Гигиеническая оценка пищевой и биологической ценности мицелия высших грибов, выращенных на питательной среде с добавлением цитратов биометаллов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

Гигиеническая оценка пищевой и биологической ценности мицелия высших грибов, выращенных на питательной среде с добавлением цитратов биометаллов

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Среди новых дополнительных источников пищевого сырья продукты биотехнологии, а именно культивируемые грибы, рассматриваются как потенциальный резерв пищевых и биологически активных веществ (Гарибова Л.В., 2004; Соломко Э.Ф. 2011; Бисько Н.А., 2011). наноцитрат биометалл гриб культивирование

Все чаще основой для создания продуктов высокого биологического действия становятся высшие съедобные и лекарственные грибы, которые синтезируют целый спектр биологически активных веществ, в т.ч. полисахариды, вещества фенольной природы, каротиноиды, антиоксиданты и т.д. (Бабицкая В.Г., 2002; Соломко Э.Ф., 2004; Гулич М.П., Ольшевская А.Д. 2004; Гвоздков Т.С., Черноок Т.В. ., 2007).

Сегодня на первый план выходят сферы деятельности инновационного характера. Поэтому открытие возможности глубинного жидкофазного культивирования грибов и высокая скорость их роста поставили этот процесс в ряд конкурентоспособных технологических решений промышленного получения протеина. Среди таких культивируемых высших грибов наибольшее внимание вызывают съедобный гриб вешенка обыкновенный (Pleurotus ostreatus) и лекарственный грибы: ганодерма (Ganoderma lucidum), кордицепс военный (Cordyceps militaris) и кордицепс китайский (Cordyceps sinensis) (Gao Y., Zhou S., Huang M ., 2002; Hu Sh.-H, Lien J.-L., 2009).

В последнее время предпочтение отдается мицелию грибов, а не их плодовым телам, поскольку культивирование мицелия позволяет получать биологически ценную и экологически чистое сырье в более короткий срок, используемой в производстве диетических добавок и функциональных пищевых продуктах (В. Бабицкая, В.В. Щерба, 2004; В. Бабицкая, Л.В. Пленина, 2004; В., Бабицкая, Н.А. Бисько, 2004). Установлено, что пищевая и биологическая ценность мицелия культивируемых грибов обусловлена содержанием в них белка, в состав которого входят эссенциальные аминокислоты жира, углеводов, витаминов и минеральных веществ. За предыдущие годы доказано, что химический состав мицелия культивируемых грибов зависит от условий их культивирования и состава жидкой питательной среды (Бисько Н.А., 1987; Соломко Э.Ф., Аре Р.Ю., Стеганцева Е.М., 1988).

Специалистами Института ботаники им. М.Г. Холодного НАН Украины получены перспективные штаммы продуцента и создано экономически приемлемый биотехнологический процесс получения сухого порошка мицелия высших грибов (Бисько Н.А., 1987).

Современное промышленное выращивание лекарственных и съедобных грибов направлено на оптимизацию способов их культивирования с целью увеличения выхода биомассы и получения грибного сырья с высокой биологической активностью, которую обеспечивают в том числе макро-и микроэлементы, особенно эссенциальные биометаллы (Николайчук Л.Ф., 2004). Одним из таких инновационных способов культивирования является использование в питательных средах органических соединений биогенных металлов. Возможность получения относительно дешевых и значительно более химически чистых карбоксилатов биометаллов появилась как результат интенсивного развития нанотехнологий (Косинов Н.В., Каплуненко В.Г., 2009). Одними из таких хелатных соединений является цитраты биометаллов, которые широко используются в пищевой промышленности для обогащения пищевых продуктов необходимыми для человека минеральными веществами (Новинюк Л.В., 2009). Предыдущие исследования по изучению цитратов биометаллов, полученные по аквананотехнологии, свидетельствуют о значительно более химической чистоте 99,98% (квалификация ОСЧ), безопасности и значительно более высокой их биодоступности по сравнению с неорганическими соединениями - сульфатами (Сердюк А.М., Гулич М . П., 2010; Гулич М.П., Емченко Н.Л., 2011).

Использование карбоксилатов эссенциальных биометаллов в питательных средах при выращивании съедобных и лекарственных грибов открывает перспективу возможности модифицировать макро-и микронутриентный состав, как плодовых тел грибов, так и их мицелия.

Учитывая вышесказанное, исследования, посвященные изучению особенностей влияния цитратов биометаллов на рост мицелия грибов, культивируемых на жидкой питательной среде, и гигиенической оценке пищевой и биологической ценности мицелия для дальнейшего использования его в производстве пищевых продуктов и, прежде всего, продуктов специального назначения для коррекции рациона питания и обогащения его макро-и микронутриентами, определяют актуальность работы и весомую научную и практическую перспективу.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнялась в рамках научно-исследовательских работ Государственного учреждения "Институт гигиены и медицинской экологии имени А.Н. Марзеева АМН Украины" на тему: «Изучить особенности влияния на организм пищевых продуктов и пищевых композиций направленного действия и создать научные основы использования в лечебно-профилактическом питании», шифр «АМН.Ф. 09.01» , «Научное обоснование методических подходов к медико-биологической оценки безопасного применения нанокомпозиций на основе металлов», шифр «АМН 18.09» (номер государственной регистрации 0109U001244) и «Научное обоснование возможности использования в производстве пищевых продуктов карбоксилатов биогенных металлов, полученных с нанотехнологией», шифр «АМН.19.11» (номер государственной регистрации 0111U001691), а также в соответствии с Распоряжением Кабинета Министров № 332-р от 26 мая 2004г. «Об утверждении Концепции улучшения продовольственного обеспечения и качества питания населения Украины».

