Выявление представителей рода Mycobacterium в аквариумной воде, находящейся в замкнутой системе очистки

Окраску мазков проводили при 75⁰С в течение 10 минут. Стекла охлаждали, промывали водой, подсушивали.

Дифференциальное обесцвечивание проводили 3 % раствором HCl в этаноле - 15-20 сек (до прекращения потока смываемой краски). Стекла промывали водой и подсушивали.

Дополнительное окрашивание проводили 0,25 % метиленовой синью в 1 % уксусной кислоте в течение 5 минут. Стекла промывали и подсушивали.

Спирто-кислотоустойчивые бактерии оставались красными, чувствительные к обесцвечиванию бактерии имели синюю окраску (Ellis, Zabrowarny, 1993).

2.4 Методики проведения идентификационных тестов

Хромогенность. Для оценки способности выделенных штаммов реагировать на освещение образованием каротиноидных пигментов проводили посев каждого штамма на 2 чашки со средой Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией. Культивирование проводили в темноте при комнатной температуре в течение 7 суток. Далее одну из чашек доставали и экспонировали несколько дней под лампой 60вт на расстоянии 25 см. По истечении 7 суток обе чашки сравнивали между собой. Штаммы, не синтезирующие пигменты при освещении, считали нехромогенными. Штаммы, синтезирующие пигмент при световой стимуляции, относили к хромогенным. микобактерия заболевание водопроводная аквариумистика

Скорость роста. Для отнесения выделенных штаммов к быстро растущим или к медленно растущим видам микобактерий их высевали на среду Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией методом истощающего мазка для получения единичных колоний. Штамм считали быстро растущим, если в течение 7 дней появлялись хорошо различимые колонии с индивидуальными свойствами. Если такие колонии формировались позже, штамм считали медленно растущим.

Способность к росту при различных температурах. Культивирование проводили на среде Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией при 28⁰, 37⁰, 42⁰ и 45⁰С. Засев проводили истощающим мазком. Результаты теста считали положительными, если на 7-14 сутки появлялись колонии типичной формы.

Арилсульфатазный тест. Положительный ответ в этом тесте характерен практически для всех представителей рода Mycobacterium. Тест ставили на 3 и 14 сутки культивирования при 28⁰С. Для постановки теста в среду Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией вводили субстрат - фенолфталеин дисульфат до конечной концентрации - 0,001 М. Питательную среду разливали столбиками, засев исследуемых штаммов проводили суспензией на поверхность столбика. По истечении времени культивирования на поверхность тестируемых посевов вносили по 6 капель 2N раствора Na₂CO₃. Регистрацию проводили в первые 30 минут. В случае положительной реакции на поверхности питательной среды появлялась розово-красная полоска.

Рост в присутствии 5 % NaCl. Тест проводили на среде Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией и 5 %NaCl при 28⁰С. Засев осуществляли истощающим мазком. Тест считали положительным, если через 7-14 (28) дней формировались типичные колонии.

Способность использовать различные источники углерода (инозит, маннит и цитрат) в присутствии аммонийного азота. Для данного теста готовили минеральную среду следующего состава (г/л): (NH₄)₂SO_4-2,4 г, KH₂PO_4-0,5 г, MgSO_4-0,5 г, агар-агар -20,0 г. Источники углерода (5-7 г/л) растворяли в стерильной дистиллированной воде, пастеризовали и добавляли в среду. Засев проводили на поверхность питательной среды в чашки Петри истощающим штрихом. Культивирование проводили при 28⁰С в течение 14 дней.

Каталазный тест (полуколичественный).

Для постановки теста штаммы выращивали на поверхности столбиков среды Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией при 28⁰С 14 дней. Для проверки наличия каталазы и ее активности на поверхность столбиков приливали 1 мл реагента - смесь 1:1-10 % Твин 80 и 30 % перекиси водорода (3таблетки гидроперита в 5 мл воды). Реакцию регистрировали в первые 5 минут. Возможны следующие варианты реакции: 1) отсутствие вспенивания (микобактерии не образуют каталазу), 2) вспенивание интенсивное, столбик пены более 45 мм, 3) вспенивание слабое, столбик пены менее 45 мм.



3. Результаты и их обсуждение

3.1 Подбор твердой питательной среды для выявления микобактерий из аквариумной воды методом прямого высева

Многочисленные методы выделения микобактерий из воды и других объектов внешней среды традиционно начинают со стадий концентрирования и деконтаминации с целью подавить жизнедеятельность сопутствующих бактерий. Для этого используют 2-4 % NaOH, антибиотики, цетримид, цетавлон, H₂SO₄ и другие санирующие агенты, агрессивные в отношении бактерий. Эти воздействия, безусловно, снижают жизнеспособность всех бактерий, включая и выделяемых микобактерий. Процедуры контаминации и концентрирования включают центрифугирование бактериальной массы. Микобактерии имеют гидрофобные оболочки, поэтому центрифугирование приводит к слипанию, агрегации и в конечном итоге потере микобактерий, особенно если они находятся в низкой концентрации. По этим причинам мы решили не проводить процедуры деконтаминации и центрифугирования при выделении микобактерий из аквариумной воды, то есть сразу осуществить прямой высев воды на питательные среды, рекомендованные для выявления микобактерий.

Основная питательная среда для выделения микобактерий из различных по типу образцов, рекомендуемая во всех руководствах и основных обзорах (Le Dantec, 2002; Thomson et al., 2013) - это среда Lцwenstein-Jensen с малахитовым зеленым, подавляющим рост сопутствующих бактерий и грибов-микромицетов. Классическая пропись этой среды содержит малахитовый зеленый в концентрации 250 мкг/мл. В то же время по данным Джонса и Фалкинхама (Johnes, Falkinham, 2003) изоляты микобактерий из неклинических образцов проявляют различную, зачастую низкую устойчивость к этому красителю - от 6 мкг/мл до 120 мкг/мл.

Таким образом, становится очевидным, что классическая среда Lцwenstein-Jensen вероятнее всего, предназначена для выделения наиболее устойчивых к красителям, медленно растущих патогенных микобактерий (M. tuberculosis и M. avis). Применение малахитового зеленого для выделения микобактерий из аквариумной воды, может привести к закономерной их потере.

