Применение методов in vitro в селекции растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Применение методов in vitro в селекции растений



1. Преодоление прогамной и постгамной несовместимости в культуре in vitro

При отдаленной гибридизации и получении межвидовых и межродовых гибридов существующие механизмы несовместимости затрудняют получение фертильных гибридов. Различают гетероморфную и гомоморфную несовместимость. Гетероморфная несовместимость связана с различиями в морфологии цветков (например, различие в длине тычинки и пестика - гетеростилия). Несовместимость гомоморфная не связана с морфологией цветка, но определяется взаимодействием отцовского гаметофита и тканей столбика материнского организма. В конечном итоге пыльца не прорастает в столбик и оплодотворение не совершается. Выделяют также прогамную и постгамную несовместимость. В первом случае механизмы несовместимости проявляются до оплодотворения, во втором - после оплодотворения.

Для преодоления прогамной несовместимости применяют оплодотворение in vitro. Используют два варианта такого оплодотворения. В первом случае столбик пестика материнского растения, кастрированного за 2-3 дня до цветения, укорачивается в стерильных условиях, и завязь помещают на питательную среду. В день опыления из стерилизованных пыльников отцовского растения извлекается пыльца, которая наносится в стерильных условиях на срез завязи.

Во втором случае завязь вскрывают и на питательную среду переносят кусочки плаценты с семяпочками, готовыми к оплодотворению. Пыльцу, подготовленную указанным выше способом, переносят на питательную среду вблизи плаценты с семяпочками или прямо на ткани плаценты. Оплодотворенные семяпочки в отличие от неоплодотворенных быстро увеличиваются в размерах. С использованием такого метода было произведено опыление и получение жизнеспособных семян при самоопылении у самонесовместимых видов семейства маковых, кукурузы, а также при опылении чужеродной пыльцы при отдаленной гибридизации маковых, пасленовых, гвоздичных. Этот метод был использован для получения межвидовых гибридов табака.

В процессе отдаленной гибридизации может наблюдаться явление постгамной несовместимости, выраженной в аномалиях развития гибридного организма на пути от оплодотворения до формирования семян. В этом случае преодолеть несовместимость поможет культура изолированных зародышей (эмбриокультура). Изоляцию и культивирование зародышей производят на различных этапах их развития в зависимости от особенностей культуры и целей эксперимента. Различают гетеротрофную фазу развития зародыша, на которой он зависим от эндосперма и материнских тканей; и автотрофную фазу, на которой зародыш способен синтезировать необходимые для развития питательные вещества, используя минеральные соли и сахарозу питательной среды. Таким образом, чем менее развит зародыш, тем более богатой компонентами должна быть питательная среда для его культивирования. Зрелые зародыши культивируют на простых средах, содержащих минеральные соли и сахарозу. Недифференцированные зародыши выращивают на среде, обогащенной витаминами, фитогормонами,

Питательными средами для эмбриокультуры служат модифицированные среды Мурасиге и Скуга, Гамборга, Уайта и др. Концентрация сахарозы варьирует от 8-12% для недифференцированных зародышей до 2-3 % для зрелых зародышей. Источником аминокислот служат обычно гидролизат казеина (от 50 до 500 мг/л) или смесь аминокислот. При культивировании незрелых зародышей в среду добавляют витамины группы В, аскорбиновую кислоту, биотин, инозитол. Зрелые зародыши могут нормально расти на средах без гормонов, для культивирования незрелых зародышей необходимо добавление цитокининов и ауксинов. Незрелые зародыши культивируют также часто с добавлением экстрактов неопределенного состава типа жидкого эндосперма каштана, кукурузы, а также подсаживания нуцеллуса, эндосперма и других частей репродуктивной системы данного растения на питательную среду вблизи зародыша.

Культивирование изолированных зародышей как метод преодоления постгамной несовместимости применяется при получении межвидовых, межродовых и межподтрибных гибридов у более, чем 30 родов, в том числе многих плодовых, овощных, декоративных, кормовых и зерновых культур. В некоторых случаях метод может модифицироваться введением промежуточного этапа получения каллуса и растений- регенерантов на его основе. Методом эмбриокультуры получены гибриды между трипсакум и кукурузой, гибриды подсолнечника, устойчивые к засухе, серой и белой гнилям, межвидовые гибриды томатов, межродовые пшенично-ячменные, ячменно-ржаные пшенично-ржаные гибриды, межвидовые гибриды миндаля, хурмы и других растений.

Метод эмбриокультуры успешно применяется для выращивания растений из щуплых семян, а также для преодоления покоя семян путем яровизации зародышей. В последнем случае удается вывести семена из состояния покоя и сократить период их выращивания. К примеру, семена ириса не прорастают до 2-3 лет, а метод эмбриокультуры позволяет получать растения для пересадки в грунт за 3,5- 4 месяца. Метод эмбриокультуры используется также для культивирования гаплоидных зародышей.

2. Индукция гаплоидов в культуре тканей и использование гаплоидов и дигаплоидов в селекции растений

Под гаплоидами имеются в виду особи, несущие одинарный или гаплоидный набор непарных хромосом. В природе гаплоиды могут возникать спонтанно с частотой один гаплоид на 10⁵ -10⁶ растений. Гаплоидные растения отличаются меньшей высотой стебля, позднеспелостью и, как правило, стерильны. Для востановления исходного набора хромосом гаплоиды обрабатывают колхицином, что позволяет получить фертильные растения, полностью гомозиготные по всем аллельным генам. Возможно и спонтанное восстановление уровня плоидности в процессе деления клеток. Гаплоидный уровень генотипа позволяет вести отбор рецессивных мутаций, проявляющихся фенотипически. Все генетические «изъяны» организма на гаплоидном уровне обнаруживаются легче, чем на диплоидном. Кроме того, у гаплоидов не проявляются генетические эффекты доминирования, но хорошо идентифицируются аддитивные и особенно эпистатические эффекты генов, что позволяет вести отбор ценных генотипов с такими эффектами.

