Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти і науки україни

Дніпропетровський національний університет

імені Олеся Гончара

Факультет біології, екології та медицини

Кафедра мікробіології, вірусології та біотехнології

Дипломна робота бакалавра

на тему: Дослідження властивостей генноінженерних білків - потенційних компонентів вакцин

Виконав: студент ІV курсу, групи ББ-12-3

напряму підготовки 6.040102 «Біологія» Резніченко Р.І.

Керівник д.б.н., професор Вінніков А.І.

Рецензент к.б.н., доцент Кириченко С.В.

Допускається до захисту:

зав. кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології,

докт. біол. наук, професор Вінніков А.І.

Дніпропетровськ, 2016

Реферат

Дипломна робота: 53 с., 1 табл., 9 рис., 57 джерел.

Метою дипломної роботи було вивчити умови продукування рекомбінантного Кор-білку вірусу гепатиту С трансформованими клітинами E. coli.

Об'єктом досліджень була здатність модифікованих штамів E. coli codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG до продукції Кор-білка, що є антигеном, придатним для створення вакцини проти гепатиту С.

Методи досліджень - бактеріологічні (трансформація), фізико-хімічні (електрофорез, афінна хроматографія), імунологічні (ІФА).

Одержані результати та їх новизна: встановлено, що найбільш ефективне очищення Кор-білка можливе з використанням афінної хроматографії на колонці з Ni-NTA-агарозою: максимум очищеного білка виходить у 3-й фракції з отриманих при елюції буфером В.

Отримані результати є науковою основою для розробки схеми отримання рекомбінатного Кор-білка для розробки вакцини проти вірусу гепатиту С.

Ключові слова: ВІРУС ГЕПАТИТУ С, КОР-БІЛОК, ТРАНСФОРМАЦІЯ, ОЧИЩЕННЯ, ВАКЦИНА

Resume

The graduation research of 4 year student (Oles Honchar DNU, Department of Microbiology, Virology and Biotechnology) devoted to creation of producent of rec-Core-protein of Hepatitis C virus.

The aim of research was to study the conditions of production of Core-protein of Hepatitis C virus by transformed cells of E. coli.

Object of research was ability of modified strains of E. coli to product the Core-protein, that is an antigen, can use in creation of vaccine against Hepatitis C virus.

Methods of research: bacteriological (transformation), physics-chemical (electrophoresis, affine chromatography), immunological (ELISA).

Results of research: it was determine that most effective purification of Core-protein was possible by method of affine chromatography on Ni-NTA-agarose-column: maximal rate of purified protein came in 3^rd fraction from got during the elution by B-buffer.

Results, that are got, can be use by medicals and microbiologists.

Key words: HEPATITIS C VIRUS, CORE-PROTEIN, TRANSFORMATION, PURIFICATION, VACCINE.

Pages 50, bibliogr. 52, tables 1, ill. 9.

Зміст

• Вступ
• 1. Генно-інженерні вакцини
• 2. Характеристика вірусу гепатиту С
• 2.1 Загальні відомості
• 2.2 Кор-білок та ініші оболонкові білки ВГС
• 2.3 Неструктурні білки
• 3. Методи отримання генноінженерних продуктів ВГС
• 3.1 Отримання відповідного фрагменту нуклеїнової кислоти
• 3.2 Трансформація клітин E. coli плазмідними векторами
• 4. Експериментальна частина. Матеріали та методи досліджень
• 4.1 Характеристика об'єкту досліджень
• 4.2 Приготування поживних середовищ
• 4.3 Отримання компетентної культури E. coli штамів codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG
• 4.4 Трансформація компетентних клітин E. сoli codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG плазмідою pET15b core та індукція експресії цільового рекомбінантного Кор-білка
• 4.5 Проведення електрофорезу
• 4.6 Отримання біомаси модифікованих культур
• 4.7 Отримання рекомбінантного Кор-білка
• 4.8 Проведення імуноферментного аналізу
• 5. Результати та їх обговорення
• 5.1 Створення штамів та перевірка активності синтезу
• 5.2 Результати очищення рекомбінантного Кор-білка ВГС
• 5.3 Результати імуноферментного аналізу
• Висновки
• Перелік посилань

Вступ

Проблема штучних вакцин у високому ступені актуальна навіть стосовно переможених інфекцій (віспи, поліомієліту, кору та деяких інших). Під словом «переможені» маються на увазі ті інфекції, проти яких створені високоефективні вакцини. Водночас, використовувані у повсякденній практиці вакцини, проти таких інфекцій - це малоконтрольована сверхкомплексна суміш з величезною кількістю баластних, у тому числі високотоксичних, забруднюючих компонентів з мікробних клітин, живильного середовища і клітин еукаріот, на яких вирощуються віруси.

Необхідними для формування імунітету є 1-2 антигенні детермінанти, а вводиться в організм сотня найскладніших комплексів. Звідси виникають важкі реакції, ускладнення, алергізація щеплених. Отже, сучасна генна інженерія стоїть перед проблемою оптимізації штучних вакцин, їх нешкідливості та створенні єдиного багатокомпонентного препарату.

Найвищого ступеня актуальності проблема штучних вакцин досягає в області створення ефективних препаратів проти ще непереможених інфекцій, серед яких однією з найбільш важливих вважається гепатит С.

Вакцина проти гепатиту С до теперішнього часу не створена. Одна з основних причин - недостатня вивченість захисних механізмів вродженого і адаптивного імунітету в ході взаємодії ВГС і імунної системи господаря. Складність розробки вакцини полягає у високій гетерогенності ВГС і здатності вірусу уникати імунної відповіді господаря.

Основним підходом до створення вакцин проти гепатиту С сьогодні є використання індивідуальних рекомбінантних білків, окремих пептидів або ділянок геному ВГС в складі ДНК-конструкцій [3].

Показано, що в перший місяць гострої фази гепатиту С, коли вміст антитіл незначний, тільки кількість кор-білка збільшується настільки ж швидко, як і вірусної РНК. Кількісний аналіз вмісту кор-білка не виявив відмінностей у майбутніх реконвалесцентів і хроніків. Після 6 місяців гострого гепатиту С швидкість накопичення РНК і кор-білка починає зменшуватись. Майже всі пацієнти, що одужали від гострого гепатиту С, мають довічно антикор-антитіла, ймовірно, через високу імуногенність цього білка, що робить його одним з найбільш перспективних компонентів для потенційної вакцини.

Метою дипломної роботи було вивчити умови продукування рекомбінантного Кор-білка вірусу гепатиту С трансформованими клітинами E. coli.

