Синтез полиэфиров гидроксипроизводных жирных кислот (полигидроксиалканоатов) и характеристика состава липидов сине-зеленых, светящихся и водородокисляющих прокариот

4.1. Влияние внутриклеточного пула ПГА на физиолого-биохимические характеристики бактерий Ralstonia eutropha и рост в неоптимальных условиях среды

Для выявления взаимосвязи между физиологическим состоянием бактерий R. eutropha, внутриклеточным пулом полимера 3-гидроксимасляной кислоты (П3ГБ) и активностью ключевых ферментов клеточного цикла П3ГБ, проведена серия экспериментов. Планировалось получение ответа на следующие вопросы: 1) как изменяются внутриклеточное содержание П3ГБ, размеры клеток и количество гранул в них в различные фазы роста культуры; 2) как при этом изменяется физиологическая активность клеток, включая активность ферментов цикла П3ГБ, 3) каково протектирующее значение внутриклеточного пула П3ГБ для роста бактерий в экстремальных условиях?

На рис. 4.1 представлены характеристики культуры R. eutropha B5786, в режиме накопления полимера при дефиците азота в среде в периодическом автотрофном режиме. Анализ внутриклеточного содержания П3ГБ у музейной культуры, хранящейся на скошенной агаризованной минеральной среде при 5 єС, показал, что пул полимера в клетках не превышал 6-9 % от сухого веса. Таким образом, питательную среду инокулировали клетками с содержанием полимера ниже 10 %. Спустя 8-10 ч от засева среды содержание П3ГБ в клетках снижалось до следовых количеств (проба I); клетки гранул полимера не содержали (рис. 4.2).

В течение последующих 30-40 ч происходило увеличение концентрации клеток в культуре и внутриклеточного содержания в них П3ГБ; в клетках были отчетливо видны гранулы диаметром 0.2-0.4 мкм в количестве от 2 до 8 на клетку. К середине линейной фазы роста культуры (проба II) содержание полимера в клетках достигло порядка 50 %, размеры гранул составило 0.5 мкм; а в стационарной фазе содержание полимера достигло 86.0 % (проба III). Клетки в культуре равномерно и практически полностью были заполнены гранулами полимера, диаметр которых достигал 0.6 мкм, а их количество зависело от размера клетки и составляло до 12 и более на клетку. Концентрация белка в клетках при этом составляла лишь 8.1 %. При переходе культуры из стационарной фазы в фазу отрицательного роста происходило сокращение внутриклеточного пула полимера; к концу наблюдаемого периода (проба IV) концентрация П3ГБ в клетках сократилась практически в 4 раза, до 19.3 %, а концентрация белка при этом возросла до 39.8 %. Содержание общих липидов в бактериях при этом существенно не менялось, варьируя в пределах 7-8 %.

Выше (раздел 1.1) было показано, что при росте на полной среде в липидах бактерий R. eutropha доминировали моноеновые и насыщенные кислоты, при этом содержание циклопропановых кислот невелико (не более 0.4 %). При неблагоприятных условиях выращивания состав ЖК липидов водородных бактерий в той или иной мере перестраивался, но характер этих изменений, как правило, однонаправлен, - на фоне снижения содержания ненасыщенных жирных кислот наблюдалось увеличение содержания насыщенных и циклопропановых кислот.

Рис. 4.1. Накопление биомассы (1),полимера (2) (а) и активность ферментов синтеза (б) (3 - в-кетотиолаза, 4 - ацетоацетил-КoA-редуктаза, 5 - П3ГБ-синтаза) и внутриклеточной деградации (в) (6 - гидроксибутиратдегидрогеназа, 7 - П3ГБ-деполимераза) П3ГБ R. eutropha B5786 в автотрофных условиях: I - лаг-фаза (4 ч), II -линейная фаза (40 ч), III - стационарная фаза (72 ч), IV - фаза деградации полимера (104 ч)

В режиме синтеза и аккумуляции клетками ПГА при дефиците азота основные изменения в составе ЖК связаны с уменьшением относительного содержания 16:1щ7 (с 27.8 до 10.5 %) на фоне увеличения С17 -циклопропановой кислоты (с 0.9 до 21.6 %). Отмечено также усиление циклизации другой моноеновой кислоты - 18:1щ7. Относительное содержание С19-циклопропановой кислоты увеличивалось от следовых значений до 2.8 % (таблица 4.1). При этом содержание в липидах основной насыщенной кислоты - 16:0 - мало менялось. Соотношение насыщенных к ненасыщенным ЖК увеличилось более чем в 2 раза, в основном за счет циклизации моноеновых кислот. Как известно, при неблагоприятных условиях роста, моноеновые кислоты количественно конвертируются в циклопропановые кислоты под контролем циклопропансинтазы, использующей в качестве субстратов ЖК-остатки, ацилирующие фосфолипиды цитоплазматических мембран грамотрицательных бактерий (Grogan, Cronan, 1997).

