Свойства сайтов связывания miRNA С mRNA генов транскрипционных факторов (GRF) растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Республики Казахстан

Казахский национальный университет им. аль-Фараби

Кафедра биотехнологии

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

На тему: «СВОЙСТВА САЙТОВ СВЯЗЫВАНИЯ miRNA С mRNA ГЕНОВ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ (GRF) РАСТЕНИЙ»

Выполнила

Сагайдак А.И.

Алматы 2014

Введение

Актуальность темы. Sorghum bicolor (сорго зерновое) является важной зерновой культурой, которая обладает солестойкостью, высокой устойчивостью к засухе, тепловому стрессу. Легко приспосабливается к различным почвам. Зелёная масса и зерно охотно поедается многими видами сельскохозяйственных животных.

Сорго не только высокоурожайная культура, оно богато углеводами, белками, каротином, дубильными веществами, витаминами, которые играют важную роль в повышении продуктивности животных. По питательным свойствам зерно и зелёная масса сорго почти не уступают кукурузе и пшенице, а в некоторых регионах и превосходят их. Зерно сорго используется для производства продуктов питания, кормов, и в качестве сырья для производства крахмала, спирта и биотоплива [1].

Семена Glycine max (соя культурная) -- широко распространённый продукт. Для пищевой сои характерны следующие признаки, делающие её столь популярной: высокая урожайность; высокое (до 50%) содержание полноценного белка; наличие в составе витаминов группы В, железа, кальция, калия и незаменимых полиненасыщенных жирных кислот (линолевая и линоленовая); возможность профилактики остеопороза и сердечно-сосудистых заболеваний; обладает уникальными свойствами, позволяющими производить из неё широкий спектр разнообразных продуктов [2].

В связи с этим соя часто используется как недорогой и полезный заменитель мяса и молочных продуктов, причем не только людьми с небольшим достатком, но и просто людьми, по различным причинам отказавшимися от мяса, например, вегетарианцам. Так же соя входит в состав кормов молодняка сельскохозяйственных животных. Соевый шрот широко задействован в мясомолочной промышленности и входит в состав многих изделий из мяса [2].

Vitis vinifera (виноград культурный) - современный культурный виноград, отличающийся от всех диких подавляющим преобладанием обоеполых цветков. Является ветроопыляемым, насекомоопыляемым и самоопыляющимся растением. Установлены даже клейстогамные (опыление при закрытом цветке) формы винограда [3].

Плоды винограда используются для еды в свежем виде и для переработки на изюм, виноградный сок, вино, варенье, маринады, компоты, разные напитки (алкогольные и безалкогольные), а также уксус. С лечебной целью используются ягоды, корешки и листья. Вторичный продукт при получении сока - жмых идёт на корм скоту [3].

Обширное использование приведенных выше сельскохозяйственных растений и увеличивающийся на них спрос для производства требует создания растений с более высокими урожаями, продуктивностью и повышенной устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессам. miRNA (микроRNA) играют важную роль в развитии растений, а также в их устойчивости к абиотическим и биотическим стрессам.

Одним из возможных путей повышения продуктивности S.bicolor, V.vinifera и G.max является воздействие на их рост-регулирующие факторы (growth-regulating factors, GRF) с помощью miRNA.

miRNA играют главную роль в регуляции большинства биологических процессов растений. Они регулируют экспрессию генов, участвующих в развитии, метаболизме клеток, в процессах дифференцировки, клеточном цикле, апоптозе, реакции организмов на биотический и абиотический стресс [4].

Сведения о системе регуляции экспрессии генов с помощью miRNA у растений были получены учеными с помощью методов биоинформатики (компьютерный анализ), молекулярной биологии, общей и молекулярной генетики и генетической инженерии [5].

Биоинформатика непосредственно объединяет в себе достижения молекулярной биологии, информатики и математики. Ее целью является изучение структуры и функций гетерологичных биологических полимеров (нуклеиновых кислот и белков) и разработка специально составленных для этой цели алгоритмов и компьютерных программ.

На сегодня становится очевидно, что изучение механизмов miRNA-опосредованной регуляции экспрессии генов в растениях предоставляет новые возможности для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и улучшения качества урожая [4].

Научная новизна исследования. Показано, что в растениях сайты связывания miRNA c mRNA генов-мишеней имеют высокую степень комплементарности нуклеотидов, и эти сайты имеются в 5'UTR, CDS и 3'UTR. Установлено связывание семейства miR396 с mRNA рост-регулирующих транскрипционных факторов (GRF) Glycine max, Sorghum bicolor и Vitis vinifera. Определены сайты связывания miR396 с mRNA, вычислена свободная энергия их взаимодействия, составлены схемы связывания нуклеотидов miR396 с mRNA.

Практическая значимость работы. В регуляции экспрессии генов растений важную роль играют транскрипционные факторы. Экспрессия генов транскрипционных факторов находится под контролем miRNA. Воздействием miRNA на рост-регулирующие факторы можно повышать урожайность сельскохозяйственных культур и их устойчивость к неблагоприятным условиям окружающей среды (засухе, переувлажнению почвы, засолению, холоду, вредителям и патогенам, пестицидам и т. д.). При помощи miRNA можно регулировать экспрессию генов, определяющих их продуктивность и устойчивость к стрессу.

Оценка современного состояния. В условиях постоянного увеличения роста населения земли продовольственная проблема с каждым годом обостряется. На сегодняшний день главной задачей остается повышение продуктивности и устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам. Важную роль в регуляции экспрессии генов играет miRNA. В Республике Казахстан, на данный момент, исследования по регуляции экспрессии генов транскрипционных факторов растений вида S.bicolor, V.vinifera и G.max не проводились, хотя данные растения являются широко распространенными продуктами. Эта проблема решается лабораторией биотехнологии и биохимии НИИ «проблем биологии и биотехнологии».

Цель работы. Изучение сайтов связывания некоторых miRNA с mRNA генов транскрипционных факторов (GRF) S.bicolor, V.vinifera и G.max.

Задачи работы. 1. Найти сайты связывания и рассчитать энергию связывания miRNA с mRNA генов GRF S.bicolor, V.vinifera и G.max. 2. Выявить miRNA, влияющие на гены GRF S.bicolor, V.vinifera и G.max с максимальной энергией связывания.

Объекты исследования. Объектами исследований являются растения вида сорго (Sorghum bicolor), винограда (Vitis vinifera) и сои (Glycine max). В качестве материала исследования использованы нуклеотидные последовательности miRNA и mRNA генов GRF S. bicolor, V. vinifera и G. max, а также аминокислотные последовательности генов GRF S. bicolor, V. vinifera и G. max.

Теоретическая и методологическая основа. Компьютерный анализ структурно-функциональных свойств miRNA. Анализ взаимодействия miRNA с mRNA генов. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности генов mRNA были взяты из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Нуклеотидные последовательности генов miRNA получены из базы miRBase (http://www.mirbase.org).

Практическая база. Работа выполнена в ДГП на ПХВ «НИИ проблем биологии и биотехнологии» РГП «КазНУ имени аль-Фараби», в рамках проекта «Изучение свойств микроРНК важнейших сельскохозяйственных культур и их фундаментальной роли в повышения продуктивности растений», финансируемый МОН РК, научный руководитель к.б.н. С.Б. Оразова (Гос. номер 0112РК00556).

