Различительная хемочувствительность: зоопсихологический подход

Размещено на http://www.allbest.ru/

на правах рукописи

специальность 19.00.01 - общая психология, психология личности, история психологии

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата психологических наук

РАЗЛИЧИТЕЛЬНАЯ ХЕМОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ: ЗООПСИХОЛОГИЧЕСКИЙ ПОДХОД

Селиванова Л.А.

МОСКВА - 2007

Работа выполнена в лаборатории поведения низших позвоночных Института проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова Российской Академии Наук

Научные руководители: кандидат психологических наук Скотникова И.Г. доктор биологических наук Моисеева Л.А.

Официальные оппоненты: доктор психологических наук, профессор Гусев А.Н. кандидат психологических наук Гаврилов В.В.

Ведущая организация: Московский Гуманитарный Университет

Защита состоится “_4_”_октября___________2007 г. в _11__ часов

на заседании диссертационного совета Д 002.016.02 при Институте психологии РАН по адресу: 129366, г. Москва, ул. Ярославская, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института психологии РАН

Автореферат разослан “__”_____________________ 2007 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат психологических наук, доцент Т.Н.Савченко

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы исследования.

Зоопсихология является теоретически принципиально важным, базовым разделом общей психологии, реализующим генетический исследовательский подход как один из ведущих в психологии. Познать природу сложнейших по своему содержанию психических явлений невозможно без изучения их форм, которые филогенетически предшествовали в ходе эволюции в животном мире, а также развивались в индивидуальном онтогенезе.

В настоящее время в отечественной зоопсихологии, как и ранее, изучается ориентировочно-исследовательское, брачное и родительское поведение; научение, интеллект и язык животных; игра, коммуникация, миграции, тогда как практически нет исследований базового уровня психики - чувствительности. В отличие от этого чувствительность животных активно изучается за рубежом, причем наиболее методически корректно - в области психофизики (Animal Psychophysics) с ее развитой методологией и богатым арсеналом экспериментальных измерительных процедур. Однако среди этих работ мало исследований различительной хемочувствительности (при ощущении и восприятии химических веществ), к тому же они ведутся главным образом у человека и некоторых наземных позвоночных, т. е. у обитателей воздушной среды и суши (террабионтов). В то же время, 3 из 7-ми классов и половина (более 20-ти тысяч!) современных видов позвоночных - это рыбообразные и рыбы: обитатели водной среды (гидробионты). Исследования психики и поведения рыб имеют давнюю традицию в отечественной науке (с 1928 г.). К.Э. Фабри (1988) разработал основы «ихтиопсихологии» и обосновал необходимость изучения у рыб порогов восприятия ключевых стимулов и роли мотивационных состояний в отношении рыб к этим стимулам.

Хемочувствительность - ведущая сенсорная модальность у многих видов и семейств рыб, т.к. лежит в основе большинства форм их поведения: пищевого, оборонительного, репродуктивного, родительского, ориентации при нерестовых миграциях. Для управления этими видами поведения промысловых рыб с помощью химических стимулов необходимо знание закономерностей их хемочувствительности. Однако такие исследования велись в основном в русле ихтиологии, реже - физиологии, где психофизическая методология использовалась недостаточно. В частности, не учитывалось фоновое содержание стимулов в природной воде, что необходимо для оценки относительного дифференциального порога, позволяющей сравнивать различительную чувствительность не к одной, а к любой величине изучаемого сенсорного признака (Бардин, 1976). Биологически значимые для рыб вещества присутствуют в природной воде, и рыбы ориентируются в изменениях их концентраций на основе своей дифференциальной чувствительности. Однако ее измерения методически сложно и потому почти не проводились. Единичные данные о дифференциальных порогах у заранее обученных рыб не отражают функциональные закономерности чувствительности и не характеризуют природную способность необученных рыб различать химические стимулы по интенсивности. Поэтому нужен адекватный и результативный подход для определения дифференциальной хемочувствительности рыб.

В условиях рыбоводных заводов рыбы наряду с естественным получают также искусственный корм. Он готовится, исходя из физиологических потребностей рыб, но зачастую «не вкусен» и отвергается ими. Поэтому практически необходимо исследовать компонентный состав пищевых стимулов, выделить их «ключевые» компоненты и изучить пределы способности рыб распознавать близкие по качеству компоненты.

Таким образом, изучение различительной хемочувствительности рыб теоретически, практически и методически актуально.

Объект исследования - поведенческая активность наивной молоди рыб (русского осетра) в ответ на изменение количества или качества химического стимула.

Предмет исследования - психофизическая составляющая хемочувствительности рыб: дифференциальная чувствительность и способность различать разные вещества одинаковой концентрации.

Цель исследования - определить пределы природной способности рыб (на примере молоди осетра) различать химические стимулы сходного качества или концентрации и выяснить, как параметры чувствительности соотносятся с фоновой концентрацией стимулов.

Задачи исследования:

- определить состояние проблемы путём анализа литературных данных;

найти методический подход для исследования различительной хемочувствительности рыб в условиях, приближенных к природным;

определить у наивной молоди осетра дифференциальные пороги для отдельных биологически значимых аминокислот и многокомпонентных химических стимулов в широком диапазоне фоновых концентраций;

определить содержание свободных аминокислот (САК) в волжской воде, используемой в качестве естественного фона при тестировании молоди осетра, и сопоставить эти результаты с параметрами хемочувствительности рыб;

выяснить способность наивной молоди русского осетра распознавать на поведенческом уровне биологически значимые вещества (аминокислоты), идентичные по элементному составу, но различающиеся по структуре и химическим свойствам (структурные изомеры) или физическим свойствам (оптические изомеры);

проследить у наивной молоди русского осетра становление в раннем онтогенезе специфических поведенческих реакций на предъявление отдельных соединений и многокомпонентных химических стимулов в стандартной концентрации и выявить возрастной диапазон, в котором эти реакции стабильны по проявлению;

выяснить зависимость знаков специфических реакций молоди на отдельные химические стимулы в стандартной концентрации от уровня пищевой мотивации;

провести сравнение результатов, полученных при изучении хемочувствительности водных позвоночных (рыб) с хемочувствительностью наземных позвоночных, включая человека.

Гипотезы исследования:

- для наземных позвоночных связь дифференциальной чувствительности с кратковременным адаптирующим фоном известна и описывается формулой (законом) Вебера, можно предполагать, что этот закон верен и для рыб (водных позвоночных);

- для разных видов морских рыб существует зависимость между спектральной характеристикой зрительных пигментов палочек и спектральным составом света в местах обитания этих рыб (Wald, 1960; Протасов, 1960, 1961, 1978), а для каждого вида «электрических» рыб существует корреляция между порогами электрочувствительности и диапазонами излучения сигнала (Барон, 1982); это позволяет предполагать аналогичную связь между параметрами хемочувствительности рыб и природной (долговременной адаптирующей) фоновой концентрацией химических стимулов;

- в электрофизиологических опытах у разных видов рыб и беспозвоночных гидробионтов обнаружены разные реакции на структурные и оптические изомеры отдельных аминокислот («различение» на сенсорном уровне), можно ожидать, что рыбы способны различать эти изомеры и на поведенческом уровне.

Методологической основой исследования являются:

Междисциплинарный подход, который заключается в комплексном исследовании проблемы с использованием методов классической психофизики, зоопсихологии и аналитической гидрохимии.

Зоопсихологический подход, основными принципами которого являются:

1) адаптация приёмов воздействия на животных к их природным способностям и особенностям образа жизни и 2) адекватность, «экологичность» применяемых стимулов (Фабри, 1988).

Подопытные животные: молодь русского осетра с момента вылупления до возраста 100 дней - 15000 особей.

Методы исследования включали: психофизический «метод постоянных стимулов», метод «привыкание-различение», применяемый в когнитивной психологии и этологии, используемые в аналитической гидрохимии метод обессоливания проб воды с применением кислых катионитов и метод ионообменной хроматографии аминокислот.

Этапы исследования.

На первом этапе анализировалось современное состояние проблемы, ставились цели и задачи исследования, выбирались методические подходы, разрабатывались и отлаживались оригинальные экспериментальные методики исследования, проводились экспериментальные исследования служебного назначения, а именно: выявление зависимости знака поведенческой реакции молоди рыб на широкий спектр химических стимулов от возраста и уровня пищевой мотивации; определение пула САК природной волжской воды в районе проведения экспериментов с молодью осетра.

На втором этапе проводилось экспериментальное исследование различительной хемочувствительности (способности к распознаванию веществ предельно близкого качества и дифференциальной хемочувствительности) рыб, проводился анализ полученных результатов и их сопоставление с результатами первого этапа исследования.

Надёжность и достоверность результатов обеспечивалась адекватным выбором и детальным освоением используемых методов, тщательным планированием и организацией экспериментов, контролем условий их проведения, повторным проведением тестовых серий и отбора проб воды в разные сезоны работы, использованием надёжных статистических критериев для оценки значимости результатов и апробацией результатов работы.

Научная новизна исследования:

впервые определена дифференциальная чувствительность (дифференциальные пороги для специфических поведенческих реакций в широком диапазоне фоновых концентраций стимулов) водных животных к биологически значимым для них стимулам: к аминокислотам разных химических типов и к многокомпонентным химическим стимулам, на основе чего установлено проявление закона Вебера и его форма применительно к хемочувствительности рыб;

впервые показана способность водных животных на поведенческом уровне различать аминокислоты, идентичные по элементному составу, но различающиеся по структуре (и химическим свойствам) или только по физическим свойствам;

выявлены положительные корреляции между параметрами хемочувствительности рыб и природными фоновыми концентрациями САК. Это позволило впервые сформулировать тезис об экологической обусловленности хемочувствительности рыб;

обнаружена сенсибилизация хемосенсорных систем молоди русского осетра к некоторым ординарным и многокомпонентным стимулам, имеющим концентрацию, подпороговую для специфической реакции, когда они предъявляются на фоне более высокой концентрации одноименного стимула;

впервые обнаружены реакции привлечения - избегания на целый ряд биологически значимых химических стимулов у предличинок («свободных эмбрионов») русского осетра, т.е. не перешедшей на активное внешнее питание молоди; прослежено становление в раннем онтогенезе русского осетра реакций на широкий спектр ординарных и многокомпонентных стимулов (на многие из них впервые);

у русского осетра впервые показана зависимость от уровня пищевой мотивации знаков и/или интенсивности специфических реакций на отдельные стимулы.

Теоретическое значение работы. Полученный экспериментальный материал позволил обнаружить «врождённое узнавание» рыбами некоторых биологически значимых химических стимулов, установить, какие из этих стимулов имеют для молоди рыб пищевое сигнальное значение, установить природную способность рыб на поведенческом уровне различать очень близкие по качеству или концентрации химические стимулы, на примере рыб показать применимость фундаментального закона Вебера к дифференциальной хемочувствительности гидробионтов, выявить экологическую обусловленность хемочувствительности рыб к биологически значимым веществам (аминокислотам), что дополняет известные ранее данные об экологической обусловленности чувствительности человека и животных к стимулам физической природы.

Практическое значение работы

При необходимости управления поведением рыб с помощью химических стимулов установленная высокая способность рыб различать их может служить ориентиром для выбора стимулов нужного качества, а данные о дифференциальной хемочувствительности рыб могут служить основой для расчёта оптимальной концентрации и режима подачи этих стимулов и в качестве информации могут служить гидрохимикам. Результаты исследований по становлению в раннем онтогенезе реакций молоди русского осетра на комплексные пищевые, внутри- и межвидовые химические стимулы, а также на их отдельные компоненты могут быть использованы в рыбоводной практике, напр., для повышения привлекательности искусственного корма, для оптимизации сроков выпуска молоди в реку и т.д. Отработанная схема подготовки проб пресной и слабосолёной воды к аминокислотному анализу может быть использована при решении аналогичных гидрохимических задач. Данные о пуле (качественно-количественном составе) свободных аминокислот волжской воды по сей день уникальны в мировой литературе.

Положения, выносимые на защиту:

- различительная хемочувствительность человека и позвоночных животных независимо от

воздушной или водной среды обитания подчиняется общим закономерностям и

характеризуется одинаковым пределом распознавания, однако дифференциальная

хемочувствительность рыб выше таковой наземных млекопитающих на 1-2 порядка;

у молоди осетра дифференциальные пороги для прибавления и уменьшения отдельных аминокислот при большинстве используемых фонов составляют 0.1% от фона, а для прибавления многокомпонентных стимулов - 1% от фона, т. е. различимость ординарных химических стимулов на порядок выше, чем многокомпонентных; для различения молодью отдельных аминокислот и многокомпонентных стимулов существуют диапазоны фоновых концентраций, где выполняется закон Вебера: lg(?C/C)=const;

чувствительность рыб к природным химическим стимулам экологически обусловлена;

наивные мальки русского осетра способны на поведенческом уровне различать структурные изомеры аминокислот, а также химически неразличимые стереоизомеры аминокислот.

Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на:

1. 3-ем Всесоюзном совещании по химической коммуникации животных (Москва, 1988).

2. Всесоюзном совещании "Поведение рыб" (Звенигород, 1989).

3. 2-м Всероссийском совещании "Поведение рыб" (Борок, 1996).

4. Симпозиуме «Проблемы эволюционной психологии» 5-ой Всероссийской конференции РПО «Психология и её приложения» (Москва, 2002).

5. Симпозиуме “Psychophysics, perception and action” of the 18th Annual Meeting of the International Society for Psychophysics, “Fechner Day'2002” (Rio de Janeiro, Brazil, 2002).

6. Секции «Инженерно-технические решения в психологии» 7-го Всероссийского научно-технического Совещания-семинара «Инженерно-физические проблемы новой техники» (Москва, 2003).

7. Симпозиуме «Современное состояние психофизики в России» 3-го Всероссийского съезда РПО (Санкт-Петербург, 2003).

8. 19-ом съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004).

9. Научной конференции «Психофизика сегодня», посвящённой 100-летнему юбилею С.С. Стивенса и 35-летию ИП РАН (Москва, 2006).

10. Коллоквиумах лаборатории поведения низших позвоночных, лаборатории сравнительной нейробиологии позвоночных, лаборатории экологии, поведения и морфологии высших позвоночных и группы поведения и поведенческой экологии наземных млекопитающих ИПЭЭ им. А.Н. Северцова РАН, 1985-2006.

11. Юбилейных научных чтениях, посвящённых 80-летию Б.Ф.Ломова, ИП РАН, 2007.

12. Расширенном заседании лаборатории системных исследований психики, с участием лаборатории нейрофизиологичеких основ психики ИП РАН, 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х основных глав, заключения, выводов и библиографии, и содержит 13 таблиц.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность темы исследования; определяются его объект и предмет; формулируются цель и задачи; излагаются методологические основы и методы исследования; определяются положения, выносимые на защиту, научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы.

В первой главе - «Методические подходы и методики исследования» - проведён анализ литературы о методах и методиках, применяемых при исследовании различительной хемочувствительности гидробионтов и химического состава их среды обитания, и приводятся собственные методики экспериментального исследования.

В теоретическом разделе впервые проведены систематизация и анализ методов и методик, применяющихся авторами работ, в которых изучается абсолютная и дифференциальная хемочувствительность и/или способность к распознаванию (различению веществ одинаковой концентрации, но разного качества).

Способности к распознаванию и различению химических веществ изучаются как у обученных, так и у наивных (не подвергавшихся обучению) животных. Используются активные (через выработку условных рефлексов) и пассивные (путём длительного выдерживания, т.е. экспонирования животных в воде, отличающейся от природной по химическому составу) формы обучения. Для исследования различительной хемочувствительности применяется поведенческий метод парного (или множественного) выбора и электрофизиологический метод (регистрация активности проводящих путей или нервных центров хемосенсорных систем, регистрация сердечного ритма или частоты дыхания). Парный выбор - вполне адекватный метод для исследования различительной способности. С его помощью показано, что рыбы и другие гидробионты (беспозвоночные животные и головастики амфибий) успешно различают, например, запахи индивидов.

В большинстве работ прямым показателем чувствительности считается пороговая концентрация стимула. Если речь идёт об искусственном веществе, отсутствующем в природной фоновой воде, или, если в качестве фона используется искусственная вода (морская, речная, прудовая), не содержащая тестового вещества, то измеренная пороговая концентрация является нижним абсолютным порогом и отражает абсолютную чувствительность к этому веществу. Однако в подавляющем большинстве работ в качестве фона используется природная вода, где такие традиционные тестовые вещества как аминокислоты содержатся во вполне ощутимых концентрациях. В таком случае можно говорить только о разностном пороге, но для его определения нужно знать концентрацию тестового вещества в фоновой воде, а вот этого практически никто не учитывает. В результате измеренные пороговые концентрации становятся данными, «повисающими в воздухе». Но даже при учёте фоновой концентрации, когда можно определить разностный порог как разницу между пороговой и фоновой концентрациями, или при непосредственном определении разностного порога методом парного выбора (при одновременном предъявлении разных концентраций одного вещества), в нашем распоряжении оказываются единичные данные, не отражающие закономерностей дифференциальной чувствительности. Четверть века назад, когда предпринималась попытка определить дифференциальную чувствительность обученной трески к простейшей аминокислоте глицину (Johnstone, 1980), автор, не имея возможности использовать искусственную воду и учитывая естественную фоновую концентрацию глицина, создавал длительно действующие искусственные фоны, перекрывавшие естественную концентрацию глицина на 3-4 порядка. В таких условиях относительные дифференциальные пороги, измеренные по изменению частоты сердечных сокращений, для глицина при разных фоновых концентрациях составили 50-90%, что явно не соответствует практическим наблюдениям за чувствительностью рыб и указывает на методическую ошибку. При определении электрофизиологическим методом дифференциальных порогов для ионов хлора у обученных карпов (Сергеева, 1975), автор использовала для приготовления искусственного фона лишённую ионов хлора воду и создавала фоновую концентрации ионов хлора, сравнимую с естественной. В этих условиях относительные дифференциальные пороги для прибавок хлора составили 0.33-6.66%, и этот результат уже более соответствует наблюдениям. Поскольку для исследования дифференциальной чувствительности необходимо использовать искусственные фоны разных концентраций, в том числе и более высоких, чем естественная, нужно найти способ минимизировать отрицательное влияние длительного действия высоких фоновых концентраций. Пока такой способ не найден, и других попыток определить дифференциальную чувствительность гидробионтов к химическим стимулам не предпринималось. В более ранних работах по определению способности рыб различать потоки разной «солёности» или потоки с разной концентрацией пищевого экстракта (определялись разностные пороги) успешно использовался метод парного выбора (Bull, 1928, 1930, 1952). Однако парный выбор основан на реакции предпочтения одного из стимулов в паре. Необученные рыбы могут предпочитать химические стимулы какого-то качества, во время хода на нерест проходные рыбы без обучения проявляют предпочтение к более пресной воде, то есть различают потоки по количественному параметру, но это единичные примеры. В большинстве случаев предпочтение у рыб вырабатывается путём обучения, то есть метод парного выбора не годится для исследования природной способности различать химические стимулы разного качества или разной концентрации.

Косвенным показателем чувствительности у биологов считается «относительная стимуляторная эффективность» (RSE) химического стимула. Предъявляется ряд веществ в одинаковой концентрации, чаще всего 1 или 0.1 мМ. Регистрируется какая-либо поведенческая реакция, напр., частота поклёвок (компонент паттерна пищевой реакции) или электрофизиологическая реакция, например, частота разрядов от обонятельного нерва или тракта, и предъявленный ряд веществ ранжируется по величине регистрируемого параметра. Вопрос в том, как толковать этот ранжированный ряд. Если при предъявлении веществ использовалась свободная от них искусственная вода, то этот ряд действительно отражает сравнительную чувствительность животных к предъявленным веществам. Но если фоном служит природная вода, в которой, например, отдельные аминокислоты содержатся в концентрациях, различающихся на несколько порядков, то и величины прибавок столь же не одинаковы, а значит, для сравнения нет единой точки отсчёта и нет оснований строить такой ранжированный ряд для аминокислот.

Анализ опубликованных работ показал, что ни чёткого понимания чувствительности в количественном (психофизическом) смысле, ни простой и отлаженной методики для определения различительной хемочувствительности необученных рыб у этологов нет. В заключительной части раздела рассматриваются такие детали методик как использование групп животных при исследовании их чувствительности или способности к распознаванию, применяемые виды схем (экспериментальных протоколов) опытов, статистические критерии, используемые для оценки достоверности результатов.

В следующем разделе главы детально описывается устройство лотков, в которых с момента вылупления на протяжении всего экспериментального периода жили и тестировались группы рыб (молодь русского осетра), численный состав этих групп в разные возрастные периоды, параметры протока, режим кормления и диета, а также возрастные особенности поведения молоди осетра, с учётом которых построена наша методика тестирования.

Применяемая в данной работе оригинальная методика тестирования и обработки данных представляет собой сплав психофизического «метода постоянных стимулов» (версия Б.В. Солухи (1989), адаптированная им к задачам исследования хемочувствительности гидробионтов) и метода «привыкания - различения» (“habituation-discrimination test'). Последний широко используется при исследовании способности распознавать зрительные стимулы у младенцев (Bornstein et al., 1976; Burnham & Day, 1979; Burnham & Dickinson, 1981; Kellman & Spelke, 1983; Kaufman-Hayoz et al., 1986; Streri & Pecheux, 1986; Baillargeon, 1987, 1991; Colombo & Mitchell, 1988; Malouit et al., 1988) и химические стимулы - у наземных млекопитающих (Schultze-Westrum, 1969; Halpin, 1974, 1986; Harrington, 1976; Heth & Todrank, 2000; Linster et al., 2001; Литвинова, Васильева, 2005; Карасёва, Васильева, 2005), а также для выявления способности распознавать фонемы у младенцев (Dehaene-Lambertz & Dehaene, 1994) и акустические стимулы разного сигнального значения - у обезьян (Сифарт, Чини, 1993). Оба метода хорошо известны, но совместно ранее не применялись, а метод «привыкание-различение» ранее не использовался для изучения дифференциальной чувствительности.

Метод «привыкание-различение» основан на феномене угасания ориентировочно-исследовательской реакции на неоднократно последовательно предъявляемый стимул («фаза привыкания») и её восстановлении на новый, чем-либо (качеством или концентрацией) отличающийся от предыдущего, стимул («фаза различения»).

В нашей методике использованы два типа предъявления стимулов: тип “одинаковые” - последовательное предъявление двух одинаковых порций одного и того же стимула “А” и тип “разные” - последовательное предъявлением одинаковых порций двух разных стимулов “А” и “Б”. Стимулы “А” и “Б” отличаются либо по качеству, либо по концентрации. В одном экспериментальном цикле (за один рабочий сезон) для каждой пары стимулов сделано по 6 предъявлений типа “одинаковые” и “разные” (по 2 на каждом из 3-х лотков с рыбами). С каждой парой стимулов проведено по 2-4 таких цикла.

Для решения поставленных задач рыбам предъявляли различные биологически значимые для них химические стимулы, а именно: 12 отдельных АК разных химических типов и изомерии и 5 многокомпонентных природных стимулов (спиртово-водных экстрактов из пищевого и внутривидового источников химических сигналов).

При изучении распознавания предъявлялось 5 качественно разных стимулов - изомеры двух АК (аланина и тирозина) в эквимолярной (одинаковой и выраженной в молях) концентрации, равной 10-4 М. Качественно близкие аминокислоты предъявлялись попарно в прямом и обратном порядке (всего 6 пар).

2) При измерении дифференциальных порогов (ДП) для природного фона предъявлялись 9 качественно разных АК. Для каждой из АК заранее была определена её концентрация в природном фоне и относительно этого фона был выбран диапазон изменения концентрации данного стимула. Верхняя граница диапазона всегда составляла 10-4 М, что было явно отличимо от природного фона для всех АК. Нижняя граница диапазона для каждой АК была на 3-4 порядка ниже природной фоновой концентрации. Таким образом, для разных АК предъявлялось от 9-ти до 13-ти градаций (констант) этого стимула с шагом в 1 порядок.

3) При измерении ДП для искусственных фонов в качестве таковых предъявлялись 5 АК, а также 2 многокомпонентных стимула разной концентрации в диапазоне, симметричном относительно природного фона (вверх и вниз на 3-4 порядка). Одноимённые стимулы предъявлялись в виде прибавлений к фону или уменьшений, величина которых составляла от 0.01% (реже - 0.001%) до 10% от фона. Таким способом стимулы подавались в 4-х (реже - 5-ти) их концентрациях (константах) с шагом в 1 порядок. По отношению к фонам определялись ДП.

В течение каждого экспериментального дня проводилось три блока опытов (утром, днём и вечером). В каждом блоке предъявлялось по 5-6 пар разных стимулов типа “одинаковые”. Каждой из них соответствовала пара стимулов типа “разные”. Опыты по качественному распознаванию стимулов и по измерению ДП на природном и искусственном фонах чередовались в случайном порядке. Каждое предъявление стимула осуществлялось непрерывно и равномерно в течение 150 секунд, вслед за ним без перерыва тем же порядком осуществлялось предъявление второго стимула в паре (того же - в паре “одинаковые” или другого - в паре “разные”). За эти 150 секунд экспериментатор проводил по 50 3-секундных наблюдений, во время которых подсчитывалось число рыб в тестовой зоне лотка. Таким образом, каждое предъявление включало 50 проб, а пара предъявлений - 100 проб. Каждый блок состоял из 1000-1200 проб, а экспериментальный день - из 3000-3600 проб. Экспериментальный цикл (сезон) включал 60 экспериментальных дней, то есть 180.000-216.000 проб, а 4 экспериментальных цикла (сезона) включали 720.000-864.000 проб. Это составило весь объём измерений по основным задачам работы.

В качестве ответной реакции регистрировалось число рыб в фиксированной по форме и размерам тестовой зоне у места подачи стимула в экспериментальный лоток. На протяжении 150-ти секунд каждая рыба пересекает тестовую зону, то есть встречается с поступающим в лоток стимулом в его исходной концентрации от 3-х до 5-ти раз. При первой встрече с данным стимулом рыбы прерывают равномерное движение по периметру лотка и на некоторое время задерживаются в тестовой зоне, за счёт чего плотность скопления рыб в тестовой зоне становится выше обычной. При втором и последующих заходах в тестовую зону на протяжении интервала подачи одного и того же стимула задержки рыб в тестовой зоне становятся короче, а плотность скопления, соответственно, плавно снижается. В предъявлении типа “одинаковые” снижение плотности скопления рыб в тестовой зоне продолжается и на 2-ом интервале подачи того же стимула. В таком случае повторное увеличение числа рыб в тестовой зоне на 2-ом интервале предъявления типа “разные” служило показателем того, что стимулы “А” и “Б” различались.

Протоколы велись отдельно для каждого предъявления, первичные данные обрабатывались статистическими методами с использованием критерия Неймана-Пирсона для избежания ошибок «ложной тревоги». По результатам обработки первичных данных определялся знак реакции: «+» - привлечение, «-» - избегание, «>» и «<» - не ориентированное относительно источника стимула увеличение и уменьшение двигательной активности соответственно. Также определялся показатель эффективности действия стимула (или интенсивности проявления реакции). Достоверность отличия реакции на стимул от реакции на эталон сравнения определялась по двум непараметрическим критериям: Колмогорова-Смирнова () и знаков. Специфическими считались реакции, достоверные по обоим критериям (p<0.05).

При установлении связи различительной хемочувствительности с природным фоном использовался параметрический коэффициент линейной корреляции rxy Пирсона.

Междисциплинарный подход предполагает уверенное владение методами смежных наук. В данном случае это методы аналитической гидрохимии аминокислот. Здесь нужно оговорить следующий момент: общепринятых методов количественного определения аминокислот в природных водах и способов экстракции аминокислот из природных материалов нет, и в литературе нет обзоров на эти темы.

В первой части раздела, посвящённого гидрохимии САК подробно рассматриваются применяемые в аналитической гидрохимии способы отбора и хранения проб воды, методики предварительной подготовки проб к анализу и методы анализа подготовленных проб. Приводимые сведения необходимы для обоснованного выбора простой, надёжной и соответствующей техническим возможностям собственной методики исследования.

Во второй части этого раздела различные способы экстракции аминокислот из природного материала сопоставляются между собой с целью выбрать такой из них, который позволяет изготавливать применяемые для тестирования рыб экстракты, хранящиеся длительное время в неизменном качественно-количественном составе и совпадающие по этому составу с «природными вытяжками». Таким требованиям отвечают спиртово-водные экстракты с содержанием этилового спирта в экстрагирующем растворе 70-80%.

В разделе, посвящённом собственной методике количественного определения свободных аминокислот в волжской воде, приводится подробная схема подготовки проб природной воды к анализу, включая обессоливание. Эта схема является результатом объединения и модификации методик, описанных ранее (Дегенс и Ройтер, 1967; Lazarus, 1973; Dawson & Pritchard, 1978; Kvenvolden et al., 1979). Анализ подготовленных проб проводился методом ионообменной хроматографии на автоматических аминокислотных анализаторах разных марок по стандартным программам анализа белковых гидролизатов или физиологических жидкостей. Для надёжности анализ каждого вида проб повторялся не менее 3-х раз.

Во второй главе - «Первый этап исследования. Зависимость поведенческих реакций молоди рыб от возраста и уровня пищевой мотивации. Аминокислотный пул волжской воды» - дан анализ литературы об отношение необученной молоди осетровых рыб к природным химическим стимулам и о содержании аминокислот в природных водах и вслед за тем приведены результаты собственного экспериментального исследования.

На первом этапе проводились исследования, результатам которых отводилась служебная роль. Используя в качестве критерия распознавания/различения знак реакции, нужно гарантировать, что его изменение отражает реакцию на изменение именно качества или концентрации предъявляемого химического стимула. Такую гарантию даёт стабильность знака и интенсивности проявления реакции на стандартную концентрацию данного вида стимула на протяжении всего периода тестирования. Знак реакции, характеризующий отношение молоди к данному виду химического стимула может меняться по мере роста и развития молоди, а также от её мотивационного состояния. Поскольку мальки осетра хорошо защищены от хищника рядами костных выростов («жучек») на поверхности кожи, защитная мотивация у них практически не выражена и ведущей мотивацией является пищевая. Поэтому на первом этапе работы определялось отношение (знаки реакций) молоди к различным химическим стимулам в стандартной концентрации и зависимость знаков реакции от возраста молоди и уровня её пищевой мотивации.

В первом теоретическом разделе главы рассмотрены работы, в которых определялось отношение (привлечение, избегание или безразличие) молоди разных возрастов и разных видов осетровых рыб к многокомпонентным пищевым, внутри- и межвидовым химическим стимулам или к их отдельным компонентам, в том числе к аминокислотам. Данные разных работ весьма противоречивы и в плане сроков появления первых реакций и возраста молоди, с которого реакции на те или иные стимулы становятся стабильными по знаку и интенсивности, и в плане отношения (знака реакции) к отдельным соединениям. Поэтому до начала исследования различительной хемочувствительности молоди осетра было необходимо: 1) определить знаки и интенсивность реакций молоди на широкий спектр химических стимулов при стандартной концентрации (1 или 0.1 мМ для отдельных соединений и 0.1 г/л для экстрактов); 2) определить возраст молоди, при котором эти параметры реакций стабильны и 3) проверить зависимость этих параметров реакций от уровня пищевой мотивации рыб (сравнить реакции голодной и сытой молоди).

В разделе, посвящённом становлению в раннем онтогенезе молоди осетра реакций на отдельные аминокислоты и многокомпонентные химические стимулы приведены результаты экспериментов, показавшие, что в возрасте 41-100 дней от момента вылупления, реакции молоди осетра на все предъявленные стимулы (26 наименований) в стандартных условиях (стандартные концентрации стимулов, голодные особи) стабильны по знаку и интенсивности, т. е. это оптимальный возраст молоди для исследования её различительной хемочувствительности. Кроме того, обнаружено, что уже предличинки, т.е. особи, еще не перешедшие на внешнее питание и живущие за счёт желтка, на большинство из предъявленных стимулов проявляют специфическую локомоторную реакцию привлечения или избегания. Причём на некоторые аминокислоты, органические лимонную и уксусную кислоты и многокомпонентный экстракт из тел пораненных мальков осетра реакции устанавливаются (стабилизируются по знаку и интенсивности), начиная с предличиночного периода. Появление специфической реакции к пищевым веществам предвосхищает и появление потребности в пище, и пищевой опыт. К.Э. Фабри (1976) относил подобные явления к «врождённому узнаванию».

Результаты серии опытов по тестированию сытых (получавших корм непосредственно до и на протяжении тестирования) и голодных (получавших корм обычным порядком, т.е. только после тестирования) особей молоди осетра показали, что на большинство из предъявленных стимулов (аминокислоты, пептиды, глюкоза и различные виды экстрактов) знак и интенсивность реакции зависят от уровня пищевой мотивации: для «сытых» особей эти стимулы теряют или снижают свою привлекательность. Поэтому далее все опыта проводились только с голодными особями. Отдельный интерес представляет тот факт, что некоторые аминокислоты не теряют свою привлекательность для сытых особей. Это может означать, что такие аминокислоты служат для рыб не только или не столько пищевыми сигналами. По результатам этой серии опытов, к числу пищевых сигналов для молоди осетра можно отнести следующие аминокислоты: L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, D-тирозин (но не D,L-тирозин!) и - с большой долей вероятности - L-б-аланин.

Следующий раздел главы представляет собой подробный анализ литературных данных по пулам (качественно-количественному составу) свободных аминокислот (САК) в морских и пресных водах в различных регионах земли, в разные сезоны и разное время суток. Подобного аналитического обзора в литературе нет, а необходимость его для данной работы определялась тем, что в настоящее время нет технических возможностей для одновременного мониторинга пула САК и тестирования рыб. Поэтому нужно было понять, правомерно ли сопоставлять данные о пуле САК и результаты тестирования, полученные в разные годы. Анализ литературных данных показал, в частности, специфичность и временную стабильность пула САК природной воды для каждого конкретного региона. Это обстоятельство предполагает, во-первых, необходимость определять пул САК (желательно повторно в течение 2-3-х сезонов) именно в том регионе и в те сезоны и время суток (светлое), где и когда будет проводиться тестирование рыб и, во-вторых, возможность на протяжении нескольких лет без большой погрешности пользоваться результатами анализа пула САК при исследовании чувствительности рыб к АК в этом регионе, в эти же сезоны и время суток. осетр аминокислота стимул поведенческий

В разделе, посвящённом содержанию САК в волжской воде, питающей осетровые рыбоводные заводы, расположенные по течению ниже города Астрахань, приведены результаты анализа пулов САК в пробах воды, отобранных в различных участках рукавов Волги, а также в районе заводского водозабора и заводских водоёмов. Этот материал даёт достаточное представление о пуле САК природной волжской воды, которая для подопытных рыб является постоянным естественным адаптирующим фоном. В весенне-летний период суммарная концентрация САК составляет примерно 300 нМ (1 нМ = 10-9 М), а концентрация отдельных аминокислот лежит в диапазоне от долей (пролин, метионин, тирозин и фенилаланин) до нескольких десятков нМ (треонин, серин, глицин и аланин). Кроме того, в отдельных опытах было установлено, что молодь осетра выделяет в воду в среднем 402 мкМ САК на кг массы в час, и эта естественная прибавка САК к фону вполне сопоставима по величине с искусственной прибавкой, которая осуществляется при предъявлении тестовых растворов аминокислот. Отслеживать динамику концентраций САК во всём объёме лотка невозможно, и это обстоятельство добавляет ещё один аргумент в пользу выбора зоны для регистрации локомоторной активности рыб именно в зоне втока, куда стимул поступает практически неразбавленным, в подаваемой концентрации.

В третьей главе - «Второй этап исследования. Различительная хемочувствительность рыб» - как и в двух предыдущих, тематические обзоры предваряют разделы с результатами собственного экспериментального исследования. В водной части главы приведены сведения о доле «химической психофизики» (2%) в общем объёме психофизических исследований, о научных периодических изданиях, о международных научных организациях и проводимых ими конференциях, а также о ведущих специалистах в этой области.

В разделе, посвящённом анализу литературных данных по различительной хемочувствительности человека и наземных позвоночных животных определена основная тематика проводимых в мире исследований: различение стимулов по качеству, восприятие смесей и их ингредиентов, память на запахи в норме и патологии и - главным образом - работы прикладного характера. Имеются данные, позволяющие сравнивать различительную хемочувствительность человека и животных, обитателей воды и суши. Например, пределы различительной хемочувствительности для обитателей воздушной среды следующие: человек и необученные крысы распознают энантиомеры (оптические изомеры) летучих соединений, а относительные дифференциальные пороги (ОДП) к различным запахам у человека и обученных крыс и собак составляют, соответственно 5%, 4.1% и 3.3%.

В следующем разделе, посвящённом способность гидробионтов распознавать качественно разные химическим стимулы, рассматриваются работы, в которых показано, что обученные рыбы, амфибии и головоногие моллюски (осьминоги) хорошо распознают как многокомпонентные химические стимулы, так и отдельные соединения. Наряду с этим существуют многочисленные данные о том, что природная способность рыб к распознаванию по качеству многокомпонентных химических стимулов и отдельных соединений с лихвой превосходит способность к распознаванию, приобретаемую в результате обучения. Если говорить о пределах распознавания веществ, то в ряде исследований было показано, что наивные рыбы в условиях электрофизиологических опытов с помощью обоняния, вкуса или тригеминальной системы (кожных хеморецепторов) чётко распознают и структурные изомеры синтетического вещества ионона (Doving, 1966), и стереоизомеры отдельных природных аминокислот (MacLeod, 1976; Caprio, 1978; Малюкина и др., 1990; Kohbara et al., 1992; Caprio et al., 1993).

Психическое отражение не тождественно физиологическому, и «распознавание» на уровне сенсорной системы, строго говоря, не является предметом психофизического исследования. Поэтому представлялось необходимым проверить способность рыб к распознаванию изомеров аминокислот на поведенческом уровне.

Третий раздел главы, посвящённый энантиомерному составу (пропорции оптических изомеров) аминокислот природных вод, призван развеять распространённое заблуждение в том, что D-аминокислоты - признак неживой материи. По мере развития аналитической био- и гидрохимии обнаруживается, что на самом деле D-аминокислоты в достаточном количестве содержатся в тканях и экскретах человека, животных, растений и микроорганизмов, и, следовательно, попадают в почву и природные воды. Являясь компонентом пищевых организмов, D-аминокислоты могут стать для рыб пищевым сигналом. В природных водах аминокислоты присутствуют в виде смеси L- и D-изомеров в различных пропорциях. В водах рек (исследовались воды северных рек от Мезени до Колымы) доля D-форм отдельных аминокислот достигает 39%. В связи с этим стоит задуматься: на что (на качественное или количественное изменение стимула) мы наблюдаем реакцию рыб, когда к природной воде (смеси изомеров) мы добавляем раствор одного из изомеров.

Следующий раздел главы - это собственные результаты исследования способности наивной молоди русского осетра на поведенческом уровне распознавать изомеры аминокислот. В качестве стимулов были выбраны следующие соединения: структурные изомеры L-б-аланин и в-аланин, оптический изомер L-б-аланин в паре с рацематом

D,L-б-аланином и оптический изомер D-тирозин в паре с рацематом D,L-тирозином. Помимо изомерии, поводом для выбора именно этих соединений послужили следующие соображения. По результатам предъявления отдельных аминокислот в стандартной концентрации 0.1 мМ по интенсивности вызываемой у молоди реакции привлечения использованные изомеры и рацемат аланина выстраиваются в следующий ряд предпочтений: L-б-ala>D,L-б-ala>в-ala. В этом ряду L-б-аланин - один из мажорных компонентов пищевого стимула для молоди осетра, и (по результатам первого этапа исследований) воспринимается ею как пищевой сигнал. Последний в этом ряду в-аланин не входит в состав белков, является результатом их метаболизма и, следовательно, не служит пищевым сигналом. Из изомеров тирозина D-тирозин воспринимается молодью осетра как пищевой сигнал, а D,L-тирозин - нет (см. вторую главу).

Результаты проведённых опытов показывают, что наивная молодь русского осетра на поведенческом уровне способна распознавать структурные (б- и в-) изомеры аминокислот, а также рацематы (смесь из L- и D- изомеров в соотношении 1:1) и энантиомеры (L- или D- изомеры в чистом виде) аминокислот, из чего с помощью элементарных логических выкладок можно заключить, что молодь способна распознавать и сами энантиомеры этой аминокислоты. Кроме того, есть определённая закономерность в знаках и интенсивности проявления реакции на замену одного вещества другим (Таблица 1). Замена менее привлекательного соединения на более привлекательное (или не пищевого стимула на пищевой) вызывает привлечение рыб в зону втока стимула, а заное (или пищевого стимула на смену одного вещества способна распозмена в обратную сторону - либо их уход из этой зоны, либо повышенную локомоторную активность, не ориентированную относительно места поступления стимула.

Таблица 1. Реакции наивной молоди осетра на последовательно предъявленные структурные и стереоизомеры аминокислот в стандартной концентрации 0.1 мМ.

Полученный результат наглядно показывает, что способность распознавать вещества очень близкого качества связана со степенью предпочтения этих веществ, что, в свою очередь, связано с их сигнальным значением для рыб. Выявленный у необученных рыб - представителей гидробионтов предел способности к распознаванию химических веществ сходен с таковым у террабионтов - человека и необученных млекопитающих (крыс).

Вопрос о сигнальном значении аминокислот для рыб представляет отдельный интерес. Традиционно аминокислоты, входящие в состав пептидов и белков, считаются пищевым химическим стимулом. Результаты опытов с голодной и сытой молодью осетра (см. вторую главу) показали, что для неё не все аминокислоты являются исключительно пищевыми сигналами. Это вполне понятно, поскольку САК присутствуют не только в пищевых объектах, но и во всех экскретах рыб: моче, фекалиях, кожной слизи, спермиевой и овариальной жидкостях. Есть данные о том, что растворы некоторых аминокислот при добавлении в аквариум, где находилась пара половозрелых японских горчаков Rhodeus ocellatus ocellatus, стимулировали у самца элементы поведения ухаживания за самкой, провоцирующие её нерест, и выделение спермы (Kawabata, 1993; Kawabata et al., 1992a,b). В этом случае аминокислоты играли для рыб роль полового феромона. Таким образом, сигнальное значение аминокислот для рыб, по меньшей мере, не однозначно.

Следующие два раздела главы - это аналитические обзоры практически всех доступных публикаций на темы чувствительность гидробионтов к химическим стимулам и относительной стимуляторной эффективности аминокислот для гидробионтов.

Методически корректных работ, где определялись дифференциальные пороги у рыб, немного (Bull, 1928, 1930, 1952; Сергеева, 1975; Johnstone, 1980; Neuhaus & Appelbaum, 1980; Mearns, 1989). Несомненный интерес представляют данные о пределах хемочувствительности наивных гидробионтов, полученные в поведенческих опытах. У лангуста ОДП для глицина составляет 1.8% (Zimmer-Faust, 1991), а у личинок атлантического лосося - порядка 15% (Mearns, 1989). У голубого краба абсолютный порог (АП) для пищевого экстракта составляет 10-18 г ткани на литр (Ache & Derby, 1985), а у гуппи АП для искусственного соединения в-фенилэтанола - 10-21 М в операционных концентрациях (Мантейфель и др., 1987). Эти данные о высокой абсолютной чувствительности позволяют предполагать и высокую дифференциальную чувствительность гидробионтов.

Данные об относительной стимуляторной эффективности (RSE) аминокислот для наивных животных (омара, лимонной акулы, белого амура, желтохвоста, тиляпии и полосатого данио), полученные в электрофизиологических опытах с использованием в качестве фона искусственной воды, разнятся, но их объединяет то, что в начале всех ранжированных рядов находится глутамин - компонент «умами» (смеси веществ, имитирующей мясной вкус) и пищевых добавок, а также другие мажорные компоненты экстрактов из пищевых организмов для рыб, которые - как следствие - «по совместительству» являются мажорными компонентами природной воды. С другой стороны, по имеющимся данным связь между RSE аминокислот и их структурой не выявляется.

Содержание двух последующих разделов главы составляют результаты собственных исследований дифференциальной чувствительности наивной молоди осетра к многокомпонентным природным химическим стимулам (водным растворами спиртово-водных экстрактов) и к отдельным аминокислотам.

Спиртово-водный экстракт представляет собой смесь веществ, растворимых в воде и/или спирте. В эту смесь входят вещества разных химических классов, что не позволяет быстро и просто устанавливать полный качественно-количественный состав экстрактов. Та же проблема существует и с определением полного состава природной воды. Поэтому в настоящий момент нет технической возможности определять на фоне природной воды разностные пороги для полных экстрактов. Но определять пороговые концентрации для полных экстрактов можно и нужно. С целью отбора конкретных экстрактов для исследования дифференциальной чувствительности рыб и для определения диапазона искусственных фоновых концентраций, в отдельной серии опытов были зарегистрированы реакции на предъявление 5 наименований экстрактов в диапазоне концентраций от 10-4 до 10-10 или 10-12 кг материала/л с шагом в 1 порядок. Для исследования дифференциальной чувствительности (ДЧ) рыб к многокомпонентным химическим стимулам (МХС) были отобраны экстракт из дафнии (пищевой стимул) и экстракт из фекалий молоди осетра (внутривидовой стимул), для которых пороговые по специфической реакции концентрации были, соответственно, 1 и 10 мкг/л.