Микроскопические исследования клеток, находящихся в различных фазах роста периодической культуры, выявили возникновение размерной гетерогенности в популяции, проявляющееся по-разному в зависимости от возраста культуры и концентрации П3ГБ в клетках (рис.4.2). В суточной культуре R. eutropha, практически не содержащей полимера, доминировали (92 % от общего числа клеток) морфологические однородные клетки длиной (L) от 1.0 до 3.0 мкм; в середине линейной фазы роста, при увеличении концентрации П3ГБ до 45-50 %, доля клеток с нарушенным делением длиной до 4 мкм составила 34 % от общего числа; кроме того, в популяции зафиксированы и более длинные клетки - 6 мкм. С наступлением стационарной фазы культуры в популяции доминировали клетки с нарушенным делением (64 %); среди них клетки длиной до 4 мкм составили 42 %; длиной от 5 до 10 мкм - 20 %; в единичных количествах в популяции встречались гигантские клетки длиной 20-30 мкм. Однако при переходе культуры из стационарной фазы в фазу отрицательного роста, где содержание полимера падало, отмечено перераспределение особей в популяции и возвращение соотношения клеток по размерам к состоянию, характерному для начальной культуры.

В популяции, находящейся в фазе отрицательного роста и активно деградирующей полимер (проба IV), зафиксирована выраженная гетерогенность клеток не только по размерам, но и по содержанию гранул в них. Среди клеток присутствовали особи (около 15 %) с множественными крупными гранулами диаметром 0.5-0.6 мкм. Однако в большей части клеток популяции, деградирующей полимер, количество гранул и их размеры уменьшились (до 0.2-0.3 мкм). Отмечено также наличие особей с единичными мелкими гранулами, а также клеток, практически лишенных пула П3ГБ. Это является свидетельством того, что полимер разрушался, однако не в одинаковой степени в отдельных клетках. Размеры основной массы клеток в культуре при этом уменьшились до 2.5-3.0 мкм. Этими экспериментами впервые представлены доказательства обратимости физиологического состояния неделящихся клеток, практически полностью заполненных гранулами полимера, то есть возможности их перехода в результате деградации и усвоения П3ГБ к активному физиологическому состоянию, для которого характерны размеры клеток от 1-2 до 3-4 мкм.

Рис. 4.2. РЭМ фотографии клеток R. eutropha B5786 из различных фаз роста периодической культуры в период накопления П3ГБ в автотрофных условиях: а - 4-часовая культура, клетки без полимера (проба I); б- 10-часовая культура, П3ГБ - 26 % (начало линейной фазы); в -40-часовая культура, П3ГБ - 54% (середина линейной фазы, проба II); г - 72-часовая культура, П3ГБ - 86 %; РЭМ фотография гигантской клетки (1) и нормальной клетки (2) (д) и фрагмент гигантской клетки (е) R. eutropha B5786 из стационарной фазы роста; гетерогенная по размерам клеток и гранул в них культура из фазы деградации полимера (104-часовая культура, проба IV)

Таблица 4.1

Состав жирных кислот липидов бактерий R. eutropha B5786 при различных режимах выращивания

* - сумма изомеров

Полагают, что метаболизм ПГА носит циклический характер, при этом синтез и биодеградация полимера происходят в клетках одновременно (Doi et al.,1990; Taidi et al., 1995). Однако прямых доказательств течения процессов внутриклеточной деградации полимера в литературе до настоящих исследований представлено не было, не была также описана динамика активности ПГА-деполимеризующих ферментов. Трудности определения активности внутриклеточных ПГА-деполимераз микроорганизмов связаны с тем, что эти ферменты могут взаимодействовать только с некристаллизованным полимером, находящимся внутри клеток. Однако, как только полимер извлекается из клеток, начинается процесс его кристаллизации, он становится недоступным для атаки фермента.

В данной работе активность ключевых ферментов клеточного цикла ПГА впервые исследована в динамике в культуре бактерий R. eutropha, находящейся в режиме синтеза ПГА, от первых часов активизации этого процесса в клетках до поздней стационарной фазы и фазы отмирания, когда в клетке доминирует процесс биораспада и эндогенной утилизации ПГА (рис. 4.1). Динамика активности ферментов, участвующих в синтезе полимера, представлена на рис. 4.1б. Наиболее высокая активность всех ферментов зафиксирована в течение первых 15-20 ч культивирования бактерий при минимальной концентрации полимера и наиболее высоких значениях удельной скорости роста клеток. Активность в-КТ составляла 3.57-4.26, АА-КоА-редуктазы - 0.98-1.23, П3ГБ-синтазы - 0.08-0.10 Е. По мере увеличения содержания внутриклеточного сополимера, несмотря на положительную динамику скоростей синтеза П3ГБ, зарегистрировано снижение активности ферментов. К концу первого этапа культивирования активности в-КТ, АА-КоА-редуктазы и ПГБ-синтазы снизились до 1.29-1.34, 0.66-1.13, 0.009-0.015 Е, соответственно. Далее, на фоне увеличения пула П3ГБ активность АА-КоА-редуктазы и ПГБ-синтазы стабилизировалась на достигнутом уровне, а для в-КТ (катализирующей первый этап синтеза и последний этап эндогенной деградации П3ГБ) отмечена тенденция к некоторому снижению активности в последние 20-25 ч.