Применение гаплоидов в селекции растений позволяет решить следующие задачи:

1. Быстрое получение константного нерасщепляющегося материала после гибридизации (в F₂), гомозиготного по всем аллельным генам. В этом случае длительность селекционного процесса у самоопылителей сокращается на 3-4 года. Весьма перспективен такой подход для гетерозисной селекции, где создание инцухт- линий растянуто во времени на 5-6 лет;

2. Эффективный отбор мутантов, т.к. при отсутствии явления доминирования все гены гаплоидов фенотипически проявляются и идет элиминация организмов, несущих летальные и полулетальные гены;

3. Получение моносомных линий и их использование для генетического анализа и хромосомной инженерии;

Первое гаплоидное растение обнаружили Блэксли с соавторами в 1922 году и предложили использовать гаплоиды в селекции. В культуре in vitro гаплоидные растения были получены впервые Гуха и Магешвари в 1964 году при культивировании незрелых пыльников дурмана. Получение гаплоидов на основе методов культуры in vitro возможно тремя способами:

Андрогенез - развитие гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников или микроспор (Рис. 1)



Рис. 1. Формирование эмбриогеных структур (а) и регенерантов (б) у пшеницы T.aestivum в культуре пыльников (Орлов, Сидоров, 2003)

Возможен прямой андрогенез, когда из пыльников развиваются эмбриоиды, а затем растения, а также непрямой андрогенез, когда образованию эмбриоидов предшествует стадия формирования каллуса. Предпочтительнее прямой андрогенез, поскольку каллус может образовываться как из микроспор, так и из соматических клеток пыльника. В последнем случае формируются гетерозиготные растения.

Гиногенез -развитие гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек.

Партеногенез - развитие гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы (метод гаплопродюсеров).

Метод изолированных пыльников и микроспор получил наибольшее распространение, он применяется более, чем для 250 видов растений, в том числе для таких хозяйственно ценных культур, как пшеница, рис, кукуруза, ячмень, люцерна, лен, апельсин, виноград, яблоня и др.. При культуре пыльников не всегда удается исключить размножение диплоидных клеток ткани пыльника, поэтому использование пыльцы там, где это возможно, предпочтительнее. На образование гаплоидов в результате андрогенеза влияют следующие факторы:

Генотип, а также взаимодействие генома и плазмона. Представители ряда семейств (пасленовые, сложноцветные, злаковые и др.) образуют андрогенные гаплоиды с большей частотой по сравнению с другими семействами. Наблюдается значительный полиморфизм по способности к андрогенезу в пределах семейств, родов и видов растений. Возможно выделение генотипов с высоким андрогенетическим потенциалом и передача этого признака в процессе гибридизации. Устанавливаются локализация и наследование генов, ответственных за образование андрогенного каллуса и эмбриоидов. Показано независимое наследование этих процессов. П.А. Орлов (1995) на примере аллозамещенных линий пшеницы показал, что основные этапы морфогенеза в культуре пыльников (дедифференцировка, пролиферация каллуса, индукция эмбриогенеза) осуществляются под совместным контролем ядерных генов и плазмогенов, о чем свидетельствует усиление или ингибирование морфогенетических процессов при замещении собственной цитоплазмы вида растений на чужеродную.

Физиологические факторы андрогенеза. Важными для успешного андрогенеза in vitro являются возраст, физиологическое состояние и условия культивирования растения- донора, стадия развития пыльцы, оптимальная для изолирования пыльников. Выращенные в поле растения- доноры превосходят тепличные; цветки, образовавшиеся в начале цветения, предпочтительнее появившихся позже. Успешному андрогенезу способствует высокая интенсивность освещения при культивировании доноров пыльников. Лучшие результаты обычно получаются при использовании стадии одноядерной пыльцы, однако оптимум для разных видов может варьировать от стадии тетрад до двуядерного пыльцевого зерна. В качестве специального приема, используемого для повышения эффективности андрогенеза in vitro, может служить холодовая предобработка пыльников перед их посадкой на питательную среду. Срезанные бутоны или колосья помещают в холодильную камеру. Для некоторых пасленовых эффективна обработка в течении 2-3 дней при температуре +3 ⁰ С; для мягкой пшеницы и ее гибридов эффективно содержание изолированных колосьев в течение 7-9 суток при +3 ⁰ С; для рапса можно применять предобработку бутонов при температуре + 4 ⁰ С 1-3 дня. А.П. Ермишин (1998) для повышения андрогенетической способности генотипа картофеля предложил ряд специальных приемов: изменение гормонального баланса донорных растений в результате их прививки на томат или обработки экзогенными гормонами (6- БАП, гиббереллин), подсветка растений дугово-ртутными лампами ДРИ -2000-6 при длине дня 16 часов и освещенности 10-15 тысяч люкс.

Условия культивирования пыльников. Пыльники культивируют на агаровых, жидких или двухфазных средах. Двухфазная среда состоит из двух слоев: твердого слоя агаровой среды и тонкого слоя жидкой среды, расположенного сверху. Питательными средами служат среда Мурасиге- Скуга с половинной концентрацией солей, среда Нич, среда N ₆ и другие. Состав питательной среды отличается более высоким содержанием сахарозы. Для стимуляции андрогенеза часто добавляют ауксины и цитокинины (например 2,4-Д стимулирует андрогенез у пшеницы, кинетин и 2,4-Д - у ячменя). Оптимальная температура культивирования пыльников 25-30 ⁰, условия освещенности - обычно темнота до появления каллусов или эмбриоидов, затем культивирование на свету.

Гиногенез получил меньшее распространение в сравнении с андрогенезом. Тем не менее он успешно применяется для получения гаплоидов у сахарной свеклы, подсолнечника, картофеля, риса, пшеницы, кукурузы, ячменя, табака, хлопчатника, райграса пастбищного. Этот метод может быть использован для получения гаплоидов у мужскистерильных растений. Для получения гиногенных гаплоидов используют неопыленые завязи и семяпочки. Начало растению могут дать яйцеклетка, а также синергиды и антиподы, а также окружающие зародышевый мешок клетки соматических тканей (нуцеллус, интегумент). В этом случае регенеранты могут стать диплоидными или полиплоидными. Гиногенез аналогично андрогенезу может быть прямым и непрямым. В последнем случае эмбриоиды образуются из каллуса. А.М. Свирщевская, В.Е. Бормотов (1994) разработали основные приемы культивирования неоплодотворенных семяпочек сахарной свеклы на питательных средах с 6 БАП, повышенным содержанием меди и сахарозы, а также применением ионообменных смол на стадии адаптации гиногенетических линий, что позволило получить растения с хорошо развитым листовым аппаратом и сформированными корнями. Линии представляют хозяйственную ценность по продуктивности и сахаристости и вовлечены в гетерозисную селекцию сахарной свеклы.

Партеногенез (метод гаплопродюсеров) Суть метода получения гаплоидов на основе партеногенеза заключается в гибридизации нескрещиваемых видов растений, в результате которой вследствие генетической несовместимости происходит элиминация отцовских хромосом и начинает развиваться гаплоидный зародыш. Наиболее успешно отработана методика такого получения гаплоидов у ячменя, где в качестве гаплопродюсера используют вид Hordeum bulbosum (ячмень луковичный) (табл. 1).

Таблица 1. Общая схема получения удвоенных гаплоидных линий Hordeum путем межвидовой гибридизации и элиминации хромосом

Время	Этапы работы
Месяцы	Дни
1-4		Получение гибридных семян F1
4		Выращивание гибридов F1	Выращивание растений H. bulbosum (2n)
6	0	гибриды F1 H. vulgare (2n)	H. bulbosum (2n)
	2	Кастрация Сбор свежей пыльцы Опыление
	3-5	Обработка ГА3 (1 капля на цветок в течении 2-3 дней, концентрация 75 мг/л)
	14-16	Извлечение и культивирование зародышей в темноте
	22-28	Культура дифференцированных зародышей при 12 - часовом освещении
8		Удвоение числа хромосом у гаплоидных проростков с помощью колхицина (0,1% в течении 5 часов)
11		Сбор семян удвоенных гаплоидов
11-14		Продолжение программы в течении 3-х месяцев с выходом 100 гаплоидов в неделю
14		Размножение семян
20		Повторные полевые испытания
24		Оценка качества
Всего два года от родительских генотипов до повторных полевых испытаний 600-800 гаплоидных линий

Для получения гаплоидов у пшеницы и овса используют в качестве гаплопродюсера кукурузу. Опыленные колосья обрабатывают раствором 2,4-Д для оптимизации условий развития зародышей.

Регенеранты, полученные одним из методов, описанных выше (андрогенез, гиногенез, партеногенез), различаются по генотипу и фенотипу. Изменчивость, проявляющаяся при получении гаплоидов, называется гаметоклональной. Наиболее частое проявление такой изменчивости -альбинизм растений, вызванный хлорофиллдефектностью. Такие растения не способны к фотосинтезу и могут культивироваться только в условиях in vitro. Возможные причины альбинизма- мутации ядерных или пластидных генов. Альбинизм чаще проявляется у андрогенных гаплоидов и реже - у гиногенных.

При получении гаплоидов среди регенерантов могут возникнуть полиплоиды, дигаплоиды, анеуплоиды, миксоплоиды. Андрогенные полиплоидные растения могут быть гомо -и гетерозиготными. Гетерозиготные полиплоиды и диплоиды развиваются из микроспор, имеющих нередуцированное число хромосом. Образование гомозиготных диплоидных растений (дигаплоидов) при андрогенезе происходит из гаплоидных микроспор. В связи с частой цитогенетической изменчивостью при получении гаплоидов необходим цитологический контроль уровня плоидности у полученных растений- регенерантов. Так, например, А.П. Ермишин (1998) получил широкий спектр цитогенетической изменчивости среди андрогенных регенерантов картофеля. (табл.2

Табл.2. Анализ хромосомного состава растений-регенератов, полученных в культуре пыльников картофеля.

Сорт	2х (24 хромосом)	Анеуплоиды 2х	3х (36 хромосомы)	Анеуплоиды 3х	4х (48 хромосом)	Анеуплоиды 4х	Химеры
	количество	%	количество	%	количество	%	количество	%	количество	%	количество	%	количество	%
Ирис	20	15,3	19	14,5	13	9,9	20	15,3	30	22,9	11	8,4	18	13,7
Ласунак	7	12,5	12	12,4	4	7,1	10	17,9	8	14,3	5	8,9	10	17,9
Отрада	7	14,6	6	12,5	6	12,5	11	22,9	11	22,9	3	6,3	4	8,3

По хромосомному составу растения -регенеранты подразделялись на четыре группы: 1) дигаплоиды (2х=24) и анеуплоиды с числом хромосом, близким к 24;

2) триплоиды (3х=36) и соответствующие анеуплоиды; 3)тетраплоиды (4х=48) и соответствующие анеуплоиды; 4) химерные формы, имеющие клетки с различным уровнем плоидности. Доли каждой из трех первых групп были приблизительно одинаковы, химер - несколько меньше. Доля дигаплоидов составила 12-15 %.

Изменчивость среди гаплоидных регенерантов по хозяйственно-ценным признакам можно повысить, если использовать для получения гаплоидов не константный материал, а гибриды F₁. Образующиеся гаметы у гибридов F₁ в результате рекомбиногенеза будут нести различные комбинации генов родителей. Перевод полученных гаплоидов на диплоидный уровень позволит быстро использовать широкий спектр изменчивости у константных дигаплоидов. Получение дигаплоидов от гаплоидов возможно спонтанно или путем использования колхицина. Первый путь предпочтительнее, поскольку упрощает процесс получения дигаплоидов. Использование гаплоидов, полученных in vitro получает все большее распространение в селекционной практике. Так, китайские селекционеры создали с применением культуры пыльников новые высокоурожайные сорта риса и пшеницы. Созданные за короткий срок, эти сорта занимают уже большие площади: рис - 170 000 га и пшеница - 70 000 га (Бутенко, 1990). В США получены двойные межлинейные гибриды кукурузы, созданные с участием гаплоидов. Помимо кукурузы, гаплоидию можно эффективно применять в селекции на гетерозис картофеля, люцерны, сорго, сахарной свеклы, подсолнечника, рапса, капусты, моркови и др.)

В Германии получены перспективные формы табака, новые межвидовые и межродовые гибриды зерновых и люпина, более 1000 клонов картофеля. В СНГ на основе гаплопродюсеров созданы два сорта ячменя Исток и Одесский 115 (ВСГИ, Одесса), ведутся интенсивные работы по получению гаплоидов у пшеницы (Саратовский ГУ), тритикале, рапсу (Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Бел НИИ земледелия и селекции), картофелю (НИИ картофельного хозяйства, Россия; Институт генетики и цитологии НАН Беларуси) и др.

Гаплоидия может быть успешно использована для преодоления межвидовой несовместимости у видов с разным уровнем плоидности. Так, например, дикие виды картофеля являются диплоидными, в то время как культурный картофель - тетраплоид. Получение дигаплоидов от тетраплоидов, вовлечение их в гибридизацию с дикими диплоидными видами, отбор ценных форм и последующее восстановление у них тетраплоидного уровня представляет интерес для селекции картофеля. А.П. Ермишиным (1990) предложена оригинальная схема гетерозисной селекции картофеля с использованием оценки комбинационной способности ди- и тетраплоидных родителей. Вегетативный способ размножения культуры позволяет закрепить достигнутый гетерозисный эффект.

3. Клеточная селекция растений

Культивирование растительных клеток в культуре in vitro приводит, как правило, к накоплению генетической изменчивости. Полученные от этих клеток растения - регенеранты отличаются от исходных растений. Австралийские ученые Ларкин и Скоукрофт (1981) предложили термин «сомаклоны» для растений, прошедших стадию неорганизованного роста in vitro. Само явление возникновения новых форм растений в результате накопления генетической изменчивости в растительных клетках, культивированных in vitro, называются сомаклональной изменчивостью. Для обозначения растений -регенерантов и их потомков приняты следующие термины:

R- растение - регенерант; R_1, R₂ и т.д.- первое, второе и последующие самоопыленные поколения растения-регенеранта;

SC - сомаклон; SC_1, SC₂ и т.д.- первое, второе и последующие самоопыленные поколения сомаклона.

Изменчивость, проявляющуюся у растений, регенерировавших в результате культивирования протопластов, называют протоклональной изменчивостью, регенерировавшие растения- протоклонами.

Причинами проявления сомаклональной изменчивости могут быть:

1. Наличие генетической изменчивости в соматической ткани, используемой в качестве экспланта для введения в культуру in vitro;

2. Переход растительных клеток в виде каллуса, суспензии или протопластов в недифференцированное состояние;

Длительное выращивание в культуре in vitro;

Использование специфических компонентов среды или фитогормонов.

Сомаклональная изменчивость может проявляться в следующих формах:

1. Цитогенетическая изменчивость (полиплоидия, анеуплодия, транслокации, делеции, инверсии, дупликации);

2.Генетическая изменчивость, связанная с мутациями генов ядра и цитоплазмы, транспозонами, амплификацией и редукцией генов, активацией ранее репрессированных генов, соматическим кроссинговером;

3. Негенетическая изменчивость (элиминация вируса, эпигенетические изменения).

На проявление сомаклональной изменчивости сильно влияют генотип, орган растения, используемый в качестве экспланта, условия культивирования и регенерации растений.

В соматических тканях растений проявляется естественное генетическое разнообразие. Установлено, что в меристемных тканях в ходе дифференцировки почти у 80% покрытосеменных на различных этапах онтогенеза может происходить эндоредупликация хромосом и формирование тканей различного уровня плоидности. Возможно также образование клеток с анеуплоидным числом хромосом. В результате образуются миксоплоиды (организмы -химеры), ткани различаются по набору хромосом в геноме. Особенно часто накопление таких соматических мутаций наблюдается у вегетативно размножаемых растений (картофель, плодовые и др.). Естественный соматический мутагенез и миксоплоидия как его результат могут быть усилены при культивировании организма в стрессовых условиях (повышенная или пониженная температура, засоление, и др.). Такие условия могут вызывать нарушения в митозе и привести к изменению числа хромосом. Таким образом, культивирование соматических миксоплоидных тканей растений является потенциальным источником генетической изменчивости и представляет интерес для селекции.

Помещение соматических клеток в культуре in vitro усиливает частоту и спектр генетической изменчивости. При этом ткань экспланта выходит из под контроля организма, что приводит к изменению гормонального баланса. Экзогенные гормоны, содержащиеся в среде, могут вызывать нарушения клеточного цикла. В целом для ткани культивирование in vitro может рассматриваться как стресс (увеличение раневой поверхности, изменение гормонального баланса и др.), в результате которого усиливается генетическая и эпигенетическая изменчивость в клетках соматических тканей (поли - и анеуплоидия, точковые мутации, передвижение мобильных элементов, соматический кроссинговер, амплификации и др.). При генетической изменчивости образуется миксоплоид, эпигенетическая изменчивость не наследуется. Наиболее часто генетическая изменчивость в культуре in vitro наблюдается у протопластов, поскольку одиночные клетки сильнее подвержены стрессовым условиям.

Длительность культивирования in vitro также увеличивает частоту возникновения мутаций в соматических тканях. Так, например, в каллусной ткани, индуцированной из молодых зародышей диплоидного культурного ячменя (2n=14) может образоваться до 40% тетраплоидных и до 30 % анеуплоидных клеток (Першина, 2000). Однако в процессе регенерации селективное преимущество получают как наиболее жизнеспособные диплоидные растения (до 99 %).

Генетические изменения могут происходить не только в ядре, но и цитоплазме (митохондрии, пластиды). Так, при культивировании каллусной ткани, полученной из незрелых зародышей кукурузы с техасским типом цитоплазмы (мужскистерильной), обнаружены мужскифертильные регенеранты, причем признак наследовался по материнской линии. Анализ регенерантов на молекулярном уровне выявил наследованные изменения в митохондриальной ДНК.

Выявлены также сомаклональные мутации пластидного генома. Примером могут быть альбиносные мутации, вызванные хлорофиллдефектностью. Установлено, что причиной такого рода мутации могут быть делеции хлоропластной ДНК.

Влияние генотипа и исходного экспланта. Генотип определяет способность экспланта к каллусообразованию и регенерации, а также размах и спектр сомаклональной изменчивости. При этом на частоту сомаклональных мутаций влияют уровень плоидности, гетерозиготности, а также взаимодействие ядра и цитоплазмы. У поли- и амфиплоидов частота цитоплазматических мутаций выше. В связи с этим поиск генотипов с высокой способностью к каллусообразованию и регенерации может способствовать получению сомаклональных вариантов и их дальнейшему использованию в селекционной работе (Сидоров, 1990).

Важным фактором, влияющим на регенерационный потенциал и сомаклональную изменчивость, является тип экспланта. Так, например, регенеранты, полученные из мезофильных тканей листа картофеля, отличались значительно меньшей частотой сомаклональных вариантов в сравнении с регенерантами, полученными из каллуса, для индуцирования которого использовались лепестки и оси соцветия (12.3% и 50,3% сомаклонов соответственно).

Влияние условий культивирования и регенерации растений. Главным фактором культивирования клеток и тканей in vitro, определяющим частоту сомаклональной изменчивости, является гормональный баланс, определяющий клеточный и тканевый гомеостаз. Нарушение гормонального баланса, в особенности под воздействием гормонов питательной среды, может приводить к нарушениям в митозе и цитогенетической разнокачественности клеточных популяций. Кроме гормонов, на сомаклональную изменчивость могут влиять и другие компоненты питательной среды (макро- и микроэлементы, сахароза, витамины), а также физические условия культивирования.

Состояние каллусогенеза, а также длительность неорганизованного роста клеточных культур усиливают частоту появления сомаклонов. Поэтому число мутаций у регенерантов, полученных при непрямом органогенезе или эмбриогенезе, выше по сравнению с прямым.

Условия и направление регенерации также изменяют частоту отклонений у регенерантов. У регенерантов, полученных методом соматического эмбриогенеза цикл развития «дедифференцированная клетка-растение» короче, и частота отклонений меньше в сравнении с органогенезом (Сидоров, 1990).

Для направленного регулирования генетических процессов in vitro и снижения частоты сомаклональной изменчивости в суспензионной культуре и культуре протопластов подобраны специальные среды. Это особенно важно и при клональном микроразмножении растений, где сомаклональная изменчивость нежелательна.

Таким образом, правильно выбирая генотип, эксплант и условия культивирования in vitro, можно увеличить или уменьшить частоту мутаций в соматических тканях клеточных культур.

Частоту и спектр сомаклональной изменчивости можно усилить, используя химические и физические мутагены. Объектами обработки служат каллус, суспензионная культура или культура протопластов. При воздействии мутагенов на клетки каллуса возможно образование тканей, а затем и регенерантов-химер. Возможно также использование эксплантов (семена, зародыши, пыльца и др.), подвергшихся обработке мутагенами.

В качестве химических мутагенов часто используют нитрозогуанидин (НГ); нитрозо-метил (этил) мочевину (НММ, НЭМ); метил (этил) метансульфонат (ММС, ЭМС). Физическими мутагенами могут служить облучение ультрафиолетом УФ, - квантами ⁶⁰Со и нейтронами. Строят кривую зависимости летального действия мутагена от его дозы. Обычно применяют концентрации химического мутагена, дающие летальный эффект 20-50 % (Шамина, 1984). Более высокие дозы могут быть нежелательны, вызывая побочные мутационные изменения (ингибирование регенерации и др.)

Клеточная селекция предполагает отбор естественных или индуцированных мутантов in vitro на клеточном уровне, регенерацию из них растений и идентификацию мутаций в R₀ -- потомстве. Для отбора клеток с желательными признаками используют селективные среды, в основном обеспечивающие системы резистентности к стрессовым воздействиям. В.А. Сидоров (1990) выделяет следующие приемы для отбора мутантных клеток:

1. Прямая (позитивная) селекция, при которой выживает определенный мутантный тип клеток;

2. Непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживании метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений;

3. Тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны;

4. Визуальная селекция и неселективный отбор, когда мутантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических маркеров.

Наиболее распространенной является прямая селекция, основанная на отборе клеток с желаемыми признаками на устойчивость к стрессовым воздействиям (патогены, гербициды, засоление, неоптимальная температура, высокие или низкие значения рН, тяжелые металлы и др.). Как правило, селективные агенты добавляют в состав питательной среды. Для выделения сомаклонов, устойчивых к патогенам, используют среду с токсином, выделяемым патогеном или с культуральной жидкостью, в которой развивался патоген. Для создания форм, устойчивых к засолению, в состав питательной среды добавляют соли Na Cl, Na₂ SO₄.

Для отбора форм с повышенным содержанием незаменимых аминокислот в среду добавляют их токсические аналоги. При этом происходит накопление в клетке основной аминокислоты. Так, например, резистентные к метионинсульфоксилу клетки моркови содержат в 200 раз больше метионина, а резистентные к аминоэтилцистеину накапливают лизина в 50 раз больше, чем в контроле (Шамина, 1984).

Схему прямой селекции мутантов можно представить следующим образом (Сидоров, 1990 с дополнениями):

1. Выделение каллуса, протопластов или суспензионной культуры;

2. Возникновение спонтанной сомаклональной изменчивости в культуре клеток, или ее индуцирование химическими или физическими мутагенами;

3. Культивирование клеток в неселективных условиях;

4. Культивирование клеток на селективных средах (отбор клеточных вариантов);

5. Культивирование колоний клеток на регенерационных средах;

Регенерация растений и их размножение (проведение тестов на устойчивость, биохимические анализы);

7. Высадка растений в почву (тестирование на устойчивость семян, изучение генетической природы устойчивости).

Клеточная селекция растений во многом напоминает селекцию микроорганизмов, и, несмотря на определенные трудности, имеет ряд преимуществ перед традиционными методами отбора:

возможность оперировать с миллионами клеток;

направленный характер селекции благодаря использованию селективного фона;

- возможность перенесения процедуры отбора в лабораторные условия, отсутствие сезонности в работе, контролируемые условия эксперимента и воспроизводимость результатов.

Обязательным условием успешной клеточной селекции является соблюдение следующего принципа- признак растения, по которому ведется отбор, должен проявляться на клеточном уровне.

В ряде исследований установлено, что сомаклональная изменчивость растений проявляется по различным качественным и количественным признакам (биохимическим, физиологическим, морфологическим и др.) Многие сомаклональные варианты, превосходящие исходные сорта по хозяйственно-ценным признакам (урожайность, устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам, качество и др.), представляют большой интерес для селекционеров. Генетический анализ мутаций в соматических клетках показал, что мутации могут быть рецессивными, доминантными, кодоминантными. Мутанты могут быть гомо-или гетерозиготными. Мутации могут касаться как моно-, так и полигенных признаков и иметь место в различных хромосомах. Частота мутаций может быть достаточно высокой (например, у томата она может составлять около одного мутанта на каждые 20-25 растений-регенерантов).

В.А. Сидоров (1990) изучал сомаклональную изменчивость среди протоклонов картофеля, полученных от сорта Зарево. Было получено 320 растений, изученных в полевых условиях (табл. 3). Лишь 20 % протоклонов оказались идентичны исходной форме. Около половины растений регенерантов оказались тетраплоидными, в то время как остальные - анеу- и миксоплоидными формами. Спектр изменчивости среди растений - регенерантов был намного шире при обработке протопластов мутагеном. Ряд форм превышал исходный сорт по урожаю клубней, их количеству и массе, а также содержанию сухого вещества, крахмала и сырого протеина.



Таблица 3. Изменчивость среди протоклонов картофеля по основным количественным признакам (сорт Зарево)

Признак	Х	Хmax	Xmin		у	V
Урожай клубней, г/куст	933	1041	70	478	268	51
Количество клубней, шт./куст	23.7	43.0	5.0	15.0	7.9	52.4
Средняя масса одного клубня, г	39.3	68.6	10.2	35.2	19	48.1
Содержание, %
Сухого вещества	28	33.5	10	27.7	3.6	13.1
Крахмала	18.9	24.5	8.0	19.5	3.6	18.3
Сырого протеина	2.1	2.9	2.1	2.4	0.22	9.1

Примечание. х--значение признака у исходного сорта, х_max и x_min - максимальное и минимальное значения признака, -- среднее арифметическое, у -- стандартное отклонение, v -- коэффициент вариации; коэффициент вариации у данного сорта по урожайности находится в пределах 5--10 %.

Методами клеточной селекции получены линии кукурузы, устойчивые к гельминтоспориозу; картофеля - к альтернариозу, фитофторозу, парше, с более высокой урожайностью, повышенным содержанием протеина и крахмала; линии люцерны с повышенным содержанием метионина; линии люцерны, табака, картофеля, пшеницы, риса, устойчивые к повышенному содержанию в почве солей; формы томата, устойчивые к фитофторозу. Все это свидетельствует о перспективности использования клеточной селекции как принципиально новой селекционной технологии улучшения растений.

4. Гаметная и зиготная селекция растений

Гаметофитный отбор в качестве метода селекции предложен недавно. Теоретически он был основан Д. Малкэхи в 1979 году. Автор высказал мысль, что отбор микрогаметофитов, устойчивых к какому -либо экстремальному фактору, может обеспечить появление спорофитов со сходной устойчивостью.

Важный вклад в развитие исследований по гаметной и зиготной селекции был внесен школой академика А.А. Жученко в Молдавии (А.В. Кравченко, В.А. Лях, Н.Н. Балашова и др.). Отбор по гаметофиту не предполагает обязательного использования техники культивирования in vitro, хотя для оценки параметров пыльцы используют специальные среды. Однако учитывая, что отбор на уровне гаметофита происходит путем элиминации одной или группы клеток, его можно отнести к методам, весьма близким к клеточной селекции in vitro.

С чем связана потребность в методах гаметной селекции? Традиционным для селекционера является отбор на уровне спорофита. Между тем в онтогенезе растений на репродуктивных фазах развития происходит интенсивная элиминация нетрадиционных рекомбинантных генотипов, носящая характер стабилизирующего отбора. До стадии взрослого растения доходит только очень малая часть генотипов. Согласно данным А.А. Жученко, А.Н. Кравченко, у некоторых межвидовых гибридов томата на стадиях гаметогенеза, сингамии, эмбриогенеза, формирования и прорастания семян гибнет свыше 90% рекомбинантных гамет и зигот. Этот процесс в большинстве случаев не контролируется селекционером и протекает в условиях культивирования генотипов F_1.

На этапе развития споры и начала формирования гаметофита (особенно мужского) элиминируется 30-40% и более рекомбинантов. Значительная элиминация отмечается на этапах зрелой пыльцы, начала ее прорастания и роста пыльцевых трубок, оплодотворения, развития зародыша, формирования и прорастания семян. Полученный фактический материал свидетельствует, что селективная элиминация происходит на всех названных критических этапах, в первую очередь "нетрадиционных" рекомбинантов, что приводит к значительному сужению спектра генетической изменчивости и отбору рекомбинантов, лишь незначительно уклоняющихся от исходных генотипов (фиксируются адаптивные формы) в результате действия стабилизирующего естественного отбора.

В эволюционном плане гаплоидное поколение всегда подвергалось более жесткому отбору, чем диплоидное. Это привело к реакции «избежания» гаплоидного гаметофита из-под действия отбора за счет сокращения продолжительности гаплоидной фазы, упрощения строения гаметофита, перемещения его под защиту спорофитного организма.

Особенное значение элиминация генотипов имеет при отдаленной гибридизации. Она сужает спектр доступной генетической изменчивости в селекционной практике, требует разработки принципиально новых методов и подходов, основанных на индуцировании генетической рекомбинации, сохранении рекомбинантных гамет и зигот, повышении эффективности отбора нужных генотипов в расщепляющихся популяциях.

Гаметная селекция имеет ряд преимуществ в сравнении с традиционными методами отбора:

1. Селекционер оперирует с пыльцой или женским гаметофитом, причем в первом случае число генотипов, подвергаемых отбору, исчисляется миллионами. В одной метелке кукурузы до 25 млн. пыльцевых зерен;

2. Малый размер пыльцы позволяет выполнять отбор в лабораторных условиях, используя для этого регулируемые условия среды (фитотрон, теплица), анализировать небольшое количество растений;

3. Гаплоидный генотип гаметофита дает возможность обнаружить редкие рецессивные аллели, выявить сбалансированность генома;

4. Гаплоиды более уязвимы для действия факторов среды, что позволяет вести отбор на устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам;

Гаметная селекция выполняется на уровне:

1. Мужских гаметофитов (этапы зрелой пыльцы, прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок.

2. Женских гаметофитов.

Наиболее часто используется отбор на уровне мужских гаметофитов.

Главное условие успешного отбора на уровне гаметофита - проявление генов, детерминирующих признак, на уровне гаметофита и спорофита. Рядом авторов при изучении ферментов гаметофита и спорофита показано, что приблизительно 60-70 % структурных генов, экспрессирующихся в пыльце, проявляется также в спорофите. Это дает основание вести отбор спорофита по гаметофиту.

Зиготная селекция производится после образования зиготы на различных этапах ее развития вплоть до образования семян.

Цели гаметной и зиготной селекции. Возможны две основные цели селекционного процесса, достигаемых на ранних этапах онтогенеза (рис. 2)

Рис. 2 методы гаметной и зиготной селекции (Жученко, Кравченко,1986)

1. Расширение спектра генетической изменчивости в результате создания комфортных условий для прохождения развития от спорогенеза до образования семян. В этом случае смягчается действие естественного отбора в его стабилизирующей форме, и большее число редких рекомбинантов проходит через «сито» лимитирующих факторов среды. Среднее значение признака х в популяции после такого отбора не изменяется (Рис. 3)

Рис.3. Влияние комфортных условий среды в F₁ на расширение спектра рекомбинантов в F₂

2. Отбор устойчивых генотипов. Для этого направления гаметной и зиготной селекции ставится задача направить спектр изменчивости рекомбинантов в желаемое для селекционера русло путем создания стрессовых условий при развитии гамет и зигот (Рис.4). Среднее значение признака в популяции после такого движущего отбора изменяется. Отобранные генотипы более устойчивы к стрессовому фактору.

Рис.4 Влияние стрессовых условий среды в F₁ на отбор устойчивых генотипов в F₂



Стресс может создаваться путем моделирования абиотических (неоптимальная температура, засоленность), биотических (токсины патогенов) и антропических (поллютанты) факторов среды.

Таким образом, принципиальное отличие методов гаметной и зиготной селекции растений от традиционных подходов в том, что объектом отбора является генотип на ранних стадиях развития, а его пригодность для целей селекции оценивается по реакции на условия среды. В результате можно сохранить уникальные рекомбинанты, возникшие при отдаленной гибридизации, а также изменить генотипическую структуру популяции рекомбинантов в результате гибели неприспособленных генотипов.

Рассмотрим отдельные аспекты методики гаметной и зиготной селекции в зависимости от ее цели на устойчивость генотипов к ботическим и абиотическим факторам.

Методы снижения элиминации генотипов для расширения спектра генетической изменчивости в расщепляющихся поколениях (по А.Н. Кравченко, 1993).

Стимуляция образования спор. Период развития спор, начиная от выхода их из тетрад и до начала формирования гаметофита (первое дифференцирующее деление ядра) у растений довольно длительный и является самым критическим. Поэтому использование различных биологически активных вещества является весьма эффективным. Так, у межвидовых гибридов томата обработка бутонов гибридов F₁ мелангозидом и смесью индолилуксусной кислоты и гиббереллина повышает выход фертильной пыльцы на 22-37%. Кроме биологически активных веществ, на элиминационные процессы на этой стадии влияют температурный фактор и обрыв бутонов в кисти. При анализе структуры популяции наблюдается значительная элиминация рекомбинантных гомозигот по маркерным генам относительно теоретически ожидаемой частоты.

Стимуляция развития и прорастания пыльцы, роста пыльцевых трубок.

При повышении жизнеспособности пыльцы увеличивается ее конкурентоспособность и возможность участия в оплодотворении обычно элиминирующихся рекомбинантных гамет. Стимулирующее действие проявляют химические (витамины В_1, В_6,ИУК, гиббереллины, пыльца других растений, стероидные гликозиды) и физические факторы (Х-лучи, ультрафиолет, видимый свет, пониженные температуры). При нанесении биологически активных веществ на рыльце пестика перед опылением повышается число пыльцевых трубок, дорастающих до завязи, что приводит к значительному расширению спектра генетической изменчивости.

Стимуляция женского гаметофита. При обработке завязей гибридов томата F₁ биологически активными веществами на этапе формирования зародышевого мешка наблюдается повышение осемененности в 1.5-1.8 раза. Еще более эффективным (в два раза) оказывается снижение элиминации рекомбинантов при обрыве бутонов в кисти, что способствует перераспределению эндогенных питательных веществ и выживанию маложизнеспособных генотипов. Таким образом, женские гаметофиты гибридов F₁ так же, как и мужские, различаясь по жизнеспособности и устойчивости, способны дифференцированно реагировать на эндогенные и экзогенные стимулирующие и стрессовые факторы, изменяя соотношение генотипов в F_2.

Стимуляция эмбриогенеза и развития семян. Выращивание зародышей межвидовых гибридов томата in vitro снижает селективную элиминацию рекомбинантов. На этапе эмбриогенеза у межвидовых гибридов томатов происходит естественный отбор против рецессивных гомозигот.

Обработка семян гиббереллином, борной, янтарной, никотиновой кислотами снижает частоту элиминации рекомбинантных генотипов в популяциях, что необходимо использовать для расширения спектра генетической изменчивости.

Такой отбор проводится на этапах развития организма от формирования спор до образования семян, однако задача этого подхода диаметрально противоположна предыдущей - создание стрессовых условий для отбора устойчивых генотипов. Такие условия создаются в фитотронах или непосредственно в поле. Успех такой селекции возможен только при тесной связи в проявлении устойчивости на уровне гаметофита и спорофита. При этом возможны два подхода для селекции:

1. Экспресс-оценка устойчивости генотипа на ранних стадиях онтогенеза (в т.ч. по гаметофиту).

2. Прямая селекция по устойчивости генотипов.

Интересно отметить, что второй вариант может проявляется и в естественных условиях при заражении растений болезнью, что может вызвать экспрессию генов у мужского гаметофита по устойчивости к патогену.

Чаще всего объектом такой селекции является пыльца на различных этапах развития, которая подвергается стрессовому воздействию (неоптимальные температуры, действие солей, токсикантов, фитопатогенов и др.). Например, для отбора на устойчивость к фузариозу капелька раствора фузариевой кислоты наносится на рыльце пестика перед опылением. Ряд исследователей успешно применяли отбор на уровне пыльцы с целью улучшения спорофитного поколения. Таким образом была повышена устойчивость растений к высоким и низким температурам, фитопатогенам, засолению, токсическим продуктам, гербицидам и др.

Отбор гамет и зигот необходимо рассматривать не только в качестве метода, но и цели селекции. Экспериментально доказана эффективность гаметофитного отбора на повышение устойчивости репродуктивной системы томата к повышенным и пониженным температурам. (Жученко и др,1983). Очевидно, что повышение фертильности пыльцы и ее оплодотворяющих возможностей в стрессовых условиях играют важную роль в обеспечении стабильно высоких урожаев растений.

Эффективность гаметной селекции на устойчивость стрессам может быть повышена при сочетании с отбором по спорофиту. Так, А.В. Кильчевским, И.Г. Пугачевой (2001) предложен вариант циклической селекции томата по гаметофиту и спорофиту на устойчивость к пониженным температурам.

Таким образом, методы гаметной и зиготной селекции значительно расширяют возможности селекционеров по сохранению редких рекомбинантов, а также отбору генотипов, устойчивых к абиотическим и биотическим факторам среды. Несомненным преимуществом этих методов является их простота и доступность.

5. Соматическая гибридизация

Под соматической гибридизацией понимается гибридизация между протопластами, выделенными из соматических клеток растений. Обычно для соматической гибридизации используют протопласты, полученные из мезофильных клеток листа или каллусных тканей. Термин "соматическая гибридизация" впервые предложен Г.Мельхерсом (1974). Для обозначения соматического гибрида используют вместо формулы Ах В, принятой для записи половой гибридизации, формулы А+В или А (х) В. Для обозначения гибрида, несущего гены ядра только одного из родителей, наряду с цитоплазматическими (внеядерными) генами от обоих или только от другого родителя, используют термин " цитоплазматический гибрид" ("цибрид"). Гибриды, несущие альтернативные цитоплазматические гены от обоих родителей, называют "цитоплазматическими гетерозиготами" ("цитогетами").

Первое слияние протопластов было получено Пауэром и др. в 1970 году. Соматическая гибридизация растений включает четыре отдельных этапа:

а) выделение протопластов

б) слияние протопластов

в) отбор и регенерация растений

г) анализ растений - регенерантов

Ю.Ю. Глеба, К.Н.Сытник (1982,1984) отмечают, что соматическая гибридизация открывает перед исследователем возможность:

скрещивать филогенетически отдаленные виды растений (организмов), которые невозможно скрестить половым путем;

получить асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами (или несколькими генами, или только органеллами и цитоплазмой) другого;

создать систему гибридизации, включающую одновременное слияние трех и более родительских клеток;

получить растения, гетезиготные по внеядерным генам (генам пластид и митохондрий)

Принципиальные различия между половыми и соматическими гибридами заключаются в следующем. При половой гибридизации происходит слияние ядер материнского и отцовского организмов и цитоплазмы материнского организма. При соматической гибридизации возможно слияние как ядер, так и цитоплазм материнского и отцовского организмов. При этом имеет место совершенно иной тип наследования ядерных и цитоплазматических генов. Ядерные гены при соматической гибридизации наследуются как дву-, так однородительски, тогда как при половой- только двуродительски. Внеядерные гены при соматической гибридизации наследуются двуродительски, а при половой передаются обычно только по материнской линии.

В результате слияния протопластов можно получить после регенерации растения, создание которых невозможно половым путем:

1) растения, ядро которых происходит от одного родителя, а цитоплазма от другого (цибриды);

2) растения, гетерозиготные по внеядерным генам (цитогеты):

3) растения, часть внеядерных генов которых происходит от одного родителя, а часть от другого.

Слияние протопластов. Методы выделения протопластов описаны нами ранее. Для слияния протопластов используют два основных подхода:

1. Использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) в сочетании с высоким рН (9-11) среды и повышенным содержанием ионов кальция Са²⁺(100-300мМ). Полиэтиленгликоль выполняет роль индуктора слияния, который обеспечивает агглютинацию (слипание). Высокое значение рН и высокая концентрация ионов кальция необходимы для нейтрализации отрицательного поверхностного заряда, который имеют протопласты. В местах слипания происходит разрыв плазмалемм протопластов, приводящий к их слиянию. На этот процесс оказывают влияние, помимо внешних факторов, особенности тканевой принадлежности клеток. Легко сливаются меристемные и каллусные протопласты, менее эффективно сливаются сильно вакуолизированные клетки и клетки с развитыми хлоропластами (например, мезофильные протопласты).

2. Электрослияние протопластов. В этом случае протопласты помещают в неоднородное переменное электрическое поле. В этих условиях протопласты образуют мостик из нескольких клеток между электродами. После пропускания единичных импульсов тока происходит слияние протопластов в результате разрыва их плазмалемм. Эффективность метода слияния протопластов определяют по частоте слившихся протопластов, частоте клеточных клонов, образовавшихся из гибридных клеток, а также частоте образования гибридных проростков. В результате слияния протопластов образуются гомокарионы- продукты слияния генетически идентичных клеток, и гетерокарионы -продукты слияния генетически неидентичных клеток. Какова судьба слившихся протопластов? Возможны следующие варианты (Першина, 2000):

- синхронное деление двух ядер без их слияния и образование в результате исходных делений двуядерных дочерних клеток;

...