Свойства сайтов связывания miRNA С mRNA генов транскрипционных факторов (GRF) растений

Обе miRNA имеют максимальную энергию связывания равную -141,7 kJ/mol. Но с такой энергией они связываются лишь с одиннадцатью генами GRF сои. С четырьмя генами взаимодействуют при -141,0 kJ/mol, а с остальными тремя генами имеют энергию равную -138,0 kJ/mol.

И наконец, в таблице 10 приведены сайты взаимодействия gma-miR396h с восемнадцатью генами факторов роста.

Таблица 10. Характеристики взаимодействия gma-miR396h и mRNA генов GRF G. max

gma-miR396h имеет максимальную энергию связывания равную -138,0 kJ/mol. В отличие от предыдущих результатов, gma-miR396h с такой энергией связывается со всеми 18 генами GRF сои.

Средняя энергия взаимодействия gma-miR396b-5p и gma-miR396с с данными сайтами составляет -141 kJ/mol, у gma-miR396a-5p и gma-miR396i-5p равняется - 141 kJ/mol. У gma-miR396h составляет ровно -138,0 kJ/mol. А вот средняя энергия взаимодействия у gma-miR396e равняется -143,0 kJ/mol. Все варианты gma-miR396 имеют почти одинаковые сайты взаимодействия.

Среди mRNA изученных генов, mRNA гена GRF5 регулируется наибольшим числом изученных видов miRNA - шестью. mRNA генов GRF2, GRF4, GRF8 и GRF11 регулируются пятью изученными видами miRNA. Экспрессия всех остальных генов - GRF1, GRF 3, GRF6-7, GRF9-10 и GRF12-18 регулируются чеырьмя видами miRNA. Следует такой же вывод: gma-miR396 регулирует экспрессию большинства генов факторов роста G.max.

Полученные данные свидетельствуют, что экспрессия генов GRF в разных растениях регулируется с помощью семейства miR396. Выявленные ортологичные miRNA обладают высокой гомологией нуклеотидных последовательностей, несмотря на многие миллионы лет прошедших после дивергенции изучаемых в данной работе. В частности, нуклеотидные последовательности семейства miR396.

3.2 Гептапептиды, кодируемые сайтами связывания miR396 в mRNA генов GRF S.bicolor, V.vinifera и G.max

В результате анализа гибридизации miRNA и mRNA выяснилось, что из десяти изученных генов GRF S.bicolor только восемь имеют высоко гомологичные сайты взаимодействия с sbi-miR396, находящиеся в белок-кодирующей части mRNA и кодирующие гептапептиды с высокой степенью гомологии (таблица 11).

Таблица 11. Гептапептиды, кодируемые сайтами связывания sbi-miR396 в mRNA генов GRF S.bicolor (выделены цветом)

Из 18 генов GRF V.vinifera лишь 17 имеют высоко гомологичные сайты взаимодействия с vvi-miR396, которые находятся в белок-кодирующей части mRNA и кодируют гептапептиды (таблица 12).

Таблица 12. Гептапептиды, кодируемые сайтами связывания vvi-miR396 в mRNA генов GRF V.vinifera (выделены красным цветом)

Далее, из 18 изученных генов GRF G.max, все гены имеют гомологичные сайты взаимодействия с gma-miR396 (таблица 13).

Таблица 13. Гептапептиды, кодируемые сайтами связывания gma-miR396 в mRNA генов GRF G.max (выделены красным цветом)

Нуклеотидные последовательности GRF генов Glycine max, Sorghum bicolor, Vitis vinifera были получены из Genbank. Нуклеотидные последовательности miRNA были заимствованы из miRBase. Свободная энергия (ДG) связывания miRNA, положение и схемы потенциальных сайтов связывания были рассчитаны программой RNAHybrid 2.1. Скрипт E-RNAhybrid был использован для расчета p-значения и величины ДG/ДG_m (%), где ДG_m - энергии связывания miRNA с полностью комплементарной последовательностью. Величина ДG/ДG_m использовалась в качестве сравнительного критерия степени взаимодействия miRNA и mRNA [52].