Для анализа ферментов деполимеризующей ветви клеточного цикла П3ГБ измерены активности П3ГБ-деполимеразы и 3ГБ-дегидрогеназы в разных фазах. Деполимеразная активность, измеренная в реакции автогидролиза выделенных из клеток R. eutropha B 5786 нативных гранул полимера, колебалась в ходе опыта от 0 до 0.0057 мг/мин (рис. 4.1в). Наибольшей автогидролизной активностью обладали гранулы, выделенные из клеток 5-25-ти часовой культуры с наименьшим содержанием полимера. Далее активность ПГБ-деполимеразы падала. Саморазрушения гранул, выделенных из клеток с высоким содержанием полимера (свыше 50-60 %), не наблюдали. Это позволяет говорить о низкой деполимеразной активности клеток в стадии активной аккумуляции полимера. Подтверждением этому служат результаты измерения активности другого фермента, участвующего в эндогенной деградации П3ГБ, - 3ГБ-дегидрогеназы. Наибольшая активность 3ГБ-дегидрогеназы (0.18-0.22 Е) также зафиксирована в первые часы опыта, когда была относительно высока активность П3ГБ-деполимеразы. В процессе активного синтеза П3ГБ активность 3ГБ-дегидрогеназы длительное время (около 40-50 ч) составляла около 0.06-0.10 Е, однако к концу опыта упала до 0.01-0.03 Е. Зарегистрированный уровень удельной активности ферментов синтеза П3ГБ сопоставим с имеющимися данными для R. еutropha, измеренными в период максимального накопления полимера. Так, при разовых замерах по данным ряда авторов получены величины активности для в-КТ от 0.3-1.8 до 2.5-18.8 Е (Haywood et al., 1988a; Jung et al., 2000); для АА-КоА-редуктазы - от 0.18-0.31 до 1.18-2.24 Е (Senior, Dawes, 1973; Haywood et al., 1988b; Schubert et al., 1988; Jung et al., 2000), а П3ГБ-синтазы - от 0.04 до 0.76 Е (Haywood et al., 1989; Jung et al., 2000; Valentin, Steinbьchel, 1994).

Нельзя не отметить, что выявление закономерностей эндогенной деградации ПГА представляет один из ключевых фундаментальных вопросов в понимании организации и функционировании цикла этих макромолекул и имеет важное практическое значение, поскольку соотношение процессов аккумуляции и деградации полимера в клетке в конечном счете определяет выход полимера и его свойства, главным образом, характеристики молекулярной массы, степени полимеризуемости и полидисперсности. Несмотря на очевидную важность вопроса, анализ литературы показал практически полное отсутствие публикаций по этой теме.

Были проведены специальные эксперименты, в ходе которых бактерии выращивали в режиме, позволяющем моделировать условия для внутриклеточных процессов: «синтез-деструкция-ресинтез» полимера. Для анализа путей синтеза и миграции продуктов распада полимера использовали меченый углеродный субстрат в виде 1,2-14С-ацетата. Эксперимент продолжался 256 ч: с 24 ч по 135 ч - в режиме аккумуляции полимера на среде с дефицитом азота; на 136 ч была сделана добавка в культуру азота, и в течение 2.5 суток культура находилась в режиме деградации полимера и синтеза азотсодержащих соединений; по исчерпании азота из среды далее, еще в течение 2 суток, происходило снижение содержания основных макромолекул на фоне ресинтеза полимера. Проанализированы исходная радиоактивность среды, скорость включения метки клетками и динамика радиоактивности в общей биомассе, а также распределение метки во фракциях: липидах, полимере и в «активной» части биомассы (вся биомасса минус полимер и липиды) (рис.4.3). В биомассе определяли содержание общих липидов, полимера и общего азота. В эксперименте с ацетатом в качестве основного субстрата, после добавки 14С-метки в среду (0.02 мкКю/мл) через 2 ч более 80 % радиоактивности включилось в биомассу. В первые часы после добавления метки активность была зафиксирована во всех анализируемых фракциях: около 40-50 % метки включилось в полимер, столько же - во фракцию азотсодержащих компонентов и около 2-4 % - в липиды. В течение последующих 112 ч бактерии культивировали в режиме аккумуляции полимера (его концентрация возросла с 50 до 80 %) на фоне падения азотсодержащих макромолекул (от 6.0 до 2.0 %). Удельная радиоактивность биомассы в период накопления полимера оставалась практически на одном уровне (1 400-1 600 имп/мин/мг). Динамика удельной радиоактивности полимера повторяла динамику таковой биомассы - наибольшая активность зафиксирована в период аккумуляции полимера (от 700-1600 имп/мин/мг полимера). Максимальная удельная активность фракции азотсодержащих соединений также зарегистрирована в этот период (8 000-15 000 имп/мин/мг), а удельная радиоактивность фракции липидов колебалась в пределах 700-2000 имп/мин/мг. Распределение метки в период максимального накопления полимера было аналогичной начальному периоду.