1. Обзор литературы

1.1 Транскрипционные рост-регулирующие факторы растений (GRF)

GRF (growth-regulating factors) - это факторы транскрипции генов структурных белков клеток растений и животных, влияющие на их рост. Транскрипционные факторы - это белки, контролирующие процесс синтеза mRNA на матрице ДНК (транскрипцию) путём связывания со специфичными участками ДНК [6]. Факторы транскрипции функционируют как самостоятельно, так и в комплексе с другими белками. Их подразделяют на репрессоры и активаторы. Репрессоры обеспечивают снижение, а активаторы, наоборот, повышение константы связывания RNA-полимеразы с регуляторными последовательностями регулируемого гена [7].

Повышение урожая любых растений можно увеличить путем воздействия на их рост-регулирующие факторы. В процессе дифференцировки и развития растений основную роль играют гены, которые содержат промоторы. В составе таких промоторов и выявлены транскрипционные элементы, которые определяют непосредственно гормональную специфичность роста растений [5].

Транскрипционные факторы растений семейства GRF были открыты относительно недавно. В настоящее время изучены экспрессии генов, которые отвечают за рост, эмбриогенез, старение, фотоморфогенез. С помощью баз данных, содержащих генетическую информацию, и компьютерного анализа стало возможным оценивать взаимодействия между различными регуляторными генами в процессе дифференцировки клеток, а также формирования органов растения [5].

Одним из первых транскрипционных факторов риса является GROWTH-REGULATING FACTOR1 (OsGRF1) - «рост-регулирующий фактор1» [7]. Далее было описано семейство генов GRF Arabidopsis thaliana. Исследователи выявили, что выделенные белки AtGRF содержат характерные домены QLQ (глутамин, лейцин, глутамин) и WRC (триптофан, аргинин, цистеин) как у OsGRF1 [7].

Гены AtGRF экспрессированы на кончиках побегов, цветочных почках и корнях и слабо выражены в зрелом стебле и тканях листьев. Чрезмерная экспрессия AtGRF1 и AtGRF2 увеличивала размеры листьев и семядолей в той же степени, в какой она задерживала цветение побега по сравнению с растениями дикого типа [7]. Мутанты с тремя вставками в гены AtGRF1-AtGRF3 имели маленькие листья и семядоли, тогда как мутанты с единственной вставкой показывали отсутствие изменений в фенотипе и двойные мутанты показывали одно незначительное изменение. Изменение роста листьев при чрезмерной экспрессии и тройной мутации было основано на увеличении или уменьшении роста клеток. Эти результаты показывают, что белки AtGRF играют роль в регуляции растяжения и роста клеток в тканях листьев и семядолей [7]. А воздействовать на синтез самих белков AT GRF можно с помощью miRNA.

1.2 Общие сведения о miRNA растений

Регуляция активности генов растений осуществляется на уровне транскрипции, сплайсинга mRNA, трансляции и деградации белков. В последнее время в эту регуляторную сеть был включен новый компонент: регуляция, осуществляемая микроRNA (miRNA) [8]. Большинство miRNA растений высококонсервативны, видоспецифичны и участвуют в регуляции различных биологических процессов.

miRNA это класс некодирующих одноцепочечных RNA длиной от 20 до 24 нуклеотидa, которые комплементарно или частично комплементарно связываются с mRNA и приводят к ее разрушению или ингибированию трансляции с этой mRNA. Эти RNA играют важную роль в регуляции трансляции и деградации mRNA [8, 9].

У растений miRNA играют важную роль в установлении сложной пространственной и временной регуляции активности генов, необходимой для развития организма, и наряду с этим участвуют в ряде процессов функционирования на взрослой стадии [9].

miRNA кодируются генами, первые из которых были обнаружены в 1993 году у Caenorhabditis elegans группой исследователей во главе с Виктором Амбросом [10]. Эволюционно гены miRNA являются производными мобильных элементов класса MITE (miniature inverted-repeat transposable elements) и возникли из отдельных копий транспозонов. Транскрипты MITE благодаря наличию инвертированных повторов и формированию шпилек клетка распознавала и использовала для подавления активности остальных копий транспозонов [10, 11].

В настоящее время miRNA обнаружены у животных и растений. Мишенями miRNA является внушительное число генов - по меньшей мере треть генов генома. Ранее считалось, что miRNA присущи лишь многоклеточным организмам, однако, наличие этой группы молекул обнаружено и у одноклеточных эукариот, а именно - у вида зелёных водорослей Chlamydomonas reinhardtii [11]. Это может свидетельствовать о большем эволюционном возрасте miRNA, чем ранее предполагалось.

Первые miRNA у растений были открыты путем клонирования малых RNA у арабидопсиса, представленных большим числом разновидностей. Среди этих малых RNA miRNA выделяются в отдельный класс в силу следующих характеристик: 1. Они относятся к малым RNA эндогенного происхождения и кодируются генами, локализованными в участках генома, обособленных от ранее аннотированных генов. 2. В процессе биогенеза они образуются из RNA-предшественника, обладающего специфичной шпилечной структурой. 3. Последовательности miRNA и соответствующих сайтов взаимодействия с mRNA -мишенями, как правило, консервативны [9].

Данные о последовательностях зрелых miRNA, их предшественниках и локализации их генов аккумулируются в базе данных miRbase (http://www.mirbase.org/) [9].

Среди почти тысячи генов miRNA растений, представленных в базе miRbase, примерно 100 семейств miRNA образуют эволюционную сеть молекул в Arabidopsis. Некоторые семейства miRNA консервативны во мхе, что указывает на их древнее происхождение. К ним относятся miR156, miR160, miR319 и miR390, каждая из которых регулирует транскрипционные факторы, которые определяют основные функции меристемы, деление клеток или гормональный контроль. Примечательно, что ни одна из miRNA, выявленных в одноклеточной водоросли Chlamydomonas, не сохраняется в многоклеточных растениях [7, 12].

На настоящий момент описаны 338 miRNA у арабидопсиса, 661 у риса, 243 у сорго, 321 у кукурузы, 556 у сои и 185 у винограда. У каждого из этих видов есть гены miRNA, кодирующие абсолютно идентичные или различающиеся по одной или двум заменам зрелые miRNA [13]. Гомологичные miRNA-гены образуют семейство паралогичных miRNA-генов, кодирующих соответственно семейство гомологичных miRNA. Члены одного семейства различаются буквой, приписываемой к названию семейства, например, athmiR169a и ath-miR169b [12, 13]. Гены, кодирующие miRNA растений, расположены в межгенных промежутках и достаточно удалены от белок-кодирующих генов, что указывает на то, что они транскрибируются независимо [13]. Анализ молодых miRNA в Arabidopsis предлагает один потенциальный вариант происхождения генов miRNA в растениях (рисунок 1).

Как показано на рисунке 1, двухцепочечная RNA с идеальным спариванием оснований первоначально создается и перерабатывается DCL3 и DCL4 в siRNA (proto-MIR). Область стебель-петля постепенно приобретает мутации (синий), которые способствуют укорачиванию и появлению выпуклостей в структуре дцRNA. В результате молодые гены miRNA производят транс-действующие малые молекулы RNA. Одна из этих RNA проходит отбор на основе эволюционной комплементарности к генам-мишеням [12].



