная стенка. Вместе с цитоплазмой в дочерние клетки переходит и нуклеоид, состоящий из ДНК. ДНК реплицируется в результате разрыва водородных связей, образуются две спирали ДНК, каждая из которых включается в состав новой клетки. Затем дочерние односпиральные ДНК восстанавливают водородные связи и вновь образуются двуспиральные ДНК. Грибы размножаются в основном в виде спор, дрожжи - почкованием.

Большинство клеток делится через 20-30 минут. Так, у кишечной палочки новое поколение образуется через 20-30 минут, у нитрифицирующих бактерий - через 5-10 ч, а у возбудителей туберкулеза только через 18-24 ч.

Микроорганизмы размножаются быстро, но не беспредельно. Это связано с нарушением оптимальных условий роста и размножения (истощение среды, неблагоприятная температура, свет, продукты жизнедеятельности).

Процесс размножения микроорганизмов на не сменяемой среде (in vitro) протекает неравномерно (стадийно). Различают восемь (четыре) стадий (разные авторы по-разному).

1. Начальная фаза (лаг-фаза), или фаза покоя. Культура приспосабливается к питательной среде.

2. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза характеризуется максимальным увеличением клеток в культуре. Оно идет в геометрической прогрессии. Большинство клеток молодые и биологически активные. Питательная среда истощается, продукты обмена замедляют рост. Кривая роста постепенно принимает горизонтальное положение.

3. Стационарная фаза, или период зрелости. Кривая идет параллельно оси абсцисс. Наступает равновесие между числом вновь образованных и погибших клеток.

Количество питательной среды уменьшается, плотность клеток увеличивается, токсическое действие продуктов обмена усиливается. Все это ведет к гибели клеток.

4. Фаза отмирания (фаза старости). Происходит уменьшение клеток и изменение их. Появляются деградированные формы, а также споры. Через несколько недель или месяцев культура погибает, из-за ядовитого действия продуктов жизнедеятельности. Знание закономерностей развития имеет практическое значение при выращивании и сохранении культур на жидких и плотных питательных средах.

Знание физиологических свойств микроорганизмов позволяет культивировать (выращивать) их на искусственных питательных средах, изучать их свойства, определять вид микроба.

Понятийный аппарат к теме 6 (Тезаурус)

1.Типы питания микроорганизмов (аутотрофные микроорганизмы, гетеротрофные микроорганизмы, метанотрофы, паратрофы, прототрофы, ауксотрофы, органотрофы, литотрофы, фотолитотрофы, фотоорганотрофные микроорганизмы, хемолитотрофные микроорганизмы, хемоорганотрофные микроорганизмы)

2. Типы дыхания микроорганизмов (облигатные (строгие, абсолютные) аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, облигатные (строгие, абсолютные) анаэробы)

3. Пермеазы

4. Экзоферменты

5. Эндоферменты

6. Классификация ферментов (оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы)

Вопросы для самоконтроля

6. Механизм и источники питания микроорганизмов.

7. Классификация ферментов. Их значение в жизни микроорганизмов.

8. Значение ферментативной активности микробов в лабораторной практике.

9. Механизм дыхания микроорганизмов.

10. Понятие «рост» и «размножение» микроорганизмов.

ЛЕКЦИЯ 7. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

7.1 Действие физических факторов на микроорганизмы

К физическим факторам относят действие температуры, высушивания, гидростатического давления, света, электричества, ультразвука, лучистой энергии, летящих электронов.

Взависимости от температуры роста все микроорганизмы распределяются на три группы.

1. Психрофилы

2. Мезофиллы

3. Термофилы

	Психрофилы	Мезофилы	Термофилы
Минимум	0	10	35
Оптимум	15-20	30-37	50-60
Максимум	30-35	40-45	70-75

В микробиологической практике из всех перечисленных физических факторов наибольшее применение имеет температурный фактор.

Большая часть микроорганизмов чувствительна к высоким температурам. Уже при температуре 56 С многие микробы погибают в течение 30 минут, при 70 С - 10-15 мин, при 80-100 С - 1мин. Однако споры характеризуются значительной устойчивостью к высокой температуре. Они сохраняют жизнеспособность даже после кипячения в течение часа и более.

Высокая температура угнетает ферментативную активность бактерий, вызывает денатурацию белков, нарушение осмотического давления.

В связи с этим, высокую температуру используют для уничтожения вегетативных и споровых форм бактерий. Полное уничтожение бактерий на объекте называется стерилизацией. В зависимости от стерилизуемого материала разработаны разные виды стерилизации.

В лабораторной практике для сохранения микробных культур применяют метод лиофилизации. Лиофилизация - это метод получения сухих культур микроорганизмов путем высушивания из замороженного состояния (-76 С) под вакуумом.

Универсальным способом уничтожения вегетативных и споровых форм является сочетание высокой температуры и повышенного давления. Для этого имеется специальное оборудование - автоклавы.

7.2 Действие химических факторов на микроорганизмы

Химические вещества, взаимодействуя с клеткой, вызывают либо остановку роста микроорганизмов (бактериостатическое действие), либо его гибель (бактерицидное действие). Бактерицидное действие химических веществ позволяет использовать их в качестве дезинфектантов.

Дезинфекция - это уничтожение патогенных микроорганизмов в окружающей среде.

Бактерицидным действием обладают различные химические вещества: кислоты, щелочи, спирты, поверхностно-активные вещества, фенолы и их производные, соли тяжелых металлов, окислители, группа формальдегида, газообразные вещества и др.

Перечисленные группы имеют различные механизмы бактерицидного действия, обусловленные разнообразной химической структурой.

7.3 Действие биологических факторов на микроорганизмы

К биологическим факторам относят антибиотики и бактериофаги.

Антибиотики (греч. Анти - против, БИОС - жизнь) - это вещества микробного, животного, растительного и синтетического происхождения, подавляющие развитие и биохимическую активность чувствительных к ним микробов или даже разрушающие их.