После добавления азота в среду (период деградации полимера) в течение 74 ч произошло сокращение полимерного пула более чем в 2 раза (с 80-88 до 35 %) на фоне активизации синтеза азотсодержащих соединений (концентрация общего азота составила 4.5 %). При этом по мере прироста общей биомассы произошло разбавление удельной радиоактивности в 2-3 раза, до 400-500 имп/мин/мг. Аналогичная динамика была характерна для полимера и липидов; в период деградации полимера зарегистрированы минимальные значения радиоактивности (около 300). Удельная радиоактивность фракции азотсодержащих соединений упала до 300-400 имп/мин/мг, однако общее включение метки в данной фракции от общей активности биомассы составило 84 %, то есть увеличилось примерно в 1.5 раза. Через 74 ч (210 ч эксперимента) начался этап прекращения синтеза белка и роста бактерий и накопления в них полимера. За 46 ч содержание полимера возросло с 35 до 65 %, а общего азота упало с 4.5 до 1-2 %. Перераспределение метки было следующим: снижение содержания в «активной биомассе» до 25-30 % и увеличение в полимере до 40-65 % от общей активности биомассы. Следует отметить, что изменяющиеся ростовые условия существенно влияли на соотношение полимера и общего азота в клетках, при этом содержание липидов оставалось практически постоянным на протяжении всего опыта и составляло 5-7 %.

Рис. 4.3. Показатели культуры R. eutropha и динамика удельной активности (С14-ацетат) в общей биомассе и во фракциях клеточных макромолекул при смене режимов (биосинтез - деградация - ресинтез ПГА) в условиях роста на ацетате

Таким образом, основной поток углеродсодержащих продуктов, образующихся при эндогенной деградации полимера, перенаправляется на синтез азотсодержащих соединений и, наоборот, при исчерпании азота наступает фаза ресинтеза полимера. В период эндогенной деградации полимера его содержание в клетках может резко снизиться (от 70-80 до 40-50 % и менее), при этом молекулярная масса в течение короткого периода времени (6-12 ч) резко падает в 2-3 раза (от 1000 до 150-300 кДа и более). Эти результаты важны для технологии получения ПГА, как в части общих выходов ПГА, так и его характеристик.

4.2. Протектирующая роль внутриклеточного пула ПГА

В неблагоприятных условиях среды для сохранения физиологической активности и жизнеспособности клетки нуждаются в дополнительных тратах энергии. ПГА являются резервным депо энергии и углерода и выполняют протекторную роль при попадании клеток в условия стресса. Известны немногочисленные примеры позитивной роли внутриклеточного пула П3ГБ для сохранения жизнеспособности клеток и регулирование окислительно-восстановительное состояние клеток (Anderson, Dawes, 1990), защита нитрогеназы при повышенном содержании кислорода (Stamm et al., 1986), участие в регуляции внутриклеточной концентрации и транспорте ионов кальция, а также ДНК (Reusch, Sadoff, 1983; Reusch, 1989), участие в процессах репарации клеток при воздействии УФ облучения, окислительного и теплового стресса (Ayub et al., 2004; Zhao et al., 2007).

Для выявления протектирующей роли П3ГБ изучен рост бактерий R. eutropha в неоптимальных условиях культивирования с различным исходным содержанием полимера. Для засева среды использовали клетки, отобранные из различных фаз периодической культуры с различным внутриклеточным пулом П3ГБ. В качестве стрессовых для культуры факторов были взяты следующие: неоптимальные для роста бактерий R. eutropha значения рН среды, кислая (5.2) и щелочная (7.5), при оптимуме 6.9-7.1; пониженная (25 °С) и повышенная (37 °С) температура при оптимуме 29-30 єС, а также отсутствие экзогенного источника углерода или энергии (рис. 4.4). При неоптимальных значениях рН, как в кислой (5.2), так и в щелочной (7.5) среде, клетки с внутриклеточным пулом П3ГБ порядка 45 % обеспечили получение урожая существенно превосходящего, в 2.0-2.5 раза, таковой у контрольной культуры, исходно не содержащей полимера (рис.4.4 а, б). Рост клеток с высоким (74 %) исходным содержанием полимера характеризовался наличием некоторой фазы задержки в начальный период ферментации, что связано, видимо, с необходимостью некоторого периода времени для внутриклеточной деградации и усвоения полимера, приводящих к переходу клеток к активному состоянию. Анализы показали, что внутриклеточная концентрация П3ГБ через сутки упала в обоих вариантах до следовых значений. Далее, на фоне роста культуры отмечено повышение содержания П3ГБ, что является типичным для культуры R. eutropha. Аналогичная картина получена при изменении температурного режима. Клетки, обогащенные запасами полимера (45 и 74 %), при пониженной (25 °С) и повышенной (37°С) температуре обеспечили получение значительно более высокого урожая по сравнению с клетками, не содержащими П3ГБ (рис. 4.4 в, г). При пониженной температуре сокращение внутриклеточного пула полимера происходило в течение 24 ч; при повышенной - медленнее, за 48 ч.

Показано, что исходные клетки посевного материала, обогащенные полимером, имели пониженное содержание общего азота. Это свидетельствует о нарушениях в системах синтеза азотсодержащих компонентов (аминокислот, белков, нуклеиновых кислот) при синтезе клетками запасных макромолекул, в частности П3ГБ. Несмотря на это, их размножение при неоптимальных условиях среды не только проходило при достаточно высоких скоростях роста, но и способствовало активизации синтеза азотсодержащих компонентов. Во всех опытах по мере увеличения концентрации клеток в культуре содержание азотсодержащих компонентов (НК и белка) в клетках возрастала. Это позволяет сделать вывод не только о позитивной роли П3ГБ для поддержания процессов роста и размножения в экстремальных условиях среды, но и о его позитивной роли для репарации процессов синтеза азотсодержащих компонентов.