Рисунок 1. Эволюция молодых miRNA-кодирующих генов через инвертированную дупликацию [12]

Отсутствие отбора приведет к генетическому дрейфу, в результате чего часть генов miRNA в конечном итоге будет потеряна. Впоследствии селекция будет определять формирование древних генов miRNA из молодых, в которых размер и различные выпуклости в структуре стебель-петля будут совместимы с процессингом DCL1 в молекулу miRNA. Согласованная эволюция гена-мишени будет способствовать выбору дискретного сайта связывания miRNA (например, в кодирующей области) [12].

Существуют несколько моделей эволюции miRNA [12]. Первая возможная модель эволюции называется «Спонтанная эволюция», которая заключается в высокой плотности малых и средних по размеру fold-back последовательностях, разбросанных по всему геному Arabidopsis (рисунок 2).



Рисунок 2. Спонтанная эволюция miRNA [12]

На рисунке 2 изображена спонтанная эволюция генов miRNA от небольших случайных инвертированных повторов, расположенных вдоль геномов растений. siRNA, полученные от таких повторов, случайно совпадали с комплементарными участками, которые находятся в потенциальных генах-мишенях [12]. Последующий отбор способствовал изоляции одной молекулы miRNA в структуру стебель-петля.

После захвата транскрипционных регуляторных последовательностей, некоторые из этих случайных fold-back последовательностей могли создать новые гены miRNA [12]. Стабилизация через коэволюцию впоследствии могли привести к фиксации этих генов в геноме.

Вторая модель опирается на недавнее наблюдение, что неавтономные элементы ДНК-типа, известные как миниатюрные перевернутые повторы мобильных элементов, легко складываются в структуру стебель-петля (рисунок 3), типичные для miRNA - предшественников [12].

Тем не менее, цис-действующие, DCL3-зависимые, siRNA длиной 24 н., участвующие в остановке транскрипции мобильных элементов, также присутствуют на этих локусах [12]. Таким образом, остается спорным, являются ли эти малые RNA действительно miRNA, а не siRNA.



Рисунок 3. Эволюция miRNA через мобильные элементы [12]

Несмотря на эти химические, биохимические и механизменные сходства miRNA с siRNA, существуют различия между происхождением и эволюционной консервативностью: 1) miRNA являются производными от геномных локусов, в то время как siRNA происходят от mRNA, транспозонов, вирусов или гетерохроматиновых ДНК; 2) miRNA синтезируются в результате обработки RNA-предшественника (прекурсора) с образованием зашпиленных структур, в то время как siRNA синтезируются в результате обработки длинных бимолекулярных дуплексов RNA или малых RNA, образующих шпильки (shRNA); ;3) молекулы miRNA образуются от одной цепи зашпиленного предшественника miRNA, в то время как различные siRNA накапливаются с обеих нитей siRNA-прекурсоров; 4) miRNA-последовательности почти всегда консервативны у родственных организмов, тогда как последовательности siRNA редко бывают консервативными у родственных организмов. Эти различия были использованы для разработки практических рекомендаций для выделения и описания вновь открываемых miRNA [14, 17].

1.3 Биогенез miRNA растений

miRNA растений являются классом 20-24 н. молекул RNA, которые регулируют посттранскрипционную экспрессию эукариотических генов.

Репрессия транскрипта мишени miRNA может произойти через ингибирование трансляции, ускоряющее экзонуклеотический распад mRNA, или разрезание в пределах спаривания оснований miRNA-mRNA [12]. Наиболее охарактеризованными эукариотическими генами MIR являются единицы транскрипции RNA-полимеразы II (Pol II), которые образуют первичный транскрипт miRNA, называемый pri-miRNA. pri-miRNA, как правило, представляет собой загнутую назад структуру, которая преобразуется в структуру стебель-петля предшественника (pri-miRNA) и далее вырезается в виде RNA-дуплекса (рисунок 4) [12].

Рисунок 4. Биогенез miRNA [12]

На рисунке 4 изображен молекулярный путь обработки и стабильность консервативных miRNA растений. pri-miRNA растений в основном транскрибируется RNA-полимеразой II (Pol II) из областей, расположенных между белок-кодирующими генами [12, 14].

DAWDLE (DDL RNA-связывающий белок, по-видимому, стабилизирует pri-miRNA для их преобразования в структуру стебель-петля pre-miRNA, которые называются D-телами [12, 14].

Эта реакция влечет за собой согласованные действия на физические взаимодействия С₂Н₂-цинковых пальцев белка SERRATE (SE), двухцепочечной RNA-связывающего белка HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1), Dicer-1 (DCL1) и ядерных Cap-связывающего комплекса (CBC). Pre-miRNA, или зрелые miRNA, образованные с помощью DCL1, затем экспортируются в цитоплазму экспортином 5 в растениях [14]. Зрелые дуплексы RNA, вырезанные из pre-miRNA, метилируются HEN1. Эта реакция защищает их от деградации посредством класса экзонуклеаз SMALL RNA DEGRADING NUCLEASE (SDN). Затем miRNA связываются с AGO белками, что приводит к реакции сайленсинга [12, 14].

DCL1 является важным ферментом, который превращает pri-miRNA в pre-miRNA, затем в дуплекс miRNA. Нормальная экспрессия генов DCL1 необходима для синтеза и накопления зрелых miRNA. Потеря функции гена DCL1 снижает уровень зрелых miRNA и, следовательно, является причиной многих нарушений развития, таких, как изменения формы листьев, задержка развития цветка, задержка в развитии эмбрионов на ранних стадиях, и бесплодие растений [14, 15].

HASTY является ортологом экспортина 5, белка, транспортирующего дуплекс miRNA:miRNA* из ядра в цитоплазму. Без этого гена невозможно синтезировать зрелые miRNA. Исследования показали, что потеря функции гена HASTY вызвало много плейотропных фенотипов, в том числе нарушения формы листьев и морфологии цветов, снижение рождаемости, и ускорение изменения вегетативной фазы и нарушения филлотаксиса цветения. Эти результаты доказывают, что miRNA участвуют в различных процессах развития растений [14, 15].

miRNA играют важную регуляторную роль, способствуя расщеплению или трансляционной репрессии mRNA [14]. Они являются продуктами одного из самых многочисленных классов генов регуляторных молекул в многоклеточных организмах и, вероятно, влияют на экспрессию многих белок-кодирующих генов [11].

Несколько классов малых RNA появились как ключевые регуляторы эукариотической экспрессии генов. miRNA, которые эндогенно проявляются 21-24-нуклеотидными RNA, регулируют конкретные мишени в mRNA на посттранскрипционном уровне [12]. Эти короткие молекулы RNA являются производными от несовершенных предшественников - прекурсоров, имеющих шпилечную структуру, которые обрабатываются семейством рибонуклеазы III DICER.

В последние годы, в целом, важность miRNA в качестве основных молекулярных компонентов развития была продемонстрирована идентификацией сотен видов miRNA в растениях и животных путем тактики клонирования генов или компьютерного анализа в сочетании с выявлением соответствующих mRNA - мишеней [10].

