Выявление представителей рода Mycobacterium в аквариумной воде, находящейся в замкнутой системе очистки

Размещено на http://www.allbest.ru/

Санкт-Петербургский государственный университет

Кафедра микробиологии СПбГУ

Выпускная квалификационная работа бакалавра

на тему: "Выявление представителей рода Mycobacterium в аквариумной воде, находящейся в замкнутой системе очистки"

Выполнила: Шакирова Айгуль Ильдусовна

Научный руководитель: доцент каф. микробиологии СПбГУ,

к.б.н. Е.Ю. Дмитриева

Санкт-Петербург - 2016 г.

Оглавление

Введение

1. Обзор научной литературы "Водные микобактерии, потенциально опасные для здоровья людей и гидробионтов"

1.1 Нетуберкулезные микобактерии водопроводной воды, вызывающие заболевания у людей

1.2 Нетуберкулезные микобактерии и проблемы профессиональной аквариумистики

1.2.1 Санация воды, используемой в профессиональной аквариумистике, и ее особенности, влияющие на микробиологический состав аквариумной воды

1.2.2 Нетуберкулезные микобактерии, вызывающие заболевания у рыб

1.2.3 Профессиональные заболевания работников аквариумистики, вызванные нетуберкулезными микобактериями

1.3 Биологические свойства микобактерий

1.3.1 Таксономическое положение и классификация

1.3.2 Структура оболочки нетуберкулезных микобактерий

1.3.3 Физиологические особенности нетуберкулезных микобактерий

2. Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования

2.2 Питательные среды для выделения и культивирования микобактерий

2.3 Окраска бактериальных мазков на кислото-спиртоустойчивость

2.4 Методики проведения идентификационных тестов

3. Результаты и их обсуждение

3.1 Подбор твердой питательной среды для выявления микобактерий из аквариумной воды методом прямого высева

3.2 Выявление кислото-спиртоустойчивых клонов бактерий на неселективных питательных средах

3.3 Идентификация выделенных бактериальных штаммов

3.3.1 Внешний вид колоний, особенности роста, отношение к свету

3.3.2 Кислото-спиртоустойчивость, морфология клеток

3.3.3 Идентификация штаммов 14, 40 и 48 по последовательностям гена 16s рРНК

3.3.4 Фенотипические свойства штаммов 14, 40 и 48, постановка заключительного идентификационного диагноза

Заключение

Список литературы

Приложение



Введение

Проблема микробиологической безопасности воды является актуальной как для слаборазвитых, так и для индустриальных стран. Особенно остро эта проблема стоит в крупных городах, где распределение воды осуществляется посредством централизованной системы водоснабжения. Вода центральной системы водоснабжения используется в бытовых целях, для приготовления пищи, доставляется в медицинские и общеобразовательные учреждения. В профессиональной аквариумистике вода центральной системы водоснабжения используется для приготовления аквариумной воды. Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, содержащиеся в воде, могут стать причиной заболеваний гидробионтов и персонала, обслуживающего работу аквариумов.

Особое внимание при рассмотрении проблем безопасности воды уделяется микобактериям. В настоящее время описан ряд условно-патогенных микобактерий, относящихся к группе нетуберкулезных, способных вызывать заболевания у человека и животных. Статистические данные регистрируют ежегодный рост количества случаев заболеваний кожи, лимфатических сосудов, легочных и генирализованных инфекций, вызванных у людей нетуберкулезными микобактериями. Сельское хозяйство, рыбная промышленность, владельцы животных и держатели аквариумов терпят убытки в связи с высокой заболеваемостью животных нетуберкулезными микобактериями.

В крупнотоннажной аквариумистике используется система замкнутой очистки воды, которая обеспечивает рециркуляцию и может стать источником накопления патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Широкому распространению и накоплению микобактерий в системах очистки воды способствует специфическое строение оболочки микобактерий. В ней содержатся гидрофобные миколовые кислоты, снижающие чувствительность микобактерий к дезинфекции, облегчающие их прикрепление к твердым поверхностям и образование биопленок.

В научной литературе практически отсутствуют данные о выявлении микобактерий в воде крупнотоннажных аквариумов, оснащенных системой замкнутой очистки воды. Данная работа явилась одним из этапов сотрудничества кафедры микробиологии с Санкт-Петербургским океанариумом. Изучение разнообразия микобактерий, содержащихся в воде аквариумов необходимо для оценки рисков заражения нетуберкулезными микобактериями гидробионтов и персонала океанариума, а также постоянного совершенствования методов очистки аквариумной воды, проводимого Санкт-Петербургским океанариумом.

В связи с этим целью данного исследования стало выявление микобактерий в аквариумной воде, находящейся в замкнутой системе очистки, на примере аквариума № 19 Санкт-Петербургского океанариума.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать питательную среду для выделения микобактерий из аквариумной воды.

2. Разработать алгоритм выделения микобактерий из аквариумной воды.

3. Выделить и очистить изоляты микобактерий, оценить их численность в исследуемой воде.

4. Провести идентификацию выделенных штаммов микобактерий.

Список сокращений:

MAC (Mycobacterium avium complex) - группа M.avium

MAIS (Mycobacterium avium-intracellulare-scrofulaceum) - группа, объединяющая M. avium, M. intracellulare, M.scrofulaceum

MFG (Mycobacterium fortuitum group) - группа Mycobacterium fortuitum

MTC (Mycobacterium terrae complex) - группа Mycobacterium terrae

NTM (Nontuberculosis mycobacteria) - нетуберкулезные микобактерии

МАПГ - Миколил-арабиногалактан-пептидогликан

КОЕ - Колониеобразующие единицы.

1. Обзор научной литературы "Водные микобактерии, потенциально опасные для здоровья людей и гидробионтов"

1.1 Нетуберкулезные микобактерии водопроводной воды, вызывающие заболевания у людей

В настоящий момент описано 170 видов микобактерий (Euzebu, 2016), из которых патогенными для людей и животных признано 73 вида (Goodfellow et al., 2012).