Рис. 4.4. Урожай биомассы R. eutropha B5786 с различным исходным содержанием П3ГБ в различных условиях: pH 5.2 (а) и 7.5 (б), 37єC (в) и 25єC (г), отсутствие H2 (д) и CO2 (е)

Как известно, газовый субстрат и его растворимость в среде являются главными факторами, определяющими кинетику роста газоиспользующих микроорганизмов. В связи с тем, что кислород и особенно водород представляют собой трудно растворимые газы, рост водородных бактерий возможен только в условиях интенсивной газовой вентиляции при непрерывном поступлении данных субстратов в систему ферментации. Таким образом, при отсутствии экзогенных источников углерода и энергии рост водородных бактерий, даже остаточный, невозможен.

Данные, представленные на рис. 4.4 (д, е), свидетельствуют о том, что клетки R. eutropha, лишенные запасов П3ГБ, не росли при отсутствии экзогенных источников углерода или энергии. Более того, в таких условиях с первых же суток наблюдали снижение концентрации клеток в культуре, что является следствием гибели части клеток. Напротив, клетки, обогащенные запасами П3ГБ, после некоторой фазы задержки размножались, обеспечивая за 2.0-2.5 суток удвоение биомассы в условиях полного отсутствия экзогенных источников углерода и энергии. По мере увеличения концентрации клеток в культуре отмечено закономерное снижение внутриклеточной концентрации П3ГБ. При отсутствии внешнего источника энергии (водорода) прироста биомассы водородных бактерий не наблюдали. Это характерно для клеток, как со средним, так и с высоким содержанием П3ГБ. Однако концентрация клеток в культуре длительное время (до 140 ч) оставалась на уровне исходной. Это позволяет говорить о том, что клетки не погибали, а использовали в качестве источника энергии полимер, запасы которого в клетках очень быстро сокращались. При этом зафиксировано изменение внутриклеточной концентрации белка. Если исходная концентрация белка в клетках была достаточно низкой - не более 20-30 %, то через 72 ч культивирования, несмотря на отсутствие прироста биомассы в целом, его концентрация возросла практически в 2 раза (до 50-60 %). Это позволяет предположить, что при отсутствии внешнего энергического источника - водорода, внутриклеточная деградация полимера обеспечивала клетки энергией не только для поддержания жизни, но и для синтеза азотсодержащих компонентов, требующих, как известно, значительных энергозатрат.

В целом, продемонстрирована позитивная роль внутриклеточного пула П3ГБ для восстановления способности к синтезу азотсодержащих компонентов и продуктивному росту бактерий R. eutropha в неоптимальных условиях среды.

4.3. Синтез ПГА различного химического строения

На основе изученных закономерностей синтеза и эндогенной деградации ПГА во взаимосвязи с физиологической активностью клеток разработан режим культивирования бактерий, позволяющий стабильно получать высокие выходы полимера-3-гидрокисмасляной кислоты (свыше 80-85 %) в автотрофной периодической культуре. Режим включает две стадии: на первом этапе бактерии выращивают на среде с лимитирующей концентрацией азота, а на втором - на среде без азота. В результате, на первом этапе накапливается достаточная биомасса с содержанием полимера в клетках на уровне 40-50 %. Поэтому длительность второй стадии существенно сокращается, и общее время ферментации не превышает 60-70 ч (Патент РФ № 5024753/13 (000787)).

Гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты (П3ГБ) - наиболее изученный представитель семейства ПГА; это высококристалличный (степень кристалличности - свыше 70 %) термопласт. Недостатком П3ГБ является то, что он кристаллизуется неупорядоченно, поэтому его весьма сложно перерабатывать, а полученные изделия характеризуются низкой ударной прочностью, жесткостью и «старятся» во времени. Однако ПГА - это семейство полимеров, образованных мономерами с различной длиной С-цепи, среди которых полимеры, имеющие различные базовые свойства, от жестких термопластов до конструкционных эластомеров. Свойствами ПГА можно управлять, варьируя в процессе ферментации состав среды и задавая тем самым ту или иную химическую структуру. Сополимерные ПГА более перспективны, однако получение ПГА различного химического состава - весьма сложная технологическая задача, решение которой невозможно без фундаментальных знаний о закономерностях структурно-функциональной организации клеточного цикла синтеза ПГА и зависимости физико-химических свойств полимеров от химического состава. В зависимости от строения известные типы ПГА подразделяют на три группы: короткоцепочечные, образованные мономерами с длиной С-цепи от С3 до С5; среднецепочечные (С6-С16) и длинноцепочеченые (С17 и выше) (Anderson, Dawes, 1990; Nakamura et al., 1991; Whitholt, Kessler, 1999; Zhang et al., 2004; Hazer, Steinbuchel, 2007).

Известно, что жирные кислоты, поступая в клетки бактерий простой диффузией через мембраны или с помощью энергозависимой ферментной системы, активируются ацил-КоА-синтазой и переправляются в процесс в-окисления. Первым этапом окисления активированных жирных кислот является их дегидрирование с помощью ацил-КоА-дегидрогеназы. Далее продукт первой реакции - 2-транс-еноил-КоА гидратируется, и образуется L-в-гидроксиацил-КоА, который и является предшественником мономеров, включающихся в полимер. Однако в синтезе полимеров участвуют только D-изомеры гидроксикислот. Бактерии легко эпимеризуют L-изомер в D-изомер. В бактериях все ферменты в-окисления, кроме первой дегидрогеназы, представлены единым комплексом, в состав которого, кроме 2-еноил-гидратазы, 3-гидроксиацил-КоА-дегирогеназы и кетотиолазы, входят 3-гироксиацил-КоА-эпимераза и 3,2-еноил-КоА-изомераза. Таким образом, при добавках жирных кислот в-окисление является наиболее вероятным источником мономеров для синтеза гетерополимеров.

При изменении источника углеродного питания разработанный в работе режим получения П3ГБ может быть модифицирован для получения сополимерных ПГА. Так, при введении в культуру бактерий R. eutropha B5786, синтезирующих полимер, добавок солей алкановых кислот в качестве предшественников мономеров, возможно получение более технологичных сополимеров 3ГБ и 3ГВ кислот (П3ГБ/П3ГВ), сополимеров - 3ГБ и 3ГГ кислот и др.

Сополимеры 3ГБ и 3ГВ (П3ГБ/П3ГВ) в отличие от гомогенного П3ГБ обладают сниженной степенью кристалличности, поэтому изделия, изготовленные из них, обладают большей эластичностью и механической прочностью. С целью определения условий контролируемого синтеза сополимеров этого типа исследованы закономерности образования ПГА культурой R.eutropha B5786, выращиваемой на смешанном углеродном субстрате (рис. 4.5). При внесении добавок валерата в культуру бактерий зарегистрирована способность штамма утилизировать этот субстрат и включать в полимер мономеры 3ГВ. Уже спустя 1.5-2.0 ч после добавки валерата его концентрация в культуре была следовой. При этом независимо от используемого источника углерода (автотрофного или гетеротрофного), включение фракции 3ГВ в полимер зафиксировано уже спустя 30 мин после подачи валерата в культуру. Далее фракция 3ГВ в полимере возрастала на фоне снижения фракции 3ГБ. Максимальное содержание 3ГВ в сополимере наблюдали спустя 10-15 ч после добавки валерата в культуру. В общих чертах динамика накопления биомассы, общего выхода сополимера мало отличались от таковых в культуре, синтезирующей гомополимер П3ГБ на моноуглеродном субстрате.

Расчет баланса углерода, выполненный по результатам опытов при росте бактерий на смешанном углеродном субстрате (СО2 + валерат или фруктоза+валерат), показал, что практически весь поданный в культуру валерат (2 г/л - при автотрофном росте и 1 г/л - при гетеротрофном) через 10-15 ч включился в сополимер. Общая концентрация полимера в культуре к этому сроку составила около 8-10 г/л (60 % в биомассе), а молярная фракция 3ГВ в полимере - 28 и 13 мол% (2 и 1 г/л) при автотрофном и гетеротрофном росте, соответственно. Таким образом, включение валерата в полимер от поданного составило практически 100 %. Вероятно, это связано с тем, что короткоцепочечные жирные кислоты, такие как бутират и валерат, напрямую превращаются в D-в-ОН-кислоты в процессе в-окисления. Эти два мономера характеризуются высоким сродством к ПГА-синтазе, поэтому не вовлекаются в дальнейший цикл окисления жирных кислот, а переправляются на синтез полимера. Однако в ходе дальнейшего культивирования бактерий величина молярной фракции 3ГВ в сополимере падала на фоне повышения общего содержания сополимера и молярной фракции 3ГБ. Спустя 25-35 ч после подачи валерата в культуру содержание фракции 3ГВ сократилось до 19 мол %. При этом абсолютное содержание валерата в культуре (г/л) оставалось практически постоянным до конца эксперимента после достигнутого максимального значения. Поэтому наблюдаемое снижение молярной фракции 3ГВ в сополимере вызвано не его деградацией, а разбавлением концентрации в результате продолжающегося синтеза 3ГБ и отсутствием синтеза 3ГВ, вызванного отсутствием субстратов.

С целью повышения включения 3ГВ в сополимер с учетом токсичности для культуры R. eutropha В5786 валерата в концентрации, свыше 2 г/л, исследованы режимы культивирования бактерий с дробной подачей субстрата - предшественника для образования мономеров 3ГВ. Таким образом, выявленный факт нестабильности соотношения молярных фракций 3ГВ и 3ГБ в сополимере П3ГБ/П3ГВ, синтезируемом бактериями R. eutropha B5786, исследованная динамика образования сополимера, с учетом установленной предельно допустимой концентрацией валерата в среде, позволили определить условия и реализовать режимы культивирования бактерий для получения сополимера П3ГБ/П3ГВ с различным соотношением мономеров. Сочетанием количества добавок валерата в культуру (1, 2 , 3 и более) и последующего времени культивирования выявлены условия, при которых возможен синтез сополимеров этого типа с варьированием соотношения мономеров 3ГБ и 3ГВ в широких пределах, от 99:1 до 70:30 (мол%) (Патент РФ №5025741/13 (000837)).