1929г. - А.Флеминг доказал, что фильтрат бульонной культуры плесневого гриба Penicillium notatum обладает антимикробными свойствами в отношении стафилококков и др. микробов.

1940 г. - Э.Чейн, Г.Флори, Э.Эбрахем, выделили пенициллин из культуральной жидкости.

1942 г. - З.В. Ермольева получила пенициллин в СССР.

1944 г. - С.Ваксман открыл ряд антибиотиков продуцентами которых были актиномицеты, в т.ч. в 1944 г. - стрептомицин (Actinomices griseus) для лечения туберкулеза и чумы. Он более эффективен, чем пенициллин против грамотрицательных бактерий.

В связи с открытием пенициллина и стрептомицина, сталдо возможным лечить большую часть бактериальных инфекций. В течение 2-х десятилетий (с 1940 по 1960 гг) были открыты все наиболее часто применяемые антибиотики: стрептомицин, хлорамфиникол, полимиксин, хлортетрациклин, бензилпенициллин, неомицин, нистатин, эритромицин, новобиоцин, олеандомицин, канамицин, леворин и др.

Поиск новых и совершенствование старых антибиотиков продолжается, в т.ч. на основе биотехнологии, производящей антибиотики в огромном количестве. Если в 1943 г. Было произведено всего 13 кг пенициллина, то сейчас ежегодно - десятки тысяч тонн антибиотиков все новых и новых поколений. Одних только антибиотиков пенициллинового ряда выпускается около 100 наименований.

В настоящее время известно более 5000 антибиотиков. Из них в медицине и ветеринарии используется около 200 антибиотиков. Антибиотики как продукты жизнедеятельности одних микробов обуславливают гибель других. Т.е. действие биологических факторов основано, прежде всего, на антагонизме микробов.

Принципы классификация антибиотиков. В основе классификации антибиотиков лежит:

1. Механизм действия. Антибиотики обладают избирательностью и специфичностью действия. Специфичность действия заключается во влиянии на различные виды обмена веществ.

По механизму действия:

1). нарушающие синтез клеточной стенки;

2). ингибирующие синтез белка, РНК, ДНК (группа левомицитина, тетрациклина, макролиды, аминогликозиды)

3) .нарушающие функции цитоплазматической мембраны(полиеновые антибиотики).

2. По типу действия на микроорганизмы:

1) антибиотики с бактерицидным действием (влияющие на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану);

2) антибиотики с бактериостатическтм действием (влияющие на синтез макромолекул).

3. По спектру действия (узкого и широкого спектра действия).

1) с преимущественным действием на грамположительные микроорганизмы (линкозамины, биосинтетические пенициллины, ванкомицин);

2) с преимущественным действием на грамотрицательные микроорганизмы (монобактамы, циклические полипептиды);

3)широкого спектра действия (аминогликозиды, левомицетин, тетрациклины, цефалоспорины.

4. По химическому строению (9 групп).

Антрациклиновые антибиотики ( к ним относят противоопухолевые антибиотики - доксорубицин, карминомицин, рубомицин, акларубицин)

5. По происхождению (4 группы - антибиотики, выделенные из грибов, из бактерий, антибиотики животного происхождения, антибиотические вещества высших растений).

6. По направлению действия (антимикробное, противоопухолевое, противопаразитарное, противомикозные).

Результаты применения антибиотиков в медицине оказались впечатляющими. Сократилась смертность среди детей, выросла продолжительность жизни людей, в с.-х. - для лечения и профилактики инфекционных заболеваний среди скота и птиц.

Однако, возникла проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов. Если до 1945 г. 5-10% стафилококков, были устойчивы к пенициллину, то к 1960 гю -75-80%. Появились полусинтетические пенициллины - метициллин, ампициллин, оксациллин. Механизм появления устойчивых форм сложен. Считают, что некоторые виды микробов вырабатывают адаптивные ферменты, разрушающие химиопрепарат, например пенициллиназу, разлагающую пенициллин. Резистентность к антибиотикам может формироваться и в результате мутаций. Ко многим антибиотикам развивается аллергия.

7.4 Бактериофаги

Бактериофаги (от греч. Phagos -пожирающий). - это вирусы, пожирающие клетки бактерий..Они не имеют клеточной структуры, не способны сами синтезировать нуклеиновые кислоты и белки, поэтому являются облигатными внутриклеточными паразитами. В настоящее время они обнаружены более чем у 100 видов бактерий. Бактериофаги встречаются в почве, воде, сточных водах, организме животных и человека, молоке, испражнениях. Владельцами бактериофагов являются эшерихии, сальмонеллы, стафилококки и стрептококки, микобактерии, листерии, коринебактерии и др.



7.4.1 Краткая история получения бактериофагов

Первым, кто наблюдал явление лизиса бактерий, был Н.Ф. Гамалея, который в 1898г. обрабатывая бациллы сибирской язвы, выделил вещество, которое лизировало за 6-12 часов молодую сибиреязвенную культуру. Он назвал эти вещества бактериолизинами и отнес их к группе ферментов.

Наиболее полно это явление изучил Д, Эрель (1917-1926г).

Первое сообщение Д. Эреля о феномене лизиса дизентерийных микробов под влиянием фильтрата испражнений дизентерийного больного было сделано в 1917 г. во Французской Академии наук. Им был проделан следующий опыт.

В стерильный бульон вносили несколько капель жидких испражнений выздоравливающего от дизентерии человека. После суточного нахождения колбы в термостате в бульоне выросла смешанная культура. ЕЕ профильтровали через бактериальные свечи.

Когда фильтрат добавили в свежие культуры дизентерийных палочек, бульон через несколько часов стал прозрачным, микробы из него исчезли (растворились). Д.Эрель повторил этот опыт несколько раз, и каждый раз получал одинаковый эффект.