Источниками заражения людей и животных патогенными микобактериями являются вода и почва. Из водопроводной воды центральной системы городского водоснабжения выявлены патогенные нетуберкулезные микобактерии, относящиеся к следующим видам: M. gordonae, M.intracellulare, M. avium, M. chelonae, M. fortuitum, M. kansasii, M. abscessus, M. flavescens, M. gadium, M. gilvum, M. lentiflavum, M. mucogenicum, M. peregrinum, M. scrofulaceum, M. szulgai, M. terrae (Thomson, 2013; Falkinham, 2011; Covert, 1999; Le Dantec, 2002; Vaerewijck, 2005). Все вышеперечисленные виды микобактерий вызывают заболевания у людей.

Следующие виды микобактерий из водопроводной воды способны вызывать заболевания у животных: M. lentiflavum, M. interjectum, M. gordonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. poriferae, M. scrofulaceum, M. farcinogenes, M. avium, M. senegalense, M. intracellulare, M. gadium, M. malmoense, M. nonchromogenicum, M. simiae, M. duvalii, M. chelonae, M. kansasii, M. palustre, M.fortuitum, M. szulgai (Goodfellow et al., 2012; Akbari et al., 2014; Jacobs et al., 2009).

Впервые кислотоустойчивые бактерии (микобактерии) были выделены из водопроводной воды Галли-Валерио и Борнардом в 1912 году и названы M. aquae (Kazda, 2000). После дальнейших исследований они были отнесены к виду M. gordonae (Runyon, 1974). 1959 году Швабахер сделал вывод о том, что изоляты микобактерий, выделенные из поражений кожи у аквариумных хладнокровных животных и у людей, имеют одинаковое водное происхождение. Но долгое время водопроводная вода не рассматривалась как источник заражения людей нетуберкулезными микобактериями. В 1970 году появились работы, доказывающие причастность микобактерий водопроводной воды к патогенезу у людей (Bullin et al, 1970; Bailey, 1970).

По данным ВОЗ питьевая вода центральной системы водоснабжения является одним из основных источников заражения людей нетуберкулезными микобактериями (Nichols et al., 2004).

Во всех странах мира, перед поступлением в центральную распределительную сеть, вода подвергается процедурам санации (озонирование, обработка активным хлором, ультрафиолетовое облучение). Это приводит к снижению общей численности бактерий в питьевой воде. Тем не менее, остаточная концентрация устойчивых нетуберкулезных микобактерий остается существенной и составляет несколько десятков КОЕ/мл (Le Dantec et al., 2002a, Eun Sook Lee, 2009, Falkinham III, 1996; Taylor et al., 2000; Le Dantec et al., 2002; Falkinham III 2003; Hilborn et al., 2006).

В США и Австралии в 2005 году заболеваемость нетуберкулезными микобактериями составила 3,2-8,6 случаев на каждые 100 тысяч населения (Van Ingen et al., 2011; Thomson et al., 2010). Ежегодно данный показатель возрастает на 2,6 % (Prevots et al., 2010). В РФ такая статистика пока отсутствует.

За период 1999-2010 гг. в США зарегистрировано 2990 случаев смертности в результате заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями, что составляет 0,01 % от общего количества смертей за этот период (Mirsaedi et al., 2014).

Заражение нетуберкулезными микобактериями чаще всего происходит при приеме зараженной питьевой воды центральной системы водоснабжения, особенно в лечебных учреждениях (Le Dantec, 2002; Ulmann, 2015).

Нетуберкулезные микобактерии, встречающиеся в водопроводной воде, вызывают заболевания у всех групп населения. Тем не менее, наиболее подверженными заражению нетуберкулезными микобактериями являются пациенты больничных учреждений, лица с иммунодефицитами, болезнями легких, раком крови, пациенты, подвергшиеся хирургическим вмешательствам (Mirsaedi et al., 2014).

В 1980-90е годы количество заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями, резко возросло, что связано с ростом количества случаев заражения ВИЧ. На сегодняшний день заболевания, вызываемые нетуберкулезными микобактериями, стоят на втором месте в списке причин, вызывающих смерть у людей с иммунодефицитами (Nichols et al., 2004).

В настоящий момент особую озабоченность вызывает ряд нетуберкулезных микобактерий (M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae, M. gordonae), вызывающих заболевания у конкретных профессиональных групп людей и гидробионтов - объектов разведения в океанариумах, на предприятиях аквакультуры, в профессиональной аквариумистике. Показана их способность заражать персонал этих учреждений (Nichols et al., 2004; Decostere et al., 2004; Novotny et al., 2010; Akbari et al., 2014). Этот вопрос более подробно будет изложен в следующей главе.

Нетуберкулезные микобактерии объединены в ряд групп для эффективной и быстрой идентификации в медицинской практике. Основой для объединения микобактерий служило сходство морфологических и физиолого-биохимических свойств.

В настоящий момент описаны следующие группы: MAC, M.chelonae\abscessus group, MFG, MTC (Kothavade, 2012).

Ниже мы приводим характеристики этих групп микобактерий и характер вызываемых ими патологических процессов в организме человека.

1. Группа MAC (Mycobacterium avium complex). В эту группу входят следующие виды: M. avuim subsp. avium, M. avium subsp. silvaticum, M. avium subsp. paratuberculosis, M. intracellulare. В 1933 году Барксдэйл и Ким показали способность M. avium вызывать заболевания у людей (Barksdale et al, 1977). С 1956 года в группу МАС введен вид M. scrofulaceum и группа МАС переименована в MAIS (Mycobacterium avium-intracellulare-scrofulaceum) (Turenne et al., 2004). В настоящий момент в литературе авторы оперируют названиями обеих групп (Turenne, 2007; Nichols et al, 2004).

Микобактерии группы МАС вызывают заболевания легких (псевдотуберкулез, аллергический альвеолит, пневмонии), заболевания костей (остеомиелиты), заболевания кожи (вздутие, болезненность), затылочные лимфадениты у детей с режущимися зубами, генерализованные инфекции (бактериемии) (De Groote, WHO, 2004; Falkinham, 2001).

Возбудители группы МАС (особенно M. avium и M. intracellulare) ответственны за 72 % всех инфекций, вызываемых нетуберкулезными микобактериями (EPA, 2009). Частота заболеваемости от всех зарегистрированных случаев заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями, составляет от 64 до 85 % по Северной Америке и от 19,8 до 82 % в Европе (Prevots et al., 2015).