Большинство miRNA растений вызывают деградацию mRNA путем частичного или полного комплементарного взаимодействия с последовательностью мишени на одном участке, обычно в белок - кодирующей области. Eсть только несколько примеров miRNA, имеющих сайты связывания в 5'UTR и 3'UTR mRNA-мишени [14]. Про уникальную miRNA (miR172) первоначально предполагали, что она действует через трансляционную репрессию, несмотря на почти идеальную комплементарность нескольким mRNA-мишеням. Позднее было показано, что она также способствует деградации mRNA, по крайней мере, двух своих мишеней [15].

1.4 Строение и функции miRNA растений

Как было описано выше, подавляющее большинство miRNA растений направляют процесс расщепления mRNA-мишеней, образуя почти совершенные дуплексы с ними [14, 17]. Это свойство miRNA растений позволяет с высокой надежностью предсказывать их mRNA-мишени с помощью традиционных методов компьютерного выявления участков нуклеотидной гомологии [10].

miRNA растений отличаются от таковых у животных. Главное отличие заключается в размере и структуре pre-miRNA. Их размер у растений более вариабельный и сами pre-miRNA длиннее. Максимальная длина pre-miRNA у арабидопсиса - 377 нуклеотидов [7, 17, 19]. Вторичная структура pre-miRNA растений может быть сложнее, чем таковая у животных [17, 19].

Еще одно из различий miRNA растений и животных состоит в том, что регулируемые мишени растительной miRNA можно убедительно предсказать просто путем выявления mRNA с почти идеальной комплементарностью. [17, 19]. Экспериментальные данные связывания miRNA и mRNA Arabidopsis и риса (Oryza sativa) показывают [12, 19], что miRNA может способствовать расщеплению mRNA-мишени, и подтверждают справедливость этих прогнозов. Способность с уверенностью предсказать регулируемые мишени для miRNA растений даёт уже, возможно, более глубокое понимание роли и регуляторного биохимического механизма действия miRNA у растений, чем у животных [12, 19].

Экспрессия miRNA может контролироваться гормонами. Абсцизовая кислота регулирует экспрессию miR393 [17, 20], гиббереллин - экспрессию miR159, а ауксин - экспрессию miR164. Также, miRNA контролируют ответ на гормоны.

Для белка NAC1 мишенью является mir164. NAC1 - белок, осуществляющий путь передачи ауксинового сигнала, необходимого для развития латеральных корней [17, 21]. После обработки ауксином приблизительно в 1,5 раза увеличивается уровень miR164, но это приводит к снижению уровня mRNA для NAC1 и, естественно, ослаблению ауксинового сигнала [17]. NAC1 действует в цепи передачи ауксинового сигнала после белка TIR1, экспрессия которого, в свою очередь, находится под контролем-miR393 [17].

mRNA других факторов ответа на ауксин являются мишенями miR160 и miR167 [17, 21]. Мишенями для miRNA являются гены, контролирующие протеолиз, процессы передачи сигналов, метаболизм, транспорт ионов, стрессовый ответ и другие важные процессы в растении [17, 21]. Значительной частью мишеней являются mRNA, кодирующие транскрипционные факторы [17].

Экспериментальные данные, накопленные к настоящему времени, позволяют утверждать, что в большинстве случаев miRNA осуществляют постранскрипционную регуляцию активности генов при образовании новых типов клеток в ходе развития организма, ингибируя активность негативных регуляторов, препятствовавших преждевременной дифференцировке родительской клетки [17].

Таким образом, мутации по miRNA или по генам, контролирующим их созревание, приводят к задержке дифференцировки новых типов клеток в ходе онтогенеза. Мутации в сайтах связывания miRNA в генах-мишенях, ведущие к конститутивной экспрессии их mRNA, или конститутивная экспрессия самих miRNA-генов приводят к ускоренному появлению этих типов клеток [17].

miRNA влияют на посттранскрипционную регуляцию генов цветения растений [22]. Понимание пространственной и временной динамики активности miRNA является центральным для понимания их функций. miRNA представляют собой, как правило, 22-нуклеотидные RNA, которые синтезируются из участков эндогенных транскриптов-предшественников, имеющих структуру «стебель-петля» [12].

miRNA играют важную роль как посттранскрипционные регуляторы своих генов-мишеней в растениях и животных [23]. Несмотря на малые размеры, эволюционная история семейства генов miRNA похожа на эволюцию их белок-кодирующих аналогов. В отличие от небольших, но многочисленных семейств miRNA в геномах животных, растения имеют меньшее число, но более многочисленные семейства генов miRNA [23]. Хотя многие гены miRNA консервативны у растительных видов, те же самые семейства генов существенно различаются по размеру и геномной организации в различных видах, что может привести к дозовым эффектам и пространственным и временным различиям в регуляции генов-мишеней [24].

В настоящее время существует несколько методов идентификации miRNA: вычислительный метод, генетический скрининг, метки экспрессированных последовательностей (ESTs) и направленное клонирование после изоляции miRNA [14, 25].

Был разработан сравнительный геномный подход систематической идентификации miRNA и их мишеней, которые являются консервативными у Arabidopsis thaliana и риса (Oryza sativa) [19]. Методы идентификации были основаны на их главных характеристиках [14, 25]: 1) все miRNA - малые некодирующие RNA, обычно состоящие из 20-22 нуклеотидов (н.) у животных и 20-24 н. у растений [14, 25, 26]. 2) все предшественники miRNA имеют хорошо предсказанную шпилечную структуру стебель-петля, и эта вторичная шпилечная структура имеет низкую свободную энергию. Большинство предшественников miRNA имеют свободную энергию ниже (-32-57 kcal/mol), чем транспортная RNA (tRNA) (-26-29 kcal/mol) или рибосомальная RNA (rRNA) (-33 kcal/mol) [26]. 3) многие miRNA эволюционно консервативны: от червей до человека [27-29], или от папоротников до двудольных и однодольных растений [30]. miRNA растений менее консервативны, чем miRNA животных.

miRNA растений были обнаружены на 10 лет позднее miRNA животных. За эти годы группы ученых обнаруживали miRNA растений путем клонирования малых RNA. С тех пор стали использоваться различные методы для нахождения новых miRNA. В последнее время общее число miRNA стало возрастать в результате улучшения методов идентификации miRNA [31, 32].

Физиологические функции miRNA крайне разнообразны - фактически, они выступают основными небелковыми регуляторами онтогенеза. miRNA не отменяют, а дополняют «классическую» схему регуляцию генов (индукторы, супрессоры, компактизация хроматина и т. д.) [14, 33]. Кроме того, синтез самих miRNA сложным образом регулируются (определенные пулы miRNA могут включаться интерферонами, интерлейкинами, фактором некроза опухолей б (ФНО-б) и многими другими цитокинами). В результате вырисовывается потрясающая по своей сложности и гибкости многоуровневая сеть регуляции экспрессии генов [34].

1.5 Свойства сайтов связывания miRNA с mRNA

Сайты связывания miRNA растений расположены в кодирующей области генов-мишеней и для того, чтобы miRNA связались с транскриптами-мишенями, необходима почти полная комплементарность между ними (рисунок 5) [35].

Рисунок 5. Различные сайты связывания miRNA с mRNA [35]

Сайты связывания miRNA основаны на комплементарности в 5'- и 3'-области miRNA и выделяет три вида сайтов: 1) канонические, 2) 3'-дополнительные, 3) 3'- компенсаторные сайты [35]. Большинство канонических сайтов связывания имеют полную комплементарность в 5'-области, которая определяет возможность взаимодействия. Существует три типа канонических сайтов [36]: 7mer1A - имеет аденин в позиции 1 на 5'-конце miRNA; 8mer, имеет связывание аденина в положении 1 и дополнительное связывание в положении 8; и 7mer-m8, имеющая совпадение в положении 8.