Действительно, наши первые попытки высева аквариумной воды на классическую среду Lцwenstein-Jensen с малахитовым зеленым по стандартной прописи дали хороший рост разноцветных бактериальных клонов (рис. 1А). Большинство колоний были в большей или меньшей степени слизеобразующими. Тем не менее, при их рассеве с целью очистки и получения чистых клонов было установлено, что большинство колоний смешанные, а отсеянные клоны оказались нежизнеспособными и погибали на 2-3 пассаже. То есть выделение микобактерий из аквариумной воды на среде Lцwenstein-Jensen с малахитовым зеленым оказалось невозможным. Поэтому было решено попытаться исключить малахитовый зеленый из состава питательной среды для первичного высева.

Анализируя прописи питательных сред для микобактерий, мы предположили, что цельный гомогенат куриных яиц, предложенный к использованию в среде Lцwenstein-Jensen в начале ХХ века, можно заменить питательным бульоном и желточной эмульсией. Это сделало бы среду более однородной, что важно при поверхностном посеве шпателем, и более воспроизводимой при ее изготовлении в лабораторных условиях.

Для проверки нашей модификации среды Lцwenstein-Jensen мы провели серию высевов аквариумной воды на среду Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого в сравнении с классической питательной средой для микобактерий - агаром MiddleBrook (в оригинальной прописи имеется малахитовый зеленый в минимальной концентрации - 1 мкг/мл) (Middlebrook, Cohn, 1958). В этом же эксперименте аквариумную воду высевали на среду Lцwenstein-Jensen без малахитового зеленого с желтками с добавлением Твина 80 для диспергирования клеточных комков с целью получения большего количества чистых клонов. В качестве дополнительных контролей высев проводили также на стандартный питательный агар (Оболенск) и среду Lцwenstein-Jensen с малахитовым зеленым в разной концентрации. Полученные данные по численности выявленных микроорганизмов представлены в табл. 1. Внешний вид посевов представлен на рис. 1.

Из представленных данных видно, что среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого дает численность и разнообразие морфотипов колоний, соизмеримые с агаром Middlebrook, рекомендованным для выделения микобактерий. Добавление в среду Твина 80 не увеличивает выявляемую численность и разнообразие морфотипов колоний. Введение в состав среды малахитового зеленого уже с 5 мкг/мл резко снижает численность и разнообразие колоний, увеличивает проблемы очистки клонов за счет образования слизи и увеличения доли смешанных колоний.

Питательный агар дает практически туже численность колоний, что и среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого, но при этом колонии более мелкие и менее выразительные по морфологии. Можно предположить, что на этой среде медленно растущие микобактерий будут не выявлены. На основании всего вышеизложенного для выделения микобактерий из аквариумной воды мы остановились на среде Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого, по качеству и селективности не уступающей коммерческой среде Middlebrook.

Таблица 1. Численность микроорганизмов, выявленных в воде аквариума № 19, при высеве на различные по составу питательные среды^*

№	Питательная среда	Концентрация малахитового зеленого, мкг/мл	Численность, КОЕ/мл	Морфология колоний
1	Питательный агар	0	5,6 х 102	10 морфотипов, колоний
2	Среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого	0	6,3 х 102	15 морфотипов
3	То же с Твином 80 (0,1 %)	0	6,9 х 102	Морфотипы те же
4	Агар Middlbrook	1	6,4 х 102	Морфотипы те же
5	Среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией с малахитовым зеленым	5	3,2 х 102	Морфотипы те же
6	Среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией с малахитовым зеленым	50	1,2 х 102	Резкое снижение чис-ленности мофотипов колоний, увеличение доли слизистых колоний
7	Среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией с малахитовым зеленым	100	1,2 х 102	Снижение численности морфотипов, колонии слизистые, смешанные
8	Среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией с малахитовым зеленым	250	7,4 х 101	То же, все колонии смешанные.

*- Высев был произведен 26.01.2016, на следующий день после очистки аквариума.

А

Б

В

Рис. 1. Внешний вид посевов аквариумной воды на питательную среду Lцwenstein-Jensen с цельными куриными яйцами (А), на ту же среду в нашей модификации с желточной эмульсией без малахитового зеленого (Б) и на Middlbrook агар (В)

3.2 Выявление кислото-спиртоустойчивых клонов бактерий на неселективных питательных средах

Как было показано на предыдущем этапе работы среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого и Middlbrook агар являются слабо селективными питательными средами. Поэтому выявленные клоны перед очисткой необходимо было проверить на принадлежность к роду Mycobacterium.

В соответствии с современными представлениями микобактерии характеризуются кислото-спиртоустойчивостью хотя бы на одной из стадий роста (Хоулт и др., 1997) и этим отличаются от близких к ним нокардий и родококков. Данный тест предполагает устойчивость микобактерий к обесцвечиванию окрашенных мазков смесью соляной кислоты и этанола. В научных публикациях этот тест часто называют сокращенно "тест на кислотоустойчивость" ("acid fast"), что не совсем правомерно. Вторым тестом на принадлежность изолятов к роду Mycobacterium является тест на арилсульфатазу (Хоулт и др., 1997).

Таким образом, алгоритм выявления микобактерий из аквариумной воды состоял из следующих этапов: 1) высев воды на выбранную питательную среду; 2) проверка колоний в тесте на кислото-спиртоустойчивость; 3) очистка отобранных клонов; 4) проверка штаммов в тесте на арилсульфатазу; 5) идентификация штаммов микобактерий.

В соответствии с выбранным алгоритмом 46 изолятов, выросших на среде Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого и Middlebrook агаре были проверены на кислото-спиртоустойчивость на 7 и 14 сутки роста при 28⁰С. Оказалось, что кислото-спиртоустойчивостью обладают лишь единичные клоны. Для расширения круга поиска дополнительно были протестированы еще 14 изолятов, выросших на среде Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией и с разными концентрациями малахитового зеленого.

В итоге было выявлено 8 кислото-спиртоустойчивых изолятов, которые можно было отнести к микобактериям. Они были подвергнуты очистке клонированием. За период выполнения данной работы удалось очистить 4 изолята - это штаммы 14, 31, 40 и 48. Их свойства приведены в следующих разделах работы. Общая численность микобактерий в исследованной воде - не менее 10 КОЕ/мл.