Выделенное литическое начало Д.Эрель назвал Bacteriophagum protobiosus. Название бактериофаг - получило всеобщее признание и прочно вошло в литературу. В настоящее время более чем у 100 видов бактерий обнаружены бактериофаги

Бактериофаги инфицируя клетку, репродуцируются в ней, образуют потомство и вызывают лизис, сопровождающийся выходом фагов в среду обитания бактерий.

Фаги различаются по форме, типу взаимодействия с микробной клеткой и специфичности.



7.4.2 Строение бактериофагов

Структура бактериофагов различна. Большинство фагов имеют форму головастика или сперматозоида, некоторые фаги имеют кубическую или нитевидную форму. В структуре бактериофага различают головку и отросток. Белковая оболочка головки называется капсидом.

Капсид состоит из морфологических единиц называемых капсомерамы. В него включена молекула ДНК или РНК. Молекула ДНК вместе с капсидом образует нуклеокапсид. У фагов нуклеокапсид имеет смешанный тип симметрии - спиральный и икосаэдрический.

У большинства фагов геном - двунитевые ДНК, геном некоторых - однонитевые ДНК.

Кроме того, в отличие от вирусов эукариот, бактериофаги имеют хвостовой отросток, с помощью которого они прикрепляются к клетке. Но некоторые его не имеют.

Размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм у нитевидных фагов. Средний размер головки 60-100 нм, длина отростка 100-200 нм.

В химическом отношении фаги представлены нуклеиновыми кислотами и небольшим количеством белков.(в состав которых входят полиамины: спермин и путресцин, кислоторастворимый полипептид, содержащий аспарагиновую и глутаминовую кислоты, лизин и кислотонерастворимый белок).

Фаги по сравнению с бактериями являются более устойчивыми к действию химических и физических факторов.

Фаги могут существовать в двух формах:

1) внутриклеточной (это профаг, чистая ДНК);

2) внеклеточной (это вирион).

Фаги, как и другие вирусы, обладают антигенными свойствами и содержат группоспецифические и типоспецифические антигены.

Различают два типа взаимодействия фага с клеткой:

1) литический (продуктивная вирусная инфекция). Это тип взаимодействия, при котором происходит репродукция вируса в бактериальной клетке. Она при этом погибает.

Взаимодействие фага и бактерий протекает стадийно.

1. Первая стадия - адсорбция фага на рецепторные участки клеточной стенки бактерий. К ним фаг прикрепляется концевыми нитями отростков.

2. Проникновение - на этой стадии ДНК фага через отросток проникает в клетку. При этом слои клеточной стенки разрушаются под действием фагового лизоцима.

3. Третья стадия - на этой стадии начинается биосинтез фаговой информационной РНК, белков капсида, которые участвуют в биосинтезе фаговой ДНК. Латентный период продолжается в пределах 15 минут.

4. Четвертая стадия - морфогенез фага, т.е. пустотелые фаговые капсиды заполняются нуклеиновой кислотой и формируются зрелые вирионы (частицы фага).

5. Пятая стадия - выход фаговых частиц из клетки. Это происходит благодаря лизису зараженной бактерии фаговым лизоцимом, накапливающимся в процессе репродукции фага.

Количество зрелых фаговых частиц (вирионов) колеблется от единиц до нескольких тысяч. Затем фаги вновь внедряются в еще незараженные клетки и процесс повторяется.

2) лизогенный. Это умеренные фаги. При проникновении нуклеиновой кислоты в клетку идет интеграция ее в геном клетки, наблюдается длительное сожительство фага с клеткой без ее гибели. При изменении внешних условий могут происходить выход фага из интегрированной формы и развитие продуктивной вирусной инфекции.

Клетка, содержащая профаг в геноме, называется лизогенной и отличается от исходной наличием дополнительной генетической информации за счет генов профага. Это явление лизогенной конверсии.

По признаку специфичности выделяют:

1. поливалентные фаги (лизируют культуры одного семейства или рода бактерий);

2. моновалентные (лизируют культуры только одного вида бактерий);

3. Типовые (способны вызывать лизис только определенных типов (вариантов) бактериальной культуры внутри вида бактерий)

7.4.3 Методы выделения и титрования фагов

Для выделения фага из субстрата (культуральная жидкость, гой ран, сточные воды и т.д.) суспензию фильтруют через мелкопористые фильтры. Затем фильтрат, внося в соответствующие молодые культуры бактерий.

При наличии фага в испытуемом материале бактерии растворяются, жидкость просветляется, а на поверхности агара на месте нанесения фильтратов образуются «стерильные пятна», «бляшки», «негативные колонии».

Бактериофаг проверяют на чистоту, специфичность, а также определяют его титр. Титром бактериофага называется то его наибольшее разведение, которое способно вызывать растворение соответствующих бактерий.

7.4.4 Применение бактериофагов

1. Для лечения и профилактики (колибактериоз, сальмонеллез, пуллороз).

2. Для дифференциации бактериальных культур (сибирская язва, стафилококки, рожа, сальмонеллы, эшерихии). Для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования.

3. проводят индикацию патогенных бактерий во внешней среде (вода, выделениях животных, пищевых продуктов) с помощью реакции нарастания титра фага.

4. Бактериофаги имеют большое значение для промышленности, которое проявляется:

1. отрицательной ролью - фаголизис;

2. положительной ролью - в генетике и селекции промышленных продуцентов.

Умеренные фаги используются в качестве векторов для получения рекомбинатных ДНК в генной инженерии и биотехнологии.

Понятийный аппарат к теме 7 (Тезаурус)

1. Психрофилы

2. Мезофиллы

3. Термофилы

4. Стерилизация

5. Дезинфекция

6. Бактериофаги (поливалентные фаги, моновалентные, типовые)

7. Антибиотики (принципы классификация антибиотиков)

8. Бактериостатическое действие, бактерицидное действие

ЛЕКЦИЯ 8. ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ УГЛЕРОДА, АЗОТА И ДРУГИХ ЭЛЕМЕНТОВ

В процессе обмена веществ микроорганизмы осуществляют разнообразные химические реакции, в результате которых образуются спирты, кислоты, эфиры, витамины, ферменты и др. Эти продукты жизнедеятельности микробов используют в медицине, промышленности, быту. Многие биохимические процессы, вызываемые микроорганизмами, применяются в пищевой и легкой промышленности, велика роль их в круговороте веществ в природе.

