2,7 мл ddH₂О;

0,67 мл 30% суміші акриламіду;

0,55 мл 1,0 M Tris, pH 6.8;

0,1 мл 10% SDS;

0,05 мл 10% амонію персульфату;

0,06 мл TEMED.

Для нижнього гелю:

3,0 мл ddH₂О;

2,5 мл 30% суміші акриламіду;

2,8 мл 1,5M Tris, pH 8.8;

0,1 мл 10% SDS;

0,06 мл 10% амонію персульфат;

0,07 мл TEMED.

Збирали пластинку, заливали «пробку» (1 мл) до низу пластинки, витримували 10 хв, фільтрувальним папером збирали воду. Потім, обережно, з боку пластинки вносили 5 мл нижнього гелю, додавали 20 мл дистильованої води зверху для вирівнювання гелю. Витримували 20 хв, сушили гель фільтрувальним папером [1,4].

Встановлювали до пластинки гребінку (1 см) і заливали верхній гель, уникаючи бульбашок.

Готували камеру для проведення електрофорезу:

приєднували пластинку з гелем до камери;

готували 75 мл 1 хелатного буферу (15 мл хелатного буферу та 60 мл дистильованої води);

заповнювали верхній резервуар свіжим буфером, а в нижній резервуар додавали старий буфер.

У пробірку «Епендорф» уміщували міоглобін (17,8 кДа) і карбоангідразу (29 кДа) і додавали 0,5 мл дистильованої води і 0,5 мл буфера (sample buffer (900 мкл) і меркаптоетанол (100 мкл)). У 14 пробірок «Епендорф» вносили однакову кількість складу: 25 мкл буферу і 25 мкл осаду клітин досліджуваних штамів E. Сoli [1,4].

Далі всі зразки з пробірок переносили в кишеньки гелю для внесення по 50 мкл та здійснювали електрофорез при кімнатній температурі. Умови: U = 100-200 V, I = 30-40 mA, час - 60-80 хв.

Виявлення і локалізацію білкових зон після їх поділу електрофорезом в ПААГ здійснювали шляхом їх фарбування у гелі. Для забарвлення гель вимочували в розчині барвника (Кумассі яскраво синій). Витримка дифузії - 24 год. Відмивання йде тільки за рахунок дифузії барвника з гелю, воно займало 3-4 дні. Візуалізація результатів індукції електрофорезом (при значенні напруги 120-140 В) виявила штами з високим рівнем експресії протеїну core ВГС [21].

4.6 Отримання біомаси модифікованих культур

Штами експресуючі протеїн core ВГС зберігали при -70 °С. З пробірок «Епендорф» відбирали суспензію клітин і поміщали в раніше підготовлені для кожного штаму 2 пробірки з рідким середовищем LB (5 мл). Дані пробірки поміщали в шейкер (New Brunswick Scientific Excella E24 Incubator) на швидкості RPM = 150 на 24 години при 37 °С. Після 24 год вміст обох пробірок діставали і додавали їх вміст у 2 порожні пробірки «Епендорф» по 1,5 мл в кожну і всі охолоджували. Далі в кожну з пробірок додавали по 50 мкл гліцерину (10%) і добре перемішували. Одержаний в результаті бактеріальний матеріал був основним компонентом для подальшої роботи, його зберігали при температурі -70 °С [4].

Щоб напрацювати трансформовані клітини і отримати білок Core, проводили культивування в об'ємі середовища 200 мл.

Приготування буферів для афінної очистки білка на колонці з Ni-NTA-агарозою

Буфер для лізису (V=30 мл, pH=8,0):

50 mM NaPh - 3 мл;

500 mM NaCl - 3 мл;

10 mM імідазол - 0,3 мл;

5 mM в-меркатоптоетанол - 11,7 мл.

Буфер для елюції (V=10 мл, pH=8,0):

50 mM NaPh - 1 мл;

150 mM NaCl - 0,3 мл;

200 mM імідазол - 2 мл;

5 mM в-меркатоптоетанол - 6,9 мл.