Микобактерии группы МАС вызывают первичные инфекции по типу псевдотуберкулеза и в форме аллергического альвеолита.

Микобактерии группы МАС вызывают вторичные инфекции по типу псевдотуберкулеза у пациентов с ВИЧ, эмфиземой, бронхоэктазией (очаговое расширение бронхов), кистозным фиброзом, туберкулезом, гистоплазмозом, силикозом, пневмонией, раком легких. Микобактерии группы МАС вызывают осложнения у 40 % больных СПИД (Nightingale et al, 1992). В 20 % случаев инфекция, вызванная МАС, осложняется комбинированной инфекцией с M. kansasii.

M. scrofulaceum вызывает затылочные лимфадениты у детей с режущимися зубами (Wayne et al., 1992).

2. Группа M.chelonae/abscessus group. В состав группы входят M. chelonae, M. abscessus, M. immunogenum, M. massiliense, M. bolletii, и M. salmoniphilum (Simmon et al., 2011).

До 1974 года вид M. abscessus считался подвидом M. chelonae, затем была доказана их принадлежность к разным видам и создана группа M. chelonae/abscessus group (Brown-Elliot et al., 2002). С 2001 года в состав группы включены еще 4 вида (M. immunogenum, M. massiliense, M. bolletii, and M. salmoniphilum). За исключением M. salmoniphilum все представители являются возбудителями заболеваний человека (Simmon et al., 2012).

В США и Бразилии заболевания, вызванные представителями группы M. chelonae/abscessus составляет от 4 до 13 % всех зарегистрированных микобактериальных заболеваний. В Европе этот показатель составляет от 5 до 8,6 %, а в Тайване 30,2 % (Prevots, 2015).

Представители группы M. chelonae/abscessus вызывают заболевания кожи (гранулемы) и мягких тканей (гиподермиты), лимфадениты, пневмонии, инфекции кровотока (бактериемии), генерализованные инфекции (Griffith et al, 1993; Wallace, 1983, Kothavade, 2012).

3. Группа MFG (Mycobacterium fortuitum group).

В состав группы входят следующие виды M. fortuitum, M. peregrinum, M. mucogenicum, M. senegalense, M. mageritense, M. septicum, M. houstonense, и M. bonickei (Brown-Elliot et al., 2002).

Из водопроводной воды наиболее часто выделяют M. fortuitum, M. peregrinum и М. septicum, которые могут также являться возбудителями заболеваний человека. Они вызывают поражения легких, кожи, генирализованные инфекции.

Члены группы MFG были изолированы из аэрозоля воздуха в домах больных с нетуберкулезными микобактериальными поражениями легких (Thomson et al., 2013a).

Представители группы MFG были выделены из водопроводной воды Парижа, Мехико и некоторых городов Южной Африки (Dubrou et al., 2013; Le Dantec et al., 2002; Castillo-Rodal et al., 2012; September et al., 2004).

M. fortuitum впервые описан как патоген человека Да Коста Крузом в 1938 году (Runyon, 1972). Он является возбудителем поражений кожи (волдыри, язвы, фурункулез) и подлежащих тканей, вызывает болезни легких, кровеносных сосудов (полиартериты, лейкоцитокластический васкулит), костей и суставов (остеомиелит), кератит и затылочный лимфаденит (Kothavade et al., 2013).

M. septicum впервые был описан как причина сепсиса у детей с метастазирующей гепатобластомой (Brown-Elliot et al., 2002). Описаны случаи возникновения фиброзно-кавернозного туберкулеза, вызванного M. septicum, сопровождающегося потерей в весе и сильным кашлем (Lulu Lian et al., 2013).

M. peregrinum вызывает гранулематозные поражения кожи (Kamijoa et al., 2012). Описаны случаи поражения легких с образованием каверн, в которых локализовался возбудитель (Todorova et al., 2015).

Частота заболеваемости MFG от всех зарегистрированных случаев заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями, составляет от 3 до 8 % по Северной Америке, от 3,4 до 16 % по Южной Америке, от 5 до 62,5 % по Европе (Prevots, 2015).

4. Группа MTC (Mycobacterium terrae complex). Включает виды M. terrae, M. triviale, M. nonchromogenicum, M. hibberinae.

Представители группы изначально считались сапрофитами, лишь в последние годы появились сведения об их патогенных свойствах (Smith et al., 2000). В 1983 году появилось сообщение о шести случаях заболеваний человека, вызванных M. nonchromogenicum. в 1983 и 1988 году появились сообщения о случаях заражения M. terrae, ставших причиной легочных заболеваний (Wayne et al., 1992).

В Шотландии за 1992-2010 годы заболеваемость составила 6,3 % от всех зарегистрированных микобактериальных заболеваний за этот период (Prevots et al., 2015).

Представители этой группы вызывают остеоартриты, тендовагиниты (воспаление синовиальной оболочки сухожильного влагалища), гранулемы, болезни легких, кишечника и генерализованные инфекции.

Ниже описаны свойства патогенных нетуберкулезных микобактерий, не объединенных в группы.

1. M. kansasii

Был описан как возбудитель инфекций в 1953 году Бухлером и Поллаком (De Lima et al., 2014). Выделен из водопроводной воды в 1967 году (Bailey et al., 1970).

M. kansasii занимает второе место по частоте встречаемости среди нетуберкулезных микобактерий - возбудителей заболеваний легких. Частота заболеваемости 0,5-1/100 тысяч населения. (De Groote, 2004).

В Бразилии и Италии заболеваемость превышает 30 %, а в Англии составляет 70 % от всех зарегистрированных заболеваний, вызванных нетуберкулезными микобактериями, и превышает данный показатель по МАС (Prevots et al., 2015).

M. kansasii вызывает заболевания легких (псевдотуберкулез и пневмония), поражения кожи, генерализованные инфекции.

2. M. szulgai

Впервые описан в 1972 году и был выделен из клинических образцов по всему миру (Falkinham, 1996). Частота заболеваемости составляет 7,6 % от всех выделенных образцов нетуберкулезных микобактерий по данным за 1999-2005 год в Нидерландах (Prevots, 2015).

Данный вид вызывает заболевания легких по типу псевдотуберкулеза (Wayne et al., 1992).