3.3 Идентификация выделенных бактериальных штаммов

3.3.1 Внешний вид колоний, особенности роста, отношение к свету

Внешний вид колоний штаммов 14, 31, 40 и 48 представлен на рис. 2 и 3. Колонии штаммов 14, 40 и 48 на среде Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого при 28⁰С появляются на 3-5 сутки и полностью формируются до истечения 7 суток. Это позволяет считать их быстрорастущими кислото-спиртоустойчивыми бактериями.

Колонии штаммов 14, 40 и 48 внешне сходны - это выпуклые, непигментированные блестящие колонии размером 3-4 мм, с возрастом подсыхающие и приобретающие морщинистость. Консистенция колоний - различная, так штамм 14 - очень вязкий, тянущийся. Штаммы 40 и 48 - маслянистые, мажущиеся.

Штамм 31 (рис. 3) растет на всех средах медленнее остальных и только при посеве густым штрихом. Поэтому очистка этого штамма и клонирование были затруднены. При 28⁰С рост штамма лишь слегка заметен на 3-5 сутки, посевы окончательно формируются (выходят в стационарную фазу роста) после 10 суток культивирования. Штамм 31 был признан медленнорастущим.

Все 4 штамма не пигментированы. Стимуляция образования каротиноидных пигментов дополнительным освещением оказалась безрезультатной. Все 4 штамма были признаны нехромогенными.

3.3.2 Кислото-спиртоустойчивость, морфология клеток

Морфология клеток всех четырех выделенных штаммов соответствует описанию микобактерий в Определителе бактерий Берджи (Хоулт и др., 1997).

Для всех штаммов, выращенных на среде Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией, характерна кислото-спиртоустойчивость на 7-14 сутки культивирования при 28⁰С (рис. 4).

3.3.3 Идентификация штаммов 14, 40 и 48 по последовательностям гена 16s рРНК

Для подтверждения систематической принадлежности выделенных штаммов к роду Mycobacterium по нашей просьбе сотрудниками лаборатории микробиологического мониторинга и биоремедиации почв ФБГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии был проведен анализ генов 16 s рРНК у трех выделенных нами быстрорастущих штаммов - 14, 40 и 48.

А

Б

Рис. 2. Внешний вид колоний кислото-спиртоустойчивых штаммов 14 (А) и 40 (Б) на среде Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого при 28 ⁰С

А

Б

Рис. 3. Внешний вид колоний кислото-спиртоустойчивых штаммов 48 (А) и 31 (Б) на среде Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого при 28 ⁰С

Рис. 4. Внешний вид выделенных бактериальных штаммов в тесте на кислото-спиртоустойчивость

Контроль - бактерии, не обладающие кислото-спирто-устойчивостью (синие).

Для амплификации выделенной ДНК использовали праймеры для гена 16S рРНК: FD1 27f agagtttgatcatggctcag, RD1 1525r aaggaggtgatccaacc и полимеразу Taq (Evrogene). Реакцию проводили в автоматическом амплификаторе BioRad в следующем

режиме: 34 цикла: 95° 15 секунд 52° 15 секунд, 72° 30 секунд. После амплификации проводили электрофорез фрагментов ДНК в 1 % агарозном геле, агарозный блок, содержащий фрагмент нужной длины вырезали из геля и очищали. Полученный

фрагмент ДНК секвенировали с праймерами FD1 27f и RD1 1525r на генетическом анализаторе AB 3500xl по методике, рекомендованной производителем.

Последовательности гена 16s рРНК, полученные в ходе секвенирования (прямая, обратная и сконструированные на их основе конкатемеры), представлены в Приложении 1. Их сравнивали с последовательностями, имеющимися на сайте NCBI (National Center for Biotechnology Information), используя программу BLAST.

Оказалось, что полученные последовательности 16s рРНК для штаммов 14, 40 и 48 (более 1000 нуклеотидов) имеют высокий уровень сходства (99-100 %) с несколькими десятками последовательностей гена 16s рРНК различных видов рода Mycobacterium. Для повышения вероятности видовой идентификации мы исключили из рассмотрения виды, не депонированные в мировых коллекциях и не являющиеся типовыми для рода Mycobacterium, предполагая, что некоторые последовательности базы данных NCBI могут иметь недостоверные видовые названия. Результаты видовой идентификации штаммов 14, 40 и 48 по сходству последовательностей гена 16s рРНК представлены в табл. 2-4.

Из результатов табл. 2 видно, что выделенный нами штамм 14 может относиться к видам: M. porcinum, M. neworleansense, M. senegalense, M. houstonense и M. fortuitum. Штаммы 40 и 48 могут относиться к видам: M. chelonae, M. abscessus, M. salmonifilum.

Для окончательной идентификации были исследованы фенотипические свойства данных штаммов микобактерий, результаты представлены в следующей главе.



Таблица 2. Потенциальные видовые диагнозы для штамма 14, установленные на основании сходства последовательности гена 16s рРНК (конкатемеров)

№	Потенциальные видовые диагнозы для штамма 141	Число последовательностей гена 16s рРНК в NCBI (сходство 99-100 %)
		Общее число	От коллекционных штаммов 2	От типовых штаммов 3
1	Mycobacterium porcinum	10	1 ATCC 33776	1 ATCC 33776
2	Mycobacterium neworleansense	2	1 ATCC 49404	1 ATCC 49404
3	Mycobacterium senegalense	2	1 ATCC 35796	1 ATCC 35796
4	Mycobacterium houstonense	1	1 ATCC 49403	1 ATCC 49403
5	Mycobacterium fortuitum	15	1 ATCC 49404	0
6	Mycobacterium septicum	7	0	0
7	Mycobacterium peregrinum	6	0	0
8	Mycobacterium conceptionense	3	0	0
9	Mycobacterium gilvum	1	0	0
10	Mycobacterium boenickei	1	0	0

¹ - виды, отсутствующие в Руководстве по систематике бактерий Берги (2 изд.), не рассматривались.

² - штаммы в коллекциях: ATCC, CCUG, CIP, DSMZ, JCM, NCTCZ.

³ - типовые штаммы вида в соответствии с Руководством по систематике бактерий Берги (2 изд.).