Следующим был вопрос, связанный с возможностью синтеза

Н2-окисляющими бактериями ПГА, содержащих в своем соcтавe не только мономеры 3ГБ и 3ГВ, но также и мономеры с более длинной углеродной цепью. Следует отметить, что до недавнего времени считалось, что ПГА-синтазы высоко специфичны к субстрату (Steinbьchel, Valentin, 1995). В связи с этим полагали, что природные штаммы не способны синтезировать полимеры, содержащие в своем составе одновременно мономеры короткой (С3-С5) и средней (С6-С12) длины С-цепи.

Рисунок 4.5. Динамика показателей культуры Ralstonia eutropha (А), активности ферментов синтеза ПГА (Б) и состав сополимера (В) в условиях смешанного углеродного питания: 1 - общая биомасса, г/л; 2 - ПГА, г/л; 3 - ПГА, %; 4 - общая скорость синтеза ПГА (V) г/ч; 5 - удельная скорость синтеза ПГА (м) ч-1. Активности: 6- ПГА-синтазы; 7 - в-кетотиолазы; 8 - ацетоацетил-КоА-редуктазы в мкмоль/мин на мг белка (Е); б - 3ГБ, в - 3ГВ

Для выявления способности природных штаммов бактерий R. eutropha В5786 и S. carboxydohydrogena Z1062 синтезировать одновременно коротко- и среднецепочечные ПГА бактерии культивировали на смешанном углеродном субстрате, содержащем углекислоту и добавки солей разных жирных кислот (гексановой, гептановой, октановой, нонановой) в качестве предшественника синтеза мономеров различного строения. В данном случае в хемотрофных водородокисляющих бактериях реализуется путь образования ПГА, связанный с циклом в-окисления жирных кислот. При этом поступающие в клетку субстраты-предшественники, - летучие жирные кислоты, активируются переносом на КоА и в виде таких производных переправляются в цикл в-окисления. Промежуточные продукты этого цикла, - 3-гидроксикислоты, служат мономерами для синтеза ПГА.

Практически сразу после внесения в культуру кислот бактерии начинали их утилизацию; спустя 1.5-2.0 ч остаточная концентрация кислот в культуральной среде падала в 2-3 раза от исходной, а спустя 4-5 ч - до следовых концентраций. Определены предельно допустимые для роста бактерий концентрации данных кислот в среде вследствие их токсичности, доза одноразовых добавок которых в культуру не должна превышать 0.5-0.7 г/л. В периодические культуры бактерий, лимитированные дефицитом азота, вносили добавку одной из жирных кислот; ферментацию продолжали в течение 15-25 ч. Выращивание бактерий на смешанном углеродном субстрате сопровождалось накоплением в клетках ПГА, концентрация и состав которых имели различные значения в зависимости от условий эксперимента. Оба штамма показали способность к синтезу полимеров, содержащих в своем составе различные типы мономеров (рис. 4.6-4.7). Независимо от типа используемой жирной кислоты, как с четным, так и нечетным числом атомов углерода в цепи, исследованные штаммы синтезировали в качестве доминирующего компонента 3ГБ и включали в качестве сополимеров два мономера - 3ГВ и 3ГГ. У водородных бактерий при использовании ими в углеродном питании кислот с нечетным числом атомов углерода (С7 и С9) в составе ПГА практически всегда обнаруживали включения 3ГВ, однако его доля с увеличением длины углеродной цепи субстрата-предшественника падала. Так, при внесении в культуру в качестве добавки гептановой кислоты включение 3ГВ достигала 10-15 мол.% и выше, но при использовании нонановой кислоты - ниже на порядок. Помимо 3ГБ и 3ГВ, в составе ПГА, синтезируемых данным штаммом при росте на гептановой или нонановой кислотах, идентифицированы также в небольших концентрациях включения 3ГГ, однако эти включения не носили регулярного характера.

Рис. 4.6. Динамика образования трехкомпонентных ПГА бактериями R. eutropha B 5786: концентрация в культуре полимера, % (1), биомассы, г/л (2); а, б, в - сополимеры, соответственно, 3ГБ, 3ГВ и 3ГГ

При использовании водородными бактериями в качестве добавок кислот с четным числом атомов углерода (С6, С8 и С10) в составе ПГА с большей регулярностью обнаруживали включения 3ГГ и нерегулярные включения - 3ГВ. Доля данных включений, однако, не превышала 1-2 мол.%, следовательно, их можно классифицировать как минорные. В отдельных экспериментах у водородных бактерий при наличии в среде октановой кислоты наблюдали включение в качестве сополимера 3-гидроксиоктаноата (3ГО), при этом его доля в ПГА составляла, как правило, менее 1 мол.% (Рис. 4.6).