Поражения могут затрагивать суставы и кости (бурситы и остеомиелиты), лимфатические узлы (шейные лимфадениты), кожу (фурункулезы). У больных СПИД зафиксированы случаи генерализованных инфекций (Falkinham, 1996).

3. M. xenopi

Патогенность для человека установлена в 1967 году, из водопроводной воды был выделен в 1970 году (Bullin et al., 1970).

Частота заболеваемости от всех зарегистрированных случаев заболеваний, вызванных нетуберкулезнами микобактериями, составляет от 1 до 23 % по Северной Америке и от 6 до 28,1 % по Европе (Prevots, 2015).

Вызывает заболевания легких по типу псевдотуберкулеза у больных с иммунодефицитами и генерализованные инфекции у иммунокомпетентных пациентов (Mirza et al., 2013)

4. M. simiae

Патогенность для человека установлена в 1971 году (Woods et al., 1987). Частота заболеваемости от всех зарегистрированных случаев заболеваний, вызванных нетуберкулезнами микобактериями, составляет 3 % в США по данным за 1994-2006 годы и от 14,3 до 22 % по Средней Азии по данным за 2005-2008 годы (Prevots et al, 2005).

Данный вид вызывает хронические заболевания легких, генерализованные инфекции и поражения почек (Woods et al., 1987).

5. M. porcinum

Впервые описан в 1973 как возбудитель лимфаденитов у свиней.

В 2004 году был впервые охарактеризован как патоген человека.

Данный вид вызывает поражения кожи, кровеносных сосудов, перитониты и остеомиелиты. Был изолирован из водопроводной воды, может являться причиной внутрибольничных инфекций (Brown-Elliott et al., 2011).

1.2 Нетуберкулезные микобактерии и проблемы профессиональной аквариумистики

1.2.1 Санация воды, используемой в профессиональной аквариумистике, и ее особенности, влияющие на микробиологический состав аквариумной воды

В профессиональной аквариумистике используется вода центральной системы водоснабжения, которая содержит всех патогенных нетуберкулезных микобактерий, охарактеризованных в главе 2.1.

В крупнотоннажной аквариумистике вода находится в замкнутой системе очистки, которая включает очистку от механических примесей, флотацию, очистку от органических примесей на биофильтре, озонирование, облучение ультрафиолетом. При лечении гидробионтов в замкнутую систему вводят фармацевтические препараты (малахитовый зеленый, фиолетовый К, антибиотики). В результате таких обработок микробиота воды обогащается устойчивыми видами бактерий, в первую очередь бактериями, содержащими миколовые кислоты. Их клеточная стенка характеризуется сниженной проницаемостью к санирующим агентам.

Действительно, имеется много литературных данных, что микобактерии обладают устойчивостью к обработкам воды. Так Ле Дантеком с коллегами была показана устойчивость M. fortuitum, M. chelonae и M. gordonae к обработкам воды на водоочистных сооружениях (Le Dantec et al., 2002). Фалкинхам с коллегами показал, что M. avium и M. intracellulare могут быть выделены из воды, прошедшей обработку, перед поступлением в рапределительную сеть (Falkinham et al., 2001). Как было упомянуто выше, микобактерии способны задерживаться на механических фильтрах благодаря способности образовывать биопленки.

Показано, что устойчивость микобактерий к облучению ультрафиолетом превышает этот показатель у E. coli и неодинакова для разных видов. Среди микобактерий, обнаруженных в воде, наибольшую устойчивость проявляет M. fortuitum (Eun-Sook Lee et al., 2010 a,b).

Тэйлором показано (Taylor et al., 2000), что M. avium устойчива к дезинфекции озоном, и что размножающиеся в неочищенной воде клетки микобактерий в 10 раз более устойчивы к озону, чем выращенные в питательной среде. Микобактерии способны переживать озонирование, так как имеют гидрофобную поверхность и способны формировать агрегированные структуры (биопленки), защищающие их. Кроме того, органические молекулы после озонирования переходят из биологически устойчивых форм в биоразлагаемые, которые затем легко усваиваются микобактериями.

1.2.2 Нетуберкулезные микобактерии, вызывающие заболевания у рыб

В аквариумной воде могут находиться микобактерии, которые содержались в водопроводной воде и микобактерии, которые находились непосредственно на самих гидробионтах и поступили из природных водоемов. Можно предположить, что обе группы микобактерий в системе замкнутой очистки аквариумов будут иметь тенденцию к накоплению. Показано, что видовой состав нетуберкулезных микобактерий воды, корма и декоративного окружения отличается от видового состава микобактерий, выделенных с аквариумных рыб (Beran et al., 2006).

Ряд нетуберкулезных микобактерий, встречающихся в водопроводной воде (гл 2.1.) описаны как возбудители заболеваний объектов профессиональной аквариумистики - случаи заболеваний зафиксированы для амфибий и рыб. Впервые патогенность у рыб описана Баталионом и коллегами на сазанах (Cyprinus carpio) в 1897 году (Aronson, 1926). Возбудителями заболеваний рыб, вызванных нетуберкулезными микобактериями, являются M. marinum, M. chelonae/abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. haemophilum, M. montefiorense, M. peregrinum/septicum, M. scrofulaceum, M. triviale, M. triplex, M. terrae, M. nonchromogenicum, M. avium.

Считается, что к микобактериозам восприимчивы более 167 видов рыб (Jacobs et al, 2009). Заболевания, вызываемые нетуберкулезными микобактериями, у рыб являются одними из самых распространенных - в некоторых популяциях заболеваемость достигает 15 % (Akbari et.al, 2014). Зарегистрированы случаи заражения в пресных и в соленых, искусственных и естественных местообитаниях (Novotny et al., 2010). Восприимчивость к микобактериальным инфекциям у разных видов рыб неодинакова.

M. marinum является причиной генерализованной инфекции у лаврака (Dicentrarchus labrax) (Ucko et al., 2002) и вызывает поражения печени у полосатого окуня (Morone saxatilis) (Lansdell et al., 1993).

У скалярии (Pterophyllum scalare) зафиксированы поражения селезенки в виде серовато-белых узелковых вкраплений, содержащие M. marinum (Zanoni et al., 2008).