Таблица 3. Потенциальные видовые диагнозы для штамма 40, установленные на основании сходства последовательности гена 16s рРНК (конкатемеров)

№	Вид 1	Число последовательностей в NCBI (сходство 99-100 %)
		Общее число	От коллекционных штаммов 2	От типовых штаммов 3
1	Mycobacterium chelonae	32	6 ATCC 19237 ATCC 35752, JCM 6388, CCUG 47445, CCUG 47286, CIP 106684	3 ATCC 35752б CCUG 47445, JCM 6388,
2	Mycobacterium abscessus	26	3 ATCC 19977, DSM 44196, JCM 13569	3 ATCC 19977, DSM 44196, JCM 13569
3	Mycobacterium salmoniphilum	10	1 ATCC 13758	1 ATCC 13758
4	Mycobacterium massiliense	3	0	0

¹ - виды, отсутствующие в Руководстве по систематике бактерий Берги (2 изд.), не рассматривались.

² - штаммы в коллекциях: ATCC, CCUG, CIP, DSMZ, JCM, NCTCZ.

³ - типовые штаммы вида в соответствии с Руководством по систематике бактерий Берги (2 изд.).

Таблица 4. Потенциальные видовые диагнозы для штамма 48, установленные на основании сходства последовательности гена 16s рРНК (конкатемеров)

№	Вид 1	Число последовательностей в NCBI (сходство 99-100 %)
		Общее число	От коллекционных штаммов 2	От типовых штаммов 3
1	Mycobacterium abscessus	26	5 JCM 13569 ATCC 19977 ATCC 19977 DSM 44196 CCUG 47286	3 ATCC 19977 DSM 44196 JCM 13569
2	Mycobacterium chelonae	26	4 ATCC 19237 CCUG 47445 JCM 388 ATCC 35752	3 CCUG 47445 JCM 6388 ATCC 35752
3	Mycobacterium salmoniphilum	13	2 ATCC 13758 ATCC 13758	1 ATCC 13758
4	Mycobacterium immunogenum	4	0	0
5	Mycobacterium massiliense	2	0	0

¹ - виды, отсутствующие в Руководстве по систематике бактерий Берги (2 изд.), не рассматривались.

² - штаммы в коллекциях: ATCC, CCUG, CIP, DSMZ, JCM, NCTCZ.

³ - типовые штаммы вида в соответствии с Руководством по систематике бактерий Берги (2 изд.).

3.3.4 Фенотипические свойства штаммов 14, 40 и 48, постановка заключительного идентификационного диагноза

На основании рекомендаций Руководства по систематики бактерий Берги для идентификации быстро растущих микобактерий мы определили ключевые родовые и видовые фенотипические признаки выделенных штаммов. Полученные результаты представлены в табл. 5 и 6. Для сравнения в эти таблицы включены признаки видов микобактерий, наиболее близких по последовательностям генов 16s рРНК (см. гл. 3.5).

Штамм 14 по совокупности установленных фенотипических признаков более всего сходен с M.porcinum, хотя имеются и различия (например, слабый рост в присутствии 5 % NaCl).



Таблица 5. Фенотипические признаки штамма 14 в сравнении с аналогичными признаками типовых штаммов микобактерий

№	Признаки	Микобактерии
		M.porci-num	M.newor-leansense	M.senega-lense	M.housto-nense	M.fortu-itum	шт. 14
1	Рост при 420С	+	?	nd	+	V	+
2	Рост при 450С	?	?	?	nd	?	?
3	Пигментация	N	N	N	N	N	N
4	Рост на среде McConkey без кристалвиолета	nd	+	?	+	+	+
5	Рост на 5 % NaCl (w/v)	+	+	+	+	+/?	?
6	Нитратредукция	?	+	+	+	+	nd
7	Арилсульфатаза на 3 день	+	+	+	+	+	+
8	Каталаза	+	nd	+	nd	Nd	+
	Рост на единст-венном источ-нике углерода:
10	- цитрат	+	?	+	?	?	+
11	- маннит	+	nd	nd	nd	D	+
12	- инозитол	+	nd	nd	nd	Nd	+

"+" - 90 % и более штаммов положительные;

" ? " - 90" и более штаммов - негативные;

"d" - 11-89 % штаммов положительные;

"v" - вариабильная реакция у исследованных штаммов;

"N" - нехромогенные;

"nd" - данные отсутствуют.



Таблица 6. Фенотипические признаки штаммов 40 и 48а в сравнении с аналогичными признаками типовых штаммов микобактерий

№	Признаки	Микобактерии
		M.chelo-nae	M.abs-cessus	M.salmo-niphilum	шт. 40	шт. 48
	Рост при 420С	?	?	?	?	?
	Рост при 450С	?	?	?	?	?
	Пигментация	N	N	N	N	N
	Рост на среде McConkey	+	+	+	+	+
	Рост на 5 % NaCl (w/v)	?	+	?	?	+
	Нитратредукция	?	?	?	nd	nd
	Арилсульфатаза на 3 день	+	+	+	+	+
	Каталаза	d	nd	nd	+	+
	Рост на единственном источнике углерода:
	- цитрат	+	?	nd	?	+
	- маннит	?	?	nd	?	?
	- инозитол	?	?	nd	?	?

Штаммы 40 и 48 по фенотипическим признакам могут быть отнесены к близким видам M.abscessus и M.chelonae соответственно. Не исключена видовая принадлежность этих штаммов и к виду M.salmoniphilum, пока еще недостаточно хорошо описанному фенотипически и трудно отличимому от M.chelonae. Вид M.salmoniphilum получил статус самостоятельного вида в 1960 г., до этого штаммы M.chelonae, выделенные от больных лососевых рыб, относили к подвиду Mycobacterium chelonae subsp. piscarium (Whipps et al., 2007).



Заключение

Таким образом, алгоритм выявления микобактерий из аквариумной воды с помощью прямого высева на неселективную среду Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией и скрининг клонов на кислото-спиртоустойчивость оказался успешным.

В воде аквариума № 19 установлено присутствие микобактерий в количестве не менее 10 КОЕ/мл. Реальное содержание микобактерий с учетом их присутствия в ассоциациях и биопленках (смешанных колониях) может быть на порядок выше. Важно отметить, что это высокая численность микобактерий в аквариумной воде, если учесть, что общее микробное число исследованной воды - 6,3 х 10² КОЕ/мл. По-видимому, причиной этого является жесткая обработка воды в замкнутой системе очистки с целью ее санации.

Выделенные микобактерии (быстрорастущая группа) представлены следующими видами: M. porcinum, M. abscessus и M. chelonae. Представители вида M. chelonae, наряду с M. marinum, M. fortuitum являются этиологическими агентами микобактериозов более 150 видов рыб (Decostere et al., 2004; Passantino et al., 2008; Gauthier and Rhodes, 2009; Shukla et al., 2013). Бактерии вида M. abscessus описаны как возбудители болезней пресноводных и морских декоративных рыб (Watral and Kent, 2007; Zanoni et al., 2008; Jacobs et al., 2009).

Данные виды микобактерий представляют определенную опасность для персонала океанариума. Микобактерии, обнаруженные нами в аквариумной воде, являются условно-патогенными и способны вызывать поражения у аквариумистов и работников аквакультуры (Decostere et al., 2004).

Выводы:

1. В воде океанариума, находящейся в замкнутой системе очистки с использованием озонирования и облучения УФ, присутствуют условно-патогенные микобактерии видов M.chelonae M.abscessus M.porcinum.

2. Малахитовый зеленый в составе питательных сред снижает эффективность выявления микобактерий из аквариумной воды.



Список литературы

1. Akbari S., Mosavari N., Tadayon K., Rahmati-Holasoo H. Isolation of Mycobacterium fortuitum from fish tanks in Alborz, Iran// Iran. J. Microbiol. - 2014 - Vol. 6 - P.234-239.

2. Aronson J.D. Spontaneous tuberculosis in salt water fish// J. Infect. Dis. - 1926 - Vol. 39 - P. 315-320.

3. Astrofsky K.M., Schrenzel M.D., Bullis R.A. et al. Diagnosis and management of atypical Mycobacterium spp. infections in established laboratory zebrafish (Brachydanio rerio) facilities// Comparative Medicine - 2000 - Vol 50 - P. 666-672.

4. Bailey R.K., Wyles S., Dingley M. et al. The isolation of high catalase Mycobacterium kansasii from tap water//Am. Rev. Respir. Dis. - 1970 - Vol. 101 - P. 430-1.

5. Barksdale L., Kim K.S. Mycobacterium// Bacteriol. Rev. - 1977 - Vol.41 - P. 217-372.

6. Beran V., MatlovaL., Dvorska L. et al. Distribution of mycobacteria in clinically healthy ornamental fish and their aquarium environment//J. Fish Dis. - 2006 - Vol. 29 - P. 383-393

7. Brennan P.J. Structure, function, and biogenesis of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis// Tuberculosis - 2003 - Vol. 83 - P. 91-97.

8. Broutin V., Baсuls A.L., Aubry A. et al. Genetic diversity and population structure of Mycobacterium marinum: new insights into host and environmental specificities// Journal of Clinical Microbiology - 2012 - Vol. 50 - P. 3627-3634.

9. Brown-Elliott B.A., Wallace R.J. et al. Five-year outbreak of community- and hospital-acquired Mycobacterium porcinum infections related to public water supplies// J. Clin. Microbiol. - 2011 - Vol. 49 - P. 4231-4238.

10. Brown-Elliott B.A., Wallace R.J. Jr. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria//Clin. Microbiol. Rev. - 2002 - Vol. 15 - P. 716-46.

11. Bullin C.H., Tanner E.I., Collins C.H. Isolation of Mycobacterium xenopei from water taps//J. Hyg. (Lond) - 1970 - Vol. 68 - P. 97-100.

12. Caputo V., Fiorella S., Orlando E. Sporotrichoid cases of Mycobacterium marinum skin infection// Clinical Medicine Insights: Dermatology - 2010 - Vol.3 - P.25-29.

13. Carson L.A., Petersen N.J., Faero M.S., Aguero S.M. Growth characteristics of atypical mycobacteria in water and their comparative resistance to disinfectants// Appl. Environm. Microbiol. - 1978 - Vol.36 - P. 839-846.

14. Carter G., Wu M., Drummond D.C. et al. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium // J. of Med. Microbiol. - 2003 - Vol. 52 - P.747-752.

15. Castillo-Rodal A.L., Mazari-Hiriart M., Lloret-Sбnchez L.T. et al. Potentially pathogenic nontuberculous mycobacteria found in aquatic systems. Analysis from a reclaimed water and water distribution system in Mexico City// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2012 - Vol. 31 - P. 683-94.

16. Chang T.C., Hsieh C.Y., Chang C.D.et al. Pathological and molecular studies on mycobacteriosis of milkfish Chanos chanos in Taiwan// Dis. Aquat. Org. - 2006- Vol. 72 - P. 147-151.

17. Cheung J.P., Fung B.K., Ip W.Y. Mycobacterium marinum infection of the deep structures of the hand and wrist: 25 years of experience// Hand Surg. - 2010 - Vol. 15- P. 211-6.

18. Covert T.C., Rodgers M.R., Reyes A.L., Stelma G.N. Occurrence of nontuberculous mycobacteria in environmental samples//Appl. Environ. Microbiol. - 1999 - Vol. 65 - P. 2492-2496.

19. Dailloux M., Albert M., Laurain C., et al. Mycobacterium xenopi and drinking water biofilms//Appl. Environ. Microbiol. - 2003 - Vol.69 - P.6946-6948.

20. De Groote M.A. Pulmonary infection in non-HIV infected individuals. World Health Organization. Pathogenic Mycobacteria in Water: A Guide to Public Health Consequences, Monitoring and Management//IWA Publishing, 2004.

21. De Lima C.T., Magalhгes V., Abscess resulting from Mycobacterium kansasii in the left thigh of AIDS patient// An Bras. Dermatol. - 2014 - Vol. 89 - P. 478-480.

22. Decostere A., Hermans K., Haesebrouck F. Piscine mycobacteriosis: a literature review covering the agent and the disease it causes in fish and humans// Vet. Microbiol. - 2004 - Vol. 99 - P. 159-66.

23. Dubrou S., Konjek J., Macheras E. et al. Diversity, Community Composition, and Dynamics of Nonpigmented and Late-Pigmenting Rapidly Growing Mycobacteria in an Urban Tap Water Production and Distribution System//Appl. Environ. Microbiol. - Vol. 79 - P. 5498-5508.

24. Ellis R.C., Zabrowarny L.A. Safer staining method for acid fast bacilli// J. Clin. Pathol. - 1993 - Vol 46 - P.559-60.

25. Engelhardt H., Heinz C., Niederweis M. A tetrameric porin limits the cell wall permeability of Mycobacterium smegmatis //J. Biol. Chem. - 2002 - Vol. 277 - P. 37567-37572.