Многие микробы способны к дыханию в среде, не содержащей свободного кислорода. Такой тип дыхания называется брожением. Именно брожения наиболее важны в практическом отношении. По субстрату, на который воздействуют хемоорганотрофные микроорганизмы. Все процессы можно разделить на две основные группы: превращение органических веществ, не содержащих азота (различные виды брожения и окисления); превращения органических веществ, содержащих азот (гниение).

8.1 Превращения азотсодержащих веществ (гниение; практическое значение процессов гниения)

Два процесса в природе происходят при активном участии микробов:

- синтез из минеральных веществ сложных органических соединений;

- разложение органических веществ до минеральных.

В круговороте азота с участием микроорганизмов различают следующие этапы:

1) усвоение атмосферного азота

2) аммонификация (гниение)

3) нитрификация

4) денитрификация

Различают две формы микроорганизмов способных усваивать атмосферный азот: свободно живущие азотфиксаторы (азотобактер) и клубеньковые бактерии.

Аммонификация (или минерализация азота) - это микробиологический процесс, в результате которого происходит гидролиз азотсодержащих органических веществ с образованием конечных продуктов (аммиака, сероводорода, углекислого газа и метана). Этот процесс является процессом гниения, в котором участвуют микроорганизмы, обладающие протеолитическими свойствами. В результате аммонификации почва очищается от останков животного и растительного мира - с одной стороны, и с другой стороны ведет к обогащению почвы азотистыми продуктами. Аммонификацию осуществляют бактерии, бациллы, клостридии, актиномицеты, плесневые грибы.

Следующий этап в превращении азота называется нитрификацией. В процессе нитрификации происходит окисление аммиака сначала в азотистую, а затем в азотную кислоту. Образовавшаяся азотная кислота в почве вступает в соединение со щелочами (гидроксид кальция), образуется селитра (нитрат кальция). Это минеральное удобрение. Селитры хорошо растворяются водой и усваиваются растениями.

Денитрификация - это процесс восстановления нитратов с образованием молекулярного азота, возвращающегося из почвы в атмосферу.

8.2 Превращения безазотистых органических веществ

Процесс разложения органических безазотистых соединений называется брожением. Существует много типов брожения, которые вызываются определенными видами микробов (дрожжами, молочно-кислыми стрептококками, ацетобактерами, глюконобактерами, клостридиями и др.). Наибольшее значение в промышленности имеют следующие виды брожений: спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, маслянокислое, уксуснокислое, ацетонобутиловое брожения.

Понятийный аппарат к теме 8 (Тезаурус)

1. Аммонификация

2. Нитрификация

3. Денитрификация

4. Азотобактеры (свободноживущие азотфиксаторы)

5. Брожение (спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, маслянокислое, уксуснокислое, ацетонобутиловое)

ЛЕКЦИЯ 9. ГЕНЕТИКА И СЕЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Генетика - наука о наследственности и изменчивости организмов.

9.1 Структура и функции генома микроорганизмов

Геном - носитель генетической информации. Геном прокариотной клетки находится в нуклеоиде в виде одной хромосомы, представленой громадной 2-х спиральной молекулой ДНК, включающей в зависимости от вида и размера микробной клетки от 50 до 2-3 тысяч генов. В среднем каждый ген состоит из 1000 пар нуклеотидов. Геном вируса гепатита В имеет самое маленькое число генов. Геном состоит из 4 генов и имеет молекулярную массу 1,6 Д. Геном вируса - возбудителя СПИДа представлен молекулой РНК, который состоит из 9213 нуклеотидов, образующих 9 генов. Геном бактериофагов - из 9-200 генов, у хламидий - из 400-600 генов, у риккетсий - из 1000 генов. E.coli имеет молекулярную массу 2,8 х 10 (9) Д и содержит 2500-3000 генов.

ДНК большинства растений и животных состоит из нескольких миллиардов пар нуклеотитов. Геном человека составляет 3,5 х 10 (9) пар нуклеотидов - 3,5 х 10 (6) пар генов.

Молекула ДНК является носителем генетической информации и состоит из генов, которые располагаются линейно вдоль хромосомы. Каждый ген представлен определенным участком молекулы ДНК. Специфическая информация, содержащаяся в гене, определяется последовательностью оснований в цепи ДНК. «Алфавит», с помощью которого записана эта информация ДНК, вкдючает четыре «буквы» основания: аденин, гуанин, тимин и цитозин. Гены являются функциональной единицей наследственности. В генах записана информация относительно всех свойств, присущих клетке. Каждый ген может существовать в виде ряда структурных форм - аллелей. Совокупность аллелей всех генов клетки составляет генотип. В настоящее время созданы генетические карты микроорганизмов, отражающие расположение генов на хромосоме. Бактерии гаплоидны, т.е. имеют один набор хромосом.

Возникает вопрос, каким же образом сохраняется наследственная информация при росте и размножении бактерий. Перед делением клетки происходит репликация генов (удвоение) и на каждой цепи по принципу комплементарности осуществляется синтез двух новых цепей. Таким образом, две новые цепи содержат одну родительскую и одну вновь синтезированную. Эта точная репликация ДНК гарантирует сохранение генетической информации.

ДНК, будучи носителем генетической информации, тем не менее не служит матрицей для синтеза полипептидов. Биосинтез белков происходит на рибосомах, которые свободно располагаются в цитоплазме и не никак не контактируют с ДНК.

Синтез белка идет в два этапа:

- на первом этапе происходит переписывание (транскрипция) информации с ДНК на РНК, которую именуют матричная или информационная РНК. иРНК представляет точную копию ДНК с той лишь разницей, что тимин ДНК заменен в РНК на уроцил.

- на втором этапе на рибосомах осуществляется соединение аминокислот в полипептидную цепь в порядке, определяемом триплетами мРНК (трансляция (перевод)). В этом процессе кроме мРНК и рибосом принимают участие тРНК, ряд ферментов и др.факторы. тРНК подносит триплеты (колоны), каждый из которых кодирует одну аминокислоту и таким образом осуществляется синтез определенной нуклеотидной последовательности, определяющей структуру специфического белка. К мРНК как правило присоединяется несколько рибосом и такой комплекс мРНК и рибосом называется полисомами.

Кроме того, некоторая часть генетической информации содержится вне хромосомы в цитоплазме в виде так называемой плазмиды (замкнутая в кольцо цепь нуклеиновой кислоты, состоящей не более чем из 40 триплетов и составляющую примерно 1/100 длины ДНК хромосомной). Плазмиды разнообразны по генетическим свойствам и молекулярным размерам. М.м. плазмид от 4,5 х 10 (6) до 9,4 х 10(6).

Плазмиды придают бактериям дополнительные свойства, но не обязательные. Бактерии могут терять плазмиды, но потеря не влияет на основные свойства клетки. Плазмиды имеются у многих бактерий.

Наиболее изученными являются:

- половой фактор (F);

- фактор множественной лекарственной устойчивости (R);

-фактор бактериоциногении (Col);

- плазмиды, контролирующие у E.coli синтез энтеротоксина (Hly);

- плазмиды, детерминирующие синтез поверхностных антигенов (К88, К99);

- известны плазмиды, контролирующие метаболические процессы, ферментацию углеводов, образование H2S, резистентность к действию тяжелых металлов (ртути) и др.

Например: плазмида бактериоциногении контролирует( детерминирует) синтез белковых веществ колицинов (антибиотических веществ), которые подавляют рост и размножение чувствительных к ним бактерий (близкородственных).

Впервые способность выделять колицины установлена в 1925 г. Gratta у штамма E.coli, поэтому феномен получил название колициногении и плазмида - Col. Другие многие бактерии также выделяют белклвоподобные вещества, летальные для близких видов. Вещества эти называют - бактериоцины, феномен - бактериоциногении (туберкулоцины, пестицины, вибриоцины). Колицины, адсорбируются на чувствительных клетках (лишенных -Col-фактора), не проникают внутрь клетки, вызывают нарушение метаболизма, приводят клетку к гибели.

У бактерий может быть одновременно до 4 плазмид.

Плазмиды (F-фактор) способные интегрировать в хромосому и реплицировать вместе с ней получили название эписом.

Практическое применение плазмид. Плазмиды обладают способностью передаваться от бактерий при конъюгации. Их называют конъюгативными. Внедряясь в клетку реципиента, коньюгативные плазмиды сообщают ей свойства донора. Это свойство применяется при создании новых штаммов - продуцентов полезных веществ.

Таким образом, геном и плазмида обуславливают все фено- и генотипические свойства микроорганизмов.

Функции генома - сохранение генетического постоянства ДНК, проявление внешних признаков.

9.2 Типы изменчивости у микроорганизмов

Наследственность бактерий - свойство микробов, обуславливающее воспроизводства одних и тех же морфологических и других свойств в ряде поколений, а также обуславливает специфический характер индивидуального развития.

Изменчивость - свойство противоположное наследственности. У бактерий она может осуществляться путем изменения генотипа ( мутации генов, различным сочетанием генов двух бактерий при рекомбинациях) и фенотипа (различным проявлением признаков, зависящих от внешних условий - модификационная изменчивость).

У бактерий различают фенотипическую и генотипическую изменчивость. К фенотипическим изменениям относят адаптацию и модификацию.

Адаптация - приспособление микроорганизмов к условиям среды. Приспособленные клетки размножаются (при действии антибиотиков), а остальные погибают, то есть происходит естественный отбор.

В геноме бактерий всегда имеются запасные возможности, т.е.гены, определяющие выработку адаптивных ферментов.

Например, кишечная палочка, растущая на среде, не содержащей углевод лактозу, не вырабатывает фермент лактазу, но если пересеять культуру на среду с лактозой, то она начнет вырабатывать этот фермент. Адаптивные ферменты позволяют микробам приспосабливаться к определенным условиям существования.

Модификации - изменение микроорганизмов под влиянием условий среды. Изменяются только внешние (фенотипические) признаки клетки (форма, размеры).

Так, добавление в среду глицерина и аланина вызывает полиморфизм у холерного вибриона. При добавлении среду кальция хлорида клетки кишечной палочки сильно укорачиваются. После удаления этого вещества из среды палочки вновь принимают исходную форму.

Изменениям подвержен и генотип. Генотипическая изменчивость играет большую роль в эволюции микроорганизмов. Если бы клетки не обладали способностью к изменению генотипа, то любое неблагоприятное изменение условий среды привело бы к вымиранию вида.

Например, появление бактериофагов в культуре вызвало бы полную гибель ее, если бы гены, определяющие фагочувствительность, не подвергались изменениям и клетки в силу этого не приобрели свойство фагорезистентности.

В основе генетической изменчивости лежат мутации и рекомбинации. Они происходят в генетическом аппарате клетки - в ДНК и проявляются стабильностью изменения каких-либо свойств.

Мутации (mutacio - изменение) характеризуются изменением последовательности нуклеотидов в ДНК, возникающие под влиянием эндогенных факторов или при действии химических и физических факторов (мутантов).

Измененнные бактерии называются мутантами. Мутации приводят к стойким передающимся по наследству изменениям свойств бактерий. Мутации делятся на две группы:

1. Мутации спонтанные

2. Мутации индуцированные

Мутации спонтанные - происходят в природе, независимо от воли и деятельности человека.