Возбудитель выделен из тканей кишечника у анциструса (Ancistrus lineolatus), голубого неона (Paracheirodon innesi), скалярии (Pterophyllum scalare), пятнистого гурами (Trichogaster trichopterus), пецилии пятнистой (Xiphophorus maculatus), коридораса пятнистохвостого (Corydoras caudimaculatus), красного неона (Paracheirodon axelrodi), гуппи (Poecilia reticulate), малоплавниковой моллинезии (Poecilia sphenops) (Slany et al., 2014). M. marinum была выделена из жабр коридораса пятнистохвостого (Corydoras caudimaculatus), красного неона (Paracheirodon axelrodi), гуппи (Poecilia reticulata), малоплавниковой моллинезии (Poecilia sphenops) и хелостомы (Helostoma temminckii) (Slany et al., 2014).

M. chelonae/abscessus. Микобактериоз, вызванный этими бактериями, был исследован Чангом и коллегами у молочных рыб (Chanos chanos), смертность при этом достигала 66,7 %. Было отмечено появление красновато и серовато-белых узелков на поверхности брюшины, селезенки, почек, печени и желудочно-кишечного тракта типа ретикулоэндотелиальных эпителиоидных гранулем (Chang et al., 2006).

Лансделлом и коллегами было показано поражение печени, почек и селезенки у цихлазом (Cichlasoma bimaculatum и Cichlasoma rneeki) (Lansdell et al., 1993).

Зафиксирован случай заражения M. chelonae/abscessus данио рерио (Danio rerio), у которых отмечалась эрозия кожи, изъязвления оснований хвостовых и грудных плавников. В некротических участках показано наличие гранулем. Заражение затрагивало гонады, печень и ткани брюшины (Astrofsky et al., 2000).

У японской оризии (Oryzias latipes) M. chelonae/abscessus вызывают гранулематозные повреждения кожи и опухоли в районе головы и анального отверстия, что является частой причиной смерти данных рыб (Teska et al., 1997).

Данные микобактерии выделены из тканей желудочно-кишечного тракта и селезенки серой кефали (Mugil curema) (Perez et al., 2001).

M. fortuitum вызывает поражения кожи и плавников у данио рерио (Danio rerio). Инфекция сопровождается увеличением жабр с кровоизлияниями, эмболией сосудов жаберных дуг. Характерно вспучивание брюха, некроз печени и истощение (Astrofsky et al., 2000).

Сандерсом и коллегами показано заражение M. fortuitum у японской оризии (Oryzias latipes). Симптомами являются изменение цвета тела, побледнение спинного плавника, гранулемы на покровах, истощение, истирания плавников, нарушение равновесия (Sanders, 2001).

M. fortuitum выделен из органов брюшной полости у здоровых обыкновенных усачей (Barbus barbus) (Mrlik et al., 2012), из тканей печени, почек и селезенки цихлазом (Cichlasoma bimaculatum) (Lansdell et al., 1993), органов желудочно-кишечного тракта кефали (Mugil curema) (Perez et al., 2001).

M. triplex может являться причиной заболевания у мурен (Gymnothorax funebris и Gymnothorax moringa). Вызывает образование гранулем на коже вокруг головы и туловища, в пределах дермы и подкожной фасции (Herbst et al., 2001).

Возбудитель выделен из тканей жабр речного окуня (Perca Fluviatilis) (Slany et al., 2014; Mrlik et al., 2012).

M. gordonae поражает печень и селезенку, может являться причиной смерти гуппи (Poecilia reticulata) (Sakai et al., 2005). Возбудитель выделен из тканей жабр и кишечника сазана (Cyprinus carpio) (Mrlik et al., 2012; Slany et al., 2014).

M. peregrinum выделен из покровов здоровых рыб золотого карася (Carassius carassius) и жабр американского сомика (Ictalurus nebulosus) (Mrlik et al., 2012), а также из тканей кишечника речного окуня (Perca Fluviatilis), где обнаружен в серозной оболочке и мезентеральной жировой ткани (Slany et al., 2014).

M. scrofulaceum может являться причиной поражения печени у бычка-рогача (Leptocottus armatus) (Lansdell et al., 1993). Возбудитель выделен из тканей желудочно-кишечного тракта кефали (Mugil curema) (Perez et al., 2001).

M. montefiorense вызывает поражения кожи мурен (Gymnothorax funebris и Gymnothorax moringa) (Levi et al., 2003).

M.haemophilum является причиной множественных гранулем в тканях данио рерио (Danio rerio) (Whipps et al., 2007b).

M. simiae вызывает поражения печени, почек и селезенки у цихлазом (Cichlasoma bimaculatum) (Lansdell et al., 1993).

M. avium выделен из тканей жабр у линей (Tinca tinca) (Slany et al., 2014).

Заражение рыб происходит при заглатывании, поедании зараженной пищи, трансовариально (у живородящих рыб) и непосредственно через воду (Lescenko et al., 2003). Бактерии обладают большей вирулентностью, если поедаются вместе с одноклеточным хозяином (амебы, жгутиковые), внутри которого могут находиться (Rowe et al., 2014).

Установлено, что гидробионты могут быть носителями микобактерий, в том числе и патогенных, не имея симптомов заболевания (Rowe et al., 2014).

1.2.3 Профессиональные заболевания работников аквариумистики, вызванные нетуберкулезными микобактериями

Деятельность работников профессиональной аквариумистики подразумевает постоянный контакт с водой, содержащей микобактерий, что повышает риск заражения микобактериозами. Согласно литературным данным, наиболее часто у данной группы людей регистрируются заболевания, вызванные M. marinum, M. fortuitum, M. chelonae, M. gordonae (Decostere et al., 2004; Novotny et al., 2010; Akbari et al., 2014). Заболевания, вызываемые M. fortuitum, M. chelonae и M. gordonae мы рассмотрели в главе 2.1.

В 1951 году Норденом и Линнелом был описан возбудитель гранулематозных поражений кожи человека ("гранулемы бассейнов") M. balnei. Позже он был признан представителем вида M. marinum, описанного Аронсоном как возбудителя болезней рыб в 1926 году. В 1962 году Свифт и Кохен сообщили о случае заражения человека M. marinum в результате инфицирования раны аквариумной водой (Caputo et al., 2010).