Відповідно до мети були поставлені наступні завдання:

створити штам продуценту рекомбінантного білка core;

здійснити індукцію експресії цільового рекомбінантного білка;

провести накопичення рекомбінантного білка core та його очищення;

визначити властивості отриманого рекомбінантного білка та встановити можливість його використання для діагностики і моніторингу вірусного гепатиту С.

Огляд літератури

1. Генно-інженерні вакцини

Досягнення молекулярної біології і генетики дозволили цілеспрямовано маніпулювати фрагментами нуклеїнових кислот і отримувати різні комбінації спадкового матеріалу. В основі цих досягнень лежать універсальність генетичного коду, можливість отримувати в ізольованому вигляді фрагменти генів і нуклеїнових кислот, синтезувати ex vivo фрагменти нуклеїнових кислот і об'єднувати їх в єдине ціле [7].

Таким чином, зміна спадкових властивостей організму за допомогою генної інженерії зводиться до конструювання з різних фрагментів нового генетичного матеріалу, введення цього матеріалу в реципіентний організм, створення умов для його функціонування і стабільного спадкування [7]. Створення генно-інженерних вакцин зводиться до цілеспрямованого отримання рекомбінантних бактерій або вірусів, нешкідливих для макроорганізму володіючих високою імуногенністю та активуючих тривалий протективний імунітет. Можлива зворотня ситуація - штучне аттенуювання, коли з генома бактерії або вірусу видаляють фрагменти ДНК, що визначають їх вірулентність і патогенність [2,3]. При збереженні протективних властивостей штучно атенуйовані бактерії і віруси можуть бути вакцинними препаратами або слугувати основою для отримання рекомбінантних вакцин. Крім того, генно-інженерна технологія дозволяє отримувати рекомбінантні суб'единичні вакцини, які виділяються в зовнішнє середовище штамами продуцентами - дріжджовими клітинами або Е. coli [12].

Існує кілька методів отримання генно-інженерних конструкцій. Найбільшого поширення набули плазмідна технологія клонування генів і фаговий метод. При клонуванні генів цільовий фрагмент ДНК, який контролює утворення певних білків, виділяють, вводять в різні бактерії і розмножують (ампліфікують). Завдяки клонуванню генів з'явилася можливість отримувати у великих кількостях білки, що визначають вакцинну конструкцію [30]. Ця технологія заснована на такому принципі: крім своєї власної кільцевої хромосоми, бактерії часто містять плазміди. Плазмідну ДНК можна виділити і розщепити відповідною рестриктазою тільки в одному сайті, перетворивши кільцеву молекулу в лінійну, з «липкими» кінцями. Далі фрагменти будьякої чужорідної ДНК з такими ж липкими кінцями можна зшити з плазмідної ДНК за допомогою лігази. Рекомбінантну конструкцію вводять потім у бактерію, де вона реплікується. При отриманні рекомбінантних вакцин в якості джерела екзогенної ДНК можна використовувати бактеріальну, вірусну ДНК, а також ДНК, отриману з клітин людини, або штучно синтезовані гени [2,7].

Крім бактеріальних плазмід в якості векторів (носіїв) ДНК використовують фаги. Частина геному цього фага не обов'язкова для його розмноження в бактерії. Замість нього можна ввести чужорідну ДНК, яка буде розмножуватися разом з фаговою після інфікування бактерій [7].

Для створення векторних живих вірусних вакцин використовують атенуйований ДНК-вірус, в геном якого вбудовується необхідний клонований ген. Вірус - носій вектора - активно розмножується, а продукт вбудованого гена забезпечує формування імунітету. Вектор може містити кілька вбудованих генів, що відповідають за транскрипцію і трансляцію відповідних чужорідних антигенів [12].

За принципами конструювання і носія вектора рекомбінантні вакцини можуть бути розділені на обмежене число груп:

1) генно-інженерні білкові рекомбінантні конструкції;

2) гетерологічні бактерії або віруси, які використовуються як носії відповідних векторів;

3) штучно атенуйовані, високоімуногенні штами, що містять протективні антигени, з генома яких вилучені гени, що визначають вірулентність і токсичність;

4) вірусоподібні конструкції, позбавлені генома;

5) генетичні конструкції що включають імуногенну складову і компонент, що визначає інші властивості.

Генно-інженерні білкові рекомбінантні конструкції.

Генно-інженерні рекомбінантні конструкції, з одного боку, самі можуть бути досить ефективними вакцинами і, з іншого боку, створення таких конструкцій є етапом для побудови вектора і отримання живої атенуйованої вакцини. Зокрема, для профілактики туберкульозу використовували генно-інженерну конструкцію з двох секретуємих у середовище протективних антигенів - А85 і Е8АТ6. Генно-інженерна конструкція, Е8АТ6-85В, в поєднанні з синтетичним ад'ювантом 1С31 викликала у мишей і мавп тривалу імунну відповідь і захищала від аерозольного зараження [44]. Надалі її використовували для отримання живої атенуйованої вакцини гВСО-Е8АТ6-85В [54].

Гетерологічні бактерії або віруси, які використовуються як носії відповідних векторів

При конструюванні вакцин на основі вірусів найбільш часто використовують аденовірус людини серотипу 5, аденовірус шимпанзе серотипу 63 (АД5, 63), вірус везикулярного стоматиту (ВВС) і цитомегаловірус (ЦМВ) [37].

Вакцинація проти Р. falciparum знизила захворюваність і смертність серед дітей у віці до 5 років. В даний час використовують конструкції на основі серотипу АД5. Крім того, сконструйована вакцина на основі не реплікуючогося в людському організмі аденовірусу шимпанзе серотипу 63 [38].

Спочатку АД5 використовувався як терапевтичний трансген для лікування генетичних дефектів [46]. Однак унікальна здатність АД5 викликати стійку імунну відповідь навіть при імунодефіцитних станах зробила АД5 дуже привабливим для створення на його основі векторів для генно-інженерних вакцин [33], зокрема для профілактики геморагічної лихоманки, викликаної вірусом Ебола (ЕБОВ). Вакцинація рекомбінантної конструкцією АД-ZGP [глікопротеїн оболонки Zaire ebolavirus (ZEBOV)] мишей, морських свинок і шимпанзе викликала стійкий прогектівний ефект при летальному зараженні [46, 38, 54]. Проводились клінічні випробувань на добровольцях. Отримані дані показали високу імуногенність вакцини NCT00374309 [29].

Атенуйований штам ВВС традиційно служив вектором для створення рекомбінантних вакцин, використовувався в якості основи для експресії поверхневого глікопротеїну ЕБОВ. Дану конструкцію використовували в експерименті на лабораторних тваринах як в профілактичних, так і в лікувальних цілях [13, 23]. Впровадження зазначеної вакцини не пізніше ніж через 24 годин після летального зараження вірусом призводило до 50 і 100%-го виживання морських свинок і мишей відповідно, хоча 50%-вий захист макак дана вакцина забезпечувала тільки при введенні не пізніше 20-30 хв [25]. Конструкція на основі ВПС-VSVDeltaG / ZEBOVGP була ефективна у мавп, інфікованих вірусом імунодефіциту мавп [2].