26. EPA (United States Environmental Protection Agency). Mycobacteria: drinking water fact sheet - 2002.

27. Eun-Sook Lee, Tae-Ho Yoon, Mok-Young Lee et al. Inactivation of environmental mycobacteria by free chlorine and UV// Water research - 2010 - Vol.44 - P.1329-1334.

28. Euzebu J.P., http://www.bacterio.net/.

29. Falkinham J.O. 3rd, Iseman M.D., de Haas P., van Soolingen D. Mycobacterium avium in a shower linked to pulmonary disease// J. Water. Health. - 2008 - Vol 6 - P. 209-13.

30. Falkinham J.O. 3rd, Norton C.D., LeChevallier M.W. Factors Influencing Numbers of Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, and Other Mycobacteria in Drinking Water Distribution Systems// Appl. Environ. Microbiol. - 2001 - Vol. 67 - P. 1225-1231.

31. Falkinham J.O. 3rd, Surrounded by mycobacteria// J. App. Microbiol. - 2009 - Vol. 107 - P. 356-367.

32. Falkinham J.O. 3rd. Mycobacterial aerosols and respiratory disease// Emerg. Infect. Dis. - 2003 - Vol. 9 - P.763-7.

33. Falkinham J.O. 3rd. Nontuberculous mycobacteria from household plumbing of patients with nontuberculous mycobacteria disease//Emerg. Infect. Dis. - 2011 - Vol. 17 - P. 419-24.

34. Falkinham JO 3rd, George KL, Parker BC, Gruft H. In vitro susceptibility of human and environmental isolates of Mycobacterium avium, M. intracellulare, and M. scrofulaceum to heavy-metal salts and oxyanions.// Antimicrob. Agents. Chemother. - 1984 - Vol.25 - P.137-9.

35. Falkinham J.O. 3rd. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria// Clin. Microbiol. Rev. - 1996 - Vol. 9 - P.177-215.

36. Fuminao Kamijoa, Hisashi Uharaa, Hitomi Kubo et al. A case of mycobacterial skin disease caused by Mycobacterium peregrinum, and a review of cutaneous Infection// Case Rep. Dermatol. - 2012 - Vol. 4 - P. 76-79.

37. Gauthier D.T, Rhodes M.W. Mycobacteriosis in fishes: A review// The Veterinary Journal - 2009 - Vol. 180 - P.33-47.

38. Goodfellow M., Kampfer P., Busse H.J. et al. Bergey's manual of systematic bacteriology. Second edition. Volume Five. The Actinobacteria. Part A. - Springer, 2012 - P 312-375.

39. Griffith D.E., Girard W.M., Wallace R.J. Jr. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients// Am. Rev. Respir. Dis. - 1993 - Vol. 147 - P. 1271-8.

40. Hall-Stoodley L., Lappin-Scott H.M. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum//FEMS Microbiol. Lett. - 1998 - Vol 168 - P.77-84.

41. Herbst L.H., Costa S.F., Weiss L.M. et al. Granulomatous skin lesions in Moray Eels caused by a novel Mycobacterium species related to Mycobacterium triplex //Inf. and immun. - 2001 - Vol. 69 - P. 4639-4646.

42. Hilborn E.D., Covert T.C., Yakrus M.A. et al. Persistence of nontuberculous mycobacteria in a drinking water system after addition of filtration treatment// Appl. Environ. Microbiol. - 2006 - Vol. 72 - P. 5864-5869.

43. Iivanainen E.K., Martikainen P.J., Katila M.L. Effect of freezing of water samples on viable counts of enviromental mycobacteria //Lett. Appl. Microbiol - 1995 - Vol. 21 - P.257-260.

44. Jacobs J., Rhodes M., Sturgis B., Wood B. Influence of environmental gradients on the abundance and distribution of Mycobacterium spp. in a coastal lagoon estuary//Appl. Environ. Microbiol. - 2009 - Vol. 75 - P. 7378-84.

45. Jones J.J., Falkinham III J.O. Decolorization of malachite green and crystal violet by waterborne pathogenic Mycobacteria //Antimicrob. Agents. Chemother. - 2003 - Vol. 47 - P. 2323-2326.

46. Jones J.J., Falkinham J.O. 3rd. Decolorization of malachite green and crystal violet by waterborne pathogenic mycobacteria//Antimicrob. Agents. Chemother. - 2003 - Vol. 47 - P. 2323-6.

47. Kazda J. The Ecology of Mycobacteria, 1st edn. - Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 2000.

48. Kothavade R.J., Dhurat R.S., Mishra S.N., Kothavade U.R. Clinical and laboratory aspects of the diagnosis and management of cutaneous and subcutaneous infections caused by rapidly growing mycobacteria//Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2013 - Vol.32 - P. 161-88.

49. Kullavanijaya P., Sirimachan S., Bhuddhavudhikrai P. Mycobacterium marinum cutaneous infections acquired from occupations and hobbies// Int. J. Dermatol. - 1993 - Vol. 32 - P.504-7.

50. Lansdell W., Dixon B., Smith N., Benjamin L. Communications: isolation of several Mycobacterium species from fish// Journal of Aquatic Animal Health - 1993 - Vol. 5 - P. 73-76.

51. Le Dantec C., Duguet J.P., Montiel A. et al Occurrence of mycobacteria in water treatment lines and in water distribution systems//Appl. Environ. Microbiol. - 2002 - Vol. 68 - P. 5318-5325.

52. Le Dantec C., Duguet J.P., Montiel A. et al. Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system// Appl. Environ. Microbiol. - 2002 - Vol.68 - P.1025-1032.

53. Lescenko P. Maltova L., Dvorska L. Mycobacterial infection in aquarium fish// Vet. Med. - 2003 - Vol. 48 - P.71-78.

54. Levi M.H., Bartell J., Gandolfo L. et al. Characterization of Mycobacterium montefiorense sp. nov., a novel pathogenic Mycobacterium from Moray Eels that is related to Mycobacterium triplex// J. Clin. Microbiol. - 2003 - Vol. 41 - P. 2147-2152.

55. Limia A., Sangari F.J., Wagner D., Bermudez L.E. Characterization and expression of secA in Mycobacterium avium // FEMS Microbiol Lett. - 2001 - Vol. 197 - P. 151-157.