M. marinum является возбудителем гранулематозных поражений кожи у человека, которые могут распространяться в глубоколежащие ткани, становясь причиной тендосиновитов, артритов и остеомиелитов (Broutin et al., 2012). Инфекция часто связана с развитием линфангитов (или споротрихоидных инфекций), затрагивающих подкожные лимфоузлы (Wolinsky et al. 1972). M. marinum является причиной генерализованных инфекций у пациентов с иммунодефицитами (Falkinham, 1996).

M. marinum является причиной 81,8 % случаев поражений кожи, вызванных нетуберкулезными микобактериями, по статистике с 1981 по 1990 годы в Тайланде (Kuilavanijaya et al., 1993).

Представители этого вида распространены по всему миру и часто становятся причиной зооантропозов. В исследовании, проведенном в Сингапуре, участвовало 38 пациентов, из которых 34 % имели домашние аквариумы, 11 % имели профессии, связанные с рыбой. В исследовании, проведенном во Франции, участвовало 63 пациента, из которых 84 % имели контакт с гидробионтами. В исследовании, проведенном в Гонконге, участвовало 24 больных, из которых 67 % были рыбаками, и в 67 % случаев раны были инфицированы морской водой (Cheung et al., 2010).

1.3 Биологические свойства микобактерий

Микобактерии имеют вид слегка изогнутых или прямых палочек (1,0-10Ч0,2-0,6 мкм). Может встречаться редуцированное ветвление и нитевидные или мицелиальные структуры, которые, при любом воздействии, рассыпаются на короткие палочки или кокки. Микобактерии не образуют спор, капсул и конидий. Большинство микобактерий не окрашиваются по Граму или демонстрируют неоднородность окрашивания, но считаются грамположительными (Magee and Ward, 2012).

1.3.1 Таксономическое положение и классификация

По филогенетической классификации, основанной на сходстве генов 16S-рРНК, микобактерии отнесены к филе BXXVI Actinobacteria, класс Actinobacteria, подкласс Actinobacteridae, порядок Actinomycetales, подпорядок Corynebacterineae, семейство Mycobacteriaceae, род Mycobacterium (Euzebu, 2016).

В Определителе бактерий Берджи микобактерии выделены в отдельную группу 21. Ключевым свойством, позволяющим выделить микобактерий в отдельный род, является кислото-спиртоустойчивость хотя бы на одной из стадий жизненного цикла (Хоулт и др., 1997). Кислото-спиртоустойчивость - это свойство бактерий сохранять окраску при обработке смесью кислота-спирт после окрашивания горячим раствором карболфуксина. Это свойство микобактерий обусловливается присутствием восков (высокомолекулярных липидов) в клеточной стенке.

Риньоном была предложена классификация микобактерий на основе их скорости роста и способности продуцировать пигмент каротиноидной природы (Runyon, 1959). Были выделены три группы медленнорастущих микобактерий (Slow growers) и одна группа быстрорастущих (Rapid growers)

1. Photochromogens - культуры на свету приобретают лимонно-желтую окраску.

2. Scotochromogens - в темноте образуют оранжево-желтый пигмент.

3. Nonphototrophogenic - не пигментируются или имеют слабую желто-розовую окраску.

4. Rapid Growers - колонии становятся видимыми без увеличения за время не более 48 часов, пигментация слабая или отсутствует.

Медленно- и быстрорастущие виды микобактерий имеют различия в структуре рРНК и организации генов, кодирующих рРНК. Показано, что медленнорастущие виды микобактерий имеют всего одну копию генов 5S, 16S и 23S рРНК, в то время как геном быстрорастущих микобактерий содержит 2 копии соответствующих генов. Кроме того, рРНК медленнорастущих видов содержит более длинную шпильку между 451 и 482 нуклеотидами, чем рРНК быстрорастущих видов микобактерий (Stahl and Urbance,1990).

Одна копия генов рРНК у медленнорастущих микобактерий приводит к ограничению синтеза белка, что замедляет процесс роста (Falkinham, 1996). С другой стороны, это дает преимущества, например, легкость накопления мутаций, позволяющих противостоять действию антибиотиков, направленных на рибосомы. Также увеличивается время для адаптации к стрессам окружающей среды (Primm et al., 2004). Энергетические затраты на синтез длинноцепочечных жирных кислот, липидов и восков и непроницаемость богатой липидами клеточной стенки также замедляют рост.

Дифференциация видов рода Mycobacterium основывается на биохимических тестах, температуре роста, образовании пигмента и диференциации генов 16S-рРНК, rpoB, hsp65, secA (Goodfellow, 2012; Хоулт и др, 1997; Zelazny et al., 2009).

В настоящее время описано 170 видов микобактерий (Ezeubi, 2016). Тем не менее, значительное количество новых изолятов микобактерий не соответствуют описанным ранее видам. Так Тортоли с коллегами (Tortoli et al.,2001) показали, что 30 % микобактерий, выделенных из воды, почвы, воздуха и клинических образцов, не принадлежат ни к одному официально признанному виду микобактерий. Это свидетельствует о том, что таксономия рода Mycobacterium еще не до конца разработана и возможно открытие новых видов.

1.3.2 Структура оболочки нетуберкулезных микобактерий

Микобактерии способны расти и размножаться при условиях, губительных для других бактерий. Устойчивость к широкому диапазону антибактериальных агентов, включая антибиотики и дезинфицирующие средства (соединения хлора), обеспечивается оболочкой с низкой проницаемостью. Поверхность микобактерий является гидрофобной, что позволяет им жить на поверхности раздела сред вода-воздух и осуществлять свойственный им аэробный метаболизм (Falkinham, 2008).

Над клеточной мембраной микобактерий находится толстый слой пептидогликана, ковалентно связаного с арабиногалактаном, который в свою очередь связан с миколовыми кислотами, имеющими длинные разветвленные цепи. Эта структура получила название кора клеточной стенки или миколил-арабиногалактан-пептидогликанового комплекса (МАГП). Над кором располагается квазинаружная мембрана, внутренний листок которой составляют миколовые кислоты (Brennan, 2003).

Миколовые кислоты, входящие в состав квазинаружной мембраны, обладают низкой текучестью и придают оболочке непроницаемость для липофильных антибиотиков. В состав миколовых кислот могут входить функциональные группы, различные для разных видов. Это объясняет разную устойчивость отдельных видов микобактерий к хлору. Так M. scrofulaceum в 5 раз более чувствителен к хлору, чем M. avium (Falkinham, 2003).

Толстую клеточную оболочку микобактерий пронизывают порины, которые служат для поступления небольших гидрофильных молекул в клетку микобактерий. Длина главного порина MspA у M. smegmatis достигает 10 нм при диаметре 2,5 нм (Engelhardt et al., 2002). Такая протяженность поринов замедляет поступление веществ в клетку микобактерий.

Плотность каналов на поверхности клетки микобактерий в 50 раз меньше, чем на наружной мембране E. coli. Это снижает проницаемость оболочки микобактерий. Показано, что проницаемость поринов M. smegmatis ниже проницаемости поринов E. coli в 1000 раз (Engelhardt et al., 2002). Число поринов на поверхности микобактерий определяет не только различия в чувствительности к агрессивным воздействиям внешней среды, но и различия в скорости поступления в клетку питательных веществ и скорости роста отдельных видов.

Отмечается повышенная устойчивость микобактерий к анилиновым красителям. Это свойство определяется высоким содержанием липидов в клеточной стенке микобактерий. Низкая проницаемость оболочки микобактерий определяет их высокую устойчивость к присутствию в питательной среде анилиновых красителей - кристаллического фиолетового и малахитового зеленого - до 5 мкг/мл жидкой питательной среды (Jones, 2003). Формирование колоний тормозится этими красителями в концентрации 15 мкг/мл и 60 мкг/мл, соответственно. Это свойство используется для селективного выделения микобактерий.

1.3.3 Физиологические особенности нетуберкулезных микобактерий

Микобактерии могут использовать в качестве питательных субстратов широкий спектр углеводородов: ацетон, алканы, бензол, гуминовые и фульво-кислоты, ди- и трихлорфенолы, керосин, морфолин, мочевину, нитроперен, пентохлорфенол, пирен, пиридины, полициклические ароматические углеводороды, пропан, стерины, тринитротолуол, трихлорэтилен, фенантрен, хлорид винила, хлор-фенольные соединения, этен (Falkinham, 1996).

Микобактерии живут в широком диапазоне температур. Выделяют термофильные виды, такие как M. avium, M. chelonae и M. xenopi, которые выживают при температуре более 55°C. Термофильность увеличивается в ряду: M. kansasii > M. fortuitum, M. intracellulare, M. marinum > M. avium, M. chelanoe, M. phlei, M. scrofulaceum, M. xenopi (Schulze-Robbecke, 1992). Микобактерии могут переживать условия заморaживания (минус 75°C в питательной среде) в течение длительного времени, число клеток при этом увеличивается, по-видимому в результате дробления клеток (Iivanainen et al.,1995).

Микобактерии - аэробные бактерии, но способны расти при пониженном содержании кислорода. Так, M. avium и M. intracellulare размножаются, начиная с 6 % кислорода в газовой среде. Эта способность позволяет микобактериям достигать наибольшей численности в средах с низким содержании кислорода - воде и почве.

Микобактерии предпочитают для роста слабокислую среду, оптимальный диапазон для роста - pH 4,5-6. При значении рН свыше 6 рост микобактерий останавливается (Carson et al., 1978).

Нетуберкулезные микобактерии относительно устойчивы к действию тяжелых металлов и оксианионов. Показано, что M. avium, M. intracellulare и M. scrofulaceum проявляют устойчивость к кадмию, ртути, серебру и теллуриту (Falkinham et al., 1984). Эти микобактерии могут расти при концентрации хлорида ртути 10^-4М, что свидетельствует о способности микобактерий выживать при загрязнении окружающей среды тяжелыми металлами. Устойчивость M. avium к цинку, возможно, является причиной распространения этих микобактерий в гальванизированных (покрытых цинком) трубах (Falkinham et al., 1984).

Микобактерии - галотолерантные бактерии, отдельные виды микобактерий выдерживают концентрацию NaCl в питательной среде до 5 %. Галотолерантность видоспецефична для микобактерий, способность к росту при 5 % NaCl является идентификационным признаком (Magee and Ward, 2012).

Таким образом, микобактерии растут при широких диапазонах температуры, pH, солености, в аэробных и микроаэрофильных условиях. Это способствует их широкому распространению во многих экологических нишах (Falkinham, 1996).

Микобактерии способны формировать биопленки, которые защищают их от агрессивных факторов окружающей среды и служат для расселения и размножения (Falkinham, 2008). Микобактерии не обладают специальными структурами для прикрепления, такими как фимбрии и пили, но гидрофобная поверхность и наличие гликопептидолипидов в наружной оболочке обеспечивают возможность прикрепления. Мартинезом было показано, что существует прямая корреляция между способностью к движению и возможностью формировать биопленки благодаря наличию гликопептидолипидов в оболочке. Микобактерии формируют гидрофобную пленку над гидрофильной поверхностью агара, что позволяет им перемещаться скользящим движением (Martinez et al., 1999).

Возможность формировать биопленки связана с чувством кворума, то есть со способностью микроорганизмов посылать сигналы другим членам популяции. Показано, что M. avium эффективнее формирует биопленки в воде, чем в питательном бульоне за счет усиления секреции в воде гена secA (Limia et al., 2001).

M. avium формирует наиболее устойчивые биопленки в присутствии глюкозы и пептона в качестве источника углерода. Присутствие в среде катионов Ca²⁺, Mg^{2 +} и Zn²⁺ вне зависимости от концентрации увеличивает скорость формирования биопленок (Carter et al., 2003). Гуминовые кислоты подавляют формирование биопленок за счет своей хелатирующей активности и снижения доступности катионов (Carter et al., 2003).

Скорость формирования биопленок относительно высокая. Показано, что M. fortuitum формирует плотные биопленки в первые 48 часов роста на твердой поверхности (Hall-Stoodley et al., 1998).

Микобактерии способны быстро формировать биопленки и в проточной воде, имитирующей распределительную водопроводную сеть в лабораторных условиях. M. xenopi при инокуляции в водный поток быстро переходит в прикрепленное состояние и через 20 дней численность клеток в биопленках становится в 10 раз выше, чем в проточной воде (Dailloux et al., 2003).

Склонность микобактерий к существованию в прикрепленном состоянии подтверждается многочисленными фактами выделения биопленок микобактерий из водопроводной сети в разных странах. В исследовании, проведенном в Южной Африке, в биопленках водопроводной системы были найдены M. gordonae, M. glivum, M. abscessus, M. fortuitum и M. septicum (September et al., 2004). В исследовании Фалкинхема и коллег из биопленок водопроводной сети были выделены M. shimoidei, M. haemophilium, M. marinum, M. intracellulare, M. terrae, M. gordonae и M. aurum. Для M. avium и M. intracellulare было показано их присутствие в биопленках распределительной сети при одновременном их отсутствии в проточной воде (Falkinham et al., 2001).



2. Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования

Выделение бактерий рода Mycobacterium проводили из воды пресноводного аквариума №19 Санкт-Петербургского Океанариума (ТРК "Планета Нептун").

Вместимость аквариума 21,8 тонн. Поддерживается температура воды 25 градусов Цельсия.

В аквариуме содержится преимущественно крупная рыба (от 60 до 120 см):

· Астронотус - 2 шт.

· Псевдоплатистома - 3 шт.

· Пиранья паку - 1 шт.

· Сом оринокский - 1 шт.

· Аравана - 4 шт.

· Скат хвостокол - 2 шт.

· Пангасиус - 1 шт.

· Арапаима - 4 шт.

Кормление осуществляется треской и креветками (2,6 кг в неделю). Обслуживание аквариума проводится с участием водолазной службы.

Очистка воды производится при помощи озонирования и обработки ультрафиолетом. Режим озонирования постоянный. Производительность озонатора 1,5 гр., редокс-потенциал 350-380. Обработка УФ постоянная. Мощность УФ-стерилизатора 1755 Вт.

Аквариум является открытым, его водная поверхность не изолирована от экспозиционных помещений, таким образом, он являются потенциальным источником аэробиологической опасности не только для сотрудников, но и посетителей Океанариума, поскольку возможен контакт с водой в виде брызг и водного аэрозоля, который образуется при испарении.

2.2 Питательные среды для выделения и культивирования микобактерий

Среда Lцwenstein-Jensen (пропись фирмы Merck, Германия):

В 600 мл дистиллированной воды растворяли: KH₂PO_4-2,5г, MgSO_4-0,24 г, магния лимоннокислого - 0,6 г, l-аспарагина - 3,6 г, картофельной муки - 30,0 г, глицерина-12 мл, малахитового зеленого - 0,4 г, среду автоклавировали при 1 атм 15 минут. Среду охлаждали до 50⁰С и добавляли 1л гомогената свежих куриных яиц с соблюдением мер стерильности. Готовую среду разливали в стерильные емкости и пастеризовали при 85⁰С 45 минут. рН среды до добавления яиц - 4,8 + 0,2.

Среда Lцwenstein-Jensen с цельными яйцами (модификация):

В 200 мл дистиллированной воды растворяли KH₂PO_4-0,6 г, цитрата натрия - 0,15 г, растворимого крахмала - 4 г, дрожжевого экстракта - 0,9 г, малахитового зеленого - 0,1 г, добавляли - агар-агар - 6,0 г. После стерилизации при 1 атм 30 минут к среде добавляли 1 мл 0,2 % стерильного раствора MgSO₄, 3 мл глицерина и 200 мл гомогената куриных яиц, разведенных 1:1 стерильной дистиллированной водой. Готовую среду проваривали в кипящей водяной бане 10 минут и разливали по чашкам Петри.

Среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией (модификация):

В 500 мл дистиллированной воды растворяли 0,9 г KH₂PO₄, цитрата натрия - 0,25 г, растворимого крахмала - 11,3 г, дрожжевого экстракта - 1,35 г, Whitley Impedance Broth (Великобритания) - 18,0 г, добавляли агар-агар - 9,0 г. После стерилизации при 1 атм 30 минут добавляли 1 мл 0,3 % стерильного раствора MgSO₄, 4,5 мл глицерина и 100 мл желточной эмульсии (1 желток среднего по размеру куриного яйца на 100 мл стерильной дистиллированной воды).

Среда яичная Ogawa (Portaels, 1988).

В 100 мл воды растворяли 1 г глутамата натрия, 1г KH₂PO₄, 6 мл 2 % малахитового зеленого, 6 мл глицерина, добавляли ага-агар - 4,5 г. После стерилизации в среду вносили 200 мл гомогената цельных куриных яиц.

Среда Middlebrook 7H11 (фирмы HiMedia Индия) (состав г/л):

Гидролизат казеина -1 г, сульфат аммония -0,5 г, L-глутаминовая кислота - 0,5 г, калий дигидрофосфат - 1,5 г, натрий гидрофосфат 1,5 г, цитрат натрия - 0,4, железа аммонийного цитрат - 0,04 г, сульфат магния - 0,05 г, пиридоксин - 0,001 г, биотин - 0,0005 г, малахитовый зеленый - 0,001 г, агар-агар - 15,0 г, глицерин - 5,0 мл, рН 6,6 + 0,2 (25⁰С). После автоклавирования в 450 мл готовой среды, охлажденной до 50⁰С, вносили 50 мл ростовой добавки (FD018) следующего состава (г/50 мл): бычий альбумин (фракция V) - 2,5 г, глюкоза - 1 г, каталаза - 0,002 г, олеиновая кислота - 0,025 г, хлорид натрия - 0,425 г.

2.3 Окраска бактериальных мазков на кислото-спиртоустойчивость

Мазки готовили на 5-7 и 14 сутки культивирования посевов. Мазки высушивали на воздухе и фиксировали в пламени спиртовки. Для окраски мазков готовили краситель - 1 г основного фуксина растворяли в 10 мл этанола. К красителю добавляли раствор L.O.C. фирмы Amway (многофункциональное чистящее средство, содержит от 5 % до 15 % анионные ПАВ, менее 5 % неионогенные ПАВ) - 0,6 мл L.O.C. в 100 мл дистиллированной воды. Готовую смесь фильтровали, заливали в стаканчики для окраски и прогревали для стабилизации температуры в течение 15 мин при температуре 75⁰С.

...