Морфолого-культуральні і фізіолого-біохімічні показники бактерії Pseudomonas aureofaciens BKM В-2501

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зміст

Реферат

Вступ

Розділ 1. Обґрунтування вибору біологічного агента

1.1 Екологічні аспекти вибору біологічного агента

1.2 Порівняння деяких штамів бактерій, які використовуються для деструкції ПАВ

Розділ 2. Характеристика біологічного агента та кінцевого продукту біосинтезу

2.1 Морфолого-культуральні ознаки

2.2 Фізіолого-біохімічні ознаки

2.3 Таксономічний статус біологічного агента

2.4 Особливості метаболізму біологічного агента

2.5 Характеристика кінцевого продукту біосинтезу

Розділ 3. Визначення показників росту під час періодичного культивування мікроорганізмів

3.1 Швидкість експоненційного росту

3.2 Визначення рівня біомаси

3.3 Економічний коефіцієнт

3.4 Тривалість лаг-фази

Розділ 4. Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів

Розділ 5. Енергетичний баланс окиснення субстрату

Висновки

Список використаної літератури



Реферат

Курсова робота присвячена вивченню морфолого-культуральних, фізіолого-біохімічних ознак та перспективам використання Pseudomonas aureofaciens BKM B-2501. У роботі викладено обґрунтування вибору біологічного агенту, його особливості та умови культивування для синтезу НАД. Також здійснено розрахунки для визначення показників росту, складу поживного середовища та енергетичного балансу окиснення субстрату.

Курсова робота складається з вступу, п'яти розділів, графічних матеріалів та списку використаної літератури з 21 найменування. Загальний обсяг роботи - 44 сторінки, 12 рисунків, 4 таблиці.

Ключові слова: Pseudomonas aureofaciens, ПАВ, біодеградація нафталіну, стійкість до важких металів, плазміда, тип живлення, поживне середовище, субстрат.



Вступ

Біотехнологія - це комплекс фундаментальних і прикладних наук, технічних засобів, спрямованих на одержання і використання клітин мікроорганізмів, тварин і рослин, а також продуктів їх життєдіяльності: ферментів, амінокислот, вітамінів, антибіотиків та ін.

Біотехнологія, яка включає промислову мікробіологію, базується на використанні знань і методів біохімії, мікробіології, генетики і хімічної технології, що дає змогу діставати користь у технологічних процесах із властивостей мікроорганізмів та клітинних культур. Що стосується більш сучасних біотехнологічних процесів, то вони базуються на методах рекомбінантних ДНК, а також на використанні іммобілізованих ферментів, клітин і клітинних органел.

В наш час модернізація промисловості і науки в Україні є актуальною проблемою в вирішенні якої значне місце відводиться біотехнології.

Останнім часом біосфера Землі відчуває на собі постійний зростаючий антропогенний вплив. Прискорені темпи науково-технічного прогресу і удосконалення сільськогосподарського виробництва розширюють ступінь впливу людини на біосферу в цілому і особливо на агробіоценози [20].

Технології, що використовуються сьогодні для вирішення цієї проблеми, є дорогими і не можуть призвести до повного очищення, а також призводять до появи ряду побічних продуктів. Процес біологічного очищення визначається як використання мікроорганізмів для детоксикації або видалення забруднюючих речовин за рахунок їх метаболічних можливостей (синтезу амінокислот, органічних кислот, ферментів, екзополісахаридів, лектинів, ПАР, вітамінів, стимуляторів росту, гормонів; одержання білкових продуктів, пробіотиків і добрив; одержання енергії; трансформації речовин та ін.) [6].

Вивчення мікроорганізмів, які мешкають в певних еколого-географічних умовах і на які одночасно впливають різні антропогенні фактори (в т. ч. високий рівень полютантів і підвищена мінералізація середовища), викликають особливу цікавість. Актуальність таких досліджень, поряд з теоретичними аспектами, обумовлена також і практичними задачами екобіотехнології. Основне серед них є розробка нових стратегій біоремедіації, в тому числі у зв`язку з неефективністю технологій, створених на основі не адаптованих до відповідних умов мікроорганізмів [17].

Одним і з сучасних і багатообіцяючих підходів до очистки забруднених ґрунтів є фіторемедіація - спільне використання рослин і асоційованих з ними мікроорганізмів. Отримані експерементальні дані, що стосуються рослин і ризосферних бактерій, на забруднених ґрунтах, є основою для підвищення ефективності фіторемедіаційних технологій. Оскільки при забрудненні погіршуються фізико-хімічні властивості ґрунту, і як наслідок, знижується накопичення рослинної біомаси, є актуальним застосування штамів, здатних не лише утилізувати токсичні сполуки, але і стимулювати ріст рослин [22]. В даний час ризосферні бактерії роду Pseudomonas, які стимулюють ріст рослин (PGPR Pseudomonas - Plant Growth-Promoting Rhizo-bacteria Pseudomonas), є досить привабливим об`єктом досліджень з точки зору їх потенційного використання в фіторемедіації. Поєднання генетичних систем деградації поліциклічних ароматичних вуглеводів (ПАВ), резистентності до важких металів і стимуляція росту/захисту рослин є одним з підходів в створенні поліфункціональних штамів PGPR Pseudomonas для фіторемедіації ґрунтів з комплексним забрудненням органічними полютантами і важкими металами [18]. Було продемонстровано, що загибель і пригнічення росту рослин на забрудненому ґрунті може відбуватись не лише через токсичний вплив на них речовини-забруднювача, але і в результаті сильного ушкодження рослин фітопатогенними грибами і накопичення в ґрунті грибних метаболітів. Таким чином, для очистки забруднених ґрунтів необхідним є використання штамів, здатних деградувати органічні забруднювачі і пригнічувати ріст фітопатогенних грибів.

Розділ 1. Обґрунтування вибору біологічного агента

1.1 Екологічні аспекти вибору біологічного агента

Поліциклічні ароматичні вуглеводні (ПАВ) є пріоритетними забруднювачами внаслідок повсюдного поширення і негативного впливу на живі організми. ПАВ входять до складу важких фракцій нафти (близько 5-10 %) і потрапляють у навколишнє середовище в результаті аварійних розливів нафтопродуктів, транспортування і при переробці нафти. Велика кількість ПАВ утворюється при неповному згорянні органічних сполук і постійно присутня у викидах ТЕЦ, коксо-, газо - та нафтохімічних виробництв [6].

Продукти на основі нафти є основним джерелом енергії для промисловості і повсякденного життя, що зумовлює постійний розвиток та зростання обсягів нафтопереробної галузі. В свою чергу, така ситуація спричинила суттєве забруднення води і ґрунту вуглеводнями різного походження. Технології, що використовуються сьогодні для вирішення цієї проблеми, є дорогими і не можуть призвести до повного очищення, а також призводять до появи ряду побічних продуктів.