Буфер для промивки (V=20 мл, pH=8,0):

50 mM NaPh - 2 мл;

500 mM NaCl - 2 мл;

20 mM імідазол - 0,4 мл;

5 mM в-меркатоптоетанол - 7,8 мл.

Буфер для змиву (V=20 мл, pH=8,0):

50 mM NaPh - 2 мл;

1 mM NaCl - 4 мл;

300 mM імідазол - 6 мл;

Отримання клітинного лізату та екстракту клітин E. coli

Суспензію клітин, отриману після культивування, цинтрифугували і збирали осад бактеріальних клітин та ресуспензували його у 12 мл лізис-буфера.

Обережно розтирали осад скляною паличкою, потроху додаючи лізис-буфер та здійснювали руйнування клітин на ультразвуковому дезінтеграторі Sonicator-4000 (Misonix Qsonica LLC): 6 циклів по 20 с озвучання та 20 с перерва між циклами. Отриманий лізат переносили у пробірки «Епендорф», залишки клітин осаджували на мікроцентрифузі Sigma 1-13 (Sigma, США) при 13000 об/хв протягом 30 хв у попередньо охолодженому роторі [6].

Супернатант обережно збирали, осад заморожували при -20 °С.

4.7 Отримання рекомбінантного Кор-білка

Очищення рекомбінантного білка core здійснювали методом афінної метал-хелатуючої хроматографії на колонці з Ni-NTA-агарозою.

Готували колонку, відновивши її 10 мл лізис-буферу. Наносили супернатант на колонку (12 мл), збирали проскок та промивали колонку протягом 2 хв 10 мл буферу для промивання, збирали фракцію промивання (50 мкл)[18].

У 5 пробірок «Епендорф» елювали по 0,5 мл буферу для елюції, після чого наносили на колонку 1 мл буферу для змивання. Збирали змив (50 мкл). Всі фракції і аліквоти зберігали про 4 °С.

Промивали колонку 5 мл буферу для змиву та консервували її 10 мл дистильованої води та 10 мл 25% C₂H₅OH [17,18].

4.8 Проведення імуноферментного аналізу

Для проведення імуноферментного аналізу з метою виявлення антитіл проти Кор-білка застосовували рекомбінантний Кор-білок. Спочатку виконували розведення досліджуваних та контрольних зразків і кон'югату, використовуючи фосфатно-сольовий розчин - Твін 80 (ФСР-Т), що містив 0,9% NaCl; 0,1% Na₂HPO₄; 0,1% Твін-80. Припустимий інтервал рН - 7,2-7,6. У якості коньюгата використовували готові імунні сироватки в концентрациії 1 мкг / мл. Як субстрат для прояву пероксидазної реакції використовували розчин тетраметилбензидину (ТМБ) у цитратному буфері, рН 5,0 (Na₂HPO₄ Ч 12H₂O - 0,2 моль/л, 14,3 г солі / 200 мл H₂O). Для зупинки ферментативної реакції використовували 5%-ий розчин сірчаної кислоти (стоп-реагент) [20].

Облік результатів здійснювали автоматично з використанням автоматичного імуноферментного аналізатора Mago 4 (USA).

Статистичну обробку даних проводили з використанням програми Microsoft Exell.

5. Результати та їх обговорення

5.1 Створення штамів та перевірка активності синтезу

Для створення штамів продуцентів Кор-білка було отримано культури компетентних клітин E. coli штамів codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG, після чого була проведена трансформація цих штамів методом heat-shock комерційною плазмідою pET15b core, яка містила ген, відповідний за синтез Кор-білка (рис. 5.1).

Рис. 5.1 Рестрикційна карта плазміди pET15b

Далі, було проведено пошук трансформованих штамів та напрацювання рекомбінантного білка, шляхом додавання індуктору для експресії білка core ВГС - ізопропіл-в-D-1-тіогалактопіранозиду (ІПТГ).

Оцінку результативності трансформації здійснювали з використанням електрофорезу осаду клітин досліджуваних штамів. Результати електрофорезу представлені на рис. 5.2.

Рис. 5.2 Електрофореграма білків клітин E. coli у поліакриламідному гелі (через 3 год від внесення індуктора)

З електрофореграми видно, що через 3 год від початку індукції було напрацьовано рекомбінантний протеїн core. Також, дослід показав, що трансформація була успішною, а отже, придатними в якості продуцентів виявилися штами Codon+ та pGRO. Лише вони показали значну експресію протеїну core ВГС. Штами E. coli pKTG і pRARE2 не експресували питомого білка, а отже, не були трансформовані.

У подібний спосіб було трансформовано клітини для отримання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV [48,51]. У цьому випадку було використано такі штами-реципієнти з музейної колекції штамів НВК «Діапроф-Мед»: Escherichia coli BL21(DE3) [E. coli B F-ompT HsdSB(rB-mB-) gal dcm л (DE3)], E. coli BL21(DE3) CodonPlusRIL [E. coli B F-ompT HsdSB(rB-mB-) gal dcm л (DE3) endA Hte [argU ileY leuW Camr]], E. coli BL21(DE3) CodonPlusRP [E. coli B F-ompT HsdSB(rB-mB-) gal dcm л (DE3) endA Hte [argU proL Camr]], E. coli BL21 AI [E. coli B F-ompT HsdSB(rB-mB) gal dcm ara B:T7 RNAP-tet A] [51].

Одержання компетентних клітин та їх трансформацію здійснювали, як і у нашому випадку за стандартною схемою з використанням 0,1М CaCl₂. Для трансформації застосовувалася рекомбінантна плазміда, створена на основі експресійного вектора рЕТ24а шляхом клонування фрагмента гена gag, який кодує білок р24 BLV. Експресія рекомбінатного білка контролювалась промотором бактеріофага Т7. Як генетичний маркер плазміда міститила ген стійкості до канаміцину [48].

Для контролю біосинтезу цільового білку здійснювали електрофорез (рис. 5.3).

Рис. 5.3 Електрофореграма розподілу рекомбінантного білка р24 за фракціями для різних штамів-реципієнтів E. сoli (БМ - лізат біомаси; ЕТВ - екстракт тілець включення; Розч - розчинна фракція; BL - E. coli BL21(DE3); RIL - E. coli BL21(DE3) CodonPlus_RIL; RP - E. coli BL21(DE3) CodonPlus_RP; AI - E. coli BL21(DE3) AI)

З електрофореграми можна побачити, що в усіх досліджуваних лізатах мав місце індукований біосинтез поліпептиду очікуваної молекулярної маси (~ 25кДа) [48].

У випадку з отриманням рекомбінантного ядерного антигену вірсу гепатита В, що містить позаклітинний домен білка М2 вірусу грипу у районі верхньої імунодомінантної петлі, в якості основи для створення рекомбінантних векторів експресії використовували вектор pQE60(Qiagen). Для отримання штамів E. coli - продуцентів рекомбінантних білків відповідні вектори вводили у клітини E. coli штаму DLT1270 за допомогою трансформації. За аналогією, для індукції синтезу рекомбінантних білків в культуру було внесено ІПТГ [47,52].

Рівень синтезу цільових білків оцінювали за допомогою денатуруючого електрофорезу у поліакриламідному гелі (рис. 5.4).

Рис. 5.4 Експресія рекомбінантних білків HBc / M2ek і HBc / 2M2ek у штамах-продуцентах. 1 - маркер молекулярної ваги; 2 - білковий препарат з неіндукованої культури; 3 - білковий препарат з культури DLT1270 pQE60 HBc / M2ek після індукції; 4 - білковий препарат з культури DLT1270 pQE60 HBc / 2M2ek після індукції.

З представленої електрофореграми можна побачити, що всі 3 дослідні препарати містили певні шукані фракції, про що свідчать лінії співпадіння продуктів електрофорезу [47].

5.2 Результати очищення рекомбінантного Кор-білка ВГС

Завдяки використанню плазміди pET15b Core, амінокислотна послідовність рекомбінантного Кор-білка містила додаткові 6 гістидинових основ, необхідних для хроматографії на Ni-агарозному сорбенті, що дозволило виділити високоочищенний білок. Результати очищення Кор-білка за допомогою афінної хроматографії представлені на рис. 5.5.

Рис. 5.5 Афінна хроматографія Кор-білка

При очищенні за допомогою хроматографії, спостерігали вихід різних протеїнів та чітке розрізнення між двома зонами в графіку елюції білка. Перша зона (1) відповідає результату, при якому протеїни вийшли з колони не вступаючи в реакцію з Ni²⁺, оскільки в їх послідовності не було гістидина. Після проходження даних протеїнів через колонку, спостерігали зниження абсорбції до моменту, коли буфер B починав проходити через колонку. У цьому випадку спостерігали пік абсорбції в зоні (2), яка відповідає результату, при якому виходить потрібний протеїн, тобто Кор-білок.

Елюція білка здійснювалася за допомогою буфера B, що містить високу концентрацію імідазолу. Молекула імідазолу має дуже високу афінність зв'язування з Ni²⁺, а отже, вступає в конкуренцію з залишками гістидину і призводить до їх вимивання.

Цей пік відповідав найбільш високій абсорбції у зоні (2). Зібрані фракції для аналізу - 1, 2, 3, 4, 5, що відповідають другій зоні (2), були проаналізовані за допомогою електрофорезу (рис. 5.6).

Рис. 5.6 Електрофореграма очищеного Кор-білку

Електрофорез дозволив виявити фракції, в яких Кор-білок був очищений. На даній електрофореграмі - це лунка 3.

Схожим чином було здійснено очищення рекомбінантного білка р72, який використовувся для вивчення африканської чуми свиней [35]. Рекомбінантний білок Р72 експресується у pET-системі у формі спліт-білка з гістидиновими залишками на кінці. Тому для його очищення використовували метод металохелатної афінної хроматографії на колонці з нікелевим сорбентом HIS-Select Nickel Affinity Gel [20].

Однак, для очищення білка p30, який також використовувся у даному дослідженні, використовували колонки фірми LKB Produkter з целюлозним сорбентом - мікрокристалічною целюлозою марки Avicel (MERCK), оскільки у плазміді pTT9 / ASFVp30, якою трансформували клітини, є ген CBD, кодуючий у структурі рекомбінантного білка целлюлозо-зв'язуючий домен, який забезпечує сорбцію рекомбінантного білка на целюлозі [20].

5.3 Результати імуноферментного аналізу

Імуноферментний аналіз здійснювали для перевірки наявності у отриманих фракціях питомого білка на автоматичному імуноферментному аналізаторі Mago 4. Для проведення ІФА використовували, крім фракції 3, і всі інші фракції.

Очищений рекомбінантний Кор-білок у ІФА специфічно взаємодіяв з імунними сироватками, що містять Anti-HCV-core (антитіла класу IgG до антигену core).

Результати проведення ІФА представлені у табл. 5.1. Жирним шрифтом відзначена позитивна реакція (присутність Кор-білка в зразках).

У таблиці показані розведення сироватки, фракції білків та результати їх взаємодії, які виражені у числових значеннях оптичної густини. Отже, за результатами ІФА наявність Кор-білка підтверджено у зразках 1, 2, 3, та 4.

Оптична густина розчину в певному діапазоні прямо пропорційна концентрації речовини і як можна бачити, оптична густина першого зразка, у двох перших розведеннях, досить висока, та відповідає значенням, що не характерні для високо очищеного продукту. Теж саме стосується другого зразка. У четвертому зразку кількість core протеїну мала, а у п'ятому - білок відсутній. Результати у третьому зразку вказують на відсутність домішок у досліджуваному матеріалі та наявність протеїну.

Таблиця 5.1. Результати виявлення Кор-білка в досліджених у ІФА зразках

Зразок	Розведення
	1:1	1:10	1:50	1:100	1:500
1	1,110± 0,112	0,496±0,101	0,148± 0,120	0,043± 0,134	0,041± 0,170
2	2,094± 0,106	2,00± 0,136	0,048± 0,105	0,055± 0,112	0,037± 0,101
3	0,460± 0,122	0,431± 0,121	0,199± 0.110	0,119± 0,131	0,117± 0,122
4	0,387± 0,900	0,354± 0,130	0,194± 0,111	0,110± 0,101	0,140± 0,120
5	0,173± 0,112	0,162± 0,100	0,049± 0,101	0,039± 0,121	0,035± 0,149
Лізат (К+)	0,313± 0,106	0,907± 0,910	0,452± 0,113	0,365± 0,110	0,107± 0,932
К-	0,039± 0,101	0,035± 0,109	0,060± 0,935	0,026± 0,118	0,020± 0,106

Примітка: жирним виділено показники для зразків, де наявний досліджуваний білок, К- та К+ - негативний та позитивний контроль

Таким чином, в результаті проведеної роботи було отримано стабільний штам продуцента рекомбінантного білка core, сам білок очищений за допомогою афінної хроматографії і протестований за допомогою імуноферментного аналізу.

Отриманий рекомбінантний Кор-білок вірусу гепатиту С може бути використаний для створення імуноферментних тест-систем, призначених для діагностики і моніторингу вірусного гепатиту С.

Крім того, з огляду на те, що відомим є факт того, що майже всі пацієнти, які одужали від гострого гепатиту С, мають довічно антикор-антитіла, що вказує на високу імуногенність цього білку, яка підтверджує можливість його використання в якості компоненту вакцини, тобто у перспективі отриманий білок може бути використаний і з цією метою [39].

Висновки

1. При проведенні досліджень на базі лабораторії відділу Білкової інженерії Інституту молекулярної біології і генетики НАН України показано можливість ефективної трансформації штамів E. coli Codon+ та pGRO плазмідою pET15b core з наступною експресією Кор-білка.

2. Встановлено, що найбільш ефективне очищення Кор-білка можливе з використанням афінної хроматографії на колонці з Ni-NTA-агарозою. Максимум очищеного Кор-білка виходить у 3-й фракції з отриманих у 2-й фазі хроматографії при елюції буфером В.

3. Методом ІФА з використанням специфічних імунних сироваток, що містили IgG-Anti-HCV-core-антитіла підтверджено наявність Кор-білка у фракції 3 у високій концентрації, що вказує на високу активність його експресії продуцентом та високий ступінь очищення.

Перелік посилань

1. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медбеши, Л. Верецкеи. - М.: Мир, 1982. - 448 с.

2. Грен Э.Я. Рекомбинантные вирусные капсиды - новое поколение иммуногенных белков и вакцин / Э.Я. Грен, П.П. Пумпен // Журнал ВХО. - 1988. - Т. II, №5. - С. 531-536.

3. Дмитриев Б.А. Проблемы и перспективы создания синтетических вакцин / Б.А. Дмитриев // Иммунология. - 1986. - №1. - С. 24-29.

4. Дорохова Е.Н. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа / Е.Н. Дорохова, Г.В Прохорова - М.: Высшая школа, 1991. - 256 с.

5. Ершов Ф.И. Вирусные гепатиты / Ф.И. Ершов // Антивирусные препараты. Справочник. Издание второе. - М., - 2006. - С. 269-287.

6. Калганова Т.Н. Практикум по микробиологии и биотехнологии: лабораторные работы / Т.Н. Калганова. - Южно-Сахалинск: СахГУ, 2011. - 56 с

7. Клаг У.С. Основы генетики / У.С. Клаг, М. Каммингс. - М.: Техносфера, 2007. - 896 с.

8. Коничев А.С. Молекулярная биология / А.С. Коничев, Г.А.Севастьянова. - М., 2005. - 397 с.

9. Лакина Е.И. РНК вируса гепатита C в организме больных хроническим гепатитом С / Е.И. Лакина, А.А. Кущ // Вопросы вирусологии. - 2002. - №2. - С. 4 - 11.

10. Лебедев Л.Р. Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени / Л.Р. Лебедев, А.А. Сизов, В.И. Масычева, Л.И. Карпенко, И.А. Рязанкин // Биотехнология. - 2001. - №1. - с. 3 - 12.

11. Макарик Т.В. Вирусный гепатит С: новое в эпидемиологии и методах диагностики / Т.В. Макарик, Е.А. Романов, // Гематология и трансфузиология. - 2001. - №3. - С. 86 - 91.

12. Мамедов М.К. К 20-летию идентификации вируса гепатита С / М.К. Мамедов, М.И. Михайлов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - №5. - С. 120 - 124.

13. Маниатис Т. Молекулярное клонирование (Методы генетической инженерии) / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М.: Мир, 1984. - 450 с.

14. Медунин Н.В. Вакцинология / Н.В. Медунин // М.: Триада-Х, 2004. - 272 с.

15. Мертвецов Н.П. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин / Н.П. Мертвецов, А.Б. Беклемишев, И.М. Савич. - Новосибирск: Наука, 1987. - 210 с.

16. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л.А. Остерман. - М.: Наука, 1981. - 288 с.

17. Прозоров А.А. Трансформация у бактерий / А.А. Прозоров - М.: Наука, 1988. - 376 с.

18. Сафонов В.И. Исследование белков и ферментов растений методом электрофореза в полиакриламидном геле / В.И. Сафонов, М.П. Сафонова // Биохимические методы в физиологии растений. - М.: Наука, 1971. - С. 113 - 137.

19. Сизов А.А. Разработка вирус-подобной конструкции для рецептор-опосредованного транспорта гена чГ-КСФ в клетки костного мозга in vivo / А.А. Сизов, Л.Р. Лебедев, В.И. Масычев, Т.А. Кашперов, А.М. Одегов // Биотехнология. - 2001. - №1. - С. 13-18.

20. Сова В.В., Выделение и очистка белков. Методическое пособие по курсу «Химия и биохимия белков и ферментов» / В.В. Сова, М.И. Кусайкин. - Владивосток: Дальневост. ун-т, 2006. - 42 с.

21. Титов В.Н., Электрофорез белков сыворотки крови / В.Н. Титов, В.А. Амелюшкина. - М.: Оптиум Пресс, 1994. - 62 с.

22. Шабарова З. А., Богданов А. А., Золотухин А. С. Химические основы генетической инженерии / А.З. Шабарова, А.А. Богданов, А.С. Золотухин. - М.: Изд-во МГУ, 1994. - 224 с.

23. Щелкунов С.Н. Клонирование генов / С.Н. Щелкунов. - Новосибирск: Наука, 1986. - 232 с.

24. Хубчер У. Генная инженерия и ветеринария. Вакцины, изготовленные с помощью генной инженерии, и анализ высоковариабельных участков ДНК / У. Хубчер // Schweiz. Arch. Tierheilk. - 1987. - №11. - С. 553 -564.

25. Юров Г.К. Конструирование и использование ДНК-вакцин / Г.К. Юров, Б.С. Народицкий, К.П. Юров // Ветеринария. - 1998. - №12. - С. 25 - 27.

26. Acton T.B. Robotic cloning and protein production platform of the northeast structural genomics consortium / T.B. Acton, K.C. Gunsalus, L. Xiao // Methods Enzymol. - 2005. - Vol. 394. - № 3 - P. 210 - 243.

27. Albeldawi M. Hepatitis C virus Prevention, screening, and interpretation of assay / M. Albeldawi, E. Ruiz-Rodriguez, W.D. Carey // Cleveland Clinic Journal of Medicine. - 2010. - Vol. 77. - № 9. - P. 616 - 626.

28. Allwinn R. Assessment of mumps virus-specific antibodies by different serological assays: which test correlates best with mumps immunity / R. Allwinn, B. Zeidler, K. E. Steinhagen // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2011. - Vol. 30. - № 10. - P. 1223 - 1228.

29. Atrasheuskaya A.V. Horizontal transmission of the L-3 live attenuated mumps vaccine virus / A.V. Atrasheuskaya, A.A. Neverov, A.V. Rubin, G.M. Ignatyev // Vaccine. - 2006. - Vol. 24. - P. 1530 - 1536.

30. Atrasheuskaya A.V. Investigation of mumps vaccine failures in Minsk, Belarus / A.V. Atrasheuskaya, E.M. Blatun, M.V. Kulak // Vaccine. - 2007. - Vol. 25. - P. 4651 - 4658.

31. Atrasheuskaya A. V. Mumps vaccine failure investigation in Novosibirsk, Russia, 2002-2004 / A.V. Atrasheuskaya, M.V. Kulak, S. Rubin, G.M. Ignatyev // Clin. Microbiol. Infect. - 2007. - Vol. 7. - P. 670 - 676.

32. Backhouse J. L. Evaluation of two enzyme immunoassays for detection of immunoglobulin G antibodies to mumps virus / J.L. Backhouse, H.F. Gidding, P.B. McIntyre, G.L. Gilbert // Clin. Vaccine Immunol. - 2006. - Vol. 13. - P. 764 - 767.

33. Barba G. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets / G. Barba, F. Harper, T. Harada // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - Vol. 94. - P. 5 - 1200.

34. Boulant S., Montserret R., Hope R.G. Structural determinants that target the hepatitis C virus core protein to lipid droplets / S. Boulant, R. Montserret, R.G. Hope // J. Biol. Chem. - 2006. - Vol. 281. - P. 222 - 247.

35. Cristenson B. Methods for screening the naturally acquired and vaccine-induced immunity to the mumps virus / B. Cristenson, M. Bцttiger // Biogicals. - 1990. - Vol. 18. - P. 213 - 219.

36. Cristofari G., Ivanyi-Nagy R., Gabus C. The hepatitis C virus Core protein is a potent nucleic acid chaperone that directs dimerization of the viral (+) strand RNA in vitro / G. Cristofari, R. Ivanyi-Nagy, C. Gabus // Nucleic Acids Res. - 2004. - Vol. 32. - P. 262 - 231.

37. Dayan G.H. Mumps outbreaks in vaccinated populations; are available mumps vaccine effective enough to prevent outbreaks? / G.H. Dayan, S. Rubin // Clin. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 47. - P. 1458 - 1467.

38. Dudarev M. Prevalence of scrum neutralizing antibodies against chimpanzee adenovirus 63 and human adenovirus 5 in Kenyan Children, in the context of vaccine vector efficacy. / M. Dudarev, L. Andrews, S.C. Gilbern // Vaccine - 2009. - Vol. 27. - №27. - P.3501-3504.

39. Fromentin R. A method for in vitro assembly of hepatitis C virus core protein and for screening of inhibitors / R. Fromentin, N. Majeau, M.E. Laliberte Gagne // Anal. Biochem. - 2007. - Vol. 366. - P. 37 - 45.

40. Hanna - Wakima R. Immune responses to mumps vaccine in adults who were vaccinated in child-hood / R. Hanna - Wakima, L.L. Yasukawa, P. Sung // J. Infect. Dis. - 2008. - № 12. - P. 1669 - 1675.

41. Houghton M. Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus / M. Houghton, S. Abrignani // Nature. - 2005. - Vol. 436. - P. 961 - 966.

42. Hussy P. Hepatitis C virus core protein: carboxy- terminal boundaries of two processed species suggest cleavage by a signal peptide peptidase / P. Hussy, H. Langen, J. Mous // Virology. - 1996. - Vol. 224. - P. 104 - 193.

43. Kunkel M. Self-assembly of nucleocapsid-like particles from recombinant hepatitis C virus core protein / M. Kunkel, M. Lorinczi, R. Rijnbrand // J. Virol. - 2001. - Vol. 75. - P. 211 - 229.

44. Langermans J.A. Protection of macaques against Mycobacterium tuberculosis infection by a subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85B and ESAT-6. / J.A. Langermans, T.M. Doherty, R.A. Vervenne // Vaccine. - 2005. - Vol.23. - P.2740 - 2750.

45. Lo S.Y. Differential subcellular localization of hepatitis C virus core gene products / S.Y. Lo, F. Masiarz, S.B. Hwang // Virology. - 1995. - Vol. 213. - P. 455 - 461.

46. McConnell M.J. Biology of adenovirus and its use asavectorfor gene therapy / M.J. McConnell, J.M. Impcriale // Hum. Gene. Ther. - 2004. - Vol.15. - P.1022 - 1033.

47. Mossong J. Seroprevalence of measles, mumps and rubella antibodies in Luxemburg: results from a national crosssectional study / J. Mossong, L. Putz, F. Schneider // Epidemiol. Infect. - 2003. - Vol. 132. - P. 11 - 18.

48. Munsen Kh. Prevalence of mumps antibodies in the Israeli population in relation to mumps vaccination policy and incidence of disease / Kh. Munsen, Y. Aboudy, E. Mendelson, M. S. Green, D. Cohen // Epidemiol. Infect. - 2008. - Vol. 136. - P. 688 - 693.

49. Norman G. R. Biostatistics. The bare essentials / G. R. Norman, D. L. Streiner // - 2nd Ed. - London, 2000. - 641 p.

50. Pipkin P.A. Assay of humoral immunity to mumps virus / P.A. Pipkin, M.A. Afzal, A.B. Heath // J. Virol. Meth. - 1999. - Vol. 79. - P. 219 - 225.

51. Rubin S.A. Antibody induced by immunization with the Jeryl Lynn mumps vaccine strain effectively neutralizes a heterologous wild-type mumps virus assiciated with a large outbreak / S.A. Rubin, L. Qi, S.A. Audet // J. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 198. - № 4. - P. 508 - 515.

52. Rubin S. Serological and phylogenetic evidence of monotypic immune responses to different mumps virus strains / S. Rubin, J. Mauldin, K. Chumakov // Vaccine. - 2006. - Vol. 24. - P. 2662 - 2668.

53. Santolini E. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis C virus core protein / E. Santolini, G. Migliaccio, N. La Monica // J. Virol. - 1994. - Vol. 68. - P. 341 - 363.

54. Santangelo M.P. Mycobacterium bovis BCG as a denverysystem for the RAP-1 antigen from Babesia bovis. / M.P. Santangelo, D. McIntosh, F. Bigi //Vaccine. -- 2007. -- Vol.25. - P.1104-1113.

55. Schuttler C.G. Suppression of hepatitis B virus enhancer 1 and 2 by hepatitis C virus core protein / C.G. Schuttler, N. Fiedler, K. Schmidt // J. Hepatol. - 2002. - Vol. 37. - P. 62 - 85.

56. Schwer B. Targeting of hepatitis C virus core protein to mitochondria through a novel C-terminal localization motif / B. Schwer, S. Ren, T. Pietschmann // J. Virol. - 2004. - Vol. 78. - P. 768 - 795.

57. Siavoshian S. Hepatitis C virus core, NS3, NS5A, NS5B proteins induce apoptosis in mature dendritic cells / S. Siavoshian, J.D. Abraham, C. Thumann, M.P. Kieny, C. Schuster // J Med Virol. - 2005. - Vol. 75. - P. 402 - 411.

Размещено на Allbest.ru

...