Промотор негайних ранніх генів (IEG) ЦМВ має високий рівень експресії в різних клітинах ссавців. Цей елемент широко використовується для створення генно-інженерних векторів [10]. Для оптимізації трансляції промотор негайних ранніх генів ЦМВ був використаний для отримання ефективної вакцини до вірусу Ебола на основі аденовірусу V типу (AD-CMVZGP) [15].

Штучно атенуйовані, високоімуногенні штами, що містять протективні антигени, з генома яких вилучені гени, що визначають вірулентність і токсичність

Резистентність до патогенних бактерій E. coli визначається інтенсивністю імунної відповіді до фактору колонізації (CFA). Для профілактики інфекції, викликаної ЕТЕС, вакцина повинна являти собою лінію, що експресують загальний CFA. Раніше б то показано, що вакцина-кандидат (PTL003), токсин-негативний штам ЕТЕС, лінія El392 / 75 мали загальний фактор колонізації CFAIІ [50]. Даний штам ніс мутації делеції в генах aroC, оmрС і ompF. При вакцинації волонтерів він викликав інтенсивну і стійку імунну відповідь. Подібно до описаного, на основі штаму ЕТЕС, лінії WS1858, експресуючого CFA1 був створений чутливий до антибіотиків, що несе мутації делеції в генах агоС, оmрС і ompF штам АСАМ2010, який тепер розглядається як найважливіший компонент живої атенуйованої вакцини. Поділ певних ділянок хромосом був проведений за допомогою нового суіцидального вектора - pJCB12, що призвело до втрати здатності АСАМ2010 продукувати IT [10,12,14]. Даний штам викликав як системний, так і мукозальний імунітет.

Вірусоподібні конструкції, позбавлені генома.

Вірус папіломи людини (ВПЛ) грає важливу роль у розвитку фонових і передракових захворюваннях шийки матки і є облігатним фактором розвитку аденокарцином генітального тракту. За даними Міжнародного агентства з дослідження раку (IARC), щорічно у всьому світі реєструється понад 500 тис. випадків раку шийки матки та 270 тис. смертей. Найбільше число випадків зареєстровано у Латинській Америці і Субсахарній Африці - більше 30 випадків на 100 тис. населення. Саме в цих країнах була переконливо доведена ефективність вакцини нового типу - вірусоподібної частки. Вона являє собою сферичний капсид ВПЛ, з якого вилучено дволанцюжкову ДНК і збережено пізні структурні білки L1 та L2 [15,28].

При природному зараженні значущий рівень антитіл до ВПЛ визначається тільки у 50% жінок. Тим часом антитіла до ВПЛ грають ключову роль в запобіганні інфікування [15,28]. Це послугуло підставою для розробки вакцин з домінантними антигенами L1 і L2. Носієм цих антигенів слугували вірусоподібні частки. Необхідно відзначити, що обов'язковим компонентом даної вакцини є спеціально розроблений ад'ювант. Крім гідроксиду алюмінію, він містить монофосфорилліпід А, отриманий з Salmonella minisotae [10]. Це дозволило відповідно до сучасної стратегії отримання ефективних вакцин ввести в конструйовану структуру компоненти, що стимулюють як специфічний, так і вроджений імунітет. В даний час широко використовуються дві вакцини «Гардасил» і «Церварикс».

Вірусоподібні конструкції апробовані в експерименті і при індукції антитіл до інших структур, зокрема до хемокінового рецептора CCR5, що грає певну роль в прикріпленні ВІЛ до клітини [13].

Генетичні конструкції що включають імуногенну складову і компонент, що визначає інші властивості.

Розробка вакцин для профілактики інфекцій, при яких протективний ефект залежить від інтенсивності клітинного імунітету, визначила впровадження нових генетичних конструкцій. В даний час реалізований ще один підхід в отриманні конструкцій на основі BCG. Зокрема, використовуються вектори, в які вбудовані не тільки гени, які контролюють синтез протективних антигенів, але і гени, що кодують різні цитокіни, що визначають розвиток і інтенсивність клітинної імунної відповіді, включаючи ІЛ-2, ІНФ гамма і інші цитокіни, які посилюють імуностимулюючі властивості BCG [24].

2. Характеристика вірусу гепатиту С

2.1 Загальні відомості

Вірус гепатиту С (ВГС) - невеликий сферичний вірус (рис. 2.1), що має білково-ліпідну оболонку, нуклеокапсид і одноланцюгову лінійну РНК. Розміри вірусу за даними різних методів аналізу становлять близько 30-60 нм. У таксономічній ієрархії ВГС відносять до родини Flaviviridae, роду Hepacivirus [11].

Рис. 2.1 Схема будови ВГС

Найбільш широко використовується класифікація вірусу гепатиту С за наступними генотипами (основними типами): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 і 11. Генотипи ВГС можуть бути розбиті на підтипи, деякі з яких включають в себе:

1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e,5a, 6a, 7a,7b, 8a, 8b,9a, 10a,11a.

ВГС еволюціонував протягом декількох тисяч років. Цей факт може пояснити нинішні особливості глобального поширення генотипів і підтипів:

1а - поширений в основному в Північній і Південній Америці, а також в Австралії;

1b - найчастіше зустрічається в Європі і Азії;

2a - найбільш поширений в Японії і Китаї;

2b - у США і Північній Європі;

2c - в Західній і Південній Європі;

3а - Австралія, Європа і Південна Азія;

4а - Єгипет;

4с - Центральна Африка;

5а - Південна Африка;

6а - Гонконг, Макао і В'єтнам;

7а і 7b - Таїланд;

8а, 8b і 9а - В'єтнам;

10а і 11а - Індонезія;

Всесвітня організація охорони здоров'я на сьогодні виділяє 6 основних генотипів вірусу, їх поширеність представлена на рис. 2.2.

Рис. 2.2 Поширення генотипів ВГС

Генотип є клінічно важливим при визначенні потенційної відповіді на терапію різними препаратами і тривалості такої терапії, тому його визначення є обов'язковим етапом клінічних та моніторингових досліджень [12,49].

Геном ВГС представлений одноланцюговою лінійною молекулою РНК позитивної полярності протяжністю близько 9400 нуклеотидів. Результати клонування і повного секвенування РНК ВГС, а також фізико-хімічні характеристики вірусу дозволили віднести ВГС до родини флавівірусів, виділивши в окремий рід Гепацивірусів. Порівняльний аналіз РНК ВГС з геномами інших вірусів, які входять у вказану родину, виявив схожість з фрагментами геномів вірусів Денге другого типу і вірусу плямистості гвоздики (група каріновірусів). Крім того, зареєстровані так звані «локальні» гомології (не більше 16 нуклеотидів в регіоні) з пестівірусами (вірус холери свиней і вірус бичачої діареї). Наявність гомології РНК ВГС і з геномами вірусів рослин дозволила припустити, що ВГС займає проміжне положення в еволюції вірусів між вірусами тварин і рослин [27].

Організація геному ВГС подібна організації геномів інших флавівірусів (наприклад, вірусу жовтої лихоманки). У РНК ВГС виділяють зони, які кодують структурні і неструктурні (функціональні) білки. Гени, що кодують структурні білки, розташовані у 5'-області геному вірусу, а неструктурні - у 3'-області. На кінцях РНК ВГС є не кодують ділянки розміром приблизно 340 і 60 основ [34].

РНК ВГС містить єдину відкриту рамку зчитування, яка несе інформацію про вірусспеціфічний поліпротеїн, розміром близько 3000 амінокислотних залишків, який, завдяки дії декількох протеолітичних ензимів вірусного і клітинного походження, розділяється на окремі білки. Встановлено, що 5'-область геному ВГС, що кодує структурні білки вірусу, коротше аналогічних областей флаві- і пестівірусів. Вважається, що ця зона контролює синтез чотирьох білків:

- Кор-білка - негліколізованого гідрофільного протеїда (р 19), який вважається нуклеокапсидним білком;

- двох оболонкових білків, кодованих зоною Е1 (Р18 і gp33);

- Е2, раніше ідентифікованого як зона ВГС-NSР1 (р38 і gp72);

- невеликого білка з невстановленою функцією.

Білки, синтезовані з ділянок гена Е1 і Е2, вважають глікопротеідами зовнішньої оболонки вірусу гепатиту С (Env). Вони грають роль в прикріпленні та проникненні вірусу в клітину [36].

Область РНК ВГС, що кодує неструктурні білки, складається з наступних ділянок: NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a і NS5b. Білки, синтезовані з зон NS2 (р 23) і NS4 (р10 і р27), вважають пов'язаними з клітинною мембранною функцією. Білок, кодований NS4a зоною, - багатофункціональний поліпротеїд. Він володіє стабілізуючою функцією і сприяє протеїназній/хеліказній активності білка, кодованого зоною NS3. Крім того, він регулює фосфорилювання білка (р70), кодованого зоною NS5a, який має функцію реплікази. Кристалографічний аналіз ВГС-хелікази продемонстрував наявність трьох доменів, необхідних для реплікації вірусу [11]. Зона NS5b несе інформацію про білок (р56), функція якого остаточно не встановлена, проте вважається, що він являє собою РНК-залежну РНК-полімеразу, необхідну для реплікації вірусу. На 5'- і 3'-кінцях РНК ВГС розташовані нетрансльовані регіони [32]. На 3'-кінці така ділянка складається приблизно з 50 нуклеотидів - поліпіримідиновий (або поліпуриновий) тракт [5,11].

Особливістю ВГС є надзвичайно висока гетерогенність його генома. Порівняльний аналіз РНК ізолятів ВГС, виділених не тільки в різних країнах, але і в межах однієї держави, і навіть від одного і того ж хворого протягом інфекції, виявив їх варіабельність. Відмінності в нуклеотидних і амінокислотних послідовностях визначені в ділянках РНК, що кодують як структурні, так і неструктурні білки. Разом з тим встановлено, що максимальна гетерогенність генома реєструється в генах, що кодують оболонкові білки вірусу. Виділяють дві гіперваріабельні ділянки РНК ВГС. Перша з них протяжністю в 90 нуклеотидів, розташована на 5'-кінці Е2 гена (HVR1 - hypervariable region). Друга (HVR2) гіперваріабельна ділянка РНК ВГС (21 нуклеотид) примикає до 3'-кінця HVR1. Вивчення послідовностей РНК ВГС у хворих, чий організм відповів або не відповів на лікування препаратами інтерферону, дозволило виявити ділянку РНК в NS5a регіоні, можливо відповідальну за резистентність до лікування (interferon-sensitivity determining region - ISDR) [5,9].

Реплікація HCV включає в себе кілька етапів. Вірус розмножується в основному в гепатоцитах печінки, де, за оцінками, щодня кожна інфікована клітина продукує близько 50 віріонів. Вірус може також реплікуватися у мононуклеарних клітинах периферичної крові, що сприяє високому рівню імунологічних порушень, які виявляються у інфікованих на хронічний гепатит С (ХВГС) [5,43].

Проникнення до клітини господаря відбувається через складні взаємодії між віріонами і поверхневими клітинними молекулами. Опинившись всередині гепатоцитів, ВГС використовує внутрішньоклітинний механізм реплікації [43].

Геном ВГС використовує для отримання одного білка більше 3000 амінокислот. Поліпротеїн взаємодіє з вірусною і клітинною протеазами для продукування 3 структурних і 7 неструктурних (NS) білків (рис. 2.3).

Рис. 2.3 Схема реплікації ВГС

РНК формується за допомогою РНК-залежною полімерази NS5B, яка виробляє негативний ланцюг проміжних РНК. Негативні ланцюги РНК потім слугують шаблоном для копіювання нових позитивно-орієнтованих вірусних геномів. Геноми що знаходяться в стадії становлення можуть далі реплікуватися і утворювати нові вірусні частинки, які згодом виходять з клітини [5].

2.2 Кор-білок та ініші оболонкові білки ВГС

рекомбінантний білок вірус гепатит

Кор-білок формує вірусний нуклеокапсид. Виявлено, що він може існувати як у повнорозмірній формі (відомій як р21 і містить 191 амінокислотний залишок), так і у вкороченій з С-кінця. Білки, що мають довжину не менш 174 амінокислотних залишків, локалізовані в цитоплазмі, а коротші виявляються в ядрі. Вважається, що укорочені форми білка відіграють важливу роль в гепатоканцерогенезі. Нещодавно показано, що кор-білок здатний модулювати внутрішньоклітинну дію в-лімфотоксина, взаємодіючи з цитоплазматичної частиною його рецептора [55]. Нуклеокапсидний білок впливає на деякі транскрипційні фактори, залучені в регуляцію запального процесу. Він також може викликати порушення клітинного метаболізму тригліцеридів [45,53]. Нуклеокапсидний білок, ймовірно, відповідальний за тривалу імуносупресію. Він є одним з найбільш імуногенних білків вірусу. Зазвичай він індукує потужну Т- і В-клітинну відповідь [36, 42].

Оболонкові білки (Е1 і Е2) утворюють нековалентно зв'язаний гетеродимер. Обидва білки інтенсивно глікозовані, в Е1 виявлено 5-6 потенційних ділянок N-глікозилювання, в Е2 - 11 аналогічних ділянок [31]. Відмітна структурна особливість оболонкових білків - наявність ділянок з високою частотою заміни амінокислотних залишків, які називаються варіабельними і гіперваріабельними зонами [56]. У Е2 знаходяться дві найбільш мінливі області вірусного поліпептида: HVR1 (27 амінокислотних залишків) і HVR2 (7 амінокислотних залишків), які локалізовані в N-кінцевій частині Е2. Е2 білок може існувати в двох формах: звичайній і подовженою, що містить маленький пептид, відомий як p7, на С-кінці [33]. Обидва оболонкових білка частково занурені в ліпідний бішар. Але більша частина їх поліпептидного ланцюга експонована на зовнішній поверхні бішару і володіє антигенністю. Ймовірно, оболонкові білки відповідальні за тропізм вірусу. Виявлено, що рекомбінантний Е2 білок взаємодіє in vitro з CD81, який, можливо, є рецептором для ВГC [42].

2.3 Неструктурні білки

NS2-білок утворюється при аутокаталітичному розщепленні протеазою NS2/NS3. Активна область цієї протеази містить С-кінець NS2 і N-кінець NS3. Ніяких інших протеолітичних процесінгових функцій у цієї протеази, не знайдено.

NS3 білок володіє декількома каталітичними функціями. Протеазну активність має N-кінцевий домен [57]. Ця серинова протеаза бере участь в процессингу майже всіх вірусних неструктурних білків. У протеазному домені виявлена дуже слабка імуногенність. С-кінцевий домен білка NS3 володіє АТФазною / геліказною активністю, яка каталізує «кеп»-синтез у геномній РНК. Імунна відповідь на NS3 сфокусована в цьому домені [41].

Область NS4 містить 2 білки, які називаються NS4A і NS4B. Перший білок виконує роль кофактора серинової протеази. Передбачається, що другий білок бере участь в утворенні ВГC-реплікативного комплексу. В-епітопи в NS4A генотип-специфічні. У білку також знайдені Т-епітопи [41,57].

Область NS5 складається з 2 білків - NS5A і NS5B. Білок NS5A інтенсивно фосфорильований. Ймовірно, він є компонентом реплікативного комплексу вірусу. У інфікованій клітині цей білок виявляється поряд з ядерною периплазматичною мембраною разом з білком NS5B. Як відомо, NS5B функціонує як РНК-залежна РНК-полімераза. Через відсутність 3'-5'-екзонуклеазної активності ця РНК-полімераза при реплікації робить багато помилок, що призводить до високої швидкості мутації. Обидва білка області NS5 імуногенні [40,44,57].

3. Методи отримання генноінженерних продуктів ВГС

3.1 Отримання відповідного фрагменту нуклеїнової кислоти

Фрагменти ДНК для вбудовування у вектор можна отримати безпосередньо з хромосомної ДНК, розщепивши її рестриктазами або зруйнувавши випадковим чином (наприклад, за допомогою ультразвуку) на сегменти з приблизно однаковою довжиною. Виділення генів за допомогою «вирізання» з генома, як правило, складається з чотирьох етапів:

1) отримання клонотеки фрагментів геному;

2) виявлення фрагментів геному, що містять необхідний ген, і точної локалізації гена в даному фрагменті;

3) вирізання гена з фрагмента(ів) за допомогою рестриктаз і зшивання ділянок гена за допомогою ДНК-лігази фага Т4, якщо ці ділянки отримані з різних фрагментів;

4) ампліфікація гена в складі векторної молекули.

Зазначений спосіб отримання генів є найбільш прийнятним для протозойних збудників, бактерій і для деяких складно влаштованих ДНК-вірусів. Такі операції проводяться, зокрема, при створенні так званих «бібліотек генів», тобто набору однакових векторних систем, в сукупності що несуть в собі весь геном даного організму [22]. Однак цей підхід має ряд істотних недоліків. По-перше, дуже складна задача підбору рестриктаз, що дозволяють вирізати з геномної ДНК або клонованого фрагмента геному цілісний ген. Як правило, разом з геном залишаються фланкуючі його зайві нуклеотидні послідовності, що заважає подальшому використанню цього гена, або ж рестріктази відрізають частину гена, роблячи його функціонально неповноцінним. По-друге, створення клонотеки генома збудника представляє спеціальну задачу і вимагає великих витрат часу. Нарешті, для ряду ДНК-вірусів (паповавіруси) доведений сплайсинг-залежний характер структури генів. Цілком зрозуміло, що виділені гени цих вірусів внаслідок наявності інтронних областей не будуть проявляти функціональної активності в бактеріальних клітинах і є непридатними при вирішенні задач з конструювання рекомбінантних противірусних вакцин. По-третє, якщо ген становить незначну частку від усієї геномної ДНК, то виникають великі труднощі з його ізоляцією й ідентифікацією [16].

Найбільш поширеним є шлях отримання генів через синтез ДНК-копій (кДНК) інформаційних або будь-яких інших (в оптимальному випадку - індивідуальних) РНК шляхом їх зворотної транскрипції [23]. Даний спосіб включає в себе три етапи:

1) виділення високоочищених мРНК, що кодують структурні білки, або виділення геномних РНК вірусів;

2) синтез дволанцюгових ДНК (гени) на матрицях РНК;

3) ампліфікація гена за допомогою методів молекулярного клонування.

Як зазначалося, першим етапом в отриманні генів за допомогою методів зворотної транскрипції є виділення і очищення геномних РНК або мРНК. Геномні РНК виділяють головним чином з очищених віріонів, а мРНК - з інфікованих клітин. Для виділення мРНК з інфікованих клітин використовують різні способи. В одному з варіантів виділення мРНК з інфікованих клітин проводять безпосередньо із лізованих клітин (лізис здійснюють у денатуруючих середовищах з метою запобігання руйнівної дії нуклеаз на мРНК) з наступною екстракцією фенолом і хлороформом або центрифугуванням лізату через подушку 5,7M СsCl (для звільнення від клітинних ДНК) і заключною афінною хроматографією на оліго(dТ)-целюлозі (полі(У)-сефарозі). Виділення мРНК можна проводити з очищених полірибосом інфікованих клітин [23].