56. Lulu Lian, Jianping Deng, Xiuqin Zhao et al. The ?rst case of pulmonary disease caused by Mycobacterium septicum in China// Internat. J. Infect. Dis. - 2013 - Vol. 17 - P. e352-e354.

57. Magee J.G. and Ward A.C. Bergey's manual of systematic bacteriology. Second edition. Volume Five. The Actinobacteria. Part A. Family iii. Mycobacteriaceae - Springer, 2012 - P 312-375.

58. Martinez A., Torello S., Kolter R. Sliding motility in mycobacteria // J. Bacteriol. - 1999 - Vol.181 - P. 7331-7338.

59. Middlebrook G., Cohn M.L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods// Tuberculosis treatment - 1958 - Vol. 48 - P. 844-853.

60. Mirsaeidi M., Machado R.F., Garcia J.G., Schraufnagel D.E. Nontuberculous mycobacterial disease mortality in the United States, 1999-2010: a population-based comparative study//PLoS One. - 2014 - Vol9. - P. e91879 - e91879.

61. Mirza S., Farrell D.J., Marras T.K. et al. Sequence-based typing of clinical isolates of Mycobacterium xenopi isolated from Ontario, Canada// J. Undergrad. Life Sci. - 2013 - Vol. 7 - P.41-45.

62. Mrlik V., Slany M., Kubecka L. et al. A low prevalence of mycobacteria in freshwater fish from water reservoirs, ponds and farms// Journal of Fish Diseases -2012 - Vol. 35 - P. 497-504.

63. Nichols G., Ford T., Bartram J.et al. Pathogenic Mycobacteria in Water: A Guide to Public Health Consequences, Monitoring and Management. Introduction. 2004 World Health Organization. - IWA Publishing, London, UK.

64. Nightingale S.D., Byrd L.T., Southern P.M. et al. Incidence of Mycobacterium avium-intracellulare complex bacteremia in human immunodeficiency virus-positive patients// J. Infect. Dis. - 1992 - Vol. 165 - P. 1082-5.

65. Novotny L., Halouzka R., Matlova L. et al. Morphology and distribution of granulomatous inflammation in freshwater ornamental fish infected with mycobacteria// J. Fish. Dis. - 2010 - Vol. 33 - P. 947-55.

66. Passantino A., Macrэ D., Coluccio P., Fotia F., Marino F. 2008. Importation of mycobacteriosis with ornamental fish: Medico-legal implications// Travel Medicine and Infectious Disease - Vol. 6 - P.240-244.

67. Perez A.T., Conroy D.A., Quiсones L. Presence of acid-fast bacteria in wild and cultured silver mullets (Mugil curema Val., 1836) from Margarita island, Venezuela// Interciencia - 2001 - Vol. 26 - P. 252-256.

68. Prevots D.R., Marras T.K. Epidemiology of human pulmonary infection with nontuberculous mycobacteria: a review// Clin. Chest. Med. - 2015 - Vol. 36 P. 13-34.

69. Prevots D.R., Shaw P.A., Strickland D. et al. Nontuberculous mycobacterial lung disease prevalence at four integrated health care delivery systems//Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2010 - Vol. 182 - P. 970-6.

70. Primm T.P., Lucero C.A., Falkinham J.O III. Health Impacts of Environmental Mycobacteria// Clin. Microbial. Rev - 2004 - Vol. 17 - P. 98-106.

71. Rowe H.M., Withey J.H., Neely M.N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens// Developmental and Comparative Immunology - 2014 - Vol.46 - P. 96-107.

72. Runyon E.H. Anonymous mycobacteria in pulmonary disease//The Medical clinics of North America - 1959 - Vol.43 - P. 273-90.

73. Runyon E.H. Conservation of the specific epithet fortuitum in the name of the organism known as Mycobacterium fortuitum da Costa Cruz. Int Jf Syst Bacteriol 1972; 22:50-1.

74. Runyon E.H. Rejection of Mycobacterium aquae//Int. J. Of Syst. Bact. - 1974 - Vol. 24 - P. 532-533.

75. Sakai M., KonoT., Ponpornpisit A. et al. Characterization of a Mycobacterium sp. isolated from guppy Poecilia reticulata, using 16S ribosomal RNA and its internal transcribed spacer sequences// Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. - 2005 - Vol. 25 - P. 64-69.

76. Sanders G.E., Swaim L.E. Atypical piscine mycobacteriosis in Japanese Medaka (Oryzias latipes)// Comparative Medicine - 2001 - Vol 51- P. 171-175.

77. Schulze-Robbecke R., Buchholtz k. Heat susceptability of aquatic mycobacteria //Appl. Environ.Microbiol - 1992 - Vol. 58 - P.1869-1873.

78. September S.M., Brozel V.S., Venter S.N. Diversity of Nontuberculoid Mycobacterium species in bio?lms of urban and semiurban drinking water distribution systems// App. Environ. Microbiol. - 2004 - Vol. 70 - P. 7571-7573.

79. Shukla S., Sharma R., Shukla S.K. 2013. Detection and identification of globally distributed mycobacterial fish pathogens in some ornamental fish in India// Folia Microbiol. - Vol. 58 - P. 429-436.

80. Simmon K.E., Brown-Elliott B.A., Ridge P.G. et al. Mycobacterium chelonae-abscessus complex associated with sinopulmonary disease, Northeastern USA// Emerg. Infect. Dis. - 2011 - Vol. 17 - P. 1692-1700.

81. Slany M., Makovcova J., Jezek P. et al. Relative prevalence of Mycobacterium marinum in fish collected from aquaria and natural freshwaters in central Europe// Journal of Fish Diseases - 2014 - Vol. 37 - P.527-533.

82. Smith D.S., Lindholm-Levy P., Huitt G.A., Heifets L.B., Cook J.L. Mycobacterium terrae: case reports, literature review, and in vitro antibiotic susceptibility testing// Clin. Infect. Dis. - 2000 - Vol. 30 - P. 444-53.

83. Stahl D.A., Urbance J.W. The division between fast- and slow-growing species corresponds to natural relationships among the Mycobacteria// J. of bacteriology - 1990 - Vol. 172 - P. 116-124.

84. Taylor R.H., Falkinham III J.O., Norton C.D., LeChevallier M.W. Chlorine, chloramine, chlorine dioxide, and ozone susceptibility of Mycobacterium avium// Appl. Environ. Microbiol. - 2000 - Vol.66 - P.1702-1705.

