Применение методов in vitro в селекции растений

- слияние ядер во время митотического деления и формирование в дальнейшем одноядерных гибридных дочерних клеток.

Стабильность ядерных и цитоплазматических носителей генетической информации зависит от степени филогенетического родства родителей. При филогенетической отдаленности в процессе последующего деления клеток может происходить элиминация хромосом одного из родителей с последующим однородительским наследованием генов. Степень элиминации может быть различной. При этом соматические гибриды, сохраняющие оба ядерных генома, называются симметрическими, а соматические гибриды, несущие хромосомы преимущественно одного родителя - асимметрическими. Элиминацию хромосом одного из видов можно индуцировать путем обработки протопластов этого вида радиацией или химическими агентами. Таким образом, при соматической гибридизации возникает источник генетической изменчивости в результате реконструкции ядерных геномов и переноса генов от одного родителя другому.

Так, в результате слияния протопластов культурного вида картофеля Solanum tuberosum и дикорастущего вида томата Lycopersiсon pimpinellifolium получены растения с реконструированным ядерным геномом картофеля и интрогрессией генов томата, контролирующих устойчивость к болезням.

Вторым источником генетической изменчивости при соматической гибридизации является сегрегация (разделение между дочерними клетками) митохондрий и пластид, полученных от обоих родителей. Такая сегрегация происходит независимо от событий, происходящих в ядре, причем митохондрии сегрегируют независимо от пластид. Такое неменделевское расщепление по генам цитоплазмы обеспечивает варианты как однородительского, так и двуродительского их наследования и различные варианты сочетания органелл в цитоплазме дочерних клеток (Рис.5). Дополнительным источником изменчивости по цитоплазматическим генам является процесс рекомбинации генов митохондрий или пластид. Учитывая, что цитоплазматические гены во многом определяют продуктивность и устойчивость культурных растений (Давыденко, 2001), использование изменчивости по этим генам, создаваемой при соматической гибридизации - важный ресурс в селекции растений.

В целом следует отметить, что расширение возможного спектра изменчивости как по ядерным, так и по цитоплазматическим генам при соматической гибридизации в сравнении с половой, а также возможность вовлечения в гибридизацию филогенетически отдаленных видов создает перспективы для создания принципиально новых генотипов растений, несущих различные комбинации ядерных и цитоплазматических генов родителей.

Отбор и регенерация гибридных растений. Важной задачей является идентификация и отбор гетерокарионов в смешанной популяции протопластов после их слияния. Отбор гибридов может производиться как на клеточном, так и на организменном уровне. Наиболее употребимы следующие методы отбора продуктов слияния протопластов:

Механическая изоляция - применение морфологически контрастных типов родительских протопластов, после слияния которых гетерокарионы обнаруживают визуально под микроскопом, изолируют микропипеткой и переносят на среду для культивирования. Примером могут служить такие визуальные маркеры, как зеленые протопласты мезофила листа, которые комбинируют с бесхлорофилльными протопластов из клеток каллуса. Гибридные протопласты в этом случае отличаются от родительских по содержанию хлорофилла.

Метод генетической комплектации предполагает использование в качестве родителей двух мутантов, несущих неаллельные рецессивные летальные гены, вызывающие гибель организма при определенных условиях культивирования. Примером могут служить хлорофиллдефектные мутанты, каждый из которых гомозиготен по одному гену, вызывающему гибель растения на свету. При соматической гибридизации двух мутантов происходит генетическая комлементация, в результате которой гибриды, гетерозисные по двум аллелям хлорофиллдефектности, приобретают способность к образованию хлорофилла.

Метод физиологической комплементации подразумевает способность гибридных клеток размножаться и переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем это является нормальной физиологической реакцией клетки на внешние условия. Так, Э. Кокинг (1974,1977) предложил метод, основанный на изучении альтернативных условий культуры, пригодных для роста клеток одного из партнеров для слияния, но не пригодных для роста другого. В этом случае суспензию клеток после слияния помещают последовательно на среду, на которой не способен расти первый родитель, а затем переносят на среду, где гибнут клетки второго родителя и остаются только гибридные клетки.

Метод инактивации протопластов основан на использовании Х или - лучей или биохимических ядов для инактивации протопластов одного или двух родителей. Так, Ф. Зельцер (1978) предложен метод получения цибридов путем направленной элиминации генома одного из родителей после предварительного облучения протопластов одного из партнеров х или - лучами.

В.А. Сидоров (1990) получил цибриды картофеля S.tuвerosum, содержащие пластиды диких видов картофеля путем инактивации ядра протопластов этих видов кобальтовой пушкой. Такой подход свидетельствует о возможности переноса цитоплазматических генов культурным растениям от их близкородственных видов. Получение соматических гибридов представляет интерес как для изучения методов преодоления нескрещиваемости при отдаленной гибридизации, так и для получения гибридов, представляющих хозяйственный интерес для селекционеров. Однако преодоление несовместимости генетических систем отдаленных видов - весьма трудная задача, сложность решения которой растет по мере возрастания филогенетической отдаленности видов (Першина, 2000).

При межцарственной соматической гибридизации растительных и животных клеток (клетки человека + бобовые, клетки человека + морковь, клетки человека + табак, клетки крысы + дрожжей) гибридные клетки не делятся.

В результате межсемейственной соматической гибридизации (соя + табак, табак +бобы) гетерокарионы при делении образуют клеточные линии, неспособные к регенерации растений.

При межтрибной соматической гибридизации (арабидопсис + турнепс, картофель + табак) получаются клеточные линии, способные к регенерации растений, имеющих аномалии в развитии. При этом могут образовываться как симметрические, так и асимметрические гибриды.

Межродовые соматические гибриды могут быть как симметрическими (Сitrus sinensis + Poncirus trifoliata), так и асимметрическими (картофель + томат).

Таким образом, гибридизация соматических клеток позволяет преодолеть созданные эволюцией барьеры несовместимости и скрещивать между собой растения, принадлежащие к различным видам, родам, семействам и трибам. При этом обычно наблюдается элиминация хромосом одного из родителей. Чаще всего гибриды между отдаленными видами аномальные и не дают потомства. Однако большой практический интерес представляет создание асимметрических гибридов, несущих полный геном одного из родителей и лишь несколько хромосом или генов другого.

Получены фертильные межвидовые амфиплоиды дурмана с повышенным на 20-25 % выходом алкалоидов. Созданы фертильные амфиплоиды межвидовых гибридов табака, картофеля, баклажанов. Путем слияния протопластов удалось ресинтезировать рапс, являющейся естественным амфидиплоидом между турнепсом и капустой. Полученные гибриды фертильны и могут быть вовлечены в селекцию. Слиянием протопластов кочанной капусты и редьки осуществлен перенос цитоплазматической мужской стерильности в капусту. Большой селекционный интерес представляют также цибриды, полученные у картофеля, томатов, капусты.

6. Сохранение генофонда растений в культуре in vitro

Сохранение генофонда в культуре in vitro является важным достижением биотехнологии. Этот подход позволяет сохранить и поддержать неограниченно долго генетические коллекции растений без изменения их наследственной основы. Поддержание генколлекций пересевом в различных условиях в течение длительного времени приводит к потере части генотипов и изменению сортов- популяций. Особый интерес методы in vitro представляют для поддержания уникальных генотипов культурных растений (трансгенных растений, линий с ЦМС, маркированных изогенных линий и др.), а также растений из Красной Книги.

Существуют два подхода для использования методов in vitro в поддержании генколлекций. Первый основан на удлинении пассажа при культивировании растений. В условиях, обеспечивающих медленный рост культур, интервалы между пересадками могут достигать от 12 месяцев до 4 лет. Методики, обеспечивающие медленный рост, основаны на снижении температуры и освещенности, модификации среды, особенно путем добавления осмотиков или ретардантов, дегидратации тканей и модификации газовой среды. Для различных культур используются модификации этих процедур. По данным Р.Г. Бутенко, длительность пассажа можно удлинить до 6-24 месяцев, поместив коллекции в условия низких положительных температур (1-10⁰ С) при интенсивности освещения 4000-5000 лк. При этом выбор температуры зависит от холодостойкости растения. Например для поддержания коллекции картофеля можно использовать температуру 10⁰ С, яблони -1 ⁰ С. Задержать рост растений in vitro можно также добавлением в питательную среду осмотиков (маннита и сорбита), повышением концентрации сахарозы или добавлением в среду ингибиторов роста (гидразид малеиновой кислоты, абсцизовая кислота и др.) В последнее время для задержки роста растений начали использовать снижение атмосферного давления (до 0,04 мм рт. ст) и гипоксию (недостаток кислорода). Гипоксию создают, применяя смесь 90% азота и 10 % кислорода (Бутенко, 1990). Располагая на малой площади климокамер большое количество пробирок, можно поддерживать обширные генколлекции. Такой материал удобен для обмена между генбанками. Однако при длительном субкультивировании не исключено возникновение генетических отклонений, а также изменение морфогенетического потенциала.

Более совершенным методом сохранения генколлекций in vitro является криосохранение (замораживание) в жидком азоте при температуре -196 ⁰ С. При такой температуре деление клеток и метаболические процессы останавливаются и растительный материал может сохраняться неограниченный период времени. Хранимый материал не занимает много места, не изменяется генетически и не заражается патогенами Таким способом, можно хранить меристемы и кончики побегов, протопласты, суспензию клеток, зародыши, пыльцу, семена. Глубокое замораживание - хранение - оттаивание является сложной экстремальной процедурой, состоящей из ряда этапов. Поскольку специфика клеток (крупные размеры, сильная вакуолизация, обилие воды) затрудняет замораживание, необходима оптимизация каждого этапа для данного вида клеток, причем особое значение имеет подготовка клеток, подбор криопротекторов - веществ, ослабляющих повреждения от осмотического стресса, а также от механических повреждений при образовании и росте кристаллов льда. Помимо эффективности действия криопротекторы не должны быть токсичными. Наиболее часто используют проникающие в клетки вещества - диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин, а также непроникающие высокомолекулярные вещества - криопротекторы - поливинилпиролидон, декстран, полиэтиленгликоль. Для защиты от поврежений клеток используется их предобработка осмотически активными веществами - маннитом, сорбитом, пролином и др.

Протоколы для хранения растений в жидком азоте разработаны более, чем для 80 видов растений. Существуют два основных подхода к технике замораживания растительного материала. Классический подход (медленное замораживание) основан на дегидратации клеток в процессе снижения температуры (Рис. 6). В этом случае растительный материал замораживают с контролируемой скоростью 0,1-4 ⁰ С /мин до температуры - 40⁰ С с последующим быстрым охлаждением в жидком азоте. К среде, в которой замораживается материал, добавляют криопротекторы. Классическая технология обычно используется для замораживания культуры клеток. Ее применение для апексов и зародышей затруднено. Недостатком метода является дорогое оборудование для замораживания.

растение селекция гаплоид мутаген

Рис. 5. Выживаемость клеток при быстром и медленном охлаждении (Фаррант, 1980).

Второй подход, разработанный за последние годы - быстрое замораживание. Метод основан на предподготовке растительного материала с последующим его погружением в жидкий азот. Предподготовка имеет целью предотвращение образования межклеточного льда, повреждающего клетки. Эта техника не требует программируемого замораживания, что удешевляет оборудование. Кроме того, растительный материал может быть более крупных размеров. Предобработка зависит от вида растения и может включать различные методики: предварительный рост материала до нескольких недель на среде при наличии криопротекторов и высоком содержании сахарозы, кратковременная обработка криопротекторами и др.

Хранится материал неограниченно долгое время. Так, например, в криобанке Института физиологии растений РАН имеются клетки моркови, хранящиеся около 20 лет, меристемы картофеля - более 10 лет и др. Регенерация растений из меристем и последующий их анализ показали, что полученный материал не отличается от исходного. Оттаивание материала производится быстро при температуре 40-60 ⁰ С.

Технологии in vitro для поддержания генколлекций используется в генбанках весьма широко. По данным ФАО, 37600 образцов сохраняются in vitro во всем мире, причем число генбанков и количество образцов с каждым годом увеличивается. В Риме создан Международный Институт генетических ресурсов растений, котoрый координирует работу международных и национальных генцентров по сохранению генколлекций, в том числе и методом in vitro.

Размещено на Allbest.ru