У разі необхідності отримання специфічних мРНК, що кодують структурні білки збудника, використовують наступний спосіб: інфіковані вірусом клітини руйнують механічним шляхом або хімічними методами (використання неіонних детергентів). Клітинний лізат звільняють від ядер і мітохондрій методом диференціального центрифугування і піддають хроматографії на антитільному сорбенті. При цій процедурі з антитілами, специфічними до певного структурного білку збудника, зв'язуються полісоми, що здійснюють синтез цього білка. Також може бути використаний метод непрямої імунопреципітації полісом, при якому комплекс антитіло - полісома преципітується з розчину додаванням другого антитіла, специфічного до першого. В якості другого антитіла найчастіше беруть фіксовані формаліном клітини Staphylococcus aureus, на поверхні яких знаходиться так званий білок А, що має спорідненість до Fc-фрагментів Ig. З полісом, отриманих одним з описаних способів, далі вже виділяють мРНК [17,23,24].

Інший шлях виділення індивідуальних мРНК базується на властивості мРНК взаємодіяти з комплементарними ДНК, пов'язаними з твердим носієм (целюлоза, сефароза, нітроцелюлозні фільтри). Цей метод відбору та очистки специфічних мРНК є найефективнішим. Однак його застосування можливе лише при наявності відповідних комплементарних ДНК [22].

Отримання препарату очищеної мРНК дозволяє перейти до процедури синтезу гена за допомогою зворотньої транскрипції, яку здійснюють за допомогою ревертази AMV у спеціально підібраних умовах. У процесі зворотної транскрипції матрицею є мРНК, а затравкою оліго(dT12-18) (для мРНК, що мають полі (А)-хвіст) або хімічно синтезований олигонуклеотид, комплементарний 3'-кінцю мРНК. Після синтезу на мРНК комплементарного ланцюга ДНК і руйнування РНК (частіше використовується обробка лугом) здійснюють синтез другого ланцюга ДНК. У цій реакції матрицею є перший ланцюг ДНК. Реакція може каталізуватися як ревертазою, так і ДНК-полімеразою [22,24].

Після отримання дволанцюгової кДНК наступна стадія отримання гена, що полягає в гідролізі одноланцюжкові ділянки ДНК, що з'єднує перший та другий ланцюги, нуклеазою S1 [23,24].

Для отримання необхідних ділянок РНК використовують дві групи способів:

1) розщеплення полірибонуклеотидного ланцюга РНК в заданому місці;

2) синтез РНК (ферментативний на ДНК-або РНК-матрицях і хімічний).

Розщеплення полірибонуклеотидного ланцюга РНК може здійснюватися в присутності різних ферментів. Для цієї мети використовують ферменти: рибонуклеазу H, нуклеази, ковалентно пов'язані з олигонуклеотидами (наприклад, стафілококова нуклеаза), рибозими (наприклад, Рибозим L-19) [19,16].

Історично першим способом спрямованої ферментативної фрагментації РНК (званої також адресованою, сайт-спрямованою або сайт-специфічною фрагментацією РНК) є метод гідролізу РНК ферментом РНКазою H в присутності комплементарних олігодезоксирибонуклеотидів. Цей метод досі залишається найбільш універсальним способом спрямованої фрагментації РНК[23].

Метод заснований на властивості РНКази Н розщеплювати полірибонуклеотидний ланцюг РНК у складі ДНК-РНК-гетеродуплекса. До ділянки РНК, за якою планується провести її фрагментацію, синтезується комплементарний олігодезоксирибонуклеотид довжиною в 6-10 нуклеотидних залишків. Далі отримують комплекс цього олигонуклеотида з РНК, який потім обробляють ферментом. У роботі зазвичай використовують РНКазу Н Escherichia coli - цілком доступний фермент, який може бути досить легко очищений від всіх супутніх нуклеазних домішок. Цей метод знайшов досить широке застосування для сайт-специфічного розщеплення вірусних і рибосомних РНК, а також для ідентифікації продуктів процесингу деяких РНК [16,19,24].

Важливою перевагою даного методу є і те, що в результаті гідролізу РНК рибонуклеазою Н утворюються фрагменти, у одного з яких на 5'-кінці міститься фосфатна група, а в іншого 3'-кінець вільний (нефосфорильований). Такі фрагменти можна прямо використовувати в реакції ферментативного лігування.

Серйозним обмеженням цього методу є те, що ділянка РНК, з якою зв'язується комплементарний йому олігодезоксирибонуклеотид, повинна мати однотяжеву конформацію і перебувати на поверхні макромолекули РНК, що представляє собою в умовах розщеплення компактну глобулу з розвиненою вторинною структурою. В окремих випадках це обмеження вдається подолати, використовуючи досить довгі олігодезоксирибонуклеотиди (15-20-членні), які попередньо відпалюють з частково або повністю денатурованої РНК.

Інше обмеження методу фрагментації полірибонуклеотидів РНКазою Н в присутності комплементарних олігодезоксирибонуклеотидів полягає в тому, що в загальному випадку передбачити, який з фосфодиефірних зв'язків в гетеродуплексі (або у безпосередній близькості від нього) піддасться розщепленню, не вдається. Більш того, фермент часто гідролізує не один, а кілька сусідніх міжнуклеотидних зв'язків. Ясно, що для подальшого конструювання рекомбінантних РНК такі фрагменти можуть виявитися непридатними [8,16].

Розщеплення РНК може проводитися і за участю нуклеаз, ковалентно зв'язаних з олігонуклеотидами. Принцип цього методу полягає в тому, що з 5'- або 3'-кінцевим залишком олігонуклеотиду, комплементарного заданому фрагменту ДНК і РНК, пов'язують модифікуючий агент, який після утворення дуплексу атакує одну з найближчих до нього основ. Реагентами цього типу вдалося спрямовано фрагментувати фенілаланінову тРНК з дріжджів, РНК-компонент (M1 РНК) РНКази Р, а також 16S рибосомну РНК E. Coli [17].

Однак, як і у випадку РНКази Н, розщеплення РНК олігонуклеотид-нуклеазою часто проходить по декількох міжнуклеотидних зв'язках, що дещо обмежує можливості застосування цього методу для отримання рекомбінантних РНК.

Для розщеплення РНК застосовують також рибозими (природні РНК і синтетичні полірибонуклеотиди, здатні каталізувати цілий ряд перетворень у інших РНК). Перший рибозим у науковій літературі позначають як рибозим L-19. Цей рибозим є РНК довжиною у 395 нуклеотидних залишків, у 5'-кінцевій області якої є гексануклеотидна послідовність GGAGGG, відповідна за специфічність розщеплення попередника 26S РНК при самосплайсингу. Ця послідовність комплементарна CUCUCU послідовності, розташованій на 3'-кінці першої екзонної ділянки попередника 26S РНК. Якщо цю РНК замінити іншою, але такою, що обов'язково містить доступну для комплементарного зв'язування CUCUCUA послідовність, то Рибозим L-19 у присутності гуанозина або гуанілових нуклеотидів з вільною 3'-гідроксильної групою розщепить її [8,23,24].

Джерелом необхідних ділянок РНК може служити такий спосіб, як синтез фрагментів РНК. Ферментативний синтез сегментів РНК здійснюють з використанням різноманітних генно-інженерних конструкцій. Однак сьогодні у переважній більшості випадків для препаративного отримання РНК використовуються РНК-полімерази, закодовані в геномах ряду ДНК-вмісних бактеріофагів (Т3, Т7 і SP6). Вони характеризуються дуже високою активністю і, на відміну від клітинних РНК-полімераз, складаються з одного поліпептидного ланцюга. Важливо також те, що ініціація і термінація синтезу РНК цими полімеразами відбувається на одному певному нуклеотидному залишку.

Отримані одним із способів фрагменти нуклеїнових кислот в подальшому вбудовують у векторні молекули [23,26].

3.2 Трансформація клітин E. coli плазмідними векторами

Процес проникнення плазмідної ДНК в бактеріальну клітину з наступною модифікацією її генома називається трансформацією. У природних умовах бактеріальні клітини практично не здатні до поглинання ДНК. Це пов'язано, перш за все, з міцною клітинною стінкою, що складається з пептидоглікану, яку, наприклад, має клітина E. coli, а також з негативним зарядом її зовнішньої мембрани, до складу якої входять фосфоліпіди і ліпополісахариди. Оскільки молекула ДНК також заряджена негативно, то її проникнення в бактеріальну клітину стає проблематичним з механічних та електростатичних причин. Для вирішення цієї проблеми було розроблено три методи трансформації: хімічна трансформація, електропорація і трансформація за допомогою мінералів [17].

У першому випадку для того, щоб проникнення ДНК в клітину стало можливим, необхідно підготувати бактеріальні клітини до поглинання ДНК, тобто зробити їх компетентними. Для цього клітини E. coli обробляють розчином бівалентних катіонів (Ca²⁺, Mg²⁺, Rb⁺, Mn²⁺) при низьких температурах. Це призводить з одного боку до зниження загального негативного заряду поверхні бактеріальної клітини E. coli, а з іншого боку змінює рухливість фосфоліпідного бішару (він стає менш рухливим). Деякі протоколи приготування компетентних клітин включають в себе обробку клітин такими речовинами, як PEG і DMSO. Було показано, що у присутності цих речовин трансформація проходить набагато ефективніше. Можливо, це пов'язано з тим, що додавання цих речовин збільшує загальну в'язкість розчину і стерично полегшує взаємодію клітин і ДНК. Крім цього, ці речовини є кріопротекторами, тобто забезпечують зберігання готових препаратів компетентних клітин при низьких температурах [6,7].

Сама процедура хімічної трансформації складається з трьох основних стадій. На початку компетентні клітини інкубують на льоду з ДНК. На цій стадії ДНК «прилипає» до бактеріальної клітинної стінки, завдяки взаємодії з бівалентними катіонами, які виступають сполучною ланкою між клітиною і ДНК [15,17].

Друга стадія полягає в дуже короткому (від 30-40c або до хвилини) тепловому шоці при 42 °С. На цій стадії через різке підвищення температури плинність фосфоліпідного бішару різко збільшується, в мембранах бактеріальних клітин виникають несанкціоновані пори, через які ДНК проникає в клітину. Дуже важливо після проведення теплового шоку відразу охолодити суміш клітин з ДНК на льоду, оскільки при температурах 40- 42 °С клітини E. coli гинуть [17].

На третій стадії до суміші клітин з ДНК додають живильне середовище без антибіотиків (LB або SOC) і ростять при перемішуванні за температури 37 °С. На цій стадії відбувається відновлення трансформованих клітин і їх розмноження. Після цього суспензію клітин висівають на чашку з твердим живильним середовищем, що містить необхідний антибіотик. Метод хімічної трансформації зазвичай використовують, коли працюють з плазмідами розміром 2-10 kb [6].

У разі електропорації проникнення ДНК в бактеріальну клітину відбувається під дією електричного поля при високій напрузі протягом короткого часу. Умови електропорації (напруженість поля і тривалість імпульсу) можуть вимагати попередньої оптимізації. Підготовка клітин не вимагає обробки їх іонами двовалентних металів, але необхідно кілька разів промити їх стерильним розчином 10% гліцерину від солей, що містяться у поживних середовищах, так як наявність навіть їх мінімальних концентрацій може різко збільшити провідність при електропорації і знизити загальну ефективність трансформації. Електропорацію проводять у спеціальних кюветах електропораторів. У кюветі змішують електрокомпетентні клітини і ДНК, потім кювету поміщають в електропоратор і проводять електропорацію. Потім до суміші клітин і ДНК додають живильне середовище, дорощують клітини і висівають їх на чашки, як у випадку хімічної трансформації. Метод електропорації зазвичай використовують, коли працюють з плазмідами з молекулярної масою вище 10 kb; необхідно зробити ко-трансформацію двох (або навіть трьох!) плазмід; при роботі з бібліотеками ДНК, що вимагають великої кількості трансформацій [17].

Після отримання свіжого препарату компетентних / електрокомпетентних клітин необхідно провести їх контрольну трансформацію відомою кількістю плазміди для того, щоб перевірити чистоту отриманого препарату компетентних клітин таприблизно оцінити їх компетентність. Компетентність клітин можна визначити, як кількість колоній, яка виростає на чашці після трансформації клітин 1 мкг ДНК [17].

Щоб оцінити компетентність отриманого препарату, необхідно порахувати кількість колоній, що виросли на чашці після трансформації (якщо виросло багато колоній, чашку зручно ділити на сектори, рахувати число колоній в кожному секторі, а потім множити отримане значення на число секторів), і знаючи кількість ДНК, яка була взята на трансформацію, розрахувати компетентність клітин на 1мкг ДНК. Компетентність клітин 10⁷ - 10⁸ може бути оцінена, як висока [17,8].

4. Експериментальна частина. Матеріали та методи досліджень

4.1 Характеристика об'єкту досліджень

Дослідження виконували на базі лабораторії відділу Білкової інженерії Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Об'єктом дослідження була здатність модифікованих штамів E. coli codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG до продукції кор-білка, що є антигеном, придатним для створення вакцини проти гепатиту С.