85. Teska J.D., Twerdok L.E., Beaman J. et al. Isolation of Mycobacterium abscessus from Japanese Medaka// Journal of Aquatic Animal Health - 1997 - Vol.9 - P. 234-238.

86. Thomson R., Tolson C., Carter R., et al. Isolation of Nontuberculous Mycobacteria (NTM) from Household Water and Shower Aerosols in Patients with Pulmonary Disease Caused by NTM//Journal of Clinical Microbiology - 2013 - Vol. 51 - P. 3006-3011.

87. Thomson R.M. NTM working group at Queensland TB Control Centre and Queensland Mycobacterial Reference Laboratory. Changing epidemiology of pulmonary nontuberculous mycobacteria infections//Emerg. Infect. Dis. - 2010 - Vol.16 - P. 1576-83.

88. Todorova T.T., Kaludova V., Tsankova G., Ermenlieva N. A pulmonary infecrion caused by Mycobacterium peregrinum - a case report// J. of IMAB - 2015 - Vol. 21 - P. 1000-1002.

89. Tortoli E., Bartoloni A., Bцttger E. et al. Burden of unidentifiable Mycobacteria in a reference laboratory // J. Clin. Microbiol - 2001 - Vol. 39 - P.4058-4065.

90. Turenne C.Y., Wallace R. Jr., Behr M.A. Mycobacterium avium in the postgenomic era// Clin. Microbiol. Rev. - 2007 - Vol. 20 - P. 205-29.

91. Ucko M., Colorni A., Kvitt H. Strain Variation in Mycobacterium marinum fish Isolates// Appl. Env. Microbiol. - 2002 -Vol. 68 - P. 5281-5287.

92. Ulmann V., Kracalikova A., Dziedzinska R. Mycobacteria in water used for personal hygiene in heavy industry and collieries: a potential risk for employees//Int. J. Environ. Res. Public. Health. - 2015 - Vol. 12 - P. 2870-7.

93. Vaerewijck J.M., Huys G., Palomino J.C. et al. Mycobacteria in drinking water distribution systems: ecology and significance for human health//FEMS Microbiology Reviews - 2005 - Vol.29 - P. 911-934.

94. Van Ingen J., Wagner D. Epidemiology of nontuberculous mycobacterial disease in Germany and worldwide//Der. Pneumologe - 2011- Vol. 8 - P. 396-403.

95. Wallace R.J. Jr., Swenson J.M., Silcox V.A. et al. Spectrum of disease due to rapidly growing mycobacteria//Rev. Infect. Dis. - 1983 - Vol. 5 - P. 657-79.

96. Watral V., Kent. M.L. Pathogenesis of Mycobacterium spp. in zebrafish (Danio rerio) from research facilities// Comparative Biochemistry and Physiology, Part C - 2007 - Vol. 145, p.55-60.

97. Wayne L.G., Sramek H.A. Agents of newly recognized or infrequently encountered mycobacterial diseases//Clin. Microbiol. Rev. - 1992 - Vol.5 - P. 1-25.

98. Whipps C.M., Dougan S.T., Kent M.L. Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities//FEMS Microbiol. Lett. - 2007 - Vol. 270 - P. 21-26.

99. Wolinsky E., Gomez F., Zimpfer F. Sporotrichoid Mycobacterium marinum infection treated with rifampin-ethambutol// Am. Rev. Respir. Dis. - 1972 - Vol. 105 - P.964-7.

100. Woods G.L., Washington J.A. 2nd. Mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis: review of microbiologic and clinical aspects// Rev. Infect. Dis. - 1987 - Vol. 9 - P. 275-94.

101. Zanoni R.G., Florio D., Fioravanti M.L. et al. Occurrence of Mycobacterium spp. in ornamental fish in Italy// Journal of Fish Diseases - 2008 - Vol. 31 - P. 433-441.

102. Zelazny A.M., Root J.M., Shea Y.R. et al. Cohort study of molecular identification and typing of Mycobacterium abscessus, Mycobacterium massiliense, and Mycobacterium bolletii// J. Clin. Microbiol. - 2009 - Vol.47 - P. 1985-1995.

103. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П. и др. Определитель бактерий Берджи - Москва "Мир" - 2й том, 9е издание - стр. 606-612.



Приложение

Последовательности прочитанных при секвенировании фрагментов генов 16s рРНК бактериальных штаммов 14, 40 и 48

>14_F

TAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATAGGACCGCGCTCTTCATGGGGTGTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAATAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTATAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACANNGGTGGCGAANGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGANGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTA

>14_R

CCATCGCCGNNCCCACCTTCGACGGCTCCNTCCACAAGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCATGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCACGGGGTCGAGTTGCAGACCCCGATCCGAACTGAGACCGGCTTTGAAAGGATTCGCTCCACCTCACGGCATCGCAGCCCTTTGTACCGGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCTCACGAGTCCCCACCATAACGTGCTGGCAACATGAGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGCACACAGGCCACAAGGGAACCAATATCTCTACTGGCGTCCTGTGCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCA

>40_F

GGCCCTTCGGGGTNCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACACACTTCATGGTGAGTGGTGCAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGACGAAGCGAAAGTGACGGTACCTACAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAA

>40_R

CTCCCTCCAAAAGGTTAGGCCACTGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCATGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCAGCTTTAAGGGATTCGCTCCACCTTACGGCTTCGCAGCCCTCTGTACTGGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTACGAGTCCCCGGCATTACCCGCTGGCAACATAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGCACACAGGCCACAAGGGAATACCTATCTCTAGATACGTCCTGTGCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGGGTACTTAATGCGTTAGCTACGGCACGGATCCCAAGGAAGGAAACCCACACCTAGTACCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCA

>48_F

GGCCCTTCGGGGTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACACACTTCATGGTGAGTGGTGCAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGACGAAGCGAAAGTGACGGTACCTACAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGNTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGANGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTA

>48_R

CGCCGATCCCACCTTCGACAGCTCCCTCCAAAAGGTTAGGCCACTGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCATGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCAGCTTTAAGGGATTCGCTCCACCTTGCGGCTTCGCAGCCCTCTGTACTGGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTACGAGTCCCCGGCATTACCCGCTGGCAACATAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGCACACAGGCCACAAGGGAATACCTATCTCTAGGTACGTCCTGTGCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTT...