Морфолого-культуральні і фізіолого-біохімічні показники бактерії Pseudomonas aureofaciens BKM В-2501

Завдання 3. Концентрація сульфату амонію в середовищі для вирощування бактерій становить 0,9 г/л, а фумарату натрію - 2 г/л. Розрахуйте теоретично можливий рівень біомаси.

Вміст азоту в біомасі бактерій становить 10-14 % від сухої маси речовин. Для визначення рівня біомаси, якого можна досягнути при культивуванні бактерій на середовищі з 0,9 г/л сульфату амонію, потрібно спочатку розрахувати вміст елементного азоту в даній солі. Молярна маса сульфату амонію - (NH₄)₂SO₄ становить 132 г/моль. Отже, у 132 г сульфату амонію міститься 28 г азоту, а в 0,9 г цієї солі вміст азоту дорівнює:

(0,928) / 132 = 0,190 г

Якщо у біомасі міститься 10 % азоту, то за пропорцією визначаємо скільки біомаси можна отримати з 0,190 г азоту:

0,190 г - 10 %

х г - 100 %

х = 1,9 г/л

Фумарат натрію в середовищі для вирощування мікроорганізмів є джерелом вуглецю.

Вміст вуглецю в середовищі становить 50 % від сухої маси речовин. Розрахуємо вміст вуглецю в даній сполуці. Молярна маса фумарату натрію 160 г/моль. Отже, у 160 г фумарату натрію - 48 г вуглецю.

При концентрації фумарату натрію 2 г/л розрахуємо теоретично можливий рівень біомаси:

(2Ч48) / 160 = 0,6 г.

Оскільки 50 % вуглецю окислюється, то залишається лише половина, тобто 0,3 г. Отже, ми обчислили теоретично можливий рівень біомаси за даним поживним середовищем (за кожним елементом окремо). З 2 г/л фумарату натрію може утворитись 0,6 г/л біомаси.

Розділ 5. Енергетичний баланс окиснення субстрату

Завдання: Скласти енергетичний баланс окислення фруктози за наступних умов:

а) катаболізм фруктози здійснюється за КДФГ шляхом;

б) Р/О = 3;

в) ізоцитратдегідрогеназа, малатдегідрогеназа, - НАДФ⁺ залежні ферменти.

Сукупність метаболічних реакцій, що зумовлюють перетворення енергії світла чи хімічних сполук (неорганічних або органічних) у форму, яка може використовуватися у конструктивному метаболізмі (макроергічні сполуки та відновлювальні еквіваленти) називається енергетичним метаболізмом.

Відновлювальні еквіваленти - це протони (атоми водню) та електрони, які утворюються при окисненні субстрату (в окисно-відновних реакціях). Дегідрування - окиснення субстрату, яке відбувається з відщепленням двох протонів. Відбувається за участі ферментів дегідрогеназ.

КДФГ шлях (шлях Ентнера - Дудорова) катаболізму глюкози характерний лише для мікроорганізмів. Його особливість полягає в тому, що інтермедіат (проміжний продукт) - 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконова кислота (КДФГ) унікальний. Поширений у аеробних бактерій, оскільки у анаеробів відсутній дихальний ланцюг, і у них АТФ утворюється під час фосфорилювання на рівні субстрату. Має велике значення, коли субстратами служать такі сполуки як глюконат, манонат, гексуронат [16].

Окисно-відновний потенціал - це кількісна міра здатності тих чи інших сполук або елементів віддавати електрони. Він може бути виміряний експериментально для будь-якої окисно-відновної системи. В залежності від отриманих значень різні речовини формують шкалу таких потенціалів, які прийнято розраховувати відносно потенціалу молекулярного водню.

Аналіз окисно-відновних потенціалів (табл. 5.1) показує, що у дихальному ланцюгу є тільки три етапи окиснення, на яких вивільнюється стільки енергії, скільки міститься в одному макроергічному зв'язку. При перенесенні двох протонів від НАДН на кисень тільки три електронні переходи можуть бути спряжені з фосфорилюванням АДФ у АТФ. Такий зв'язок окиснення та фосфорилювання виражають у вигляді коефіцієнта Р/О.

P/O (Коефіцієнт окисного фосфорилювання) - це відношення кількості фосфорної кислоти (Р), яка була використана на фосфорилювання, у розрахунку на один атом поглинутого кисню (О) [11]. Іншими словами, Р/О - це число молекул АТФ, утворених у розрахунку на один атом кисню. У мітохондріальному дихальному ланцюгу цей коефіцієнт дорівнює трьом, якщо донор електронів є НАДН, і двом, якщо донор електронів ФАД. Відомі навіть пункти утворення АТФ: дегідрування НАДН, окиснення цитохрому b та окиснення цитохрому а. Знаючи співвідношення Р/О, можна скласти енергетичний баланс окиснення субстрату [16].

Таблиця 5.1. Окисно-відновні потенціали компонентів дихального ланцюга, різниця потенціалів та еквівалентні зміни вільної енергії

Згідно з умовою, катаболізм фруктози здійснюється за КДФГ шляхом (рис. 5.1). У цьому разі на 1 моль використаної фруктози кількість утворених відновлювальних еквівалентів НАДН становить:

§ при окисленні фруктози до пірувату - 1 моль НАДН;

§ при дегідруванні пірувату до Ацетил-КоА - 1 моль НАДН;

§ у циклі Кребса: при окисненні 2-Оксоглутарату - 1 моль НАДН; Крім того, при окисненні сукцинату до фумарату утворюється 1 моль ФАДН.

Отже, загальна кількість відновлювальних еквівалентів, утворювана при окисненні фруктози, дорівнює: 1+1+1= 3 моль НАДН і 1 моль ФАДН. При цьому утворюється 2 моль АТФ.

Рис. 5.1. Катаболізм фруктози за КДФГ-шляхом: Ферменти: 1 - глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа; 2 - лактоназа; 3 - фосфоглю-конатдегідратаза; 4 - альдолаза; 5- гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа; 6 - фосфогліцераткіназа; 7 - фосфогліцератфосфомутаза; 8 - гліцератфосфо-мутаза, енолаза

Фруктоза - моносахарид, тому перед залученням до КДФГ шляху відбувається її перетворення в глюкозо-6-фосфат за участю УДФ-вуглеводів (уридиндифосфатпохідних вуглеводів). Ця реакція проходить з витратою АТФ.

При Р/О, що дорівнює 3, з 1 моля НАДН утворюється 3 моль АТФ, а з 1 моль ФАДН - 2 моль АТФ. Отже, кількість АТФ становить: 3 Ч 3 + 2 = 11 моль. Якщо до цього додати 1 моль АТФ, що синтезується при катаболізмі фруктози за КДФГ шляхом та 1 моль АТФ, що утворюється при перетворенні сукциніл-КоА на сукцинат у циклі трикарбонових кислот, одержимо 11 + 2 = 13 моль АТФ. 3 моля НАДФН,які утворились під час процесу катаболзіму фруктози йдуть на реакції конструктивного метаболізму.

Рис. 5.2. Цикл трикарбонових кислот. Ферменти: 1 - піруватдегідрогеназа; 2 - цитратсинтаза; 3 - аконітаза; 4 - ізоцитратдегідрогеназа; 5-2-оксоглутаратдегідрогеназа; 6 - сукцинаттіокіназа; 7 - сукцинатдегідрогеназа; 8 - фумараза; 9 - малатдегідрогеназа

Отже, при окисленні 1 моль фруктози за заданим шляхом утвориться 13 моль АТФ.

Висновки

1. В ході виконання курсової роботи було визначено та охарактеризовано морфолого-культуральні, фізіолого-біохімічні показники бактерії Pseudomonas aureofaciens BKM В-2501.

2. Визначено параметри кривої росту при періодичному культивування мікроорганізмів з отриманням певних результатів:

ь швидкість експоненційної фази росту = 0,144 год

ь концентрація біомаси = 3,1 г/л

ь економічний коефіцієнт = 31 %

ь тривалість лаг-фази = 3 год

ь константу швидкості поділу = 3,322; тривалість генерації = 0,3 год.

3. Визначено тип живлення мікроорганізмів за такими параметрами: якщо джерелом енергії є світло, джерелом вуглецю та донором електронів - глутамат - фотоорганогетеротроф.

4. Теоретично можливий рівень біомаси при концентрації сульфату амонію в середовищі для вирощування бактерій 0,9 г/л - 1,9 г/л біомаси, при концентрації фумарату натрію 2 г/л - 0,6 г/л.

5. В результаті окиснення фруктози за КДФГ шляхом згідно вказаних умов було вирахувано, що з 1 моля фруктози утвориться 13 моль АТФ.

6. Штам Pseudomonas aureofaciens BKM B-2501 використовується для біодеградації (утилізації) ПАВ в умовах забруднення ґрунтів солями нікелю. Володіє більш високою життєздатністю, швидкістю росту, питомою активністю ключових ферментів біодеградації при вирощуванні на мінеральному середовищі в присутності 100 мкМ нікелю. Фітостимулюючі властивості штаму дозволяють використовувати його для створення мікробно-рослинної взаємодії для біоремедіації, а також для покращення росту рослин в присутності ПАВ. Рівень резистентності до нікелю в 4 рази вище, ніж у чутливого варіанта Pseudomonas aureofaciens BS1393.

Список використаної літератури

1. Alvaro Peix, Angel Valverde, Rauґl Rivas, Joseґ M. Igua. Reclassification of Pseudomonas aurantiaca as a synonym of Pseudomonas chlororaphis and proposal of three subspecies, P. chlororaphis subsp. chlororaphis subsp. nov., P. chlororaphis subsp. aureofaciens subsp. nov., comb. nov. and P. chlororaphis subsp. aurantiaca subsp. nov., comb. nov. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology - 2007. - 57, P. 1286-1290.

2. A.J. Kluyver. Pseudomonas aureofaciens Nov. Spec. And Its Pigments / J Bacteriol. 1956 Sep; 72(3), P. 406-411.

3. http://eco.com.ua/ [Електронний ресурс]/ Біодеградація вуглеводнів як вирішення проблеми нафтового забруднення - Матвєєва О.Л., Алієва О.Р. - 02.01.2016 - Режим доступу:http://eco.com.ua/content/biodegradaciya-vuglevodniv-yak-vyrishennya-problemy-naftovogo-zabrudnennya.

4. www.genome.jp/kegg/KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Pathway Database.

22. Анохина Т.О. Ризосферные плазмидосодержащие бактерии рода Рseudomonas, стимулирующие рост растений и деградирующие полициклические ароматические углеводороды/Автореф.дис. канд.биол.наук. - Пущино, 2011.

5. Биодеградация ксенобиотиков / [Електронний ресурс]. Режим доступу - http://www.biotechnolog.ru/prombt/prombt12_1.htm.

6. Біохімічні процеси екологічних технологій [Електронний ресурс]: курс лекцій з дисципліни для студ. напряму 6.040106 "Екологія, охорона навколишнього середовища та збалансоване природокористування" ден. та заочн. форм навч. / уклад. Н.О. Бублієнко, О.І. Семенова, Т.Л. Ткаченко. - К.: НУХТ, 2012. - 49 с.

7. Бактерии рода Pseudomonas / Смирнов В.В., Киприанова Е. А; Отв. ред. Айзспман Б. Е.; АН УССР, Ин-т микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного. - Киев: Наук, думка, 1990. - 264 с. - ISBN 5-12-001610-3.

8. Воронин А.М. Генетические системы биодеградации: организация и регуляция экспрессии / A.M. Воронин, Т.В. Цой // Микробиология. 1989. -Т. 25, №4. -С. 581-594.

9. Ровинский Ф.Я., Теплицкая Т.А., Алексеева Т.А. Фоновый мониторинг полициклических apоматических углеводородов. Ленинградгидрометеоиздат. -1988. УДК 502.55:632.95.

11. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии // Под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Академия, 2005. - 604.

12. Определитель бактерий Берджи.: Пер. с англ. / Под. ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита,Дж. Стейли, с. Уильямса. М.: Мир.1997. -Том 1, 2.

13. Патент № 1805849 РФ. Технологический регламент по производству бактериального препарата Псевдобактерин-2, ПС - № 436 от 27.10.2014.

14. Патент № 2509150 РФ. Ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов и способ ремедиации нефтезагрязненных объектов/ Ильичева Т.Н., Мокеева А.В. Шестопалов А.М. - Опубл.10.03.2014.

15. Патент № 2396339 РФ. Штам бактерії Pseudomonas aureofaciens BKM B-2501 для біодеградації поліциклічних ароматичних вуглеводнів в умовах забруднення ґрунтів солями нікелю/ Анохина Т.О., Сиунова Т.В., Сизова О.І. - Опубл. 10.08.2010.

16. Пирог Т.П. Загальна біотехнологія: підручник / Т.П. Пирог, О.А. Ігнатова. - К.: НУХТ, 2009. - 336 с.

17. Пирог Т.П. Загальна мікробіологія: підручник / Т.П. Пирог. - К.: НУХТ, 2004. - 471 с.

18. Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика/Автореф.дис. канд. биол. наук - Пермь-2010.

19. Сиунова Т.В., Анохина Т.О., Машукова А.В., Кочетков В.В. Микробиология, Ризосферный штамм Pseudomonas chlororaphis, способный к деградации нафталина в присутствии кобальта/никеля. - 2007, том 76, № 2, с. 212-218.

20. Токовенко І.П., Малиновська Л.П. Використання невуглеводних субстратів. - С. 41-44.

21. Хархун Е.В. Использование антагонизма Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens при создании экспериментального биопрепарата и его влияние на состояние микробоценоза почвы / Автореф. дис. канд. биол. наук - Ростов-на-Дону - 2013.

22. Чачина С.Б., Болтунова С.В., Черкашина Н.В. Деструкция углеводородов нефти с использованием микробиологических препаратов "Байкал-Эм", "Тамир", "Восток" / Омский научный вестник- № 1 (138). - 2015.

Размещено на Allbest.ru