Цель и задачи исследований. Целью работы была гигиеническая оценка пищевой и биологической ценности мицелия высших грибов, выращенных на питательной среде с добавлением цитратов биометаллов, полученных за аквананотехнологиею и научное обоснование оптимизации и повышения эффективности способа культивирования лекарственных и съедобных грибов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать в динамике наблюдений влияние наноцитратов биометаллов Zn, Cu, Fe, Mg, Se, Ge, внесенных в жидкую питательную среду, на увеличение объема биомассы мицелия грибов G.lucidum, C.militaris, C.sinensis, P.ostreatus и установить закономерности роста объема биомаси Автор выражает искреннюю благодарность ведущему научному сотруднику отдела микологии, Института ботаники им. М.Г. Холодного НАН Украины, д.б.н., ст.н.сотр Бисько Н.А. за консультативную и практическую помощь, оказанную при выполнении отдельных фрагментов работы..

2. Изучить особенности аккумуляции биометаллов мицелием грибов G.lucidum, C.militaris, C.sinensis и P.ostreatus и установить закономерность их сорбции биомассой грибного мицелия.

3. Определить биодоступность биометаллов Zn, Cu, Fe, аккумулированных мицелием грибов и оценить особенности поведения различных микроэлементов в экспериментах на животных.

4. Изучить пищевую и биологическую ценность мицелия гриба G.lucidum при глубинном культивировании его на питательных средах, обогащенных цитратами цинка, селена, германия: исследовать белоксинтезирующую активность грибного мицелия (количество белка, аминокислотная характеристика аминокислотных скор), провести оценку его жировой компоненты, определить содержание полисахаридов и оценить витаминный спектр.

5. Дать гигиеническую оценку безопасности мицелия грибов, культивируемых на питательной среде с цитратами биометаллов, по содержанию токсичных элементов Pb, Cd, Hg, As.

Объект исследования: влияние цитратов биометаллов, полученных по аквананотехнологии, на рост биомассы, пищевую и биологическую ценность мицелия культивируемых грибов, аккумуляцию мицелием биоэлементов, их биодоступность, закономерности роста биомассы мицелия и сорбции им биометаллов.

Предмет исследования: биомасса мицелия культивируемых грибов, цитраты и сульфаты биометаллов, питательные среды, белок и аминокислотный состав белка, жир и его жирнокислотный состав, полисахариды, витамины (А, С, В1, В2, В6 и РР).

Методы исследования: гигиенические, микологические, физико-химические, химические, биохимические, статистические и поисково-информационный.

Научная новизна полученных результатов. Научная новизна заключается в том, что впервые при культивировании грибов для модификации питательной среды применены цитраты биометаллов, полученные по аквананотехнологии.

Впервые для обогащения питательной среды использовано биоэлементы селен и германий.

Впервые научно обоснована возможность повышения пищевой и биологической ценности съедобных и лекарственных грибов при культивировании их на питательной среде с добавлением цитратов биометаллов, полученных по инновационной нанотехнологии.

Теоретическое значение полученных результатов. Установлены закономерности влияния цитратов биометаллов на рост биомассы грибного мицелия, сорбцию им металлов, является теоретической основой для научного обоснования оптимизации и повышения эффективности способа культивирования мицелия съедобных и лекарственных грибов на жидкой питательной среде с использованием цитратов биогенных металлов, полученных за аквананотехнологией.

Практическое значение полученных результатов. По результатам работы научно обосновано модификацию технологии безопасного и эффективного культивирования мицелия съедобных и лекарственных грибов на жидкой питательной среде с использованием цитратов биогенных металлов, полученных за аквананотехнологией. Установлено необходимые концентрации цитратов биометаллов и определены оптимальные сроки выращивания мицелия грибов для получения высокого объема биомассы и повышения ее пищевой и биологической ценности. Разработанная оптимизация культивирования грибов позволяет получать биологически ценную грибную продукцию в промышленных объемах более дешевым способом. Это также является одним из направлений конкурентоспособных технологических решений промышленного получения грибного сырья с высокой пищевой и биологической ценностью и может служить основой для разработки рецептур пищевых продуктов, прежде всего специального назначения, как дополнительный источник пищевого белка, незаменимых аминокислот, полиненасыщенных жирных кислот, полисахаридов, витаминов и микроэлементов для коррекции рациона и сохранения здоровья населения.

По материалам диссертации разработаны и внедрены:

1. Информационное письмо «Пищевая и биологическая ценность мицелия высших съедобных и лекарственных грибов, культивируемых на жидкой питательной среде с добавлением цитратов биометаллов полученных по инновационной аквананотехнологии» (г. Киев, 2013, № 90 - 2013).

2. Декларативный патент «Способ культивирования высших съедобных и лекарственных грибов» (г. Киев, 2013, приоритетная справка № u 2013 01601).

Весомым практическим творчеством диссертационной работы является внедрение указанного информационного письма в лекционный курс «нанотехники и наноматериалы» Национального университета биоресурсов и природопользования Украины (акт внедрения от 26.04.2013 г.) в практическую работу сотрудникам отделения нанобиотехнологии Украинского государственного научно-исследовательского института нанобиотехнологии и ресурсосбережения (акт внедрения от 19.04.2013 г.) в практику культивирования съедобных и лекарственных грибов на предприятии ООО «Здоровая пища» (акт внедрения от 18.04.2013 г.).

Личный вклад соискателя. Соискателем в полном объеме осуществлен информационный поиск, проведен аналитический обзор отечественной и мировой научной литературы по проблеме, определены цели и задачи исследований, проведено планирование экспериментов и их выполнение в полном объеме, осуществлено обобщение и статистические расчеты полученных результатов, сформулированы выводы и практические рекомендации. В общем итоге личный вклад соискателя в структуре диссертации составляет более 80%.

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертации были представлены на научно-практических конференциях: "Актуальные вопросы гигиены и экологической безопасности Украины" (г. Киев, 2007 г.), "Применение продуктов, напитков и БАД в профилактически-оздоровительном питании населения Украины в современных эколого-экономических условиях" (г. Партенит, Крым, 2009 г.), "Актуальные вопросы гигиены и экологической безопасности Украины" (г. Киев, 2010 г.), "Актуальные вопросы гигиены и экологической безопасности Украины" (г. Киев, 2011 г.), "Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения" (г. Новый Свет, Крым, 2011 г.), "Проблемы гигиены и технологии питания. Современные тенденции и перспективы развития" (г. Донецк, 2012), на научно-практической конференции молодых ученых "Актуальные вопросы гигиены и экологической безопасности Украины" (г. Киев, 2009 г.), на научно-практических конференциях с международным участием "Медико-экологические и социально-гигиенические проблемы сохранения здоровья детей в Украине" (г. Киев, 2009 г.), "Функциональные пищевые продукты - диетические добавки - как действенное средство разноплановой профилактики заболеваний" (г. Харьков, 2013 г.), на XV съезде гигиенистов Украины. "Гигиеническая наука и практика: современные реалии" (г. Львов, 2012 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 работы, из них - 7 статей в научных изданиях, 17 тезисов в материалах научно-практических конференций и съезда гигиенистов, выдано 1 патент на полезную модель и 1 информационное письмо.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 158 страницах печатного текста (включая приложение), иллюстрирована 35 таблицами и 62 рисунками (из которых 30 - в приложении А). Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела, посвященного описанию материалов и методов исследований, раздела результатов собственных исследований, анализа и обобщения результатов, выводов и списка литературы. Библиографический указатель содержит 250 источников.

Основное содержание работы

Методы, объем и организация исследований. Программно-целевая структура диссертационного исследования представлена на рис.1. Комплексная программа исследований включала три этапа. На первом этапе проводилось исследование влияния цитратов биометаллов, полученных за нанотехнологией (Zn, Cu, Fe, Mg, Ge и Se), которые были добавлены к жидкой питательной среды, на рост биомассы мицелия культивируемых грибов, зависимости этого процесса от концентрации данных биоэлементов в питательной среде и изучение его в динамике, а также установление особенностей и закономерностей сорбции биоэлементов грибным мицелием.

В исследованиях были использованы 4 вида высших шляпочных грибов: вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr) Kumm. 453), (P.ostreatus) - съедобный гриб и лекарственные грибы: ганодерма (Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P . Karst. 1900), (G.lucidum) кордицепс военный (Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link. 2029), (C.militaris) и кордицепс китайский (Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. 209), ( C.sinensis) из коллекции культур Института ботаники им. М.Г. Холодного НАН Украины.

Цитраты металлов (Zn, Cu, Fe, Mg, Ge и Se) были получены с нанотехнологией и предоставлены фирмой ООО «Наноматериалы и нанотехнологии».

Комплекс исследований включал выращивание грибного мицелия глубинным методом на качалке со 120 об/мин. при 24-26 0С и поверхностным стационарным методом в колбах Ерленмейера при 22-24 0С (срок культивирования от 8 до 30 суток). Мицелий грибов культивировали в глюкозо-пептонному среде следующего состава: глюкоза - 25 г/дм3, пептон - 3 г/дм3, дрожжевой экстракт - 2 г/дм3 K2HPO4 - 1 г/дм3 KH2PO - 1 г/дм3, вода дистиллированная - 1 дм3 (контроль № 1), на такой же питательной среде, в которую добавлялись наноцитраты Mg-500 мг/дм3, Zn - 300 мг/дм3, Cu - 70 мг/дм3, Fe - 200 мг/дм3, Ge - 200 мг / дм3 и Se - 100 мг/дм3 (опыт), а также сульфаты Mg, Zn, Cu и Fe в тех же концентрациях (контроль № 2).

Цитраты биометаллов в питательную среду добавлялись в двух вариантах - в комплексе (Zn + Cu + Fe) и отдельно (Zn, Cu, Fe, Mg, Se, Ge).

Рис. 1 Программно-целевая структура исследования

Проводилось определение прироста биомассы грибного мицелия при различных разведениях питательной среды (1:100; 1:200, 1:500, 1:1000, 1:1500, а для Se еще и 1:2000 и 1:2500), и в зависимости от продолжительности культивирования. Для этого выращенную биомассу фильтровали через капроновый фильтр, высушивали при 105 0С до постоянной массы и взвешивали с точностью до 4 знака после запятой. По полученным результатам строили зависимости концентрации биомассы в питательной среде от концентрации в нем металла и от срока культивирования.

Исследование сорбции металлов из контрольных и опытных сред при различных разведениях (разных концентрационных уровнях металлов) состояла в определении их в биомассе мицелия, исчислении коэффициента биологического поглощения (КБП) как отношение концентраций их в биомассе мицелия и в питательной среде, и построении зависимостей концентрации металла в мицелии и полноты абсорбции (%) его биомассой гриба от концентрации в питательной среде.

Биоэлементы определялись в сухой биомассе мицелия грибов после ее озоления при 450 0С. Zn и Cu-определялись методом инверсионной вольтамперометрии; Mg - методом атомной абсорбции; Fe - фотометрическим методом; Ge и Se - методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

Второй этап исследований состоял в оценке безопасности грибного мицелия по содержанию в них токсичных элементов и изучении биодоступности металлов, накопленных грибным мицелием из питательной среды.

Для оценки безопасности полученной грибной биомассы в ней определялось содержание токсичных элементов Pb, Cd, Hg, As, которые регламентированы в грибах. Для исследований были взяты гриб G.lucidum который наиболее активно сорбирует токсические элементы. Определение вышеупомянутых элементов проводили по методу инверсионной вольтамперометрии после озоления биомассы мицелия при 450 0С.

Исследования биодоступности Zn в первом варианте эксперимента проводилось на белых беспородных мышах весом 25 г по 7 особей в опытной и контрольной группах. Животным в течение 16 суток в рацион добавляли сухой мицелий гриба G.lucidum, содержащий цинк в количестве 593 мг/кг. В суточном рационе мышей масса цинка составляла 0,03 мг. Суммарная масса цинка за 16 суток - 0,48 мг. Животные контрольной группы получали общий виварний рацион.

Во втором варианте исследований биодоступности Zn, Cu и Fe из сухого мицелия смеси грибов C.sinensis, C.militaris, проводили параллельно: с предварительно культивируемого мицелия на питательной среде с цитратами этих металлов, и культивируемому на среде с их сульфатами. Белым мышам в течение 12 суток зондом вводили по 0,1 мл водную суспензию сухого мицелия (1:10). После забоя животных проводилось определение Zn, Cu и Fe (по вышеприведенным методами) в органах и тканях: почках, печени, семенниках, крови, костях, мышцах.

На третьем этапе на примере лекарственного гриба G.lucidum оценивалась пищевая и биологическая ценность грибного мицелия, полученного на питательной среде, обогащенной цитратами Zn, или Ge, или Se и для сравнения на необогащенной среде (контроль № 1) и такой же среде, обогащенной сульфатом цинка (контроль № 2).

В сухой биомассе мицелия этих грибов определялось содержание белка по методу Кьельдаля; жира-экстракционным методом; полисахаридов (углеводов) весовым методом; витаминов: витамина С йодатным методом; витамина А и витаминов группы В (В1, В2, В6 и РР) методом ВЭЖХ. Изучалось аминокислотный состав белка мицелия на аминокислотном анализаторе Т 339 - Microtechna, в частности количественное содержание заменимых и незаменимых аминокислот, соотношение между ними, аминокислотный скор (отношение количества аминокислоты в 1 г исследуемого белка (мг) к количеству аминокислоты в 1 г стандартного белка (мг) х 100) и индекс питательности белка, а также жирнокислотный состав жира грибной биомассы методом газожидкостной хроматографии, в частности содержание НЖК, ПНЖК, МНЖК, соотношение между ними по сравнению с «идеальным» жиром.

Диссертационная работа включала микологические исследования: подбор и стерилизацию культуральной среды (30 образцов), получения биомассы мицелия 4-х видов грибов (400 г) для дальнейших химических, физико-химических, биохимических исследований в целом 1446 определений, а также исследования биодоступности биометаллов с биомассы мицелия грибов, проведенного на 28 белых мышах, в течение 16 и 12 суток.

Полученные результаты оформляли в виде электронных таблиц в MS Excel, с помощью которого выполняли первичные расчеты - начальную статистическую обработку, которая включала расчет средних значений (М) и их погрешностей (м). Основные математические расчеты и описания функций и построение графиков выполняли с помощью статистического пакета STATISTICA 10.0; математическое описания зависимостей - методами регрессионного анализа. На первом этапе исследования зависимостей строились соответствующие скатерграмы, затем проводилось сглаживание точек с помощью стандартных средств STATISTICA, после чего осуществлялся выбор аналитического вида математической модели. При расчете параметров нелинейных моделей сначала графическим способом определяли их начальные приближения, а затем уточняли их методом Левенберга-Марквардта. Для всех параметров модели рассчитывали погрешность, достоверность и границы доверительных интервалов. Для описания зависимостей выбирались только адекватные модели достоверным параметрами (p <0.05).

Результаты исследования. В эксперименте, который охватывал широкий круг биотехнологических приемов культивирования ряда лекарственных и съедобных грибов (поверхностное и глубинное их выращивания), с добавлением в питательную среду эссенциальных микроэлементов (Zn, Cu, Fe, Mg, Se, Ge) в цитратной или сульфатной форме установлено, что на рост биомассы грибного мицелия влияет цинк, причем этот эффект ярче проявляется при использовании его органической (хелатной формы) - цитрата. Наиболее чувствительным к действию наноцитратив оказался гриб P.ostreatus - вешенка. Обогащение питательной среды цитратом цинка производит увеличение его биомассы на 209%. На порядок менее чувствительным был гриб G.lucidum, еще менее чувствительны грибы рода Кордицепс. Похожим цинка на рост грибного мицелия действует селен, введенный в питательную среду в микрограмових количествах (66 мкг/л). Так мицелий P.ostreatus при этом дает прирост биомассы до 200%. Цитрат германия производит увеличение биомассы мицелия G.lucidum, P.ostreatus и C.militaris соответственно на 31% 48% и 56%. Очень незначительное влияние на накопление биомассы мицелия (особенно гриба C.militaris) имел наноцитрат железа, и совсем не действовал магний. При этом более эффективно влияли на рост биомассы грибного мицелия всех грибов цитраты биоэлементов при низких концентрациях. Зависимость концентрации биомассы мицелия (в) в питательной среде от концентрации в нем биоэлементов (х), описаны математически методом регрессионного анализа и полученная нами для цинка, германия и селена для 4-х видов грибов. Как пример приведена следующая зависимость для цинка и селена для гриба G.lucidum (рис. 2, 3).

Исходя из вида графиков математической моделью, описывающая эту зависимость, была выбрана функция такого вида: у = а + b * х-с * х ^ 2.

С рисунков видно, что концентрация биомассы мицелия в питательной среде при уменьшении концентрации в нем металла повышается до определенного уровня, а дальше падает. Максимальной концентрации биомасса достигает при таких значений концентрации металла: при введении в питательную среду цитрата цинка в зависимости от вида гриба - (0,8-0,9) мг/дм3, цитрата германия - (0,25-0,4) мг / дм3, а цитрата селена - (0,053-0,072) мг/дм3.

Было также исследовано влияние цитрата и сульфата цинка, внесенных в питательную среду, на динамику накопления биомассы мицелия исследовательского гриба P.ostreatus при его глубинном культивировании.

Зависимость концентрации биомассы в питательной среде (в) от времени культивирования (х) описана математически методом регрессионного анализа для гриба P.ostreatus приведена на рис. 4 и 5.

Исследования показали, что зависимость концентрации биомассы всех грибов от суток культивирования, при добавлении в питательную среду как цитрата цинка, так и его сульфата, описывается одной математической моделю y = d * (1-exp (-b * (v1-c))) но с различными числовыми параметрами, которая представляет собой экспоненциальную функцию «с ограничением».

Предел наибольшего роста биомассы для мицелия гриба P.ostreatus достигается на 8 сутки, для G.lucidum - на 9 сутки, для грибов C.sinensis и C.militaris - на 10 сутки.

Установлены закономерности влияния наноцитратов биометаллов на рост мицелия грибов позволяют прийти к оптимизации условий их культивирования и далее - на модификацию биотехнологии выращивания грибов в направлении интенсификации и удешевление получения грибного мицелия.

На основе проведенных исследований установлено также и математически описаны закономерности сорбции мицелием грибов биометаллов из питательной среды, содержащей их цитраты и сульфатами. Полученные результаты свидетельствуют, что биометаллы в той, и другой химической форме сорбируются грибным мицелием, однако интенсивность сорбции цитратов биометаллов намного выше, чем интенсивность сорбции их сульфатов (для Cu в (10 - 20) раз, Zn (20 - 140) раз, Fe (90 - 100) раз). Обнаружено, что интенсивность сорбции металлов увеличивается с разведением питательной среды. Графики зависимости полноты сорбции Zn и Cu с цитратного питательной среды грибом P.ostreatus приведены на рис. 6 и 7.

Исходя из вида графиков математической модели, описывающей зависимость сорбции металла (в) от его концентрации в питательной среде (х), была выбрана такая нелинейная унимодальная функция: y = a * (x-x0) * exp (-c (x-x0 ) ^ n). Полное - 100% поглощения металлов биомассой грибного мицелия имело место при их концентрации от 0,1 до 0,5 мг / л. Так Zn и Fe на 100% сорбируются мицелием гриба P.ostreatus в интервале концентраций от 0,2 до 0,5 мг / л, Cu - от 0,1 до 0,2 мг / л. Интересно, что при тех же условиях биомасса мицелия этого гриба, полученной на питательной среде с добавлением сульфатов металлов, содержала только 5% Cu, 4% Fe и 0,8% Zn по сравнению с их концентрацией в питательной среде.

Поскольку наиболее интенсивно накопление этих биометаллов мицелием гриба P.ostreatus проходила при разведении питательной среды 1:500 и 1:1000, интенсивность и полнота сорбции металлов из цитратных и сульфатных питательных сред мицелием 3-х других грибов исследовалась именно в этих условиях. Анализ полученных данных и сопоставление их с предварительными результатами подтвердили тот факт, что аккумуляция биометаллов с их цитратных растворов протекает значительно эффективнее, чем с сульфатных. Максимум концентрации их приходится на те же уровни, что и для гриба P.ostreatus.

Изученные нами цитраты биометаллов меди, цинка и железа по степени увеличения поглощения различными видами грибов можно разместить в такой ряд: для G.lucidum - Zn> Cu, для P.ostreatus - Fe> Cu ? Zn, для C.sinensis - Fe> Zn > Cu, для C.militaris - Fe> Zn> Cu. В то же время для сорбции сульфатов этих металлов исследованными видами грибов существует другая закономерность: для G.lucidum - Cu> Zn, для P.ostreatus - Cu> Fe> Zn, для C.sinensis - Zn> Cu> Fe, для C. militaris - Cu> Zn> Fe.

Аналогичные исследования возможности сорбции германия мицелием грибов из питательной среды показало, что при культивировании грибов на питательной среде, обогащенной цитратом германия, содержание металла в биомассе мицелия повышается для гриба P.ostreatus - от 40 до 400 раз, для гриба G.lucidum - от 25 до 280 раз, для C.sinensis - от 360 до 3710 раз и для гриба C.militaris - от 410 до 4140 раз. Есть коэффициент кумуляции германия очень высок.

Зависимость полноты сорбции Ge мицелием исследовательских грибов на примере P.ostreatus и G.lucidum проработана с помощью регрессионного анализа и приведена на рис. 8, 9.

Исходя из вида графиков математической модели зависимости сорбции (в) от концентрации (х) была выбрана функция у = а + b * х-с * х ^ 2.

Графики имеют одинаковый характер для всех 4-х грибов но способность к аккумуляции германия у грибов различна. Интенсивность и полнота сорбции его уменьшается в ряду: C.sinensis> C.militaris> G.lucidum> P.ostreatus. Максимум сорбции его находится при концентрации от 0,5 до 0,6 мг/л, близкой к концентрационным уровням, при которых имеет место 100% сорбция других биометаллов (Zn, Cu, Fe), что свидетельствует об одном механизме сорбции.

Сорбция селена мицелием исследовательских грибов была значительно меньше, чем германия. Только с разведением питательной среды сорбция селена повышалась, достигая максимума при концентрации 0,07 мг/л.

Динамика аккумуляции биометаллов с питательных сред, обогащенных цитратами биометаллов или их сульфатами, изучалась на примере мицелия гриба G.lucidum и цитрата цинка. Как оказалось, аккумуляция металла из питательной среды, где он присутствует в виде цитрата, практически полностью (на 98,8%) заканчивается на 3 сутки глубинного культивирования гриба в то время, как сульфат цинка сорбируется только на 54%. Итак, цинк из раствора цитрата Zn поглощается мицелием грибов вдвое легче и быстрее, чем с его неорганической сульфатной формы.

Для оценки возможности практического применения наноцитратов биометаллов при культивировании грибов необходимо было, во-первых, определить содержание токсичных элементов в мицелии, учитывая его способность более интенсивно накапливать эти элементы. Во-вторых, учитывая данные литературы о возможности необратимого абсорбции металлов хитин-глюканов комплексом стенок грибного мицелия, полагается на экспериментальных животных оценить биодоступность аккумулированных грибным мицелием биоэлементов. В качестве объекта исследования были взяты наиболее способен к накоплению токсичных элементов гриб G.lucidum. Установлено, что при введении в питательную среду наноцитратив биометаллов, содержание Cd, Pb, Hg, As, в грибном мицелии не отличался от содержания их в мицелии грибов, культивируемых без добавления наноцитратив биометаллов и в обоих случаях был на порядок меньше, чем предельно допустимый.

Установлено, что высокая биодоступность характерна только для цинка, содержание которого в органах и тканях (почках, печени, семенниках крови, мышцах, костях) подопытных животных была в 1,5 - 2 раза выше по сравнению с контролем.

Пищевую и биологическую ценности мицелия изучали на примере наиболее известного и эффективного лекарственного гриба G.lucidum. Результаты по синтезирующей активности белка в мицелии гриба G.lucidum в присутствии биоэлементов представлены в табл. 1.

Введение в питательную среду цитратов селена и особенно цинка приводит к повышению в биомассе мицелия уровня белка соответственно на 36 и 50%, причем этот белок содержит все 18 аминокислот. Цитрат цинка повышает общее содержание аминокислот на 47%, цитрат Se - на 24%, а сульфат Zn - на 20%. Цинк, кроме

Таблица 1. Сравнительная оценка содержания азота и общего белка в мицелии гриба G.lucidum

Примечание. * - Разница с контролем достоверна, р <0,05

того, вызывает повышение скорую основной лимитирующей аминокислоты лизина белка грибов от 28% до 63%. Введение в питательную среду цитрата Zn приводит также к более чем 2-кратное уменьшение индекса питательности белка. Соотношение незаменимых и заменимых аминокислот во всех вариантах опыта было оптимальным. Результаты аминокислотной характеристики белка мицелия представлены на табл. 2.

Таблица 2. Показатели биологической ценности мицелия гриба G.lucidum

Таким образом, белок мицелия гриба G.lucidum, выращенный на питательной среде, обогащенной цитратом цинка, имеет наивысшую биологическую ценность, существенно отличает его от белков мицелия грибов, выращенных на других питательных средах, и белков высших растений.

Результаты определения общего содержания жира и анализа его жирнокислотного состава представлены в табл.3.

Таблица 3. Содержание жира в мицелии гриба G.lucidum и его жирнокислотный состав

Примечание. * Разница с контролем достоверна, р <0,05

Как видно, из приведенных данных ввода в питательную среду цитратов цинка и германия вызывает почти 2-кратное повышение содержания жира в мицелии грибов. Причем, цитрат цинка обусловливает достоверно большее содержание жира в мицелии, чем его сульфат. Цитрат селена, который не стимулирует процесс жироутворення, существенно меняет жирнокислотный состав жира в сторону повышения содержания линоленовой кислоты (щ3) до 49,5% при почти полном отсутствии стеариновой - 0,13%. Значительное содержание суммы линолевой (щ6) и линоленовой (щ3) жирных кислот от 30,60% до 72,85% и олеиновой жирной кислоты до 22,79% свидетельствует о высокой биологической ценностью жира мицелия гриба G.lucidum. В целом его можно характеризовать как полноценный, что открывает перспективу для использования грибного мицелия, полученного на питательной среде, обогащенной наноцитратамы биометаллов, для коррекции жирнокислотного состава рациона.

Установлено достоверное повышение содержания полисахаридов - основного компонента углеводов грибного мицелия, во всех опытных вариантах, а также достоверно более высокое содержание полисахаридов в варианте с добавлением цитрата цинка по сравнению с его сульфатом. Полученные результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4. Содержание полисахаридов в мицелии гриба G.lucidum

Примечание. * Разница с контролем достоверна, р <0,05

При исследовании витаминного спектра мицелия гриба G.lucidum установлено, что введение в питательную среду цинка, особенно в виде его цитрата и в меньшей степени цитрата селена и цитрата германия, производит синтез витамина С. Так, для цинка имеет место 8-кратное повышение уровня его содержимому, селена-3-кратное, для германия 2-кратное (табл. 5).

Таблица 5. Характеристика витаминного спектра мицелия гриба G.lucidum

Примечание. * Разница с контролем достоверна, р <0,05

Цитраты германия и селена способствуют повышению в мицелии содержания витамина В6 в 34 раза и витамина В2 - в 2 раза. Цитрат селена эффективно стимулирует синтез ниацина (до 30-кратной величины) и витамина А (до 4-кратной величины). Цитрат германия повышает содержание витамина А в мицелии в 6 раз. В присутствии цитрата цинка отмечено, по сравнению с контролем, достоверное увеличение содержания всех исследовательских показателей витаминного спектра. Наличие в полученном грибном мицелии гриба G.lucidum витаминов антиоксидантного ряда (С и А) и селена делает перспективным создание на его основе специальных продуктов антиоксидантной направленности.

Выводы

На основании проведенных исследований и полученных результатов дана гигиеническая оценка пищевой и биологической ценности мицелия грибов, культивируемых на питательных средах с добавлением наноцитратив биoметалив и научно обоснованно оптимизацию и повышение эффективности биотехнологии культивирования грибов, способствовать получению грибной сырья с высокой пищевой и биологической ценностью в промышленных объемах более дешево и в короткие сроки.

1. Обнаружено, что наноцитраты Zn, Cu, Fe, Se и Ge способны стимулировать рост мицелия культивируемых грибов. Установлено и математически описаны закономерности накопления биомассы мицелия в зависимости от концентрации в культуральной жидкости соответствующего элемента и от времени культивирования, что позволило определить оптимальные условия культивирования грибного мицелия на питательной среде, обогащенной наноцитратамы металлов.

Показано, что интенсивность индуцирующего влияния цитратов биометаллов на рост биомассы мицелия, снижается в ряду: Zn ? Se> Ge> Fe, а чувствительность грибов к действию наноцитратив металлов - в ряду: P.ostreatus> G.lucidum> C.militaris> C. sinensis.

2. Доказано, что цитраты Zn, Cu, Fe, Ge и Se сорбируются биомассой грибного мицелия с культуральной жидкости на 2-3 порядка интенсивнее, чем их сульфаты. Наиболее активно сорбируются Fe и Ge, меньше Zn и Cu, еще меньше Se. Установлено и математически описаны закономерности их сорбции мицелием грибов и определены оптимальные концентрационные уровне металлов в питательной среде для их полной (100%) сорбции. Для Cu это от 0,1 до 0,2 мг / л, для Zn, Fe и Ge от 0,2 до 0,5 мг / л, для Se от 0,05 до 0,07 мг / л.

3. Показано в эксперименте на белых мышах высокую биодоступность Zn, который был аккумулирован биомассой мицелия грибов из питательной среды обогащенного его цитратом Zn. Содержание Zn в отличие от Fe и Cu в органах и тканях экспериментальных животных был в 1,5 - 2 раза выше содержания его в биологическом материале интактных животных.

4. Установлено, что содержание токсичных элементов Cd, Pb, Hg, As, в мицелии гриба G.lucidum при культивировании его на питательной среде с наноцитратамы этих биометаллов, был на порядок меньше предельно допустимые уровни.

5. Выявлены особенности химического состава мицелия гриба G.lucidum, культивируемого на питательной среде, обогащенной наноцитратамы Zn, Se и Ge. Показано, что наноцитраты этих биоэлементов влияют на синтезируя активность грибного мицелия. Обогащение питательной среды цитратом цинка приводило к увеличению общей массы белка на 45,5%, цитратом селена - на 36,4%. Цитрат цинка увеличивал содержание жира в мицелии на 52%, а цитрат германия - на 43%. Содержание полисахаридов в мицелии повышался при обогащении питательной среды цитратом цинка на 21%, а цитратом селена на 22%.

6. Установлено, что белок мицелия гриба G.lucidum, который выращен на питательной среде, обогащенной цитратом цинка, по своей биологической ценности существенно отличается от белков мицелия грибов, выращенных на других питательных средах, и белков высших растений: ему присущ высокий показатель аминокислотного скорую (по лимитирующей аминокислотой - лизина) - 63% и высокий индекс питательности - 13,24.

7. Определено, что цитраты эссенциальных биоэлементов (Zn, Se, Ge) повышают биологическую ценность жира мицелия гриба G.lucidum. Он характеризуется высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот (щ6 + щ3) от 30,6 до 73,0%. Цитрат германия повышает содержание линолевой жирной кислоты (щ6) почти в 2 раза. Цитрат селена меняет жирнокислотный состав жира в сторону повышения содержания линоленовой полиненасыщенных жирных кислот (щ3) до 50% при почти полном отсутствии (<0,13%) стеариновой - насыщенной жирной кислоты.

8. Доказано, что обогащение питательной среды цитратами цинка, селена и германия при культивировании гриба G.lucidum достоверно повышает в его мицелии содержание витаминов. Содержание витамина С в мицелии, полученный на среде с цитратом цинка, в 8,4 раза, а ниацина в 6 раз больше, чем в контроле. Цитраты селена и германия способствуют повышению витамина В6 до 34 - кратного уровня, витамина В2 в 2 раза, витамина А в 4 и 6 раз, соответственно, по отношению к контролю. Цитрат селена также приводит почти к 30 - кратному увеличению в мицелии ниацина (витамин РР). Одновременное присутствие в значительных количествах в грибном мицелии витаминов антиоксидантного ряда С и А свидетельствует о наличии у него антиоксидантных свойств.

9. Научно обоснована технология эффективного и безопасного культивирования мицелия съедобных и лекарственных грибов с высокой пищевой и биологической ценностью за счет использованием биогенных металлов - цитратов Zn, Se и Ge, полученных за аквананотехнологиею.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Научные работы, опубликованные в периодических изданиях:

1 Ольшевская А.Д. Функциональные продукты питания - приоритетное направление решения проблемы питания и здоровья населения Украины / А.Д. Ольшевская, А.А. Ятченко, А.В. Харченко и другие / / Гигиена населенных мест: сборник научных трудов. - Вып. 44. - М., 2004. - С. 554-559 (Сбор и обработка материала, интерпретация данных, подготовка статьи к печати).

2. Гулич М.П. Современные подходы к обогащению микронутриентами пищевых продуктов массового потребления / М.П. Гулич, А.Д. Ольшевская, А.В. Ященко и другие / / Гигиена населенных мест: сборник научных трудов. - Вып. 51. - М., 2008. - С. 318-322 (Сбор и обработка материала, участие в написании и оформлении статьи).

3. Гулич М.П. Цитрат цинка, полученный по аквананотехнологиею: химическая и биологическая характеристика (оценка химической чистоты и биологической доступности) / М.П. Гулич, Н.Л. Емченко, А.В. Ященко и другие / / Окружающая среда и здоровье. - 2011. - № 2 (58). - С. 44-49 (Анализ литературы, сбор и обработка материала, участие в написании и оформлении статьи).

4. Гулич М.П. Цитраты железа, полученные по аквананотехнологиею: химическая и биологическая характеристики (оценка химической чистоты и биодоступности) / М.П. Гулич, Емченко Н.Л., А.В. Ященко и другие / / Окружающая среда и здоровье. - 2011. - № 4 (59). С. 11-15 (Анализ литературы, сбор и обработка материала, участие в оформлении статьи).

5. Гулич М.П. Цитраты биогенных металлов - перспективный источник обогащения съедобных и лекарственных грибов минеральными веществами / М.П. Гулич, Н.А. Бисько, А.В. Ященко и другие / / Окружающая среда и здоровье. - 2012. - № 1 (60). С. 75-80 (Изучение проблемы, проведение экспериментальных исследований, сбор материала, участие в написании и оформлении статьи).

6. Гулич М.П. Проблемы дефицита минеральных веществ и возможные пути ее решения с помощью достижений нанотехнологии / М.П. Гулич, Н.Л. Емченко, А.В. Ященко и другие / / Гигиена населенных мест: сборник научных трудов. - Вып. 57. - М., 2011. - С. 290-295 (Анализ литературных источников, проведения экспериментальных исследований, участие в написании и оформлении статьи).

7. Ященко А.В. Пищевая и биологическая роль съедобных и лекарственных грибов в питании населения / А.В. Ященко / / Гигиена населенных мест: сборник научных трудов. - Вып. 59. - М., 2012. - С. 234-240 (Анализ литературных данных, сбор и обработка материала, написание и оформление статьи).

Публикации в других изданиях:

8. Гулич М.П. Обогащение пищевых продуктов микронутриентами: основные положения и принципы / П. Гулич, А.В. Ященко / / Научные труды национального университета пищевых технологий. - Часть 1, № 25. - Киев, 2008. - С. 50-52.

9. Ященко А.В. Изучение влияния порошков съедобных грибов сиитаке и ганодерма на организм крыс / А.В. Ященко / / Актуальные вопросы гигиены и экологической безопасности Украины: сборник тезисов докладов научно-практической конференции молодых ученых (пятые марзеевськи чтения, 21-22 мая 2009г., Киев). - Вып. 9. - М., 2009. - С. 142-144.

10. Гулич М.П. К вопросу об использовании достижений нанотехнологии для решения проблемы дефицита микроэлементов в питании населения / / М.П. Гулич, В.Г. Каплуненко, А.В. Ященко и др. / / Применение продуктов, напитков и БАД в профилактически-оздоровительном питания населения Украины в современных эколого-экономических условиях: материалы международной научно-практической конференции (2-6 июня 2009г., Г. Партенит, Крым). - М., 2009. - С. 5-8.

11. Гулич М.П. Основные принципы обогащения пищевых продуктов микронутриентами / М.П. Гулич, А.А. Ятченко, А.В. Ященко и другие / / Применение продуктов, напитков и БАД в профилактически-оздоровительном питания населения Украины в современных эколого-экономических условиях: материалы международной научно-практической конференции (2-6 июня 2009г., Г. Партенит, Крым). - М., 2009. - С. 3-5.

12. Ольшевская А.Д. Обоснование возможности использования сухих порошков съедобных грибов сиитаке и ганодерма в продуктах специального назначения для детей / А.Д. Ольшевская, А.В. Ященко / / Медико-экологические и социально-гигиенические проблемы сохранения здоровья детей в Украине: сборник тезисов докладов научно-практической конференции с международным участием (10-11 сентября 2009г., Киев) - К., 2009. - С. 245-247.

13. Ященко А.В. Перспективно использование лекарственных съедобных грибов в продуктах специального назначения / А.В. Ященко, А.Д. Ольшевская / / Всеукраинская конференция по вопросам безопасности питания: тезисы докладов (27-29 марта 2010г., Киев). - М., 2010. - С. 16-17.

14. Гулич М.П. Инновационная аквананотехнология получения цитрата цинка для использования в пищевой промышленности и обработки методов определения их частей / М.П. Гулич, Н.Л. Емченко, А.В. Ященко и другие / / Научные труды: материалы VI международной научно-практической конференции "Пищевые технологии-2010". - Вып. 38, том 2. - Одесса, 2010. - С. 102-105.

15. Гулич М.П. Повышение биологической ценности съедобных грибов и лекарственных грибов за счет обогащения их минерального состава нанокарбоксилатамы биогенных металлов / М.П. Гулич, Н.А. Бисько, А.В. Ященко и другие / / Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения: материалы научно-практической конференции (23-28 мая 2011 г., г. Новый Свет, Крым). - М., 2011. - С. 357-358.

16. Гулич М.П. Коррекция минерального состава съедобных и лекарственных грибов за счет обогащения их карбоксилат биогенных металлов / М.П. Гулич, Н.А. Бисько, А.В. Ященко и другие / / Актуальные вопросы гигиены и экологической безопасности Украины: сборник тезисов докладов научно-практической конференции (седьмые марзеевськи чтения, 15-16 сентября 2011 г., Киев). - Вып. 11. - М., 2011. - С. 215-116.

17. Гулич М.П. Роль цитратов биогенных металлов, полученных за аквананотехнологиею в преодолении дефицита микроэлементов / М.П. Гулич, Н.Л. Емченко, А.В. Ященко и другие / / Актуальные вопросы гигиены и экологической безопасности Украины: сборник тезисов докладов научно-практической конференции (седьмые марзеевськи чтения, 15-16 сентября 2011 г., Киев). - Вып. 11. - Киев, 2011. - С. 216-117.

18. Иванова Т.С. Влияние наноматериаллов на рост лекарственных грибов / Т.С. Иванова, Л.А. Антоненко, О. Ященко и др. / / Микробиологическая биотехнология - научное направление современных знаний: материалы международной научной конференции (6-8 июля 2011 г., г. Кишенев, Молдова). - М., 2011. - С. 167-168.

19. Гулич М.П. Наномикронутриенты, вопросы безопасности и биоетичности при производстве пищевых продуктов / М.П. Гулич, Н.Л. Емченко, А.В. Ященко и другие / / Этика нанотехнологий и нанобезопасность: международный семинар (13 октября 2011, Киев). - М., 2011. - С. 35-37.

20. Ященко А.В. Инновационные технологии выращивания съедобных и лекарственных грибов с заданным микроэлементным составом / А.В. Ященко / / Проблемы гигиены и технологии питания. Современные тенденции и перспективы развития: материалы международной научно-практической конференции (19-20 апреля 2012, Донецк). - Д., 2012. - С. 83-84.

21. Гулич М.П. Биодоступность железа, меди, цинка с мицелия грибов, выращенных с добавлением в культуральную среду наноцитратов этих биометаллов / М.П. Гулич, Н.А. Бисько, А.В. Ященко и другие / / Актуальные вопросы гигиены и экологической безопасности Украины: сборник тезисов докладов научно-практической конференции (восьмые марзеевськи чтения, 23-24 мая 2012 г., Киев). - Вып. 12. - М., 2012. - С. 200 - 201.