Процес біологічного очищення визначається як використання мікроорганізмів для детоксикації або видалення забруднюючих речовин за рахунок їх метаболічних можливостей. Він є перспективним способом видалення і деградації багатьох забруднювачів навколишнього середовища, включаючи продукти нафтової промисловості. Крім того, технологія біологічного очищення, як вважають, є неінвазивним і відносно економічним способом. Успіх біоремедіації залежить від здатності створювати і підтримувати умови, які сприяють біодеградації у навколишньому середовищі. Однією з важливих вимог є наявність мікроорганізмів з відповідною метаболічною здатністю. Якщо ці мікроорганізми присутні, то їх можливість росту на вуглеводневому середовищі залежить від комбінації двох чинників: біохімічної взаємодоповнюваності організмів і стійкості до токсичної дії вуглеводнів. Очевидно, ці два чинники мають бути оптимальними. Враховуючи характер багатокомпонентних нафтових забруднень, мікроорганізми (асоціації мікроорганізмів) повинні мати можливість рости на більшості компонентів забруднюючих речовин і бути стійкими до токсичної дії для повної мінералізації нафтопродуктів.

Оптимальні темпи росту мікроорганізмів і біодеградації вуглеводнів можливо досягти шляхом забезпечення оптимальних концентрацій поживних речовин і кисню, рН та температури. Фізичні та хімічні характеристики нафтопродуктів, площа поверхні розділу фаз також є важливими детермінантами успіху біологічного очищення. Існують два основні підходи до біологічного очищення розливів нафти:

a) біоаугментація, коли відомі нафтоокиснюючі бактерії додаються до існуючих природних мікробних популяцій екосистеми, де стався розлив;

б) біостимуляції, коли ріст нативних деструкторів нафти стимулюється додаванням поживних речовин або інших субстратів для забезпечення оптимальних умов життєдіяльності мікроорганізмів [3].

Все частіше забруднення навколишнього середовища носить комплексний характер, обумовлений як присутністю органічних токсикантів, так і сполук важких металів. Наявність високих концентрацій важких металів у ґрунтах значно знижує швидкість деградації органічних забруднювачів і, нагромаджуючись у сільськогосподарських рослинах, дані сполуки можуть надходити в організм людини і викликати ряд важких захворювань.

Найздібнішими до боротьби із забруднювачами різного типу є представники роду Pseudomonas. Клітини цих мікроорганізмів містять оксидоредуктази і гідроксилази, здатні розкладати велике число молекул вуглеводнів та ароматичних сполук, таких як бензол, ксилол, толуол. Гени, що кодують ці ферменти, знаходяться в складі плазмід. Наприклад, плазміда ОСТ відповідає за розкладання октану і гексану, XYL - ксилолу і толуолу, NAH - нафталіну, CAM - камфори. Плазміди САМ і NAH забезпечують власне перенесення, індукуючи схрещування бактеріальних клітин; інші плазміди можуть бути перенесені тільки в тому випадку, якщо в бактерії введені інші плазміди, що забезпечують схрещування [8].

Ці мікроорганізми зручно використовувати для очищення нафтових плям на суші або морі при різних аваріях. Для більшої ефективності створюють мікроемульсію, що містить бактеріальні штами і капсули з сумішшю основних поживних елементів - азоту, фосфору і калію всередині. Додавання цих речовин стимулює розмноження бактеріальних штамів. Застосування такого методу дозволяє очистити від 70 до 90 % забрудненої поверхні, за цей же час очищується всього близько 10-20 % необробленої поверхні.

Перевага бактеріального очищення в порівнянні з хімічним в тому, що вона не викликає появи нового забруднюючого агента в навколишньому середовищі. Щільність фітопланктону після бактеріального очищення підвищується. Деякі мікроорганізми здатні змінювати молекулу ксенобіотика і робити її доступною і привабливою для інших мікроорганізмів ("кометаболізм"). Прикладом може служити розкладання інсектициду паратіона під дією двох штамів Pseudomonas - P. aeruginosa і P. stuzeri. У деяких випадках відбувається неповне перетворення молекули ксенобіотика - фосфорилювання, метилювання, ацетилювання, тощо, результатом якого є втрата цією речовиною токсичності [5].

Штам Pseudomonas aureofaciens BKM B-2501 використовується для біодеградації (утилізації) ПАВ в умовах забруднення ґрунтів солями нікелю.

Фітостимулюючі властивості штаму є дуже важливими при проведенні фіторемедіаційних технологій, заснованих на використанні рослин і асоційованих з рослиною мікроорганізмів для очищення навколишнього середовища.

Технічним ефектом, який може бути отриманий при використанні даного штаму, є швидка деградація ПАВ в ґрунтах при їх забрудненні солями нікелю, а також захист рослин від токсичного впливу ПАВ і поліпшення їхнього росту при культивуванні внаслідок зменшення вмісту ПАВ у цих ґрунтах за рахунок біодеградації [14].

Вихідним бактеріальним штамом для отримання даного плазмідного штаму є штам Pseudomonas aureofaciens BS1393, який пригнічує ріст багатьох фітопатогенних грибів і бактерій за рахунок продукування антибіотико-активних сполучень. Діюча речовина - живі бактеріальні клітини, які колонізують листя і стебла рослин. На основі цього штаму розроблений біопрепарат Псевдобактерин-2 (ПС-2): культуральна рідина з концентрацією живих клітин 6-8Ч10¹⁰ в мл і паста - 3-4Ч10¹³ живих клітин в 1 грамі [21].

Захисна дія базується на здатності клітин бактерій продукувати позаклітинні метаболіти (сидерофори, феназини), які пригнічують ріст фітопатогенних бактерій і грибів, а також підвищують власний імунітет рослини. Крім того, клітини бактерій синтезують індоліл-3-оцтову кислоту (ІОК, стимулятор росту) і різноманітні органічні кислоти, які перетворюють нерозчинні фосфати ґрунту в доступні для рослин форми, а також продукують різноманітні фітогормони [21].

При отриманні плазмідних штамів PGPR Pseudomonas - P. aureofaciens BS 1393 (pB217,pB501) необхідно враховувати можливий негативний вплив плазмід на фітостимулюючі і захисні властивості штамів. В отриманих штамах наявність плазмід біодеградації нафталіну і стійкості до важких металів не зменшувало продукування феназинових антибіотиків (рис. 1.1) [22].

Рис. 1.1. Антагоністична активність плазмідних штамів P. aureofaciens BS1393 in vitro: А - пригнічення росту F. graminearum, Б - R. solani. 1 - P. aureofaciens BS1393, 2 - P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501), 3 - P.aureofaciens BS1393(pOV17), 4 - P. aureofaciens BS1393(pBS216)

Антагоністична активність запропонованого штаму Pseudomonas aureofaciens ВКМ В 2501 по відношенню до фітопатогенних грибів і бактерій не відрізняється від активності вихідного безплазмідного штаму P. aureofaciens BS1393 [14].

Здатність ризосферних бактерій до синтезу фітогормонів може позитивно вплинути на ефективність фіторемедіації за рахунок збільшення вегетативної маси рослин. Всі штами-деструктори синтезують індоліл-3-оцтову кислоту в кількості 2-6 мкг/мг сухих клітин (рис. 1.2).

Рис. 1.2. Вплив різних варіантів штаму P. aureofaciens BS1393 на ріст пшениці в присутності нафталіну (200 мкг/г)

Штам бактерій Pseudomonas aureofaciens BKM В-2501 містить природну плазміду біодеградації нафталіну pBS216 та природну плазміду pBS501, що містить cnr-подібний оперон, який забезпечує стійкість до кобальту і нікелю, пов'язану з вилученням катіонів металів з клітини [18].

При використанні плазмідних штамів в ремедіації ґрунтів велике значення має стабільність підтримання плазмід і збереження фенотипу інтродукуючих мікроорганізмів. Порівняння стабільності плазмід у одного і того ж варіанта штаму показало, що на середовищі М 9,зазвичай, стабільність вища ніж на LB. Це може бути пов`язано з більш тривалим часом генерації штамів на бідних середовищах. Для P. aureofaciens BKM В-2501 час однієї генерації в експоненційній фазі росту на середовищі LB склало приблизно 40 хв, а на М 9 з гліцерином - 1,5 год. Окрім стабільності підтримання, важливою характеристикою плазмід є їх структурна стабільність. Низька швидкість росту і накопичення продуктів неповного окиснення нафталіну може бути результатом нездатності плазмідних генів катаболізму нафталіну ефективно здійснювати експресію в результаті структурних змін плазміди, які відбуваються під час її перенесення в даний штам [22].

Штам бактерій Pseudomonas aureofaciens BKM В-2501 стійкий до катіонів нікелю та кобальту. Максимальна толерантна концентрація (МТК) хлориду нікелю - 400 мкМ, хлориду кобальту - 200 мкМ. Рівень резистентності до нікелю і кобальту у пропонованого штаму P. aureofaciens BKM В-2501 в 4 рази вище, ніж у чутливого варіанта P. aureofaciens BS1393(pBS216), незалежно від джерела вуглецю в середовищі вирощування (глюкоза або нафталін). Нікель не мав негативного впливу на життєздатність стійкого штаму PCL1391(pBS216,pBS501) - Pseudomonas aureofaciens BKM В-2501. Як в контролі, так і в присутності металу при однаковій густині культури кількість КУО співпадала і зростала. В кінці експоненційного росту титр клітин склав 1,2Ч10¹⁰ КУО/мл порівняно з початковим значенням 1,5Ч10⁷ КУО/мл.

У присутності 100 мкМ нікелю чутливий штам бактерій P.aureofaciens BS1393(pBS216) за 36 годин окисляє близько 11 % нафталіну. У присутності нікелю пропонований штам P. aureofaciens ВКМ В-2501 за 21 годину окисляє близько 98 % нафталіну, стільки ж, скільки чутливий штам P. aureofaciens BS1393(pBS216), вирощений без додавання металу [14].

Збереження активності ферментів біодеградації нафталіну у пропонованого штаму при різних умовах культивування (наявність або відсутність іонів нікелю) свідчить про здатність даного штаму ефективно деградувати ПАВ в присутності хлориду нікелю.

Питома активність ключових ферментів біодеградації нафталіну, а саме, нафталін диоксигенази, саліцилат гідроксилази і катехол-1,2-диоксигенази в присутності хлориду нікелю (100 мкМ) у пропонованого штаму P. aureofaciens BKM В-2501 у 6, 9 і 8 разів вище, ніж у чутливого P. aureofaciens BS1393(pBS216) [14].

Таблиця 1.1. Питома активність ключових ферментів біодеградації нафталіну (нмоль/хв мг білка) у різних варіантів штаму P. сhlororaphis PCL1391

1.2 Порівняння деяких штамів бактерій, які використовуються для деструкції ПАВ

Відомий мультиплазмідний штам Pseudomonas aeruginosa 123, що містить плазміди ОСТ, САМ, NAH, здатний утилізувати октан, камфору, нафталін і саліцилат і використовується при біологічному очищенні води від нафти і нафтопродуктів. Проте відсутні відомості про здатність цього штаму деградувати нафту і нафтопродукти в присутності важких металів, а також про ефективність деградації вуглеводнів і зменшення їх концентрації у воді та ґрунті.

Найбільш близькими до Pseudomonas aureofaciens BKM B-2501 є штами бактерій P. stutzeri MEV-S1 і P. alcaligenes MEV, що використовуються для очищення ґрунтів, ґрунтових та поверхневих вод від нафти та продуктів її переробки. Дані штами утилізують нафту, мазут, дизельне паливо; поліциклічні ароматичні вуглеводні (ПАВ), які містять від 2 до 4 бензольних кілець: нафталін, фенантрен, пірен, флуорен, фенол. Вони стійкі до іонів важких металів: Pb⁺, Zn²⁺, Mo²⁺, Fe²⁺, Cr²⁺. Штами продукують поверхнево-активні речовини (біосурфактанти) [14].

Авторами зазначених патентів показано, що ці штами можуть бути використані для одержання препарату для очищення ґрунту, ґрунтових і поверхневих вод при потраплянні в навколишнє середовище нафти і продуктів її переробки, а також при комбінації цих штамів деградувати нафту, нафтопродукти і ПАВ в присутності кобальту і нікелю. Але у всіх перерахованих аналогах немає відомостей про вплив штамів на ріст і розвиток рослин.

Відомий штам бактерій Pseudomonas aeruginosa XP-25, який був виділений з фенолзабруднених ґрунтів Стерлітамакського нафтохімічного заводу шляхом культивування ґрунтового зразка в мінералізованому середовищі з подальшим відбором найбільш активних форм, і який використовується для очищення стічних вод хімічних підприємств від ароматичних сполук. Проте спектр дії штаму Pseudomonas aeruginosa XP-25 направлений на утилізацію ароматичних сполук, зокрема фенолу, і не поширюється на інші "важкі" фракції вуглеводнів, а також екотоксикантів, таких як спирти, альдегіди, технічні масла, жири та ін. Відсутні відомості про здатність цього штаму деградувати нафту і нафтопродукти в присутності важких металів. Крім того, Pseudomonas aeruginosa відноситься до мікроорганізмів, деякі штами яких є патогенними для людини [14].