Установлено ранее, что из 338 miRNA A. thaliana только miR396 эффективно связывалась с mRNA GRF. Из девяти генов GRF mRNA GRF1-4 и GRF7-9 являются мишенями miR396 с величиной ДG/ДG_m от 85 до 90%. Сайты взаимодействия miR396 и mRNA GRF находились в белок-кодирующей области и кодировали RSRKHVE или RSRKPVE гептапептид. Анализ взаимодействий miR396 с ортологами GRF в других растительных организмах показал сходство характеристик сайтов связывания miRNA.

Было установлено, что из 556 miRNA G. max только miR396 имеет сайты связывания в mRNA 18 генов GRF. В V. vinifera из 185 miRNA только miR396 связывается с 17 генами GRF, в S. bicolor из 243 miRNA только miR396 связывается с 8 генами GRF.

Полученные результаты показывают, что в изученных растениях сайты связывания miR396 находятся в кодирующей области mRNA и их нуклеотидная последовательность консервативна. Сайты взаимодействия miR396 и mRNA GRF кодировали RSRKHVE или RSRKPVE гептапептид. Во всех случаях критерием эффективности связывания miRNA с mRNA служила величина ДG/ДG_m более 85%. Высокая величина ДG/ДG_m свидетельствует о сильном контроле экспрессии генов семейства GRF со стороны miR396 и высокой селективности miRNA-мишеней.

По полученным данным были составлены схемы взаимодействия miRNA c mRNA растений (рисунки 10-12).

Заключение

Транскрипционные факторы играют важную роль в регуляции экспрессии генов растений. За развитие и рост растений отвечают рост-регулирующие факторы (growth-regulating factors, GRF). Экспрессию генов транскрипционных факторов контролируют miRNA.

miRNA - это небольшие молекулы длиной от 19 до 24 нуклеотидов, которые осуществляют посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов путём регуляции трансляции либо деградации mRNA с помощью связывания с частично комплементарными участками в нетранслируемых областях (UTRs) mRNA. Знание miRNA-опосредованной системы регуляции экспрессии генов позволит с помощью специальных препаратов повысить урожайность сельскохозяйственных культур и их устойчивость к неблагоприятным условиям.

Поэтому проведенные исследования были посвящены изучению влияния miRNA на рост-регулирующие транскрипционные факторы S. bicolor, V. vinifera, G. max и изучению особенностей взаимодействия их с mRNA генов-мишеней.

Для этого были созданы базы данных по генам и miRNA, связанных с ростом и развитием данных растений. База данных по генам насчитывала 10 генов S. bicolor, 18 генов V. vinifera и 18 генов G. max.

Транскрипционные факторы GRF играют важную роль в процессе роста растений. Регуляция экспрессии кодирующих их генов осуществляется на посттранскрипционном уровне при участии miRNA. Поиск miRNA, регулирующих экспрессию генов был проведен с помощью программы RNAhybrid.

Величину ДG и ее стандартное отклонение использовали для определения уровня достоверности сайтов взаимодействия miRNA с mRNA. Достоверность сайтов связывания miRNA подтверждается консервативностью сайтов miRNA.

Было установлено, что из 556 miRNA G. max только miR396 имеет сайты связывания в mRNA 18 генов GRF. В V. vinifera из 185 miRNA только miR396 связывается с 17 генами GRF, в S. bicolor из 243 miRNA только miR396 связывается с 8 генами GRF.

В mRNA генов GRF всех изученных растений сайты связывания локализованы в белок-кодирующей области mRNA и кодируют олигопептиды RSRKHVE или RSRKPVE.

Анализ взаимодействия miRNA с паралогичными генами выявил, что не все гены одного семейства являются мишенями данной miRNA. Это указывает на специфичность и избирательность связывания miRNA и существование защитных механизмов от действия miRNA.

На основе полученных результатов можно сделать следующие выводы:

1. Члены семейства sbi-miR396 имеют сайты связывания с mRNA генов транскрипционных факторов GRF1- GRF8 S. bicolor.

2.Члены семейства vvi-miR396 имеют сайты связывания с mRNA генов транскрипционных факторов GRF1 - GRF17 V. vinifera.

3.Члены семейства gma-miR396 имеют сайты связывания с mRNA генов транскрипционных факторов GRF1 - GRF18 G. max.

4. Нуклеотидные последовательности сайтов связывания miRNA находятся в белок-кодирующей области mRNA генов транскрипционных факторов GRF S. bicolor, V. vinifera, G. max. В mRNA генов GRF всех изученных растений сайты связывания кодируют олигопептиды RSRKHVE или RSRKPVE.

5. Сайты связывания miRNA в mRNA генов GRF S. bicolor, V. vinifera, G. max взаимодействуют разными участками miRNA. Эти взаимодействующие локусы имеют участки на центральной, 5'- и 3'-концах miRNA.

Оценка полноты решения поставленных задач: в работе были выявлены miRNA S.bicolor, V.vinifera и G.max., взаимодействующие с mRNA генов рост-регулирующих транскрипционных факторов (GRF) данных растений. Также были описаны особенности сайтов связывания miRNA с mRNA-мишенью и рассчитана энергия взаимодействия между miRNA и генами mRNA транскрипционных факторов. Можно заключить, что задачи дипломной работы решены и полностью раскрыты.

Рекомендации: miRNA играют важную роль в развитии растений, а также в их устойчивости к абиотическим и биотическим стрессам. Поэтому, установленные in silico сайты взаимодействия miRNA с mRNA генов GRF являются одним из возможных путей повышения продуктивности растений.

биохимический растение механизменный соя

Список используемой литературы

Amit K., Shuchi S., Viswanathan Ch., Dev M.P., Kailash B. Identification of miRNAs in sorghum by using bioinformatics approach // Plant Signal Behav. - 2012. - Vol. 7, N. 2. - P. 246-259.

Зеленцов С.В., Кочегура А.В. Современное состояние систематики культурной сои Glycine max. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. - Краснодар, 2006. - 34-48 с.

Барабанов Е.И., Зайчикова С.Г. Ботаника: учебник для студентов высших учебных заведений. Москва, 2013. - 309-448 с.

Tang Z., Zhang L., Xu C., Yuan S., Zhang F., Zheng Y., Zhao C. Uncovering small RNA-mediated responses to cold stress in a wheat thermosensitive genic male-sterile line by deep sequencing // Plant Physiol. - 2012. - Vol. 159. - P. 721-738.

Lu S., Sun Y.H., Chiang V. Adenilation of plant miRNAs // Nucleic Acids Research. - 2009. - Vol. 37. - P. 1093-2020.

Latchman D.S. Transcription factors: an overview // Cell Biol. - 2001. - Vol. 29. - P. 1305-1312.

Kim J.H., Choi D., Kende H. The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis // The Plant journal. - 2003. - Vol. 36. - P. 94-104.

Achard P., Herr A., Baulcombe D., Harberd N. Modulation of floral development by a gibberellin-regulated microRNA // Development. - 2004. - Vol. 131. - P. 3357-3365.

Allen E., Xie Z., Gustafson A., Sung G., Spatafora J., Carrington J. Evolution of microRNA genes by inverted duplication of target gene sequences in Arabidopsis thaliana // Nat. Genet. - 2004. - Vol. 36. - P. 1282-1290.

Arteaga-Vazquez M., Caballero-Perez J., Vielle-Calzada J.-P. A Family of MicroRNAs Present in Plants and Animals // Plant cell. - 2006. - Vol. 15. - P. 3406-3415.

Johnston R.J., Hobert O. A microRNA controlling left/right neuronal asymmetry in Caenorhabditis elegans // Nature. - 2003. - Vol. 426. - P. 845-849.

Voinnet1 O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs // Institut de Biologie Moleculaire des Plantes. - 2009. - Vol. 136, N. 4. - P. 669-687.

Axtell M., Bartel D. Antiquity of microRNA and their targets in land plants // Plant Cell. - 2005. - Vol. 17. - P. 709-717.

Bartel D.P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function // Cell. - 2004. - Vol. 116. - P. 281-297.

Lai E.C. MiRNAs: Whys and Wherefores of miRNA-Mediated Regulation // Current Biology. - 2005. - Vol. 15. - P. 1673-1681.

Taganov K.D., Boldin M.P., Chang K.J., Baltimore D. NF-кB-dependent induction of microRNA, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses // PNAS. - 2006. - Vol. 103. - P. 12481-12486.

Омельянчук Н.А., Кузнецова Т.Н., Катохин А.В. МикроРНК растений. Вестник ВОГиС. - Новосибирск, 2005. - Т. 9. - 440-450 с.

Cerutti L., Mian N., Bateman A. Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the PIWI domain // Trends Biochem. Sci. - 2000. - Vol. 25. - P. 481-482.

Bonnet E., Wuyts J., Rouze P., Peer Y van de. Detection of 91 potential conserved plant microRNAs in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa indentifies important target genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol. 101. - P. 11511-11516.

Ren B. Transcription: Enhancers make non-coding RNA // Nature. - 2010. - Vol. 465. - P. 173-174.

Dugas D., Bartel B. MicroRNA regulation of gene expression in plants // Curr. Opin. Plant Biol. - 2004. - Vol. 7. - P. 512-520.

Laufs P., Peaucele A., Morin H., Traas J. MicroRNA regulation of the CUC genes is required for boundary size control in Arabidopsis meristems // Develompment. - 2004. - Vol. 131. - P. 4311-4322.

Emery J., Floyd S., Alvarez J., Eshed Y., Hawker N., Izkaki A., Baum S., Bowman J. Radial patteming of Arabidopsis shoots by class III HD-ZIP and KANADI genes // Curr. Biol. - 2003. - Vol. 13. - P. 1768-1774.

Fahlgren N., Howell M.D., Kasschau K.D., Chapman E.J., Sullivan C.M., Cumbie J.S., Givan S.A., Law T.F., Grant S.R., Dangl J.L., Carrington J.C. High Throughput Sequencing of Arabidopsis microRNAs: Evidence for Frequent Birth and Death of MIRNA Genes // Plant Physiology. - 2005. - Vol. 16. - P. 2800-2833.

Reinhart B.J., Weinstein E.G., Rhoades M.W., Bartel B., Bartel D.P. MicroRNAs in plants // Genes Dev. - 2002. - Vol. 16. - P. 1616-1626.

Bonnet E., Wuyts J., Rouze P., Van de Peer Y. 2004. Evidence that microRNA precursors, unlike other non-coding RNAs, have lower folding free energies than random sequences // Bioinformatics. - 2002. - Vol. 20. - P. 2911-2917.

Weber M.J. New human and mouse microRNA genes found by homology search // FEBS J. - 2005. - Vol. 272. - P. 59-73.

Berezikov E., Guryev V., van de Belt J., Wienholds E., Plasterk R.H., Cuppen E. Phylogenetic shadowing and computational identification of human microRNA genes // Cell. - 2005. - Vol. 120. - P. 21-24.

Altuvia Y., Landgraf P., Lithwick G., Elefant N., Pfeffer S., Aravin A., Brownstein M.J., Tuschl T., Margalit H. Clustering and conservation patterns of human microRNAs // Nucleic Acids Res. - 2005. - Vol. 33. - P. 2697-2706.

Llave C., Xie Z., Kasschau K.D., Carrington J.C. Cleavage of scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA // Science. - 2002. - Vol. 297. - P. 2053-2056.

Floyd S.K., Bowman J.L. Ancient microRNA target sequences in plants // Nature. - 2004. - Vol. 428. - P. 485-486.

Axtell M.J., Bartel D.P. Antiquity of microRNAs and their targets in land plants // Plant Cell. - 2005. - Vol. 17. - P. 1658-1673.

Zhang B.H., Pan X.P., Wang Q.L., Cobb G.P., Anderson T.A. Identification and characterization of new plant microRNAs using EST analysis // Cell Res. - 2005. - Vol. 15. - P. 336-360.

Hiraguri A., Itoh R., Kondo N., Nomura Y., Aizawa D., Murai Y. Specific interactions between Dicer-like proteins and HYL1/DRB-family dsRNA-binding proteins in Arabidopsis thaliana // Plant Mol. Biol. - 2005. - Vol. 57. - P. 173-88.

Witkos T.M., Koscianska E., Krzyzosiak W.J. Practical Aspects of microRNA Target Prediction // Cur. Mol. Med. - 2011. - Vol. 11. - P. 93-109.

Bartel D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions // Cell. - 2009. - Vol. 136. - P. 215-233.

Thanasis V., Ioannis S., Vlachos K., Panagiotis A., George G., Manolis M., Martin R. TarBase 6.0: capturing the exponential growth of miRNA targets with experimental support // Nucleic Acids Research. - 2011. - Vol. 10. - P. 1-8.

Размещено на Allbest.ru