1.6 miRNA Sorghum bicolor

В растениях miRNA составляют один из двух классов малых RNA, которые функционируют преимущественно как отрицательные регуляторы на посттранскрипционном уровне. Несколько генов miRNA в растительном царстве являются древними, консервативными, в то время как многие другие в последнее время эволюционировали. Для выявления, профилирования и анализа неконсервативных генов miRNA у S. bicolor было использовано глубокое секвенирование и компьютерные методы [24]. В отличие от большого количества miRNA, предсказанных в моделях растений риса, на данный момент в сорго идентифицированы только 243 miRNA [1]. Исследователи использовали для прогнозирования новых miRNA в сорго 1379 известных и уникальных растений, произошедшие из 33 разных культур. Они определили 31 новую miRNA, принадлежащих к 10 различным семействам miRNA. Ученые прогнозировали, что большинство из 72 потенциальных генов-мишеней для 31 miRNA будут задействованы в росте и развитии растений. Эти недавно идентифицированные miRNA добавили к растущей базе данных miRNA, а также они положили начало дальнейшему изучению функций miRNA в развитии сорго [1].

Гены, кодирующие miRNA, транскрибируются посредством RNA-полимеразы II, чтобы произвести первичный транскрипт (pri-miRNA). Структура стебель-петля pri-miRNA обрабатывается ферментом Dicer-Like (DCL) RNAазы III (в Arabidopsis в основном DCL1), чтобы произвести дуплекс miRNA - miRNA* длиной примерно 21 нуклеотид [14].

DCL1 катализируемой обработки pri-miRNA предшественника miRNA требует два дополнительных RNA-связывающих белков именно HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1) и SERRATE (SE) в Arabidopsis [36, 38]. HEN1, метилтрансфераза, катализирует 2'-O-метилирование 3'-конца в дуплексе miRNA-miRNA*. miRNA экспортируются в цитозоль с помощью HASTY (Exportin 5). В цитозоле miRNA загружается в AGO1 содержащие RISC-комплекс, который катализирует PTGS [14, 39, 40].

Недавно идентифицированные miRNA в этом исследовании были отнесены к различным семействам miRNA в сорго [1]. Распределение по семействам было основано на схожести последовательностей между недавно выявленными miRNA и уже известными miRNA в других растениях, включая miRNA сорго в miRBase [41]. Чтобы определить гомологию последовательностей, было выполнено многократное выравнивание последовательностей при помощи ClustalW61 и на основе кластерного анализа, в результате чего исследователи распределили 31 miRNA по соответствующим семействам miRNA. В этом исследовании 31 новых идентифицированных miRNA были распределены по 10 разнообразным семействам miRNA сорго, а именно, miR156, miR166, miR167, miR168, miR171, miR390, miR396, miR398, miR399 и miR444 (рисунок 6) [1, 41, 42].

Среди новых miRNA наибольшее число, девять miRNA, были отнесены к семейству miR166, следующие шесть miRNA включены в семейство miR396. Длина нуклеотида варьировала от 19 до 24 н. со средним числом 20.91 ± 1.18 н. Длина нуклеотида у pre-miRNA сорго (стебель-петля) изменялась от 74 до 243 н. со средним числом 122.58 ± 32.78 н. [42, 43]. Распределение длин miRNA и последовательностей их предшественников аналогичны результатам в других видах растений [42, 43]. Характерной особенностью 31 miRNA являлось то, что 22 из них (71%) начинались с 5'уридина [42, 43]. Зрелые последовательности miRNA были расположены на плече вторичной структуры стебель-петля pre-miRNA. Исследователи определили, что 11 из 31 miRNA (35%) были обнаружены на 5'-плече структуры стебель-петля (рисунок 7), а 20 (65%) расположены на 3'-плече [42].

Рисунок 6. Распределение 31 miRNA в различные семейства miRNA [42]

Рисунок 7. miRNA, расположенная на

1.7 miRNA G. max

Практически все растений испытывают абиотический стресс (например, засуха, засоление, щелочность, холод, патогенные реакции и другие различные заболевания). Это является основной причиной снижения урожайности сельскохозяйственных культур [44]. Являясь одним из основных масличных культур в мире, Glycine max испытывает воздействия окружающей среды. Чтобы справится с этим, культуры развивались в сложных адаптивных механизмах реагирования [44]. Поэтому, распутывание сложных механизмов устойчивости соевых бобов будут обеспечивать фундаментальное понимание в биологических процессах, связанных с внешними раздражителями, которые могут оказаться полезными в облегчении потери урожая.

Появляется все больше доказательств того, что miRNA выступают в качестве ключевых факторов в регуляции экспрессии генов, процессах развития и устойчивости растений к стрессовым ситуациям [45]. Действительно, было высказано мнение, что miRNA, которые участвуют в стрессовых реакциях, приспособились к решению экологических проблем. Например, Philips [46] сообщал, что miR395, miR397b, miR402 участвуют в стрессовых ситуациях.

Знание роли, которую играют miRNA в условиях стресса у растений все еще остаются ограниченными. В последние годы, стало возможным определить miRNA с помощью методов биоинформатики и секвенирования. Например, различные методы были использованы для выявления miRNA в рисе, пшенице и кукурузе [46].

Глубокое секвенирование определило многие miRNA в различных видах растений, мутантов и тканей на различных стадиях развития [47]. 556 известных miRNA, соответствующих 95 семействам miRNA были обнаружены в геноме сои. Кроме того, экспрессия 71, 50 и 45 miRNA проводилась в условиях засухи, засоления и защелачивания почв, предполагая, что экспрессия многих miRNA проходила по-разному в ходе различных факторов окружающей среды [47].

Более 36 миллионов первоначальных помеченных последовательностей производили около 9-10 миллионов необработанных считываний с каждой библиотеки. После обработки от низкого качества, фильтрации 5'загрязняющих примесей и обрезки 3'-конца, адаптер начал считывать. Всего 9,357,545; 9,003,582 и 9,223,744 чистых считываний были получены от применений засухи, засоления и защелачивания почв, соответственно [47].

Хотя общее число последовательностей, которые считывались в трех библиотеках RNA, были похожи, распределение помеченных последовательностей осуществлялся по-разному (рисунок 8). Например, 2182005 (23.72% чистых считываний) последовательностей являются каноническими малыми RNA из 21 нуклеотида, с наиболее распространенными малыми RNA в корнях сои. В то время как 7651982, 1505929 и 1476829 считывали 21 нуклеотид из других трех библиотек, учет составил 19.64% чистого считывания от засухи, 20.22% чистого считывания от солености и 14.33% чистого считывания от защелачивания, соответственно [47].

Рисунок 8. Длина размеров распределения miRNA в сои при засухе, засолении и защелачивании почв [47]

1.8 miRNA V. vinifera

В настоящее время, сотни miRNA были идентифицированы вычислительными и/или экспериментальными подходами во многих растениях [48, 49]. Большое количество выявленных miRNA были консервативны в различных видах растений. Кроме того, довольно большое число конкретных видов miRNA, которые найдены в нескольких видах растений, имеют эволюционно консервативные последовательности [48, 49].

Исследование было направлено на изучение эволюционных консервативных miRNA других растений и эти выводы могли бы обогатить генетические исследования miRNA на основе регуляторных систем в винограде. Выявление новых консервативных miRNA в V. vinifera позволило создать библиотеку miRNA с размером от 15 до 30 нуклеотидов [50, 51].

Всего 19,692,474 считываний были получены из секвенирования наборов данных. После удаления адаптера и фильтрации низкого качества считывания были получены 18,902,700 (95.99%) чистых считываний, которые включают 6,740,185 уникальных последовательностей. Среди чистых считываний 8,706,269 (46.06%) соответствовали геному винограда, среди которых 1,030,053 были похожи с уже известными miRNA, в то время как другие последовательности принадлежали другим типам RNA, в том числе и non-coding RNA, t-RNA, r-RNA, snRNA или snoRNA [51].

Идентифицированные miRNA в этом исследовании были отнесены к различным семействам miRNA (рисунок 9). Распределение по семействам было основано на схожести и уже известными miRNA в других растениях [51].



Рисунок 9. Распределение miRNA винограда в различные семейства [51]

Как видно из рисунка 9, идентифицированные miRNA были распределены по 13 разнообразным семействам miRNA винограда, а именно, miR479, miR399, miR396, miR319, miR171, miR169, miR168, miR167, miR166, miR164, miR160, miR159 и miR156 [51]. Самое многочисленное семейство является miR166, оно включает в себя 36 идентифицированных miRNA. Самое малое количество идентифицированных miRNA - всего 2 - объединяет семейство miR159. В случае с семейством miR396, оно включает в себя 4 miRNA: miR396a, miR396b, miR396c и miR396d.

Sorghum bicolor, Glycine max и Vitis vinifera являются высокоурожайными культурами в нашей стране. Обширное использование данных сельскохозяйственных растений и увеличивающийся на них спрос для производства требует создания растений с более высокими урожаями, продуктивностью и повышенной устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессам. Так как miRNA играют важную роль в развитии растений, а также в их устойчивости к абиотическим и биотическим стрессам, одним из возможных путей повышения продуктивности является воздействие на их рост-регулирующие факторы (GRF) с помощью miRNA. Поэтому нами изучено связывание miRNA с mRNA генов рост-регулирующих транскрипционных факторов.

2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы исследования

Объектами исследований являются растения вида сорго (Sorghum bicolor), винограда (Vitis vinifera) и сои (Glycine max). В качестве материала исследования использованы нуклеотидные последовательности miRNA и mRNA генов GRF S. bicolor, V. vinifera и G. max, а также аминокислотные последовательности генов GRF S. bicolor, V. vinifera и G. max.

2.2 Методы исследования

В работе использованы методы компьютерного анализа:

1. Извлечение нуклеотидных последовательностей miRNA S. bicolor, V. vinifera и G. max из базы данных miRBase (http://mirbase.org/);

2. Извлечение нуклеотидных последовательностей mRNA генов GRF и аминокислотных последовательностей GRF из базы данных Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/);

3. Поиск сайтов взаимодействия miRNA с генами при помощи программы E-RNAHybrid (http://sites.google.com/site/malaheenee/software/).

Для подготовки последовательностей mRNA была использована программа lextractor (http://sites.google.com/site/malaheenee/software/). Поиск сайтов осуществлялся с помощью программы RNAhybrid 2.1 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid), которая выдавала 5 сайтов со свободной энергии гибридизации (ДG) для каждой miRNA в каждом гене. Cвободную энергию гибридизации выражали в kJ/mol (1 kcal/mol = 4,18 kJ/mol). Программа выдает энергию гибридизации и схему взаимодействия для каждого сайта [52].

Для автоматизации процесса поиска генов использовали скрипт E-RNAhybrid (http://sites.google.com/site/malaheenee/software/), который расчитывал ДG/ДG_m, p-значение для каждого сайта. Программа выдает информацию о локализации (5'UTR, CDS и 3'UTR) и позиции начала сайта в нуклеотидной последовательности mRNA. При расчете коэффициента достоверности использовали корректирующий коэффициент, который зависит от длины miRNA [52].

Параметр ДG/ДG_m выражаются в процентах (%), где ДG - свободная энергия гибридизации определенной miRNA с mRNA, ДG_m - максимальная возможная свободная энергия гибридизации для этой miRNA. Этот параметр является сравнительным количественным критерием силы взаимодействия miRNA с mRNA [52].

Сайты взаимодействия miRNA с mRNA определяли на основании величины ДG/ДG_m. Начальная величина ДG/ДG_m зависит от длины miRNA. Сродство miRNA к 5'UTR, CDS и 3'UTR mRNA изученных генов оценивали на основании величины ДG/ДG_m [52].

3. Результаты исследования и обсуждение

3.1 Характеристики сайтов связывания miRNA в mRNA генов GRF S.bicolor, V.vinifera и G.max

По полученным результатам компьютерного анализа гибридизации miRNA и mRNA генов GRF S.bicolor V.vinifera и G.max были составлены таблицы 1-10, в которых область допустимых значений энергии взаимодействия соответствующих miRNA и mRNA начинается с 85%-й комплементарности.

В первом столбце представлены названия генов GRF, во втором -- названия miRNA, в третьем - позиции сайтов связывания в белок-кодирующей части mRNA (CDS -- англ. coding sequence - «кодирующая последовательность»), в четвертом - значения энергии гибридизации miRNA с полностью комплементарной последовательностью, в пятом -- энергия гибридизации miRNA и mRNA (ДG miR/mRNA) и степень комплементарности.

В таблице 1 представлены сайты взаимодействия sbi-miR396e с восьмью генами факторов роста.

Таблица 1. Характеристики взаимодействия sbi-miR396e и mRNA генов GRF S.bicolor

Ген	miRNA	Позиция в CDS, н.	Энергия (kJ/mol)	?G/?Gm, %
1	2	3	4	5
GRF1	sbi-miR396e	529	-171,4	95,3
GRF2	sbi-miR396e	604	-171,4	95,3
GRF3	sbi-miR396e	364	-171,4	95,3
GRF4	sbi-miR396e	376	-171,4	95,3
GRF5	sbi-miR396e	496	-171,4	95,3
GRF6	sbi-miR396e	448	-171,4	95,3
GRF7	sbi-miR396e	784	-168	94,9

Из семейства miR396 именно sbi-miR396e имеет самую высокую энергию взаимодействия с mRNA генов GRF сорго, которая составляет -171,4 kJ/mol. Но sbi-miR396е взаимодействует только с семью генами из восьми, и один ген из семи (GRF7), взаимодействуя с sbi-miR396e, имеет энергию взаимодействия -168 kJ/mol.

В таблице 2 приведены сайты взаимодействия sbi-miR396d с семью генами факторов роста. miR396d взаимодействует с mRNA генов GRF сорго с энергией равной -168 kJ/mol. sbi-miR396d взаимодействует также только с семью генами из восьми.

Таблица 2. Характеристики взаимодействия sbi-miR396d и mRNA генов GRF S.bicolor

Ген	miRNA	Позиция в CDS, н.	Энергия (kJ/mol)	?G/?Gm,%
1	2	3	4	5
GRF1	sbi-miR396d	529	-168	91,2
GRF2	sbi-miR396d	604	-168	91,2
GRF3	sbi-miR396d	364	-168	91,2
GRF4	sbi-miR396d	376	-168	91,2
GRF5	sbi-miR396d	496	-168	91,2
GRF6	sbi-miR396d	448	-168	91,2
GRF7	sbi-miR396d	784	-168	91,2

В таблице 3 приведены сайты взаимодействия sbi-miR396c с восьмью генами факторов роста.

Таблица 3. Характеристики взаимодействия sbi-miR396с и mRNA генов GRF S.bicolor

Ген	miRNA	Позиция в CDS, н.	Энергия (kJ/mol)	?G/?Gm,%
1	2	3	4	5
GRF1	sbi-miR396c	529	-141,7	88,1
GRF2	sbi-miR396c	604	-141,7	88,1
GRF3	sbi-miR396c	364	-141,7	88,1
GRF4	sbi-miR396c	376	-141,7	88,1
GRF5	sbi-miR396c	496	-141,7	88,1
GRF6	sbi-miR396c	340	-141,7	88,1
GRF7	sbi-miR396c	448	-141,7	88,1
GRF8	sbi-miR396c	784	-141,7	87,5

sbi-miR396с имеет энергию взаимодействия с mRNA генов GRF сорго равную -141,4 kJ/mol. Это составляет в среднем 88% энергии взаимодействия.

В таблице 4 представлены сайты взаимодействия двух miRNA, которые также взаимодействуют с восьмью генами факторов роста. Это sbi-miR396a и sbi-miR396b.

Таблица 4. Характеристики взаимодействия sbi-miR396a, b и mRNA генов GRF S.bicolor

Ген	miRNA	Позиция в CDS, н.	Энергия (kJ/mol)	?G/?Gm, %
1	2	3	4	5
GRF1	sbi-miR396a, b	529	-141,7	85,4
GRF2	sbi-miR396a, b	604	-141,7	85,4
GRF3	sbi-miR396a, b	364	-141,7	85,4
GRF4	sbi-miR396a, b	376	-141,7	85,4
GRF5	sbi-miR396a, b	496	-141,7	85,4
GRF6	sbi-miR396a, b	340	-141,7	85,4
GRF7	sbi-miR396a, b	448	-141,7	85,4
GRF8	sbi-miR396a, b	784	-141,0	84,9

Обе miRNA имеют энергию взаимодействия с mRNA равную -141,7 kJ/mol. Лишь один ген из восьми (GRF8), взаимодействуя с sbi-miR396a и sbi-miR396b, имеет энергию взаимодействия -141,0kJ/mol.

Средняя энергия взаимодействия sbi-miR396a-b-с с данными сайтами составляет -141,7 kJ/mol, а у sbi-miR396e она равняется -171,4 kJ/mol. У sbi-miR396d составляет -168kJ/mol. Все варианты sbi-miR396 имеют почти одинаковые сайты взаимодействия.

Максимальная энергия гибридизации sbi-miR396a-b-c с полностью комплементарной последовательностью составляет -141,7 kJ/mol, sbi-miR396d равна - 168 kJ/mol, sbi-miR396e - 171,4 kJ/mol.

Среди mRNA изученных генов, mRNA гена GRF5 регулируется наибольшим числом изученных видов miRNA - пятью. Экспрессия гена GRF8 регулируется тремя видами miRNA, а гены GRF1-4 и GRF6-7 - четырьмя. Таким образом, следует вывод: sbi-miR396 регулирует экспрессию большинства (семи из восьми) генов факторов роста S. bicolor.

В таблице 5 представлены сайты взаимодействия vvi-miR396b с семнадцатью генами факторов роста V. vinifera.

Таблица 5. Характеристики взаимодействия vvi-miR396b и mRNA генов GRF V. Vinifera

Ген	miRNA	Позиция в CDS, н.	Энергия (kJ/mol)	?G/?Gm, %
1	2	3	4	5
GRF1	vvi-miR396b	493	-141,7	90,2
GRF2	vvi-miR396b	445	-141,7	90,2
GRF3	vvi-miR396b	334	-141,7	90,2
GRF4	vvi-miR396b	682	-141,7	90,2
GRF5	vvi-miR396b	343	-141,7	90,2
GRF6	vvi-miR396b	349	-141,7	90,2
GRF7	vvi-miR396b	349	-141,7	90,2
GRF8	vvi-miR396b	328	-141,7	90,2
GRF9	vvi-miR396b	346	-141,7	90,2
GRF10	vvi-miR396b	520	-141,7	90,2
GRF11	vvi-miR396b	781	-141,7	90,2
GRF12	vvi-miR396b	781	-141,7	90,2
GRF13	vvi-miR396b	340	-141,7	90,2
GRF14	vvi-miR396b	400	-141,0	89,6
GRF15	vvi-miR396b	373	-141,0	89,6
GRF16	vvi-miR396b	361	-141,0	89,6
GRF17	vvi-miR396b	156	-141,0	89,6

Из семейства miR396 именно vvi-miR396b имеет самую высокую энергию взаимодействия с mRNA генов GRF винограда, которая составляет -141,7 kJ/mol. Но vvi-miR396b имеет такую высокую энергию только с тринадцатью генами, с остальными четырьмя немного ниже -141,0 kJ/mol.

В таблице 6 представлены сайты взаимодействия vvi-miR396а с семнадцатью генами факторов роста V. vinifera.

Таблица 6. Характеристики взаимодействия vvi-miR396а и mRNA генов GRF V. Vinifera

Ген	miRNA	Позиция в CDS, н.	Энергия (kJ/mol)	?G/?Gm, %
1	2	3	4	5
GRF1	vvi-miR396a	493	-141,7	87,1
GRF2	vvi-miR396a	445	-141,7	87,1
GRF3	vvi-miR396a	334	-141,7	87,1
GRF4	vvi-miR396a	682	-141,7	87,1
GRF5	vvi-miR396a	343	-141,7	87,1
GRF6	vvi-miR396a	349	-141,7	87,1
GRF7	vvi-miR396a	349	-141,7	87,1
GRF8	vvi-miR396a	328	-141,7	87,1
GRF9	vvi-miR396a	346	-141,7	87,1
GRF10	vvi-miR396a	520	-141,7	87,1
GRF11	vvi-miR396a	781	-141,7	87,1
GRF12	vvi-miR396a	781	-141,7	87,1
GRF13	vvi-miR396a	340	-141,7	87,1
GRF14	vvi-miR396a	400	-141,0	86,6
GRF15	vvi-miR396a	373	-141,0	86,6
GRF16	vvi-miR396a	361	-141,0	86,6
GRF17	vvi-miR396a	156	-141,0	86,6

Vvi-miR396а имеет также высокую энергию взаимодействия с mRNA генов GRF винограда, которая составляет -141,7 kJ/mol. Но как и vvi-miR396b, vvi-miR396а имеет такую высокую энергию только с тринадцатью генами, с остальными четырьмя ниже -141,0 kJ/mol.

В таблице 7 представлены сайты взаимодействия двух miRNA c mRNA генов GRF винограда. Это vvi-miR396с и vvi-miR396d.

Таблица 7. Характеристики взаимодействия vvi-miR396с, d и mRNA генов GRF V. Vinifera

Ген	miRNA	Позиция в CDS, н.	Энергия (kJ/mol)	?G/?Gm, %
1	2	3	4	5
GRF1	vvi-miR396c, d	493	-141,7	85,4
GRF2	vvi-miR396c, d	445	-141,7	85,4
GRF3	vvi-miR396c, d	334	-141,7	85,4
GRF4	vvi-miR396c, d	682	-141,7	85,4
GRF5	vvi-miR396c, d	343	-141,7	85,4

Подобные документы

• Взаимодействие генов, генетика человека, селекция растений и животных

  Описание комплементарного взаимодействия генов. Рассмотрение характерных особенностей модификационной и наследственной (комбинативной, мутационной) закономерностей изменчивости организма. Задачи и методы селекции растений, животных и микроорганизмов.
  
  реферат [20,8 K], добавлен 06.07.2010
  

• Проблемы экспрессии перенесенных генов в трансгенных растениях

  Регуляция экспрессии у генетически модифицированных растений. Исследование функционирования промоторов бактериального и вирусного происхождения в трансгенных растениях. Регуляторные последовательности, используемые в генетической инженерии растений.
  
  курсовая работа [39,4 K], добавлен 03.11.2016
  

• Генетическая инженерия растений

  Этапы получения трансгенных организмов. Агробактериальная трансформация. Схема создания генетически модифицированного организма. Пример селективного маркера растений. Процесс подавления экспрессии генов (сайленсинг). Направления генной инженерии растений.
  
  презентация [6,2 M], добавлен 24.06.2013
  

• Прикладные вопросы экологической генетики

  Основы и техника клонирования ДНК. Этапы генной инженерии бактерий. Развитие генетической инженерии растений. Генетическая трансформация и улучшение растений с помощью агробактерий, источники генов. Безопасность генетически модифицированных растений.
  
  реферат [26,3 K], добавлен 11.11.2010
  

• Анатомо–морфологические и физиологические адаптации растений к засухе и повышение засухоустойчивости растений

  Определение понятий "засуха" и "засухоустойчивость". Рассмотрение реакции растений на засуху. Изучение типов растений по отношению к водному режиму: ксерофитов, гигрофитов и мезофитов. Описание механизма приспособления растений к условиям внешней среды.
  
  реферат [998,2 K], добавлен 07.05.2015
  

• Диагностика минерального питания растений

  Факторы среды, влияющие на рост и развитие растений. Основные этапы органогенеза. Физиологическая сущность покоя растений, методы повышения зимостойкости. Способы уменьшения предуборочного опадания плодов. Физиология накопления белков в зерне злаковых.
  
  контрольная работа [97,2 K], добавлен 05.09.2011
  

• Иммунитет растений к насекомым и клещам

  Фитоиммунитет и его виды. Типы повреждений растений насекомыми и клещами. Связь между устойчивостью к вредителям и поражением растений возбудителями заболеваний. Основные факторы групповой и комплексной устойчивости растений к патогенным агентам.
  
  курсовая работа [28,2 K], добавлен 30.12.2002
  

• Приспособление растений к водному режиму

  Характеристика основных групп растений по отношению к воде. Анатомо-морфологические приспособления растений к водному режиму. Физиологические адаптации растений, приуроченных к местообитаниям разной увлажненности.
  
  курсовая работа [20,2 K], добавлен 01.03.2002
  

• Рост и развитие растений

  Клеточные основы роста растений. Рост тканей в зависимости от её специфичности. Процесс превращения эмбриональной клетки в специализированную (дифференциация). Основные части побега. Особенность роста листа однодольных растений. Морфогенез корня.
  
  курсовая работа [90,0 K], добавлен 23.04.2015
  

• Систематика растений

  Разработка естественной классификации высших растений на основе выделения таксономических единиц. Происхождение и методы систематики растений: сравнительно-морфологический, географический, экологический, анатомический, цитологический и биохимический.
  
  курс лекций [321,3 K], добавлен 09.04.2012
  

• Идентификация генов – основная задача нового этапа развития генетики

  Эволюция представлений о гене. Основные методы идентификации генов растений. Позиционное клонирование (выделение) генов, маркированных мутациями. Выделение генов, маркированных делециями методом геномного вычитания и с помощью метода Delet-a-gen.
  
  контрольная работа [937,4 K], добавлен 25.03.2016
  

• Закаливание растений

  Закаливание растений. Сущность закаливания растений и его фазы. Закалка семян. Закаливание рассады. Реакция адаптации корневых систем, воздействуя на них температурами закаливания. Холодостойкость растений. Морозоустойчивость растений.
  
  курсовая работа [43,4 K], добавлен 02.05.2005
  

• Основные факторы жизни растений

  Земные и космические факторы жизни растений. Солнечная радиация как основной источник света для растений. Фотосинтетически и физиологически активная радиация и ее значение. Влияние интенсивности освещения. Значение тепла и воздуха в жизни растений.
  
  презентация [2,0 M], добавлен 01.02.2014
  

• Физиология стресса растений

  Рассмотрение и анализ основных групп факторов, способных вызвать стресс у растений. Ознакомление с фазами триады Селье в развитии стресса у растений. Исследование и характеристика физиологии стрессоустойчивости растений с помощью защитных систем.
  
  контрольная работа [194,8 K], добавлен 17.04.2019
  

• Метаморфоз

  Метаморфоз (видоизменение, превращение, переход в другую форму развития) у животных и растений. Онтогенез растений, связанный со сменой выполняемых ими функций или условий функционирования. Регуляция метаморфоза у животных, его отличие от растений.
  
  презентация [1,1 M], добавлен 16.05.2011
  

• Влияние высоких температур на растения

  Влияние перегрева растений на их функциональные особенности, виды опасностей. Связь между условиями местообитания растений и жароустойчивостью. Приспособления и адаптация растений к высоким температурам. Экологические группы растений по жароустойчивости.
  
  реферат [9,8 K], добавлен 23.04.2011
  

• Реакция растений на факторы среды: влияние микроэлементов почвы как фактора

  Активирование определенных ферментативных систем растений с помощью микроэлементов. Роль почвы как комплексного эдафического фактора в жизни растений, соотношение микроэлементов. Классификация растений в зависимости от потребности в питательных веществах.
  
  курсовая работа [1005,7 K], добавлен 13.04.2012
  

• Инфекционные заболевания растений

  Пути передачи вирусов от одного растения к другому. Грибковые заболевание в виде белого мучнистого налета на листьях, побегах, бутонах растений. Лечение зараженных растений. Химическое протравливание, сбрызгивание, опыливание и другая обработка растений.
  
  презентация [6,0 M], добавлен 16.11.2014
  

• Гены идентичности цветковых меристем

  Разнообразие генов, регулирующих процесс цветения растений. Схематическое изображение генеративного побега арабидопсиса. Молекулярная характеристика генов, контролирующих идентичность цветковой меристемы. Экспрессия генов идентичности цветковых меристем.
  
  реферат [709,9 K], добавлен 06.01.2010
  

• Жизненные формы растений

  Понятие жизненной формы в отношении растений, роль внешней среды в ее становлении. Габитус групп растений, возникающий в результате роста и развития в определенных условиях. Отличительные черты дерева, кустарника, цветковых и травянистых растений.
  
  реферат [18,9 K], добавлен 07.02.2010
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам