Размещено на http://www.allbest.ru/

Санкт-Петербургский Государственный университет

Биологический факультет

Кафедра биофизики

Выпускная квалификационная работа по направлению подготовки «Биология»

«Амилорид - чувствительные эпителиальные натриевые каналы (ENaC): строение, функции и патология»

Основная образовательная программа бакалавриата «Биология»

профиль «Физиология и биомедицина»

Иудин Владимир Андреевич

Работа выполнена на кафедре Биофизики Биологического факультета

Научный руководитель: доцент кафедры Биофизики, к.б.н., А.В. Мельницкая

Санкт-Петербург, 2017

Содержание

• Введение
• 1. Структурно-функциональная организация ENaC
• 1.1 Суперсемейство DEG/ENaC
• 1.2 Структурная организация ENaC и топология канала в мембране
• 1.3 Стехиометрия ENaC и модель поры
• 1.4 Биофизические характеристики ENaC
• 2. Функция ENaC в различных тканях и органах
• 2.1 Функция ENaC в почках
• 2.2 Функция ENaC в кишечнике
• 2.2.1 ENaC в тонком кишечнике
• 2.2.2 ENaC в толстом кишечнике
• 2.3 Функция ENaC в легких
• 2.3.1 ENaC в легких в эмбриогенезе
• 2.3.2 ENaC в легких в постэмбриональном периоде
• 2.4 Функция ENaC в сенсорных клетках
• 2.5 Функция ENaC в нетипичных тканях
• 3. Патология ENaC
• 3.1 Синдром Лидла
• 3.2 Псевдогипоальдостеронизм I типа
• 3.3 Эссенциальная гипертензия
• Заключение
• Выводы
• Список литературы
• Список сокращений
• ВОЗ -- всемирная организация здравоохранения
• ASIC -- кислото-чувствительный канал
• BASIC, hINaC, BLINaC -- каналы чувствительные к желчной кислоте
• ENaC -- амилорид-чувствительный эпителиальный натриевый канал
• FaNaC -- фенилаланин-метионин-аргинин-фенилаланинактивируемый Na+-канал
• Nedd4 -- убиквитин лигаза
• PHA1 -- псевдогипоальдостеронизм I типа
• PHA1A -- псевдогипоальдостеронизм I типа почечная форма
• PHA1B -- псевдогипоальдостеронизм I типа мульти-системная форма
• PPK/RPK-каналы - Ripped Pocket («разорванный карман») /Pickpocket («карманник»)-каналы
• TM -- трансмембранный сегмент

Введение

Эпителиальные натриевые каналы (ENaC) являются важными участниками, наравне с Na+/K+-АТФ-азой и K+-селективными каналами, активного трансэпителиального транспорта катионов Na+. Они экспрессируются в тканях почек, легких, кишечника и многих других.

В легких ENaC участвуют в поддержании уровня Na+ необходимого для предотвращения чрезмерного накопления жидкости и функционирования эндогенных антимикробных факторов, таких как дефенсины. В дистальных канальцах почек ENaC отвечают за реабсорбцию Na+, тем самым контролируя баланс Na+ и воды в организме. Таким образом ENaC можно считать структурной основой такого физиологического процесса, как регуляция объема жидкости в организме. Нарушения в структурно-функциональной организации данных каналов является причиной многих тяжелых наследственных заболеваний, таких как синдром Лиддла, эссенциальная гипертензия, псевдогипоальдостеронизм I типа. Все эти заболевания в той или иной степени связаны с нарушениями реабсорбции Na+ в почке и сопровождаются такими симптомами как полиурия, дегидратация, солевое истощение организма, артериальная гипертензия и некоторые другие.

Структурно-функциональная организация ENaC является актуальной темой для изучения в свете возможности борьбы с заболеваниями, вызванными ее нарушением. Знание особенностей структурно-функциональной организации ENaC может являться перспективным направлением для разработки высокоизбирательных агентов для нормализации функции мутантных каналов. Открытия новых мутаций и принципов их наследования могут помочь в прогнозировании и выявлении болезней, связанных с ними.

Целью настоящей работы является анализ данных литературы о структурно-функциональной организации амилорид-чувствительных Na+-каналов и их функции в различных тканях и органах, а также заболеваниях, связанных с нарушениями в работе каналов данного типа.

Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:

Изучение и анализ данных литературы о структурной организации и биофизических характеристиках ENaC;

Анализ данных литературы о физиологических функциях ENaC в клетках различных типов.

Изучение и анализ литературных данных о заболеваниях человека, связанных с нарушениями в структурно-функциональной организации ENaC.

1. Структурно-функциональная организация ENaC

Суперсемейство DEG/ENaC объединяет амилоридчувствительные каналы с различными функциями (Рис. 1). Каналы данного суперсемейства экспрессируются в различных тканях, как возбудимых и не возбудимых. Эти каналы отвечают за механочувствительность, болевую рецепцию, участвуют в поведении страха и обучении, отвечают за направленный транспорт ионов Na+.

Суперсемейство DEG/ENaC является функционально-неоднордной группой каналов имеющих, однако, схожие биофизические параметры и структурную организацию. В суперсемействе DEG/ENaC можно выделить 6 основных семейств.

Рис. 1. Филогенетическое древо суперсемейства Deg/ENaC. Зеленым отмечено семейство дегениринов. Коричневым -- FaNaC. Сиреневым -- BASIC (BLINaC). Красным -- ASIC. Синим -- ENaC. Желтым -- RPK/PPK. (Модифицировано из Kellenberger, Frateschi, 2016)

Дегенерины. Считается, что дегенерины образуют механочувствительные катионные каналы и отвечают за механосенсорную трансдукцию. Механосенсорная трансдукция лежит в основе различных физиологических процессов, таких как тактильные ощущения, слух и проприорецепция.

Кислото-чувствительные каналы (ASIC). ASIC представляют собой H+-активируемые Na+-селективные каналы, однако, для изоформы ASIC1a показана небольшая селективность и для ионов Ca2+. ASIC широко экспрессированы в центральной нервной системе. Также все изоформы ASIC, кроме ASIC4 обнаруживаются и во взрослой периферической нервной системе. ASIC участвуют в поведении страха, обучении, функциях памяти и болевой рецепции. Показан их вклад в нейродегенирацию после ишемического инсульта (Reeh P.W., Steen K.H., 1996; Waldmann R. et al., 1997, 1998; Wemmie et al., 2013; Kellenberger, Schild, 2015). Обнаружено, что активация ASIC в нейронах вызывает деполяризацию и генерирование потенциала действия. Показано, что изоформа ASIC1a широко экспрессируется в амигдоле, где способствует поведению страха, а разрушение ASIC1a приводит к протекторному эффекту при некоторых дегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и рассеяный склероз (Xiong Z.G. et al., 2004; Friese M.A. et al., 2007; Pignataro G et al., 2007; Arias R.L. et al., 2008; Wong H.K. et al., 2008).

Каналы чувствительные к желчной кислоте (BASIC, hINaC или BLINaC). Впервые клонированы в 1999 году (Sakai H. et al., 1999). Экспрессия BASIC обнаруживается в мозге, печени и кишечнике млекопитающих (Sakai H. et al., 1999; Schaefer L. et al., 2000). Предполагается, что BASIC могут участвовать в ингибировании осаждения желчных кислот, тем самым препятствуя образованию желчных камней (Marinelli R.A. et al., 1996; Bogert P.T. et al., 2007). Однако достоверно их физиологическая роль пока не выявлена.

PPK/RPK-каналы.Представляют собой Na+-селективные каналы с низким сродством к амилориду. Впервые были выявлены у дрозофилы. Транскрипты RPK обнаруживаются только в яичниках и семенниках. Экспрессия транскриптов RPK ограничена ооцитами и ранними эмбрионами, что указывает на их роль в раннем развитии. Продукт гена PPK экспрессируется на поздних стадиях развития дрозофилы в сенсорных дендритах периферических нейронов. Счситается, что PPK, по аналогиии с дегенеринами отвечает за механочувствительность у насекомых (Adams C.M. et al., 1998; Benos D.J., Stanton B.A., 1999; Kellenberger S., Schild L., 2002).

Фенилаланин-метионин-аргинин-фенилаланин-активируемые Na+-каналы (FaNaC). Впервые выделены из улитки Helix aspersa, где экспрессируются в нервной системе и мышцах ноги (Lingueglia E. et al., 1995). FaNaC являются лиганд-управляемыми натриевыми каналами. На сегодняшний день, FaNaC известны для четырех различных видов моллюсков: Helix aspersa (HaFaNaC) (Lingueglia E. et al., 1995), Helisoma trivolvis (HtFaNaC) (Jeziorski M.C. et al., 2000), Lymnaea stagnalis (LsFaNaC) (Perry S.J. et al., 2001), Aplysia kurodai (AkFaNaC) (Furukawa Y. et al., 2006).

Амилорид-чувствительные эпителиальные натриевые каналы (ENaC). ENaC - высоко селективные Na+-каналы, участвующие в трансэпителиальном транспорте Na+ (Рис. 2). Транспорт Na+ описывается двухмембранной моделью, предложенной Кефед-Джонсеном и Уссингом (Koefoed-Johnsen, Ussing, 1958), позже модифицированной Уссингом совместно с Виндхагером (Ussing, Windhager, 1964), в которой ключевую роль, наряду с ENaC играет Na+/K+-АТФаза. Экспрессируются ENaC в тканях почек, легких, кишечника, а также во многх других. Отвечают за реабсорбцию катионов Na+. Нарушения функций ENaC вызывают тяжелые наследственные заболевания.

Рис. 2. Двумембранная модель трансэпителиального транспорта Na+. ECF - внеклеточная жидкость. ISF - интерстициальная жидкость. ICL - внутриклетиочная жидкость. (Модифицировано из Hanukoglu, Hanukoglu, 2016)

1.2 Структурная организация ENaC и топология канала в мембране

ENaC являются важными участниками трансэпителиального транспорта. Каналы данного типа образованы тремя гомологичными субъединицами: б, в и г (Canessa C.M. et al., 1994) (Рис. 3). Позднее были обнаружены еще две субъединицы ENaC: д и е. д-субъединица обладает довольно высокой (37%) идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к б-субъединице (Waldmann R. et al., 1995). Функционально д-субъединица также сходна с б-субъединицей, она может в одиночку образовывать функциональный канал, а также образовывать двг-гетеротример (Waldmann R. et al., 1995). е-субъединица так же как и д-субъединица имеет функциональное сходство с б-субъединицей. Она способна к образованию гетеротримера евг, являющегося менее чувствительным к амилориду, и проявляющим зависимость активности канала от кислотности среды (Wichmann L. et al., 2016). Экспрессией в гетерологичных системах (ооциты Xenopus) было показано, что для возникновения амилорид-зависимых Na+ токов достаточно экспрессии только б-субъединиц ENaC. В свою очередь совместная экспрессия б-субъединиц с в и г субъединицами увеличивает проводимость канала более чем в 100 раз (Canessa C.M. et al., 1994).

Субъединицы ENaC состоят из 632-698 аминокислотных остатков, а их молекулярная масса составляет около 90 кДа (Benos D.J., Stanton B.A., 1999) (Рис. 4).

Каждая субъединица канала состоит из четырех функциональных доменов, различающихся по строению и функциям: цитоплазматический N-конец, два трансмембранных сегмента, экстраклеточная петля и цитоплазматический C-конец (Canessa C.M. et al., 1994). (Рис. 3-5).

В составе субъединиц DEG/ENaC обнаружены участки, консервативные по аминокислотному составу. Одни последовательности характерны для всех представителей данного суперсемейства, другие консервативны только в отдельных ветвях. Данные фрагменты представляют собой важные структурные элементы, необходимые для нормального функционирования канала (Мельницкая А.В. и др., 2006) (Рис. 5).

Цитоплазматический N-конец участвует во многих важных функциях: эндоцитозе, сборке канала, воротных характеристиках, деградации канала (Adams C.M. et al., 1997; Grunder S. et al., 1997; Prince L.S. et al., 1998). При изучении активности ENaC крысы с делециями в N-конце, было обнаружено, что делеция 2-67 аминокислотных остатков в N-конце альфа-субъединицы приводит к снижению эндоцитоза ENaC. Исходя из данных результатов, был сделан вывод о наличии консервативного эндоцитотического мотива в N-конце б-субъединицы ENaC (Chalfant M.L. et al., 1999). Также N-концевой домен играет важную роль в регуляции количества каналов в мембране. Он содержит высоко консервативные остатки лизина, с которыми взаимодействует убиквитинлигаза. Считается, что участок с 47 по 50 аминокислотные остатки (KGDK) являются мотивом, связаным с эндоцитозом, а замены в нем или его делеция приводят к росту амилорид-чувствительных токов за счет увеличения числа каналов в мембране (Staub O. et al., 1997; Chalfant M.L. et al., 1998, 1999). Обнаружено влияние точечных мутаций в N-концевом домене на воротные характеристики ENaC. Показано, что точечные мутации, вызывающие замену высоко консервативных остатков глицина на серин (б-rENaC (G95S), в-rENaC (G37S), г-rENaC (G40S)), резко уменьшают амилорид-чувствительные Na+ токи. Показано, что уменьшение амилорид-чувствительных Na+ токов в данном случае связано с уменьшением вероятности открытого состояния ENaC (Chang S.S. et al., 1996; Grьnder S. et al., 1997; Chalfant M.L. et al., 1999).

Трансмембранные участки M1 и M2 (TM1 и TM2) являются гидрофобными сегментами (Рис. 3-5). Это альфа-спиральные участки богатые остатками положительнозаряженных аминокислот лизина и аргинина. Наибольшая концентрация остатков лизина и аргинина обнаружена на цитоплазматической стороне TM-сегментов (von Heijne, G., 1992). На границе фаз (мембрана/вода) обнаружены остатки ароматических аминокислот триптофана и тирозина, которые, по-видимому, вносят вклад в заякоревание и точное позиционирование TM-сегментов в мембране (Hong H. et al., 2007). Сегмент TM2 содержит в себе множество функциональных участков. Сегмент TM2, по-видимому, является селективным фильтром, воротным механизмом канала и содержит сайт связывания амилорида. На роль воротного механизма претендует участок с 527 по 530 аминокислотные остатки (LLSN). Известно, что замена серина в данном участке на крупные аминокислотные остатки приводит к увеличению вероятности открытого состояния канала (Snyder P.M. et al, 1999; Sheng S. et al., 2001; Kellenberger S., Schild L., 2002).

Экстраклеточная петля -- самый крупный функциональный домен белков семейства Deg/EnaC (Рис. 3-5). В нем находится примерно 70% всех аминокислотных остатков белка. Экстраклеточная петля ENaC содержит три крупных консервативных участка CRD I, CRD II, CRD III. Данные участки богаты консервативными остатками цистеина (Рис. 3, 5). Например точечная замена C133 в CRD I участке б-субъединицы ENaC приводит к уменьшению активности канала (фенотип «loss-of-function»), а замены C458S, C472S в участке CRD II б-субъединицы ENaC приводит к уменьшению поверхостной экспрессии канала (Firsov D. et al., 1999). Также в CRD I была обнаружена последовательность WYRFHY, которая считается сайтом связывания амилорида, а мутации в данной последовательности приводили к уменьшению амилорид-чувствительности (Kieber-Emmons T. et al., 1995; Li X.J. et al., 1995). Считается, что данные участки также участвуют в поддержании третичной структуры белка (Firsov D. et al., 1999).

Внутриклеточный C-конец содержит в себе участки связывания с другими белками, сигнальными молекулами и ионами, регулирующими ENaC (Hanukoglu I., Hanukoglu A., 2016). Область после TM2 богата остатками положительнозаряженных аминокислот лизина и аргинина, которые могут взаимодействовать с полярными головками мембранных липидов. Данная область является сайтом связывания фосфотидилинозитолтрифосфата в в- и г-субъединицах ENaC (Pochynyuk O. et al., 2005, 2007; Di Paolo G., De Camilli P., 2006). Показано также, что С-конец б-субъединицы ENaC содержит участки фосфорилирования протеинкиназой C, сфингозин-зависимыми протеинкиназами (SDK киназами), казеинкиназой 2 (Volk K.A. et al., 2000; Shi H. et al., 2002; Diakov A., Korbmacher C., 2004; Yang L.-M. et al., 2006). На С-конце также находится участок регуляции ENaC белком - регулятором мембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR) (Ji H.L. et al., 2000; Bachhuber T. et al., 2005). Кроме того, данный домен б-субъединицы ENaC содержит сайты связывания с элементами цитоскелета: F-актином и б-спектрином (Rotin D. et al., 1994; Mazzochi C. et al., 2006; Sasaki S. et al., 2014). PY-мотив (PPPXYXXL) (Рис. 5), богатый пролином фрагмент в 65-70 аминокислотных остатков, находящийся в C-конце после сегмента TM2, играет важную роль в убиквитинировании ENaC убиквитинлигазой Nedd4, а нарушения в данном участке приводят к тяжелому наследственному заболеванию -- синдрому Лиддла (Schild L. et al., 1996; Staub O. et al., 1996, 1997; Kellenberger S. et al., 1998).

Рис. 3. Топология субъединиц ENaC в мембране. (Модифицировано из Benos, Staton, 1999)

Рис. 4. Аминокислотная последовательность бENaC и топология в мембране. (Модифицировано из Hanukoglu, Hanukoglu, 2016)

Рис. 5. Консервативные домены ENaC. CRD I, II, III - богатые цистеином домены. Deg - экстраклеточный воротный домен. ERD - экстраклеточный регуляторный домен. HG - консервативный His-Gly фрагмент в составе цитоплазматического N-концевого домена. M1, M2 - трансмембранные сегменты. Post-M1 - консервативный участок аминокислотных остатков, следующий за M1. Pre-M2 - участок гидрофобных аминокислотных остатков, находящийся перед M2. PY - высоко консервативный богатый пролином мотив, участок связывания Nedd4. (Модифицировано из Kellenberger, Schild, 2002)

1.3 Стехиометрия ENaC и модель поры

ENaC представляет собой гетеромультимер состоящий из трех гомологичных субъединиц: б, в и г (Canessa C.M et al., 1994). Вопрос о стехиометрическом соотношении субъединиц встал сразу же после их первоначального клонирования. Результаты и выводы по данному вопросу были неоднозначными и предполагали структуры от тетрамерной (2б, в, г) до крупных комплексов, содержащих по две и более субъединицы каждого вида. Долгое время наиболее распространенной моделью строения ENaC была тетрамерная модель (Рис. 6). Исследования по данной проблеме были основаны на оценке стехиометрии путем смешивания мутантных субъединиц и субъединиц дикого типа, предполагая, что эти субъединицы могут свободно ассоциировать друг с другом и образовывать различные комбинации (Firsov D. et al., 1998; Kosari F. et al., 1998; Eskandari S. et al., 1999; Anantharam A. et al., 2007). Эти данные дополнялись также и другими методами: градиентом осаждения сахарозы (Snyder P.M. et al., 1998; Dijkink L. et al., 2002), поверхостной экспрессией (Firsov D. et al., 1998), электронной микроскопией (Eskandari S. et al., 1999), флуоресцентным анализом (Staruschenko A. et al., 2005). Однако после открытия гетеротримерной модели каналов ASIC, относящихся к тому же суперсемейству Deg/ENaC, появились идеи об аналогичном гетеротримерном строении и ENaC (Canessa C.M., 2007) (Рис. 7). Рассмотрение тримерной структуры ENaC породило вопрос о круговой ориентации субъединиц б-в-г или б-г-в (по часовой стрелке с внешней стороны мембраны) (Рис. 8). На основе результатов эксперимента построенного на Cl--зависимом ингибировании ENaC, предполагается, что ENaC является б-г-в тримером (Collier D.M., Snyder P.M., 2010). Эту идею подтверждает и другое исследование, основанное на связывании двухвалентных катионов Cu2+ с внеклеточными доменами ENaC (Chen J. et al., 2011). Однако не исключено существование популяций ENaC с расположением субъединиц б-в-г (Рис. 8).

Рис. 6. Модель тетрамерной организации субъединиц ENaC. (Модифифицировано из Kellenberger, Schild, 2002)

Рис. 7. Модель тримерной организации субъединиц ENaC. (Модифицировано из Bhalla, Hallows, 2008)

Рис. 8. Возможные варианты сборки гетеротримера ENaC бгв (A), бвг (B). Короткий пунктир -- область домена thumb («большой палец»); длинный пунктир -- область домена palm («ладонь»). (модифицировано из Collier, Snyder, 2011)

Предсказанная по аналогии с ASIC гетеротримерная модель ENaC представляет собой бокалообразную структуру с крупным воронковидным внеклеточным участком, узким трансмембранным сегментом и расширением в области концевых цитоплазматических доменов. Внешняя воронка представлена экстраклеточными доменами и C-концевым участками сегментов TM1. Непосредственно пора и селективный фильтр образованы сегментами TM2 (Рис. 9). Внутриклеточная часть сложена N- и С-концевыми доменами (Stockand J.D. et al., 2008). На внеклеточном конце сегментов TM2, в области наружного устья канала имеются высококонсервативные остатки тирозина, которые, по-видимому играют роль в воротных характеристиках канала. На внутриклеточном конце сегментов TM1 обнаружены высококонсервативные остатки триптофана, выдающиеся своими радикалами в просвет поры, мутации в которых предположительно должны были менять воротные характеристики канала, однако, исследование по данному вопросу не показало изменений в воротных характеристиках, при этом обнаружено влияние на амилорид-чувствительные токи и нарушение поверхностной экспрессии канала, возможно, из-за нарушения сборки канала (Kashlan O.B. et al., 2006).

Рис. 9. Модель поры ENaC. (Модифицировано из Loffing, Schild, 2005)

Селективный фильтр поры ENaC позволяет проникать через канал катионам Na+ и более мелким катионам Li+ и H+, при этом более крупные катионы, такие как катионы K+, Rb+, Cs+, не могут проходить сквозь канал дикого типа (Palmer L.G., 1990). Предполагается, что катионы проходящие через канал полностью лишены гидратной оболочки или связаны не более чем с одной молекулой воды в районе селективного фильтра ( Doyle D.A. et al. , 1998 ). Исходя из радиуса катионов K+ и Na+ было высказано предположение, что диаметр селективного фильтра у ENaC дикого типа составляет 1,9-2,7 Е. На основании исследования селективности каналов с мутациями G587 и S589 в б-субъединице, G529 в в-субъединице (положение гомологично бG587 ) и S542 в г-субъединице (положение гомологично бS589), предполагается, что данный участок непосредственно является селективным фильтром (Snyder P.M. et al., 1999; Kellenberger S. et al., 2001) (Рис. 10).

Рис. 10. Предсказанная структура поры и области короны ENaC. Предсказанные порообразующие трансмембранные домены гетеротримерного ENaC параллельно плазматической мембране (А). Консервативный Trp52 на внутриклеточный N-конце TM1 в-hENaC изображен с голубой боковой цепью. Консервативный Tyr (358 и 391) в предполагаемых петлях связи в- и б-ENaC, которые находятся чуть выше поры, изображены с синими и желтыми боковыми цепями, соответственно. Изображение поры, перпендикулярно плазматической мембране с внеклеточной (В) и внутриклеточной (С) стороны, изображены консервативный Trp на N-конце TM1 и консервативный Ser (черные стрелки). На С-конце ТМ2, отмеченном для каждой субъединицы. Боковые цепи остатков в ТМ2 каждой субъединицы, образующей селективный фильтр, размещены на расстоянии, заполненном шариками. (модифицировано из Stockand et al., 2008)

1.4 Биофизические характеристики ENaC

ENaC являются высокоселективными каналами. Проводимость ENaC для Na+ и Li+ в 100-1000 раз выше, чем для K+. ENaC дикого типа абсолютно непроницаемы для более крупных одновалентных катионов (Cs+, Rb+) и для всех двухвалентных катионов (Palmer L.G. et al., 1982). По-видимому, в связи с меньшими размерами катионов Li+ проводимость ENaC для них выше, чем для Na+ в 1.3-2 раза в зависимости от типа канала и температуры (Kellenberger S. et al., 1999). Диаметр селективного фильтра ENaC дикого типа составляет 1,9-2,7 Е (Kellenberger S. et al., 2001). Проводимость ENaC для Na+ при концентрациях Na+ >100 мМ и комнатной температуре составляет примерно 4-5 пС, в зависимости от типа ENaC и около 9 пС при 37° С (Garty H., Palmer L.G., 1997).

На сегодняшний день выделено несколько типов ENaC. Они различаются по таким характеристикам как: чувствительность к амилориду, селективность, проводимость. Na+-каналы, экспрессирующиеся в дистальных сегментах нефрона млекопитающих и в эпителии кожи и мочевого пузыря амфибий, относятся к типу высоко-селективных или Н-типу ENaC (Garty H., Palmer L.G., 1997; Kellenberger S., Schild L., 2002). Каналы Н-типа ENaC обладают очень высокой чувствительностью к амилориду и максимальной среди ENaC селективностью для катионов Na+ в сотношении к катионам K+ (Benos D.J. et al., 1995; Garty H., Palmer L.G., 1997; Kellenberger S., Schild L., 2002). Проницаемость ENaC каналов Н-типа для ионов Li+ примерно в полтора раза выше, чем для ионов Na+ (Garty H., Palmer L.G., 1997). Помимо этого высокоселективные Na+-каналы обладают самой медленной кинетикой среди всех типов ENaC (Garty H., Palmer L.G., 1997). Средняя длительность открытого и закрытого состояния канала составляет (при комнатной температуре) 0,5 - 5 с (Garty H., Palmer L.G., 1997; Kellenberger S., Schild L., 2002, Мельницкая А.В. и др., 2006).

ENaC блокируются пиразинкарбоксиамидом -- амилоридом в микромолярной концентрации (Bentley P.J., 1968; Benos D.J. et al., 1976) (Рис. 11). Амилорид был разработан в 1960-х годах, как K+-сберегающий диуретик (Baer J.E. et al., 1967). Блокирование ENaC амилоридом является потенциал-зависимым и усиливается при гиперполяризации мембраны (Palmer L.G., 1984; Garty H., Palmer L.G., 1997). Было установлено, что мутации в бSer583, вGly525 и гGly537 снижают чувствительность ENaC к амилориду. Также было показано, что снижение чувствительтности к амилориду зависит от того, в какой субъединице происходит мутация и какая аминокислотная замена происходит (Schild L.et al., 1997; Kashlan O.B. et al., 2005). С помощью поли- и моноклональных антител к амилориду в CRD I была обнаружена последовательность WYRFHY, мутации в которой приводили к уменьшению амилорид-чувствительности (Kieber-Emmons T. et al., 1995; Li X.J. et al., 1995). Однако роль данного участка в блокировании канала не ясна.

ENaC обладают саморегуляцией. Катионы Na+ ингибируют ENaC двумя путями. Во-первых, так называемое, Na+-ингибирование обратной связи. Данный процесс вызывается ростом внутриклеточной концентрации Na+ и приводит к уменьшению активности ENaC. Такая инактивация развивается в течение нескольких минут и связанa с уменьшением числа активных каналов на поверхности клеток и уменьшением вероятности открытого состояния канала (Frindt G. et al., 1993, 1995; Anantharam A. et al., 2006). Во-вторых, Na+-самоингибирование, вызывающее быстрое снижение активности ENaC после роста концентрации катионов Na+ во внеклеточной среде (Chalfant M.L. et al., 1999; Horisberger J.D., Chraпbi A., 2004; Bize V., Horisberger J.D., 2007). Данные процессы направлены на уменьшение входа Na+ на одном участке, с целью оптимального поглащения вдоль всего дистального нефрона (Kellenberger S., Schild L., 2015).

Недавно было показано, что анионы Cl- ингибирует ENaC. Анионы Cl- ингибируют ENaC за счет уменьшения вероятности открытого состояния канала. При этом Br- и I- ингибируют ENaC аналогично Cl-, а F- и более крупные фосфаты и сульфаты ингибируют ENaC очень слабо (Collier D.M., Snyder P.M., 2009, 2010).

Ввиду структурной общности и нахождению в одном суперсемействе с дегенеринами, было предположено, что ENaC обладают механочувствительностью. Данное предположение было подтверждено экспериментами. Считается, что на активацию ENaC влияет поток жидкости, каким-то образом изменяющий конфигурацию экстраклеточных доменов. Полагается, что с механочувствительностью каким-то образом связаны CRD-домены (Tavernarakis N., Driscoll M., 2000; Kellenberger S., Schild L., 2002; Carattino M.D. et al., 2003) (Рис. 12). Обнаружена экспрессия в- и г-субъединиц ENaC в механо-чувствительных нейронах, а также установленно, что амилорид и бензамил (блокаторы ENaC) препятствуют передаче механического стимула в барорецепторных нейронах (Drummond H.A. et al., 2001). Отсутствие экспрессии б-субъединицы, позволяет предположить, что активный канал в нейрональных клетках не образуется, однако остальных двух субъединиц, возможно, достаточно для выполнения роли механозависимых сенсоров (Вачугова Д.В., Морачевская Е.А., 2009).

Рис. 11. Блокаторы ENaC. А - амилорид (3,5-диамино-N-(аминоиминометил)-6-хлорпиразинкарбоксамид). Б -- метил изобутил амилорид. В -- диметил амилорид. Г -- бензамил. Д -- 5-(N-этил-N-изопропил)-амилорид. (Модифицировано из Мельницкая и др., 2006)

Рис. 12. Возможная модель механочувствительности ENaC. Внеклеточные петли спокойно находятся с внешней стороны клеточной мембраны (слева). Реакция на изменения скорости и давления внеклеточной жилкости. (Модифицировано из Вачугова, Морачевская, 2009)

2. Функция ENaC в различных тканях и органах

Почки поддерживают постоянство состава внеклеточной жидкости (Рис. 13). Почки выводят из организма избыток воды, растворенные в ней вещества. Наоборот, при дефиците воды и электролитов включаются процессы, уменьшающие их дальнейшие потери, сохраняя нормальную экскрецию продуктов обмена. Функциональной единицей почки является нефрон. Нефрон состоит из клубочка с боуменовой капсулой, проксимального извитого канальца, петли Генле, дистального извитого канальца и собирательной трубочки.

Рис. 13. Локализация различных транспортных процессов в нефроне. Красным отмечены реабсорбируемые вещества. Черным -- секретируемые. (Модифицировано из Шмидт, Тевс, 2005)

Почка является основным органом, регулирующим экскрецию Na+. Обычно, в почке реабсорбируется до 99% процентов Na+, отфильтрованного в капиллярном клубочке (Рис. 14). Почки способны очень тонко контролировать количество экскретируемого Na+. 60-70% Na+ реабсорбируются в проксимальном извитом канальце, 15-25% - в петле Генле, 5-10% - в дистальном извитом канальце и 1-2% в собирательной трубочке. В реабсорбции Na+ в почке участвуют такие транспортные белки как Na+/H+-обменник, в проксимальном извитом канальце, Na+/K+/Cl---ко-транспортер в петле Генле, Na+/Cl--ко-транспортер в дистальном извитом канальце, ENaC, Na+/K+-АТФаза, снабжающая энергией процесс активного переноса Na+ (Sahay M. et al., 2007) (Рис. 15).

Рис. 14. Количество Na+ реабсорбированого в нефроне. CD - собирательная трубочка. DCT - дистальный извитой каналец. PCT - проксимальный извитой каналец. (Модифицировано из Bankir et al., 2010)

В почке ENaC выполняет функцию тонкой настройки уровня экскреции Na+, поддержания K+ гомеостаза, корректировку кислотно-щелочного баланса. Экспрессируется ENaC в почке, в основном, в собирательных трубочках, а также в дистальных извитых канальцах (Rossier et al., 2013) (Рис. 15). В тех же клетках экспрессируются V2-рецептор и аквапорин-2. Экспрессия ENaC регулируется транскрипционными и пост-трансляционными факторами. Эта регуляция происходит непосредственно на субъединицах канала и/или на ENaC-регулирующих белках (Loffing J. et al., 2001) Регуляция ENaC в почке происходит под действием гормонов: вазопрессина и альдостерона (Loffing J. et al., 2000). Принцип действия этих гормонов, в основном, заключается в увеличении плотности ENaC на апикальной мембране клеток (Butterworth M.B. et al., 2009). Вазопрессин увеличивает плотность ENaC за счет слияния везикул содержащих ENaC с апикальной мембраной (Butterworth M.B. et al., 2005). После удаления вазопрессина, ENaC подвергается эндоцитозу с поверхности мембраны и реорганизуется в рециркулирующие везикулы. Альдостерон может регулировать активность ENaC с помощью транскрипционно-зависимых и независимых механизмов (Thomas et al., 2007). Например, альдостерон увеличивает плотность ENaC за счет уменьшения интернализации ENaC, путем синтеза киназы SGK1, которая негативно модулирует Nedd4 (Debonneville C. et al., 2001). Нарушение структурно-функциональной организации ENaC приводит к тяжелым наследственным заболеваниям (синдром Лиддла, псевдогипоальдостеронизм I типа и др.).

Рис. 15. Локализация ENaC в нефроне. (Модифицировано из Kellenberger et al., 2016)

2.2 Функция ENaC в кишечнике

Тонкий кишечник выполняет множество важных функций, таких как: перемешивание химуса с секретами пищеварительных желез, переваривание пищи, всасывание различных веществ, продвижение материала по желудочно-кишечному тракту, секреция гормонов, иммунологическая защита. Тонкий кишечник состоит из трех отделов: двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки. Всасывание является одной из важнейших функций тонкого кишечника, и всасывание Na+, наравне с всасыванием воды, здесь играет одну из ключевых ролей (Рис. 16).

Всасывание катионов Na+ в кишечникe происходит за счет активного и пассивного механизмов. Всасывание Na+ важно, в том числе, тем, что катионы Na+ участвуют в сопряженном транспорте многих других важных веществ. В переносе катионов Na+ важнейшую роль играет Na+/K+-АТФаза, находящаяся на базальной мембране энтероцитов. Na+/K+-АТФаза переносит катионы Na+ и K+ (в соотношении 3/2) против градиента концентрации и против электрохимического градиента. Создание концентрационного и электрохимического градиентов способствует переносу Na+ из просвета кишечника внутрь клетки через ENaC и с помощью белков-переносчиков, обеспечивающих сопряженный транспорт Na+. Сопряженный транспорт Na+ -- исключительно важный процесс, так как таким образом в энтероциты вместе с катионами Na+ проникают такие важные вещества как: D-гексозы, L-аминокислоты, водорастворимые витамины, переносимые общими c Na+ переносчиками.

Нарушения в функции ENaC в тонком кишечнике может приводить к болезни Крона, которая представляет собой хроническое воспалительное заболевание кишечника, характеризующееся регулярными болями в животе, диареей и потерей в весе.

Рис. 16. Поглощение ионов в тонком кишечнике. 1. Электрогенный транспорт Na+ против электрохимического градиента. 2. Сопряженный электрогенный транспорт Na+. 3. Нейтральный сопряженный транспорт Na+ и Cl-. 4. Нейтральное поглощение Na+ путем обмена на H+ и Cl- путем обмена на HCO3-.(Модифицировано из Шмидт, Тевс, 2005)

2.2.2 ENaC в толстом кишечнике

В толстом кишечнике происходит переваривание и всасывание органических компонентов пищи, всасывание воды, электролитов (Рис. 17). В толстом кишечнике катионы Na+ всасываются через ENaC в апикальной части клеток путем простой диффузии, в следствие большого градиента концентрации и разницы электрохимических потенциалов. Выводится же Na+ из клеток так же, как и из клеток тонкого кишечника: за счет активности Na+/K+-АТФазы, расположеной в базолатеральной части клеток. За счет плотных контактов вода не может проникать обратно в просвет кишечника, а поглощение катионов Na+ возможно даже тогда, когда содержимое кишечника становится гипотоническим. В толстой кишке нарушение работы ENaC ведет к потере Na+ и альдостерона, хотя в экспериментах было показано, что она может быть компенсирована за счет работы системы ренин-ангиотензин-альдостерон (Malsure S. et al., 2014).

Рис. 17. Транспорт ионов в слизистой толстого кишечника. Активное поглощение Na+ и пассивная диффузия K+ (вверху). Обмен ионов HCO3- и Cl- (внизу). (Модифицировано из Шмидт, Тевс, 2005)

2.3 Функция ENaC в легких

В эмбриогенезе эпителиальные клетки легких плода активно секретируют анионы Cl- в пространство легких. В это время катионы Na+ пассивно переносятся для поддержания электронейтральности. Данный процесс отвечает за секрецию жидкости в легкие плода, необходимую для нормального развития легких. Электродвижущую силу в данном случае создает Na+/K+-АТФаза. Незадолго до рождения, усиливается активность ENaC на апикальной поверхности эпителиальных клеток легких и приводит к усилению активного транспорта Na+. Результатом этого процесса является реабсорбция легочной жидкости плода и создание оптимальных условий для газообмена (Matalon S. et al., 2015). Исследования, проведенные на крысах, показали ключевую роль ENaC в данном процессе (Hummler E. et al., 1996; Barker P.M. et al., 1998).

2.3.2 ENaC в легких в постэмбриональном периоде

В здоровых легких перенос катионов Na+ из альвеолярной подкладочной жидкости в интерстиций легкого идет по градиенту концентраций, создаваемому Na+/K+-АТФазой в базолатеральной части мембраны, через ENaC в апикальной мембране клеток легочного эпителия (Рис. 18) (Matthay M.A. et al., 1996; Matalon S. et al., 1999; Berthiaume Y. et al., 2007 ). Параллельно с катионами Na+ пассивно движутся анионы Cl-, для поддержания электронейтральности. Направленное движение Na+ и Cl- создает градиент осмотического давления и заставляет жидкость двигаться в интерстиций. Этот процесс называется альвеолярным клиренсом жидкости. Данный процесс играет ключевую роль в реабсорбции альвеолярного отека. Также ENaC играют важную роль в рассасывании высокогорного отека легких (Scherrer U. et. al., 1999). Эпителиальные клетки дыхательных путей поглощают Na+ и активно секретируют Cl- через апикальные хлорные каналы, в первую очередь CFTR и аноктамин-1 (ANO-1), являющийся Ca2+-зависимым Cl--каналом (Riordan J.R. et al., 1989).

Поверхностная жидкость в дыхательных путях, состоящая из перицилиарного слоя и слоя слизи, покрывает дыхательные пути и способствует улавливанию и выведению патогенов и твердых частиц. Толщина перицилиарного слоя в норме составляет около 7мкм. Такая толщина обеспечивает движение слизи в гортани и эффективный мукоцилиарный транспорт, очищающий поверхность дыхательных путей от патогенных микроорганизмов и других вредных веществ (Livraghi A. et al., 2007). Толщина перицилиарного слоя контролируется совместно ENaC и CFTR, таким образом, они участвуют в мукоцилиарном клиренсе (Boucher R.C. et al., 1989; Collawn J.F. et al., 2012). Сверхэспрессия ENaC приводит к муковисцидоз-подобным заболеваниям легких из-за избыточного поглащения жидкости (Mall M.A. et al., 2004, 2010). Ослабление мукоцилиарного клиренса ведет к хронической бактериальной инфекции и воспалительным реакциям при легочных заболеваниях, таких как: муковисцидоз, хроническая обструктиивная болезнь легких и прочие (Ribeiro C.M. et al., 2012; Rab A. et al., 2013; Astrand A.B. et al., 2015).

Рис. 18. Транспорт Na+ и Cl- через апикальную мембрану эпителиальных клеток легкого. PCL - перицилиарный слой. (Модифицировано из Matalon et al., 2015)

2.4 Функция ENaC в сенсорных клетках

ENaC были обнаружены в кортиевом органе крысы, фотороцепторах, механочувствительных нервных окончаниях, барорецепторах и клетках вкусовых рецепторов (Drummond H.A. et al., 1998, 2000; Kretz O. et al., 1999; Golestaneh N. et al., 2000; Couloigner V. et al., 2001; Chandrashekar J. et al., 2010).

Мембранный лабиринт улитки является комплексом нейросенсорного эпителия. Базолатеральная сторона омывается перилимфой, по ионному составу схожей с плазмой крови. А эндолимфа, омывающая волосяные пучки сенсорных клеток, гиперосмотична, богата катионами K+, практически лишена катионов Na+, и ее ионный состав крайне важен для трансдукции. В улитке ENaC обнаружены в эпителиальных и неэпителиальных структурах. Их роль, по-видимому, связана с поддержанием низкого уровня Na+ в эндолимфе. Считается также, что ENaC играют ключевую роль в изменении состава эндолимфы в поздних стадиях эмбриогенеза (Couloigner V. et al., 2001).

Роль ENaC в фоторецепторах на данный момент не ясна (Golestaneh N. et al., 2000).

Наличие ENaC в барорецепторах, иннервирующих дугу аорты, как и в механочувствительных нервных окончаниях позволяет предполагать, что ENaC у млекопитающих, как Deg у C. Elegans могут являться механочувствительными каналами (Рис. 19). Работа по изучению ENaC в барорецепторах показала, что г-субъединица ENaC, по-видимому, входит в состав механорецепторных комплексов. Важным моментом является то, что б-субъединица в данных сенсорных клетках не экспрессируется (Drummond H.A. et al., 1998, 2000).

Рис. 20. Модель механо-чувствительного комплекса C. Elegans. (Модифицировано из Kellenberger, Schild, 2002)

Большинство млекопитающих способны различать пять основных вкусов: сладкий, кислы, горький, соленый и умами. Клетки вкусовых рецепторов являются специфичными для каждого вкуса. В грибовидных вкусовых рецепторах мышей есть клетки реагирующие исключительно на NaCl (Shigemura N et al., 2008).

Детектирование соли для животных имеет большое значение, поскольку важно для поддержания ионного гомеостаза внутренней среды. Обнаружено, что рецепция ионов Na+ чувствительными к соленому вкусовыми рецепторными клетками осуществляется без участия гетеротримерных G-белков, а опосредуется Na+- специфическими вкусовыми ионными каналами, чувствительными к амилориду. Наиболее вероятными кандидатами на роль таких каналов являются именно ENaC. Считается, что ENaC отвечают за восприятие соленого вкуса при концентрациях Na+<120мМ (Chandrashekar J. et al., 2010). Поток Na+ внутрь вкусовой рецепторной клетки способствует деполяризации, приводящей к выделению медиатора на соседние нервные окончания (рис. 20).

Рис. 20. Пути передачи сигнала соленого вкуса.

Na+ входит в амилорид-чувствительные ENaC, а затем откачивается наружу Na+/K+-АТФазой в базальной части клетки. Одновременно в базальной части из клетки выходят катионы (вероятно К+ через К+- каналы). Деполяризация вызывает открывание Са2+-каналы, и поток Са2+ внутрь вызывает выделение медиатора на дендрит сенсорного волокна (Модифицировано из Смит, 2005.).

Чувствительность к соленому находится под гормональным контролем. Гормонами, влияющими на чувствительность к соленому, являются альдостерон и антидиуретический гормон (АДГ).

Интересной особенностью является то, что в порядке китообразные гены четырех вкусов нефункциональны из-за большого числа мутаций, а гены, кодирующие субъединицы ENaC, которые служат в том числе рецепторами соли, остаются функциональными. Однако, до сих пор не ясно способны ли китообразные ощущать соленый вкус. (Zhu K. et al., 2014).

2.5 Функция ENaC в нетипичных тканях

Относительно недавно ENaC были обнаружены в тканях, по-видимому, не участвующих в поддержании Na+ гомеостаза организма. Экспрессия ENaC обнаружена в коже, роговице глаза и кровеносных сосудах (Rossier B.C. et al., 2013; Kellenberger S., Schild L., 2015). В этих тканях и органах ENaC выполняют такие функции как синтез и секреция липидов, миграция кератиноцитов, поддержание гидратации поверхности глаза, эпидермальная дифференцировка, барьерная функция, уменьшение выхода оксида азота в эндотелиальных клетках (Charles R.P. et al., 2008; Chandrashekar J. et al., 2010; Krueger B. et al., 2012; Yu D. et al., 2012; Jeggle P. et al., 2013; Yang H.Y. et al., 2013).

эпителиальный натриевый мембрана патология

3. Патология ENaC

Синдром Лиддла -- это редкое наследственное заболевание, описанное британским медиком Грантом Лиддлом (Liddle G.W. et al., 1963). По клиническим проявлениям синдром Лиддла напоминает гиперальдостеронизм.

Синдром Лиддла это наследуемая по аутосомно-доминантному механизму форма артериальной гипертензии, вызванная увеличением объема крови и усиленной реабсорбцией Na+ в дистальных почечных канальцах, совместно со снижением уровня K+, ренина и альдостерона в крови (Yang K.-Q. et al., 2014). Клинические нарушения у лиц с синдромом Лиддла могут быть исправлены диетой с низким содержанием соли в сочетании с приемом антагонистов ENaC, но не антагонистами рецепторов минералкортикоидов. На основании этих данных было предположено, что гипертензия у пациентов с этим синдромом вызывавется усиленной реабсорбцией Na+ в почках. В 1994г. Ботеро-Велез предположил, что синдром Лиддла может объясняться структурно-функциональной аномалией какого-либо компонента комплекса ENaC или рецептора минералокортикоидов в собирающем канальце (Botero-Velez M. et al., 1994).

Основной причиной синдрома Лиддла являются мутации в консервативном PY-мотиве в- и г-субъединиц ENaC (Рис. 21). Это могут быть как мутации с изменением смысла (миссенс-мутации), так и мутации со сдвигом рамки считывания (Shimkets R.A. et al., 1994; Hansson J.H. et al., 1995; Tamura H. et al., 1996). Эти мутации в той или иной мере нарушают связывание убиквитинлигазы Nedd4 с ENaC и, по-видимому, ведет к накоплению избыточного количества активных каналов на поверхности клетки, а как следствие к усилению реабсорбции Na+ в почке. Несмотря на то, что в б-субъединицах ENaC также присутствует PY-мотив, пока ни одной мутации, вызывающей синдром Лиддла зарегистрировано не было (Abriel H. et al., 1999).

Кроме мутаций в PY-мотиве (Kellenberger S. et al., 1998; Abriel H. et al., 1999) были обнаружены еще 2 мутации: замена положительно заряженного аргинина на нейтральный глутамин в C-концевом домене в-субъединицы (R563Q) (Rayner B.L. et al., 2003) и замена аспарагина на серин в трансмембранном домене TM2 в г -субъединице (N530S) (Hiltunen T.P. et al., 2002). Однако, в исследовании (Hiltunen T.P. et al., 2002) мутация N530S была зафиксирована и у здорового человека, что свидетельствует о том, что, скорее всего, одной мутации N530S недостаточно для возникновения гипертензии и, по-видимому, в данном случае должны присутствовать и иные факторы. Сама по себе мутация N530S увеличивает вероятность открытого состояния ENaC в два раза по сравнению с каналами дикого типа.

Все мутации, вызывающие синдром Лиддла приводят к увеличению активности эпителиальных натриевых каналов (фенотип «gain-of-function») (Schild L. et al., 1995).

Рис. 21. Мутации аминокислотных остатков в составе субъединиц ENaC, вызывающие псевдогиперальдостеронизм (Синдром Лиддла) (Модифицировано из Snyder, 2002)

3.2 Псевдогипоальдостеронизм I типа

Псевдогипоальдостеронизм I типа -- это редкое наследственное заболевание, описанное Д. Чиком и Дж. Перри в 1958г. Псевдогипоальдосьеронизм I типа характеризуется невоспреимчивостью почки к минералкортикоидному гормону альдостерону (Cheek D.B., Perry J.W., 1958). Симптомами гипоальдостеронизма I типа являются: гипонатриемия, гиперкалиемия, повышенная экскреция Na+. Было выявлено 2 независимых синдрома псевдогипоальдостеронизма, различающихся клинической картиной, способом наследования, вовлеченностью органов-мишеней альдостерона и тяжестью солевого истощения: почечная форма (PHA1A), которая наследуется по аутосомно-доминантному принципу, и мульти-системная форма (PHA1B), которая наследуется по аутосомно-рецессивному принципу (Hanukoglu A. et al., 1991; Chang S.S. et al., 1996; Geller D.S. et al., 1998).

Псевдогипоальдостеронизм I типа А (почечная форма) является менее тяжелой формой псевдогипоальдостеронизма и связан с мутациями в гене, кодирующем минералокортикоидный рецептор (Geller D.S. et al ., 1998).

Псевдогипоальдостеронизм I Типа В (мульти-системная форма) является более тяжелой формой, связана с мутациями в генах, кодирующих б-, в-, г-субъединицы ENaC (Chang S.S. et al., 1996). При данной форме поражаются не только почки, но и толстая кишка, слюнные и потовые железы, дыхательные пути. Возможны клинические проявления такие как: гиперкалиемия, гипонатриемия, ацидоз, обезвоживание, рецидивирующие инфекции нижних дыхательных путей, хроничесая ринорея (Hanukoglu A. et al., 1994; Kerem E. et al., 1999). Первые клинические проявления заболевания, обычно, наблюдаются в младенчестве. PHA1B вызывается мутациями с потерей смысла (nonsense), мутациями со сдвигом рамки и мутациями, вызывающими нарушение сплайсинга (abnormal splicing) ( Hanukoglu A. et al., 2008). Так же причиной могут быть мутации с заменой смысла (missence), однако, проявления заболевания будут менее выраженными (Edelheit O. et al., 2010).

Большая часть обнаруженных мутаций приводящих к гипоальдостеронизму затрагивает б-субъединицу (Рис. 22). Все известные мутации, приводящие к псевдогипоальдостеронизму I типа (бE272fs, бG327C, бR438fs, бY447fs, бK459stop, бR492stop, бR508stop, бS589A/C/D, вQ213stop, вG217fs, вY306fs, гR440stop) приводят к уменьшению активности ENaC («loss-of-function») (Kellenberger S. et al., 1999; Bonny O. et al., 2002; Saxena A. et al., 2002; Edelheit O. et al., 2005, 2010; Belot A. et al., 2008; Wang J. et al, 2013).

Рис. 22. Мутации аминокислотных остатков в составе субъединиц ENaC, вызывающие псевдогипоальдостеронизм I типа (Модифицировано из Snyder, 2002)

3.3 Эссенциальная гипертензия

Эссенциальная гипертензия (первичная гипертензия, гипертоническая болезнь) -- это хроническое заболевание, характеризующееся стойким повышенным артериальным давлением (140мм рт. ст. - систолическое, 100мм рт. ст. - диастолическое). Может приводить к изменениям в структуре и функциях артерий и сердца.

В клинической практике эссенциальная гипертензия зачастую на ранних этапах протекает бессимптомно и проявляется только в случае гипертонических кризов. В более тяжелых случаях может сопровождаться такими симптомами, как одышка, головные боли, нарушение зрения, почечная недостаточность. Эссенциальная гипертензия может приводить к таким осложнениям, как ишемический инсульт, геморрагический инсульт, инфаркт миокарда, стенокардия, нарушение мозгового кровообращения и др.

Эссенциальная гипертензия по данным ВОЗ наблюдается примерно у 20-25% населения Земли, смертность данного заболевания около 6,5%. Примерно 50% случаев эссенциальной гипертензии являются наследственными и связаны с мутациями в генах ангиотензина, ренина, альдостеронсинтазы, рецептора ангиотензина, в-субъединицы ENaC.

В исследованиях А. Персу и соавторов были обнаружены семь мутаций в гене, кодирующем в-субъединицу ENaC, вызывавшие эссенциальную гипертензию: G589S, T594M, R597H, R624C, E632G, G442V, и V434M. Наиболее распространенной оказалась мутация T594M, а изменение биофизических параметров канала было наибольшем в случае мутации G589S. Интересен тот факт, что данные мутации встречались гораздо чаще у чернокожих пациентов (44% из выборки), чем у белокожих (1% из выборки). При всех этих мутациях в ENaC наблюдалось незначительное увеличение амилорид-чувствительных натриевых токов по сравнению с каналами дикого типа (Persu A. et al., 1998). Позже была обнаружена еще одна новая мутация P592S среди японского населения, однако она не влияла на частоту случаев эссенциальной артериальной гипертензии (Matsubara M. et al., 2000).

Поскольку мутации в C-концевом домене г-субъединицы ENaC могут являться причиной синдрома Лиддла, проводились исследования влияния мутаций в гENaC на эссенциальную гипертензию. В этих исследованиях было обнаружено две мутации R631H и V546I, однако, результаты исследований были различны. В первом случае разница между амилорид-чувствительными Na+ токами у мутантных каналов и каналов дикого типа не была существенна, и, по-видимому, данная мутация не лежит в основе эссенциальной гипертензии (Persu A. et al., 1999). Во втором случае наблюдалась значительная разница между амилорид-чувствительными Na+ токами мутантных каналов и каналов дикого типа, более того частота данной мутации была в три раза выше у людей с эссенциальной гипертензией, чем у людей с нормальным артериальным давлением (Hannila-Handelberg T. et al., 2005).

Все мутации в ENaC, связанные с эссенциальной гипертензией увеличивают активность каналов («gain-of-function»).