Розділ 2. Характеристика біологічного агента та кінцевого продукту біосинтезу

2.1 Морфолого-культуральні ознаки

Грамнегативні рухливі бактерії, виділені із ризосфери злакових. Клітини поодинокі паличкоподібні, розміром (0,6-0,9)Ч(1,5-2,0) мкм (рис. 2.1 а) Має полярні джгутики - лофотрих (рис. 2.1 б). Спор не утворює. Кінці клітин заокруглені [2].

а б

Рис. 2.1 (а, б). Електронна мікрофотографія Pseudomonas aureofaciens

На м`ясо-пептонному агарі колонії круглі, гладкі, випуклі, блискучі, слизисті, жовто- помаранчевого кольору, однорідної структури. Пігмент зелений, з часом дифундує в середовище.

На LB - круглі, краї рівні, гладенькі, випуклі, блискучі, слизисті, жовто-помаранчевого кольору, діаметр 4-5 мм, пігмент жовто-помаранчевий, дифундує в середовище.

На триптозо-соєвому агарі колонії крупні, інтенсивно забарвлені, спостерігається більш інтенсивна дифузія пігменту в середовище.

На середовищі Кінг Б колонії жовто-зелені, пігмент інтенсивний, зелений, і з часом набуває жовто-помаранчевого кольору. З часом в середовищі утворюються помаранчеві кристали. В рідкому середовищі Кінг Б протягом доби утворюється сильна каламуть, осад, зелений пігмент, який на 4ту добу змінює колір на жовто-помаранчевий.

На середовищі М 9 з нафталіном колонії круглі, слабовипуклі, непрозорі, світло-коричневі [14].

2.2 Фізіолого-біохімічні ознаки

Прототроф - факторів росту не потребує. Не накопичує в клітинах полі-в-оксибутират. Желатину розріджує, молоко пептонізує, утворюючи зелений пігмент. Молекулярний азот не фіксує. Крохмаль не гідролізує. Пектиназна активність відсутня. Нітрати не редукує. Присутня аргініндигідролаза [7].

Оптимальна температура росту 28-30°С. Не росте при 37 °С.

Значення рН середовища: росте в межах 5,5-8,0. Оптимальне для росту 6,8-7,4.

Джерела вуглецю: глюкозу, фруктозу, трегалозу, маніт, гліцерин. Не засвоює арабінозу, ксилозу, рамнозу, галактозу, сорбозу, мальтозу, лактозу, адоніт, сорбіт, дульцит, інулін.

З органічних кислот засвоює оцтову, мурашину, молочну, бурштинову, фумарову, піровиноградну, яблочну, бензойну, саліцилову. Не засвоює винну, лимонну, щавлеву, глюконову кислоти.

Використовує як джерело вуглецю нафталін, фенантрен.

Джерело азоту - (NH₄)₂SO₄, NH₄NO₃, пептон, аланін, аргінін. Слабо засвоює KNO₃, аспарагін, тирозин, сечовину.

По відношення до кисню - облігатний аероб.

Штам стійкий до антибіотиків: стрептоміцину (100 мкг/мл), триметоприму (100 мкг/мл), хлорамфеніколу (100 мкг/мл), карбеніциліну (1000 мкг/мл).

Чутливий до канаміцину (50 мкг/мл), гентаміцину (20 мкг/мл), тетрацикліну (20 мкг/мл).

Не володіє фітопатогенною активністю, про що свідчить відсутність мацерації на скибочках картоплі при нанесенні на них уколом живих клітин штаму. pseudomonas культивування бактерія екологічний

Штам синтезує принципово специфічні продукти - гетероциклічні феназинові антибіотики (феназин-1-карбонову кислоту, 2-оксифеназин-1-карбонову кислоту і 2-оксифеназин), сидерофори, індоліл-3-оцтову кислоту (ІОК) [14].

Штам бактерій P. aureofaciens BKM В-2501 зберігають на чашках з трис-мінеральним середовищем з додаванням нікелю (100 мкМ) і нафталіну (пари). Пересіви на свіжі середовища - один раз на місяць. Зазначений штам може зберігатися не менше 1 року в 15 % гліцерині при -20°С, не більше 5 років під вазеліновою олією в напіврідкому середовищі наступного складу: живильний бульйон (Difco, США) - 4 г/л, NaCl - 5 г/л, агар - 6 г/л, рН 6,8 [14].

2.3 Таксономічний статус біологічного агента

В 1-му виданні Визначника Бергі рід Pseudomonas був включений в порядок Eubacteriales, родину Bacteriaceae, трибу Chromobacteriaceae. Основна увага в описі роду була звернена на пігменти.

Автори 7-го видання Бергі помістили рід Pseudomonas разом з родами Xanthomonas і Aeromonas в родину Pseudomonadaceae [7].

Відповідно до класифікації першого видання керівництва Бергі з систематики бактерій, де представлена фенотипова систематика, Pseusomonas aureofaciens відноситься до Царства - Procaryotae, відділу - Gracilicutes, класу - Scotobacteria, порядку - Pseudomonadales,родини - Pseudomonaceae, роду - Pseusomonas, виду - aureofaciens.

У дев'ятому виданні Визначника бактерій Бергі (Керівництва Бергі з ідентифікації бактерій) всі прокаріоти розподілені по групах, що не мають таксономічного статусу. Група 4 - грамнегативні аеробні/мікроаерофіли палички та коки. До цієї групи належить велика кількість лабораторних культур, які отримали загальну назву "псевдомонади" за формою клітин з полярним джгутиком [16].

За філогенетичною класифікацією згідно останнього Видання Бергі з систематики бактерій P.aureofaciens знаходиться: Домен - Bacteria, відділ - Proteobacteria, клас - Gammaproteobacteria, порядок - Pseudomonadales, родина - Pseudomonaceae, рід - Pseudomonas, вид - aureofaciens [12].

2.4 Особливості метаболізму біологічного агента

Метаболізм біологічного агенту тісно пов'язаний з поживним середовищем, яке він катаболізує. Штам бактерій Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2501 в присутності важких металів культивують в синтетичному трис-мінеральнму середовищі складу, г/л: трис - 6,06, NaCl - 4,68, KCl - 1,49, NH₄Cl - 1,07, Na₂SO_4-0,43, MgCl₂Ч6H₂O - 0,2, CaCl₂Ч2H₂O - 0,03, Na₂HPO₄Ч12H₂O - 0,23, FeNH₄ цитрат - 5 мг/л, рН 7.Як джерело вуглецю і енергії в середовище додають глюкозу (2 г/л) чи нафталін (1 г/л) [14].

В базі даних KEGG не представлено даний мікроорганізм, тому використаємо дані про катаболізм Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca, оскільки аналіз ДНК-ДНК гібридизації показав 70 % відповідність між цими видами, а сиквенс гену 16S рРНК - подібність на 99,5 % [1].

У цього мікроорганізма функціонує гліколітичний шлях розщеплення глюкози (рис. 2.4).



Рис. 2.4. Катаболізм глюкози за гліколітичном шляхом: ферменти: 1 (КФ 2.7.1.2) - глюкокіназа; 2 (КФ 5.3.1.9) - глюкозо-6-фосфатізомераза; 3 (КФ 3.1.3.11) - фрутоктозо-1,6-дифосфатаза; 4 (КФ 4.1.2.13) - фруктозо-1,6-дифосфат-альдолаза; 5 (КФ 1.2.1.12) - гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа; 6 (КФ 2.7.2.3) - фосфогліцераткіназа; 7 (КФ 5.4.2.12) - гліцератфосфомутаза; 8 (КФ 4.2.1.11) - енолаза; 9 (КФ 2.7.1.40) - піруваткіназа [4]



2.5 Характеристика кінцевого продукту біосинтезу

Відома величезна кількість поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАВ), які є сильними канцерогенами, оскільки мають поглиблення в структурі молекули, характерне для багатьох канцерогенних речовин (Рис. 2.5.1). Сполуки цієї групи (Рис. 2.5.2) поширені убіквітарно і зустрічаються практично у всіх сферах навколишнього середовища людини.

Рис. 2.5.1. Бензо(б)-пірен

Рис. 2.5.2. Група поліциклічних аренів

Встановлено, що БП і інші ПАВ виникають як продукт абіогенного походження в результаті вулканічної діяльності.

Багатоядерні арени (поліциклічні арени або ароматичні вуглеводні) поділяють, в залежності від їх сполучення, на дві групи (Рис. 2.5.3): з конденсованими бензеновоми, з ізольованими бензеновоми ядрами [9].

Рис. 2.5.3. Класифікація багатоядерних аренів

Мають виражені канцерогенні, мутагенні та тератогенні властивості. У навколишнє середовище вони потрапляють через спалювання і переробку органічної сировини, а в організм людини - ще й унаслідок куріння тютюну.

Здатність розщеплювати такі сполуки з розривом ароматичного кільця притаманна багатьом бактеріям і грибам. Для розщеплення ароматичних сполук необхідна присутність молекулярного кисню. Поліциклічні сполуки спочатку деградують до ароматичних сполук. Більшість ароматичних сполук розщеплюється спочатку до пірокатехіну або до протокатехової кислоти, які піддаються діоксигенуванню [14].

Встановлена важлива роль ферментів диоксигеназ на початкових етапах аеробної деструкції ПАВ і біфенілу [17].

Здатність до самоочищення природних середовищ від ПАВ залежить від властивостей ПАВ, їх кількості, властивостей ґрунтів чи водних середовищ, від температури, вологості, мікробіологічної активності. Як правило, в перший період після потрапляння ПАВ в ґрунт їх вміст спочатку знижується відносно швидко. При зниженні концентрації ПАВ швидкість їх розкладу падає, і підвищується при їх повторному внесенні. Зменшення ПАВ в оточуючому середовищі йде по експоненту. Швидкість деградації вище в теплу пору року. У воді ПАВ більш стійкі, ніж у ґрунті. Є дані, що період напіврозпаду бензо(б)-пірену у воді коливається від декількох годин до діб. Час збереження бензо(б)-пірену в ґрунті - 4-24 міс. Стійкість ПАВ в ґрунті пов`язана з закріпленням їх компонентами ґрунту [9].

Рис. 2.5.4. Шляхи розпаду деяких ароматичних амінокислот

Самоочищення ґрунту під ПАВ можливе за рахунок природних біотичних і абіотичних процесів їх трансформації, деградації і міграції. Основні з цих процесів:

§ окислення ПАВ під впливом сонячного світла (фотоліз) і кисню повітря;

§ хімічна дія, наприклад лугами;

§ мікробіологочна деструкція (біодеградація) мікроорганізмами, які використовують ПАВ як джерело вуглецю;

§ сорбція ґрунтом;

§ поглинання коренями рослин;

§ винесення з ґрунту водними потоками.

Можливе штучне очищення ґрунтів, забруднених ПАВ, шляхом окислення їх при опроміненні УФ-променями. Процес посилюється в присутності посилювачів, наприклад перекису водню.

Найбільш традиційні методи аналізу поліциклічних ароматичних вуглеводів в органічних сполуках складного складу можна умовно розділити на 2 категорії: спектральні та хроматографічні. Останнім часом ці методи застосовуються одночасно.

Основні джерела емісії ПАВ пов`язані з різноманітними технологічними процесами, особливо з виробництвом тепла, енергії і з промисловими викидами виробництв, які використовують вугілля. Природні джерела ПАВ не вносять вагомий внесок в глобальну емісію цих вуглеводів, а скоріш за все впливають на їх накопичення в ґрунтах, донних породах [9].

Біопрепарати, створені на основі асоціацій мікроорганізмів-нафтодеструкторів, здатних окислювати широкий спектр вуглеводнів нафти від довголанцюжкових алканів до поліароматичних сполук, успішно використовуються в технології ремедіації (очищення) нафтозабруднених об'єктів. Біопрепарати призначені для очищення від нафти і нафтопродуктів ґрунтів і акваторій, для відновлення функцій самоочищення ґрунту і водойм, очищення стічних вод промислових підприємств, очищення стоків автомийок, СТО, АЗС, територій підприємств нафтовидобувної і нафтопереробної промисловості, депарафінізації свердловин, технічних резервуарів.

Відомі комерційні препарати на основі нафтоокислюючих мікроорганізмів (таб. 2.5). До складу препаратів входять монокультури (препарати "Путідойл", "Екойл", "Дестройл" і ін.) або асоціації з двома і більше ніж двадцятьма видами різних нафтоокислюючих мікроорганізмів: бактерій, грибів, дріжджів ("Деворойл", "Simbinal", " Родоторін ") [13].



Таблиця 2.5. Характеристика найбільш відомих препаратів нафтодеструкторів (за Кузнєцовим А.Е, 2012) [10]

Препарат	Склад мікроорганізмів	Особливості використання	Норми витрат
Деградойл	Azotobacter vinelandii	t0C +10..+35 забруднення до 20г/кг ґрунту, широка субстратна специфічність	5-10 кг/га ґрунту
Олеоворин	Acinetobacter oleovorum, Candida	t0C +3..+45.pH 3.5-10, забруднення до 20 г/кг ґрунту	15 кг/ га ґрунту
Екойл	Pseudomonas sp.,Acinetobacter sp., Mycobacterium	t0C не нижчее +5, забрудненість до 25 г/кг	30-50 кг/ 100 м3 ґрунту
Ленойл	Bacillus, Arthrobacter	Ефективний при рівні забруднення до 20 г/кг	3-кратне внесення
Родер	Rhodococcus sp.	Забрудення до 5 г/кг	3-кратне внесення
Сойлекс	Pseudomonas putida	Концентрація нафти не більше 5 %	1000 кг/га
Біодекструктор- Валентіс	Acinetobacter valentia	t0C +10…+50,pH 6-8, забруднення не вище 20 кг/м 2	15-20кг/га ґрунту

Також не менш відомий препарат "Путідойл" складається з одного штаму бактерії Pseudomonas putida 36. Препарат отримують глибинним культивуванням бактерії в живильному середовищі при 30° С, в аеробних умовах, з подальшим розпилювальним сушінням або ліофілізацією отриманої культуральної рідини. Оскільки препарат "Путідойл" є монокультурою, він володіє меншим потенціалом і більш вузьким спектром дії на вуглеводні, ніж препарати, що складаються з двох і більше штамів мікроорганізмів, наприклад "Деворойл".

Відомо, що до складу препарату "Деворойл" входять штами Pseudomonas stutzeri, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus maris, Rhodococcus sp., Yarrowia lipolytica (раніше Candida sp.). Відповідно до патенту "Деворойл" також отримують глибинним культивуванням в живильному середовищі. Однак "Деворойл" складається з мікроорганізмів різної таксономічної та видової приналежності, які потребують роздільного вирощування, що істотно ускладнює і збільшує вартість процесу виробництва препарату. З іншого боку, при спільному культивуванні мікроорганізмів, що відносяться до різних таксономічних груп і розрізняються за швидкістю зростання, субстратної специфічності, температурному оптимуму зростання та ін., виникає конкурентна боротьба за джерела харчування, і в результаті в такому препараті виживають не всі види із вказаних, і, відповідно, зменшується ефективність такого препарату. Недоліком біопрепарату "Деворойл", окрім необхідності роздільного вирощування мікроорганізмів, що входять до його складу, є застосування дорогого вуглеводневого середовища для отримання біомаси препарату і більш висока температура культивування 20-40 ° С, що обмежує сферу застосування [14]. Найбільш розповсюдженими препаратами нафтодеструкторів є "Деградойл", який містить Azotobacter vinelandii, і препарат "Деворойл", який містить асоціацію бактерій і дріжджів. Мікробіологічні препарати "Байкал-Эм" і "Тамир" показали високу ефективність при високому рівні забруднення ґрунтів нафтою (50-150 г/кг), навіть за низьких температур 10-15 °С [10]. Останнім часом все частіше використовують біопрепарати, що складаються з 2 і більше штамів, оскільки використання монокультури не може повністю вирішити проблему очищення. Нафта - складний багатокомпонентний субстрат, що містить кілька сотень різних хімічний з'єднань, і один штам не здатний володіти всім спектром ферментів, необхідних для біодеградації. Використання ж декількох штамів, що відрізняються за спектром споживаних субстратів, може призводити до повної деструкції нафти [14].

В умовах природного мікробіоценозу спостерігається одночасна асиміляція різних фракцій нафти різними групами мікроорганізмів.

При спільному використанні декількох штамів-деструкторів в консорціумі їх нафтоутилізуючий ефект посилюється. Причинами цього є:

- Різне пріоритетне використання складових компонентів нафти різними штамами;

- Різна швидкість росту мікроорганізмів;

- Продуковані штамом метаболіти, які можуть бути факторами росту для інших штамів консорціуму.

Розділ 3. Визначення показників росту під час періодичного культивування мікроорганізмів

Завдання 1. Визначити:

- швидкість росту () між та 12 год культивування;

- рівень біомаси;

- економічний коефіцієнт за умови, що початкова концентрація глюкози в середовищі становить 1 %;

- тривалість лаг-фази.

При внесенні у поживне середовище бактерії ростуть до тих пір, поки вміст якого-небудь необхідного компонента не стане мінімальним або не вичерпається, після чого ріст припиняється. Якщо впродовж усього часу в середовище не вносити ніяких поживних речовин і не виводити продукти метаболізму, то отримаємо періодичну культуру-популяцію клітин в обмеженому життєвому просторі. Крива, що описує залежність логарифму має S-подібну форму та декілька фаз:

- Лаг-фаза: вона починається з моменту посіву бактерій у свіже поживне середовище. У цей період клітини адаптуються до даних умов культивування. Тривалість цієї фази залежить від передісторії інокуляту, його віку, наявності потрібного бактерії pH середовища, температури, концентрації розчиненого кисню.

- Експоненційна фаза: характеризується максимальною швидкістю поділу клітини і збалансованістю процесів росту (подвоєння біомаси супроводжується подвоєнням кількості білка, ДНК, РНК).

- Фаза сповільненого росту: настання цієї фази зумовлене якісними змінами поживного середовища, а саме: споживання поживних речовин, накопичення продуктів обміну, дефіцит кисню, зміна pH.

- Стаціонарна фаза: характеризується рівновагою між клітинами, що утворюються і клітинами, що гинуть. Саме у цій фазі спостерігається максимальна біомаса (вихід або врожай) і максимальна сумарна кількість клітин.

- Фаза відмирання: спостерігається зниження кількості живих клітин, і підвищення гетерогенності популяції (іноді спостерігається автоліз-лізис під дією власних ферментів).

- Фаза виживання: в умовах загибелі більшості клітин популяції, окремі одиниці виживають. І якщо їх пересіяти у свіже поживне середовище, клітини починають активно рости, хоча і характеризуються низькою інтенсивністю процесів метаболізму [16].

3.1 Швидкість експоненційного росту

Експоненційна фаза - ця фаза характеризується максимальною швидкістю поділу клітини. У цій фазі процеси росту проходять збалансовано (тобто подвоєння біомаси супроводжується подвоєнням кількості білка, ДНК, РНК та ін.). Можна сказати, що культура в експоненційній фазі складається із "стандартних" клітин. Вплив факторів зовнішнього середовища, складу поживного середовища на ріст мікроорганізмів визначають, спостерігаючи за показником біомаси чи кількістю клітин саме під час експоненційного росту [16].

Швидкість експоненційного росту - це міра швидкості росту клітин в експоненційній фазі. Її визначають за формулою (3.1)

, (3.1)

де lg e = 0,43429.

Швидкість експоненційного росту (питома швидкість росту) може бути також розрахована за формулою (3.2)

(3.2)

Згідно з умовою t = 12, а t₀ = 4 год. Визначаємо за графіком (Рис. 3.1.) концентрацію біомаси у момент часу t та t₀. Маємо, що:

Х_t = 1,9 г/л;

Х ₀ = 0,6 г/л.

Рис. 3.1. Швидкість росту

Отже, швидкість експоненційного росту між 4 та 12 годинами культивування згідно з розрахунком становить:

м=(ln1,9-ln0,6)/ (12-4)=1,15/8=0,144 год.

3.2 Визначення рівня біомаси

Рівень біомаси X (концентрація біомаси) - це різниця між максимальною (у стаціонарній фазі росту) та вихідною біомасою бактерій.

X = X_max X₀ (3.3)

Цю величину виражають у грамах (міліграмах) сухої речовини, яка міститься у літрі (мілілітрі) культуральної рідини або клітинної суспензії. Біомасу визначають за допомогою прямих і непрямих методів. У повсякденній практиці перевага надається непрямим методам (з використанням відповідного калібрувального графіка) [15].

Рис. 3.2. Рівень біомаси

Згідно з наведеним графіком (Рис. 3.2) вихідний рівень біомаси становить 0,5 г/л, а рівень біомаси у стаціонарній фазі росту - 3,6 г/л. Отже, згідно з рівнянням концентрація біомаси становить:

Х = 3,6-0,5 =3,1 г/л

3.3 Економічний коефіцієнт

Важливим показником періодичного процесу є відношення концентрації біомаси до кількості спожитого субстрату - X/S. Якщо ці дві величини виражені у вагових одиницях, то відношення X/S називають економічним коефіцієнтом (Y). Економічний коефіцієнт може бути розрахований також як відношення біомаси до заданого субстрату. Якщо врожай у грамах відноситься до кількості молей спожитого субстрату, то одержану величину називають молярним економічним коефіцієнтом [16].

Згідно з умовою:

- початкова концентрація глюкози у середовищі становить 1 % або]г/л,

- рівень біомаси становить 3,1 г/л,

Отже, економічний коефіцієнт складе:

Y= X/S = 3,1/10= 0,31 або 0,31100= 31 %.

Висновок: Економічний коефіцієнт не є високим, оскільки найвища його межа на практиці може становити близько 50 %. Адже частина субстрату йде на енергетичні витрати. Щоб збільшити цей показник, потрібно переглянути доцільність даного субстрату для цього продуцента. Також можна покращити (збільшити чи зменшити) засвоєння тих чи інших компонентів поживного середовища.

3.4 Тривалість лаг-фази

Тривалість лаг-фази визначають як проміжок часу між моментом t_r, в який культура досягла певної біомаси Х_r, і моментом часу t_t, в який вона могла б досягти такої ж біомаси, якби одразу ж після інокуляції починався експоненційній ріст.

Для визначення тривалості лаг-фази на кривій росту (Рис. 3.3.) проводимо теоретичну пряму, паралельно тій частині кривої, що відображає експоненційний ріст культури. Тривалість лаг-фази визначають за формулою:

, (3.4)

(3.5)

За умовою X₀=0,5 г/л; приймемо X_r таким, що дорівнює 2 г/л. На реальній і теоретичній кривих визначаємо час t_r і t_t, необхідний для досягнення 2 г/л біомаси: t_r=13 год, а t_t=8 год. Швидкість росту розрахуємо за першою формулою для реальної кривої в інтервалі часу t_r= 13 год. та t_t=8 год. За реальною кривою визначаємо X_r=2 г/л; X_t =1,3 г/л. Отже, швидкість росту:

м = (2,3•(lg2-lg1,3))/(13-8) =2,3·0,187/5 = 0,086 год^-1.

Рис. 3.3. Тривалість лаг-фази

Знаючи швидкість росту, можна визначити тривалість лаг-фази:

T = 8 - (ln2 - ln1,3) /0,086 = 8-0,430/0,086 = 85 = 3 год

Отже, тривалість лаг-фази становить приблизно 3 год.

Висновок: Лаг-фаза для даного процесу знаходиться в межах норми. Це може означати, що пристосувальний до умов культивування етап відбувся без ускладнень. Можливо, були застосовані наступні заходи для скорочення лаг-фази:

- як посівний матеріал використовували клітини культури із середини експоненційної фази;

- середовище для отримання посівного матеріалу і для виробничого процесу має бути однаковим за складом;

- підживлювали середовище дробним внесенням.

Завдання 2. Визначити константу швидкості поділу (н) та тривалість генерації (g), якщо:

- початкова концентрація клітин становить 10³, а через 5 годин-10⁸.

Розв'язання

Як відомо, бактерії розмножуються шляхом бінарного поділу, тому їх кількість збільшується в геометричній прогресії: 2°>2№>2І>2і>...2?. Якщо на одиницю об'єму періодичної культури, що росте, припадає N₀ клітин, то після n поділів отримаємо N = N₀ • 2? клітин. Логарифмуючи, отримаємо:

lg N = lg N₀ + n lg 2, (3.6)

звідси кількість клітинних поділів:

n = (3.7)

Кількість клітинних поділів за 1 год (константа швидкості поділу н) визначають за формулою:

н = = (3.8)

Час, потрібний для одного циклу поділу (тривалість генерації g), визначають за формулою:

(3.9)

Якщо за 5 год кількість клітин у суспензії збільшується з 10³ до 10⁸, то константа швидкості поділу:

н = (lg 10⁸- lg 10³) / 5• 0,3010 = (8-3) / 1,505 =3,322.

Тривалість генерації g = 1 / н = 1 / 3,322 = 0,3 год.

Отже, тривалість одного циклу складає 0,3 год.

Висновок: Клітини з таким показником генерації вже адаптувалася до даних умов культивування. Це свідчить про високу придатність даного середовища для росту, про наявність достатньої кількості потрібних ферментів для його засвоєння, а також, у випадку ауксотрофів (організмів, які потребують факторів росту) наявність в достатній кількості і співвідношенні амінокислот, пуринів та піримідинів, вітамінів та споріднених сполук.



Розділ 4. Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів

Завдання 1.Чи правильно вказаний склад поживного середовища (г/л)? Якщо так, для вирощування яких мікроорганізмів це середовище може бути використане?

Ацетат калію - 0,2 %

NH₄NO_3-1,8

KH₂PO_4-2,0

CaCl₂Ч2H₂O - 0,05

MgSO₄Ч7H₂O - 1,0

FeCl₃Ч6H₂O - 0,001

Поживні середовища, на яких вирощують мікроорганізми, мають відповідати таким мінімальним вимогам: у них мають бути присутні всі елементи, з яких будується клітина, при чому в такій формі, в якій мікроорганізми здатні їх засвоювати.

До складу бактеріальної клітини входять такі елементи, % до маси сухої речовини:

вуглець - 50;

кисень - 20;

азот - 10-14;

водень - 8;

фосфор - 3;

сірка, калій, натрій - 1;

кальцій, магній, хлор - 0,5;

залізо - 0,2;

решта елементів - близько 0,3.

Тільки невелика кількість елементів періодичної системи потрібна мікроорганізмам у відносно високих концентраціях (>10^-4 M). Це десять головних біологічних елементів: вуглець, кисень, водень, азот, сірка, фосфор, калій, магній, кальцій та залізо (табл.4.1).

Таблиця 4.1. Головні біологічні елементи (макроелементи), їх джерела і функції

Елемент	Джерело	Функції в метаболізмі
C	Органічні сполуки, CO2	Основний компонент клітинного матеріалу
O	O2,H2O, органічні сполуки, CO2	Основний компонент клітинного матеріалу
H	H2, H2O, органічні сполуки	Основний компонент клітинного матеріалу
N	NH4+, NO3-, N2, органічні сполуки	Основний компонент клітинного матеріалу
S	SO4+, HS-, S0, S2O32-, органічні сполуки сірки	Компонент цистеїну, метионіну, тиамін-пірофосфату, коферменту А, біотину та б-ліпоєвої кислоти
P	HPO42	Компонент нуклеїнових кислот, фосфоліпідів та нуклеотидів
K	K+	Основний неорганічний катіон у клітині, кофактор деяких ферментів
Mg	Mg2+	Кофактор ферментів (наприклад, кіназ), присутній у клітинних стінках, мембранах та ефірах фосфорної кислоти
Ca	Ca2+	Кофактор ферментів, входить до складу екзоферментів (амілаз, протеаз), Са 2+-дипіколінат є важливим компонентом ендоспор
Fe	Fe2+, Fe3+	Міститься в цитохромах, фередоксинах, інших залізосіркопротеїдах, кофактор ферментів

Крім десяти головних біоелементів, мікроорганізмам необхідні мінорні біоелементи (табл.4.2), джерелом яких, як правило, є водопровідна вода [16].

Таблиця 4.2. Мінорні біоелементи, їх джерела і функції

Елемент	Джерело	Функції в обміні речовин
Zn	Zn2+	Міститься в ферментах (алкогольдегідрогеназа, лужна фосфатаза, альдолаза, PHK- та ДНК-полімераза)
		Закінчення таблиці 4.2
Mn	Mn2+	Міститься в бактеріальній пероксиддисмутазі, кофактор ферментів
Na, Cl	Na+,Cl-	Необхідні галофільним бактеріям
Mo	MoO42-	Міститься в ферментах (нітратредуктаза, нітрогена-за, форміатдегідрогеназа)
Se	SeO32	Міститься в ферментах (гліцинредуктаза, форміатдегідрогеназа)
Co	Co2+	Міститься в коферменті вітамін-В 12-ферментів (глута-матмутаза, метилмалоніл-КоА-мутаза)
Cu	Cu2+	Міститься в цитохромоксидазах та оксигеназах
W	WO42-	Міститься в деяких форміатдегідрогеназах
Ni	Ni2+	Міститься в уреазі, необхідний для автотрофного росту водневих бактерій

У середовищі даного складу ацетат калію є джерелом вуглецю, оксигену, водню та калію; NH₄NO₃ - головним джерелом азоту; KH₂PO₄ - є головним джерелом фосфору і калію; хлорид кальцію (CaCl₂Ч2H₂O) - джерелом кальцію і хлору; MgSO₄Ч7H₂O - джерелом магнію і сірки; Na₂SO₄ - сірки і натрію; FeCl₃Ч6H₂О - заліза і хлору. В даному середовищі присутні всі елементи, що входять до складу основних компонентів клітинного матеріалу. Однак, згідно вихідних даних ми маємо надзвичайно малий вміст вуглецю в середовищі. Тому дане середовище може бути використане, лише для деяких бактерій.

На поживному середовищі такого складу теоретично можна культивувати мікроорганізми класу Mollicutes: Mycoplasma pneumonia, Mycoplasma capricolum, Acholeplasma modicum 19.

Для бактерії Pseudomonas aureofaciens BKM B-2501 найоптимальнішими середовищами для культивування є:

1) Мінерально синтетичне середовище М 9: Na₂HPO_4-6 г/л, KH₂PO_4-3 г/л, NH₄Cl - 1 г/л, NaCl - 0,5 г/л, 1М MgSO_4-2 мл, 1М CaCl_2-1 мл, глюкоза - 2 г/л;

2) Мінерально синтетичне середовище М 9 з нафталіном 1-2 г/л в якості єдиного джерела вуглецю та енергії;

3) Синтетичне трис-мінеральне середовище складу, г/л: трис - 6,06, NaCl - 4,68, KCl - 1,49, NH₄Cl - 1,07, Na₂SO_4-0,43, MgCl₂Ч6H₂O - 0,2, CaCl₂Ч2H₂O - 0,03, Na₂HPO₄Ч12H₂O - 0,23, FeNH₄ цитрат - 5 мг/л, рН 7.

В якості джерела вуглецю і енергії в середу додають глюкозу (2 г/л) або нафталін (1 г/л). Трис-мінеральне середовище, що містить мінімальну кількість фосфат-аніонів і трис, використовується для запобігання преципітації Со ²⁺ і Ni²⁺ і підтримання рН середовища, відповідно. Розчини металів у вигляді сульфату нікелю (NiSO₄) додають у середовище в концентрації від 20 мкМ до 2 мМ [14].

Завдання 2. Назвіть тип живлення, якщо джерелом енергії є світло, джерелом вуглецю і донором електронів є глутамат.

У класифікації типів живлення у мікроорганізмів використовують термінологію, запропоновану у 1946 р. на симпозіумі у Колд Спринг Харбор [16]. Розглядають типи живлення (трофії) щодо:

1) джерела енергії (хемо - хімічне, фото - світлове);

2) донора електронів (органо - органічна речовина, літо - неорганічна; неорганічними донорами електронів є H₂, NH₃, H₂S, S, CO, Fe²⁺ та ін.);

3) джерела вуглецю (авто - вуглекислота, гетеро - органічна сполука).

Отже, згідно з умовою завдання, щодо джерела енергії тип живлення визначають як фототрофію, щодо донора електронів (глутамат, органічна сполука) - органотрофію, щодо джерела вуглецю (глутамат, органічна сполука) тип живлення визначають як гетеротрофію. Таким чином даний тип живлення - фотоорганогетеротрофія [11].

До цієї групи належать пурпурові (Rhodopseudomonas, Rhodobacter) несірчані бактерії, які у великій кількості населяють забруднені солоні та прісні водойми, насичені сульфідом. Також фотоорганогетеротрофічним типом живлення характеризуються ціанобактерії з окислювальним типом метаболізму, які є важливими об'єктами біотехнології: Spirulina platensis є продуцентом біологічно активних речовин, які використовуються як харчова добавка. Окрім комплексу біологічно активних сполук, спіруліна здатна синтезувати йодовмісні сполуки гормональної природи - тироксин і трийодтиронін, які швидко та ефективно засвоюються організмом людини. Тому спіруліна може бути використана як додаткове джерело легкозасвоюваного йоду [16].

...