Для досліджень використовували штами E. coli codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG з колекції культур мікроорганізмів Інституту молекулярної біологїі і генетики НАН України (м. Київ). Було модифіковано 4 штами, яким вводили штучну камерційну плазміду pET15b core, отриману з інституту вірусології РАМН. Рекомбінантні штами відбирали на середовищах: рідке поживне середовище LB, тверде нативне середовище LB, тверде середовище LB для контролю та середовище 2YT. З них виділяли білок Core вірусу ВГС - це невеликий білок, що складається з 191 амінокислот (~ 21 кДа), це самий консервативний білок всередині вірусного генома. Структурний білок Core розташований на N-кінці поліпептиду. Протеїн Core має здатність звьязувати різні РНК: рибосомну РНК [4], транспортну РНК [10] та вірусну РНК ВГС [11]. Місце взаємодії знаходиться в N-кінцевій області протеїну Core (домену D1) [12]. Взаємодія Core зі своєю власною РНК призначена не тільки для утворення вірусного капсида. Протеїн Core має здатність регулювати свою власну трансляцію завдяки взаємодії з регіоном 5'UTR (IRES) вірусного генома. Протеїн Core ВГС є цільовим об'єктом для протеїнкінази, його фосфорилювання необхідно для придушення експресії і реплікації вірусу гепатиту В в клітинах, особливо фосфорилювання серина Core 116 відіграє роль репрессора в транскрипції його гена а також локалізації Core в ядрі [13]. Протеїн Core має важливе значення для взаємодії з вірусною РНК. Проте, цей білок має можливість взаємодіяти з іншими вірусними білками ВГС.

Досліджували його властивість специфічно взаємодіяти з імунними сироватками, що містять антитіла до ВГС та подальше використання для створення імуноферментних тест-систем, призначених для діагностики і моніторингу вірусного гепатиту С.

4.2 Приготування поживних середовищ

Для культивування робочих культур мікроорганізмів використовували наступні середовища: рідке поживне середовище LB, тверде нативне середовище LB, тверде середовище LB для контролю та середовище 2YT [6].

Для приготування рідкого поживного середовища LB використовували колбу об'ємом 0,5 л. Зважували на аналітичних електронних вагах KERN ABS/ABj (Kern, Німеччина) наважки:

Бактотриптон (Merck, Німеччина) - 5 г.;

Дріжджовий екстракт (ІПО, РФ) - 2,5 г.;

NaCl (НВП «Альфарус», Україна) - 5 г.

Доводили до об'єму 0,5 л дистильованою водою, автоклавували при 0,5атм., кип'ятили.

Для приготування твердого середовища LB для контролю та твердого нативного середовища відбирали по 80 мл проавтоклавованого рідкого середовища LB і додавали 1,2 г агару (Difсo, США), зваженого на аналітичних вагах KERN ABS/ABj для кожного середовища, та кип'ятили.

Готували по 80 мл агаризованого середовища LB, до якого додавали 60 мкг/мл хлорамфеніколу, 100 мкг/мл ампіциліну для контрольного середовища та 80 мкг/мл для нативного середовища та розливали на 8 чашок Петрі (d=10 см).

Для приготування середовища 2 YT використовували колбу об'ємом 100 мл. На аналітичних вагах зважували 1,6 г бактотриптона, 1 г дріжджового екстракту та 0,5 г NaCl. Використовували 97 мл дистильованої води [6,24].

4.3 Отримання компетентної культури E. coli штамів codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG

Для отримання компетентної культури використовували нічну культуру клітин E. coli штамів codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG. Для цього у 4 стерильні колби ємністю 20 мл кожна, вносили по 10 мл приготованого рідкого середовища LB. Потім до колб з середовищем вносили по 10 мкл канаміцину та по 1 колонії E. coli кожного штаму, вирощених на твердому нативному середовищі LB. Далі, інкубували в шейкері New Brunswick Scientific Excella E24 Incubator (New Brunswick Scientific, Germany) на швидкості RPM = 200 при температурі 37°С протягом ночі.

Для отримання компетентних клітин E. сoli штамів codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG для модифікування плазмідою pET15b core до 4 колб, об'ємом 100 мл стирильно вносили по 15 мл поживного середовища LB з 30 мкг/мл хлорамфеніколу.

Додавали по 150 мл нічної культури штамів E. сoli codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG до середовища та інкубували при 37 °С, RPM = 250 на шейкері, до досягнення культурами оптичної густини OD₆₀₀ = 0,6. Далі всі маніпуляції проводили на льоду.

По 1 мл культури переносили до мікропробірок та інкубували на льоду протягом 10 хв після чого, відцентрифуговували на центрифузі при 5000 об/хв при 4°С протягом 5 хв і ретельно видаляли супернатант.

Клітини ресуспендували у 1 мл 0,1 М CaCl₂, інкубували на льоду протягом 30 хв. Потім клітини ще раз центрифугували при 5000 об/хв при 4°С протягом 5 хв та ретельно видаляли супернатант.

Клітини ресуспендували у 0,2 мл. 0,1 М CaCl₂ та інкубували при 4°С протягом 60 хв.

4.4 Трансформація компетентних клітин E. сoli codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG плазмідою pET15b core та індукція експресії цільового рекомбінантного Кор-білка

Після розморозки плазміди pET15b core на льоду клітини кожного штаму E. coli розділяли по 100 мкл на 2 пробірки. До першої пробірки для кожного штаму додавали 5 мкл плазміди (дослід), до другої - нічого (контроль).

Далі інкубували суміш на льоду 40 хв, потім інкубували на водяній бані при 42 °С протягом 90 с. Після цього інкубували 2 хв на льоді [17].

До кожної мікропробірки (дослід та контроль) додавали по 400 мкл поживного середовища LB. Далі інкубували в термостаті при 37 °С протягом 1 год. Після здійснювали висів отриманих культур на агаризоване поживне середовище LB з 60 мкг/мл хлорамфеніколу, 100 мкг/мл ампіциліну та інкубували протягом ночі у термостаті при 37 °С[17].

У 4 пробірки, що містили середовище 2 YT, вносили колонії бактерій з чашок Петрі з агаризованим середовищем LB. Далі пробірки центрифугували та отримували матеріал у вигляді осаду, в якому містились клітини. Дану процедуру маркували як 0 год - без ІПТГ(Ізопропіл-в-D-1-тіогалактопіранозид - індуктор для експресії білка core ВГС в клітинах E. сoli). Таку процедуру проводили ще 3 рази з інтервалом у 1 годину з 45 мкл ІПТГ. Кожну наступну процедуру маркували як 1 год, 2 год, 3 год - з ІПТГ. Для оцінки ролі ІПТГ застосувували метод електрофорезу на наступному етапі та вимірювали оптичну густину кожну годину для побудування графіку залежності росту культури від часу культивування [6,17].

4.5 Проведення електрофорезу

Електрофорез проводили в поліакриламідному гелі, що містив лаурилсульфат натрію або SDS-PAGE. Для верхнього гелю:

...