Например от действия радиоактивных элементов. Примером спонтанным мутаций возникающих при культивировании бактерий может быть феномен диссоциации, т.е. разъединение бактерий и возникновение S- и R- форм. Есть и переходные формы: М-(слизистая) и О-(переходная) формы. Следует отметить, что большинство патогенных бактерий имеют S-форму, R-формы являются слабовирулентными.

Однако такие бактерии как возбудители сибирской язвы и туберкулеза патогенны в R-форме.



Свойства клеток колоний S- и R-форм

S-форма	R-форма
Колонии прозрачные, с гладкой блестящей поверхностью, круглые, с ровными краями, выпуклые	Колонии шероховатые, неправильные с неровными краями, часто морщинистые
Подвижные виды имеют жгутики	Жгутики часто отсутствуют
У капсульных видов хорошо видна капсула или слизистый слой	Капсулы или слизистый слой отсутствуют
Биохимически более активны	Биохимически менее активны
У патогенных видов выражены вирулентные свойства	Слабовирулентные или авирулентные
Полноценны в антигеном отношении	Неполноценны в антигеном отношении
Чувствительны к фагу	Слабочувствительны к фагу
Взвесь клеток в физиологическом растворе гомогенная, стойкая. Клетки нормальных размеров	Взвесь быстро оседает. Осадок крошковидный, клетки полиморфные.

Мутации индуцированные - такие изменения генотипа, которые происходят путем определенных воздействий на бактерию различными мутагенами, для получения клеток с заранее заданными свойствами.

Примеры. Одним и з первых, кто изучал изменчивость у бактерий основных при знаков был Л.Пастер. Он показал как можно ослабить вирулентные свойства у микробов под влиянием физических, химических и биологических факторов.

Так Луи Пастер в 1881 г. приготовил вакцину против сибирской язвы. Он выращивал возбудителя при температуре -42,5С (вместо 37С) в течение 12 и 24 дней, что привело к снижению патогенности.

Таким же образом была получена вакцина против бешенства в 1885 г. путем 133 последовательных заражений кроликов интрацеребрально. Тем самым он ослабил вирус для людей. При подкожном введении предупреждал у покусанных бешество (фиксированный вирус - virus fixe). Мутация при пассаже на кроликах.

Пассаж самая распространенная форма индуцированной мутации применяемой на практике для получения вакцин. (Пассаж - это многократные пересевы микробов. Мутации при пассажи -пересев в системах культивирования не свойственных данному микроорганизму в природе).

Путем мутации при пассаже на искусственной питательной среде была получена вакцина против туберкулеза. Кальмет и Герен во Франции в 1919 г. путем длительных пассажей на картофельной среде с желчью и глицерином, при Т-38 С значительно снизили патогенные свойства возбудителя туберкулеза бычьего вида.

Таким образом полученный штамм был назван вакциной БЦЖ (BCG - от фр.: Bacilla Calmet -Geren)/

Мутации могут быть точечными, которые затрагивают только одну пару нуклеотидов и могут быть мутации-абберации - они затрагивают изменение двух и более пар нуклеотидов в структуре генома.

Точечные мутации могут происходить в результате: замены пары нуклеотидов, в результате выпадения (делеции) пары нуклеотидов, или в результате вставки пары нуклеотидов. Самая легкая мутация это замена. Изменения происходят только в одном триплете, т.е. изменяется кодировка только одной аминокислоты.

Мутация замены не всегда приводит к изменением фенотипа бактерий. Это обусловлено эффектом вырожденности генетического кода, когда одна и та же аминокислота может кодироваться не одним, а несколькими триплетами. Генотип изменяется.

Делеция и вставка - это сложные мутации, так как одновременно меняется кодировка всех последующих аминокислот. Образуются другие белки. (Плакат)

Мутации абберации - занимают большое место. Они могут происходить в результате замены, вставки и выпадения двух и более пар нуклеотидов, а также в результате инверсии. Это такая мутация, когда часть нуклеотидной последовательности в составе нуклеиновой кислоты разворачивается на 180С.

Мутации могут иметь различные последствия для бактерий. В некоторых случаях меняется генотип, фенотипические свойства. В других случаях, когда нарушатся синтез жизненно важного белка, мутация является летальной. Мутация может быть условно летальной, если жизненноважный белок сохраняет свою функцию только при определенных условиях внегней среды (температура 37-40С).

Мутации по механизму действия могут быть прямыми и обратимыми. Прямые мутации изменяют фенотип, а обратимые мутации (реверсии) востанавливают его до такого состояния, каким он был перед прямой мутацией (L-формы бактерий - утрачивают клеточную стенку под воздействием различных факторов).

Мутагены - факторы, ведущие к проявлению мутации. Они бывают физической, химической, биологической природы.

1. Физические мутагены.

ь Повышенная температура до 40-50 С. Она способствует удалению пуринового основания - гуанина из цепочки ДНК. На его место может встать любое азотистое основание.

ь УФО, рентгеновские лучи способствуют изменению химической структуры пиримидиновых оснований (аденин, тимин). Под воздействием этих лучей увеличивается внутримолекулярная энергия пиримидиновых оснований и между двумя соседними молекулами пиримидиновых оснований образуются мостики - ковалентные связи. Образуется димер, который не может играть никакой информативной роли.

2. Химические мутагены.

ь Первая группа - это вещества, которые реагируют с нуклеиновой кислотой только во время ее репликации. Такие химические веществ, а по своей структуре сходны с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, но не несут никакой информации и если в момент репликации ДНК такие вещества окажутся в нуклеоиде, они могут встать в структуру ДНК на место нуклеотидов.

ь Вторая группа - это такие химические вещества, которые вступают в реакцию с покоящейся молекулой ДНК, но для проявления мутации необходима последующая репликация ДНК.

Таким образом мутации классифицируются:

По локализации различают мутации:

1. Генные (точечные)

2. Хромосомные

3. Плазмидные.

По происхождению мутации могут быть:

1. спонтанными ( образующиеся самопроизвольно и без видимого внешнего воздействия);

2. индуцированными (проявляющиеся в результате обработки микробной популяции мутагенными агентами).

По направлению мутационного изменения мутации подразделяются на:

1. Прямые (возникают в геноме «дикого типа» у бактерий в естественных условиях обитания. Образовавшиеся особи являются мутантами).

2. Обратные (завершающиеся возвратом от мутантного типа к дикому).

3. Одной из форм мутации является диссоциация (мутация, в результате которой в популяции микроорганизмов возникают особи, отличающиеся от исходных внешним видом и структурой колоний, так называемые -S-формы и R-формы).

9.3 Трансформация, трансдукция, коньюгация

Генетические рекомбинации возникают в результате обмена генетичеким материалом между бактериями. Получаются рекомбинанты, обладающие свойствами обоих родителей. Рекомбинации осуществляются путем трансформации, трансдукции, коньюгации.

Трансформация - вставка в струкрупу генома реуипиентной бактерии свободного участка ДНК из среды, целого генома или части генома другой бактерии (донорной) из среды. В результате трансформации образуется полиплоидная бактерия.

Коньюгация - замена участка генома одной бактерии соответствующим участком генома другой бактерии при непосредственном контакте (половое разхмножение у бактерий).

Трансдукция - вставка в геном бактерий чужеродной генетической информации, главным образом вирусов (бактериофагов).

9.4 Генетическая инженерия

Изучение генетики микроорганизмов позволило конструировать рекомбинантные молекулы ДНК вне живой клетки (70-е г.20ст.)

Молекулярная генетика (50-60г.20ст)

Биотехнология -на стыке микробиологии, генетики и молекулярной биологии. Биотехнология использует методы генетической и клеточной инженении для получения биологических веществ с заданными свойствами по производству антибиотиков, витаминов, вакцин, моноклональных антител, диагностикумов.

Генетическая система бактерий имеет четыре особенности, присущие только им.

1. Хромосомы бактерий, располагаются свободно в цитоплазме, не имеющие мембран, но связаны с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране.

Хромосома у E.coli мм, т.е. во много раз превышает длину бактериальной клетки (1,5-3мкм в среднем).ДНК компактным образом упакована, в виде спирали свернута.

2. Бактерии являются гаплоидными организмами, т.е. имеют один набор генов, которые определяют все основные свойства организма. Содержание ДНК у них не постоянно (при благоприятных условиях ДНК по массе может соответствовать 2, 4, 6 - 8 хромосомам). У всех других живых существ содержание ДНК постоянное, и оно удваивается перед делением.

3. У бактерий в естественных условиях передача генетической информации происходит не только по вертикали, т.е. от родительской клетки дочерним, но и по горизонтали с помощью различных механизмов: конъюгации, сексдукции, трансдукции, трансформации. Практическое применение.

4. У бактерий кроме хромосомного генома имеется дополнительный плазмидный геном, наделяющий их важными биологическими свойствами, нередко - специфическими (приобретенными) иммунитетом к различным антибиотикам и др. химиопрепаратом.

Понятийный аппарат (тезаурус) к теме 9

1. Геном

2. Плазмида

3. Фенотипическая изменчивость (адаптация, модификация)

4. Генотипическая изменчивость (мутации, рекомбинации)

5. Мутации (спонтанные, индуцированные, прямые, обратные (реверсионные), генные (точечные), хромосомные (мутации-абберации), плазмидные, диссоциация)

6. Пассаж

7. Рекомбинативная изменчивость (трансформация, трансдукция, конъюгация)

8. Генетическая инженерия



Вопросы для самоконтроля

1. Сформулируйте цели и задачи генетики микроорганизмов.

2. Что вы понимаете под термином «ген»?

3. Что вы понимаете под термином «диссоциация культуры»?

4. Что означает термин «фенотипическая изменчивость»?

5. Что означает термин «генотипическая изменчивость»?

6.Что вы понимаете под термином «мутация»?

7.Что такое трансформация, трансдукция, конъюгация?

8. Что такое колицины (бактериоцины)?

9. Что такое «плазмиды»?

10. Назовите задачи, которые решает генетическая инженерия.

ЛЕКЦИЯ 10. ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ

10.1 Определение понятий «инфекция», «инфекционный процесс», «инфекционная болезнь»

Инфекция (по Богданову) - сложный биологический процесс, возникающий в результате проникновения патогенных микробов в организм и нарушения постоянства его внутренней среды.

Инфекция (лат.infectio - впитывание, заражение) - состояние зараженности, при котором развивается эволюционно сложившийся комплекс биологических реакций взаимодействия макроорганизма и патогенных микроорганизмов.

Инфекционный процесс - динамика реакций взаимодействия микро- и макроорганизмов.

Наиболее яркой формой проявления инфекции является инфекционная болезнь.

Отличия инфекционной болезни от неинфекционной.

1. Инфекционная болезнь вызывается определенным патогенным возбудителем.

2. Заболевший организм становится источником возбудителя инфекции.

3. В больном организме образуются антитела. Он становится невосприимчивым к повторному заражению

4. Контагиозность.

5. Цикличность в развитии инфекционной болезни (инкубационный период, период предвестников, разгар болезни, исход болезни).

Чтобы возникла инфекционная болезнь возбудитель должен обладать патогенностью и вирулентностью.

Типы биотических взаимоотношений микроорганизмов с макроорганизмами

а) мутуализм

в) комменсализм

с) паразитизм

10.2 Патогенность и вирулентность микробов

Патогенность - видовой генетический признак микроорганизма, его потециальная возможность вызывать при благоприятных условиях инфекционную болезнь. - Патогенные, условно-патогенные и сапрофиты.

Вирулентность - это степень патогенности конкретного микроорганизма. Вирулентным считается тот микроорганизм, который даже в исключительно-малых дозах приводит к болезни.

Факторы вирулентности. инвазивные и 2. токсигенные

Инвазивные факторы - капсула, ферменты (гиалуронидаза, нейроминидаза), жгутики и другие химические компоненты.

Токсигенные факторы - токсины микроорганизмов: экзотоксины и эндотоксины.

10.3 Иммунитет. Виды иммунитета

Иммунология. История развития иммунологии. Иммунология - наука об иммунитете. Она изучает проявление, механизмы и способы управления иммунитетом, а также разрабатывает иммунологические методы диагностики, лечения и профилактики болезней человека и животных.

Давно было известно, что человек перенесший опасную заразную болезнь, как правило, второй раз ею не болеют. Об этом писал около 460-400 лет до н.э. в своей «Истории» древнегреческий историк Фукидид. Описывая, Пелопоннесскую войну он отмечал, что во время эпидемии никто дважды не заболел и что уход за больными осуществляли переболевши.

Эти наблюдения люди использовали, чтобы обезопасить себя от заразных болезней таких как оспа. В Китае еще в 11 веке до н.э. оспенные корочки (струпья) растирали в порошок и вносили в нос. В Индии натирали кожу до ссадин и прикладывали к ней ткань, пропитанную оспенным гноем.

В результате развивалась легкая форма оспы. Этот метод предупреждения заболевания назван вариоляцией. Он использовался до 18 века н.э.

Однако, этот метод был далеко не безопасен, так как мог вызвать и тяжелые формы оспы. Тем не менее вариоляция наглядно доказала возможность исскуственного воспроизведения иммунитета, путем перенесения заболевания в легкой форме и подготовила общественную мысль к восприятию идеи вакцинации, предложенной в 1798г. английским врачом Э.Дженнером (1749-1823). Он заметил, что люди переболевшие коровьей оспой, не болеют натуральной оспой. Во время эпидемий оспы чаще всего не заболевали оспой доярки.

Известно, что оспа у коров протекает с поражением кожи, чаще кожи сосков и вымени с образованием оспенных пустул. У доярок пустулы образуются на руках. Дженнер пришел к выводу, что после заражения и переболевания коровьей оспой люди становятся невосприимчивыми к заражению человеческой оспой.

В подтверждение этого Дженнер привил в 1976г. мальчику Джеймсу Фипсу коровью оспу - вакцину (от лат. Vacca - корова), а спустя 1,5 месяца оспу человека, и мальчик не заболел.

Его метод быстро распространялся. Через два года было привито более 100000 человек. В России первая прививка против оспы по методу Дженера была сделана в 1801 г. мальчику из сиротского дома Антону Петрову, получившему после этого фамилию Вакцинов.

Однако Дженнер не увидел в открытом им способе борьбы с оспой принципа предохранения от других инфекционных болезней. ОткрытиеДженнера мало способствовало развитию иммунологии, так как нужно было знать природу заразных болезней.

Основоположником современной научной иммунологии признан Луи Пастер. Так,в 1881г. Л.Пастер сообщил, что куры зараженные ослабленным возбудителем холеры кур, становятся невосприимчивыми к заражению вирулентными культурами. Его опыты с возбудителями куриной холеры, сибирской язвы и бешенства доказали возможность искусственного получения вакцин.

Пастер в честь первооткрывателя предохранительных прививок против оспы Дженнера назвал ослабленные культуры возбудителей вакцинами. В дальнейшем было установлено, что иммунитет можно создавать и убитыми микроорганизмами, а также токсинами, выделяемыми микробами.

Таким образом, Л.Пастер научно обосновал основной принцип борьбы с инфекционными болезнями - создание искусственного иммунитета против них.

К концу 19 и в начале 20 столетия были сделаны многие открытия, создавшие научный фундамент иммунологии.

- И.Мечников открыл фагоцитоз в 1883 г. и ввел понятие «клеточный иммунитет»

- П. Эрлих развил гуморальную теорию иммунитета в эти же годы. В 1908 г. им была вручена Нобелевская премия за выдающиеся открытия по иммунитету.

Крупнейшим обобщением последних лет явилось выделение двух независимых, но совместно функционирующих клеточных популяций в иммунном ответе Т- и В-лимфоцитов.

Иммунология состоит из двух больших взаимосвязанных разделов. Первый раздел - учение об иммунной системе организма, т.е о той реагирующей системе, которая обеспечивает распознавание генетически чужеродных веществ.

Иммунная система обеспечивает иммунитет - защиту от бактерий, вирусов, паразитов; элиминацию отмирающих и мутационно изменившихся собственных клеток тела.

Второй раздел - учение об антигенах, их свойствах и структуре, которые включают иммунную систему организма.

Иммунология делится на общую и частну. К числу направлений общей иммунологии относят молекулярную иммунологию, иммуноморфологию, иммуногенетику, иммунохимию, эволюционную иммунологию.

К направлениям частной иммунологии относят иммунопрофилактику инфекционных болезней, клиническую иммунологию, иммунологию репродукции и эмбриогенеза, иммунопатологию, иммуноонкологию, трансплантационную иммунологию.

Развитию ветеринарной иммунологии способствовали труды виднейших ученых Н.Н.Гинсбурга, С.Н.Вышелеского, А.А. Владимирова, С.Г.Колесова, Я.Е. Колякова, С.Я. Любашенко и др.

Задачи иммунологии:

1. Создание новых и совершенствование имеющихся вакцин, сывороток и диагностикумов

2. Изучение и профилактика иммунных болезней

3. Расширение исследований в области неинфекционной иммунологии( возрастная иммунология, иммунология размножения, неспецифические механизмы резистентности).

Иммунитет (от лат. Immunitas - освобождение или избавление от чего-либо) - состояние невосприимчивости организма к воздействию патогенных микробов, их токсинов и других чужеродных веществ биологической природы.

Иммунитет - это способ защиты от тел и веществ, несущих признаки генетической чужеродности. Таким чужеродными веществами могут быть патогенные бактерии, чужеродные белки, липополисахариды, полисахариды, собственные измененные клетки, т.е. организмы человека и животных точно дифференцируют «свое» и «чужое» и осуществляют защиту против них.

...