Рис. 4.7. Динамика образования трехкомпонентных ПГА бактериями S. carboxydohydrogena Z1062: концентрация в культуре полимера, % (1), биомассы, г/л (2); а, б, в - сополимеры, соответственно, 3ГБ, 3ГВ и 3ГГ

Карбоксидобактерии, в отличие от водородных бактерий (рис. 4.7), при росте с аналогичными добавками жирных кислот мономеры 3ГВ в ПГА в заметных количествах включали не всегда, а, как правило, только при добавлении кислот с нечетным числом атомов углерода в цепи. При этом доля фракции 3ГВ в полимере была невысокой (единицы и десятые доли мол.%). Включение 3ГГ, однако, было более выраженным, его доля в полимере достигала в отдельных экспериментах 20 мол.% и более, однако включения 3ГО в состав ПГА у карбоксидобактерий не отмечено. Все это позволяет говорить о специфичности микробного метаболизма жирных кислот в бактериях при различных путях синтеза ПГА. При использовании режима выращивания бактерий, предложенного в ходе оптимизации синтеза сополимера П3ГБ/П3ГВ по величине фракции 3ГВ, и варьировании количества добавок гексаноата в культуру, получена серия образцов многокомпонентных ПГА с макровключениями 3ГГ (таблица 4.3).

Таблица 4.3. Состав многокомпонентных ПГА, образованных мономерами 3ГБ, 3ГВ, 3ГГ, 3-гидроксигептаноата (3ГГеп) и 3ГО, синтезированных R.eutropha B5786

На рис. 4.8 представлена ионная хроматограмма ПГА, образованного мономерами 3ГБ, 3ГВ, 3ГГ, 3Ггеп и 3ГО; идентификация мономеров подтверждена масс-спектрами.

Полученные в работе результаты, доказавшие возможность синтеза природными штаммами хемолитотрофных водородокисляющих бактерий гетерополимерных ПГА, содержащих в своем составе как коротко-, так и среднецепочечные мономеры, подтверждены зарубежными коллегами спустя пять лет (Green et al., 2002).

4.4. Водородсодержащие субстраты для биосинтеза ПГА

Тип основного ростового субстрата, используемого для получения ПГА, определяется исходя из физиолого-биохимических свойств продуцентов и экономической целесообразности выбранной стратегии с учетом области применения полимера.

Рис. 4.8. Хроматограммы полимеров, выделенных из биомассы Ralstonia eutrophа В5786, с добавкой валерата (верх) и октаноата (зеркально внизу) и масс-спектры соответствующих мономеров: 3ГБ с временем удерживания 7.37; 3ГВ - 8.42; 3ГГ - 9.48; 3ГГеп - 10.75; 3ГО - 11.95

В связи с тем, что ПГА перспективны для использования в медицине, фармакологии, пищевой промышленности, сельском и коммунальном хозяйстве, масштабы производств полимеров могут быть самыми разными, от десятков килограммов (для медицины и фармакологии), до сотен тысяч тонн в год. Поэтому требования, предъявляемые к качеству и стоимости сырья для различных объемов производств и областей применения, также различны. Потенциально сырьем для получения ПГА могут быть самые разные субстраты с различными степенью восстановленности, энергосодержанием и, конечно, стоимостью. Среди субстратов - индивидуальные соединения (сахара различной природы, спирты, кислоты, углекислота, углеводороды) и комплексные субстраты, включая отходы промышленных и сельскохозяйственных производств.

Для получения полигидроксиалканоатов возможно привлечение разнообразных субстратов. Среди известных - индивидуальные соединения (углекислый газ и водород, сахара, спирты, органические кислоты), отходы спиртовой, сахарной, гидролизной промышленности, производства оливкового и пальмового масла и др. (Tanaka еt al.,1995; Cromwick et al., 1996; Lee,1998; Sugimoto et al., 1999), а также необычные субстраты, включая токсичные. Например, установлена возможность синтеза ПГА на плохо растворимом и токсичном октане и октаноате, бензоате натрия и феноле, метакриловой кислоте (Lee et al., 1997; Hazenberg, Witholt, 1997; Durner et al., 2000).

В настоящее время все чаще появляются работы, рассматривающие в качестве субстрата для биотехнологических производств угли и продукты их переработки (Fakoussa, Hofrichter, 1999). В связи с огромными запасами и относительно низкой стоимостью данный субстрат потенциально представляет интерес и для будущих крупнотоннажных производств микробных биопластиков (Fьchtenbuch, Steinbьchel, 1999). Как было показано выше, среди водородных бактерий есть организмы, обладающие СО-резистентностью. Возможность выращивания названных организмов на техногенных источниках водорода, содержащих в своем составе монооксид углерода, (конвертированном газе и продуктах газификации углей и лигнина), показана пионерными работами ИБФ СО РАН (Патент № 2207375 RU 2207375).

Исходя из этого, в работе сформулирована задача оценить возможность синтеза ПГА водородокисляющими бактериями на источниках водорода (например, синтез-газе), содержащих в своем составе высокотоксичный монооксид углерода. Общеизвестно, что высокие выходы ПГА у водородных бактерий могут быть получены в условиях несбалансированного роста при ограничении реакций белкового синтеза и избытке углерода и энергии. Наиболее ярко это проявляется в условиях дефицита азота, при котором концентрация ПГА может составить до 80% и выше от сухого вещества.

Последствия двухфакторного воздействия (дефицита азота в сочетании с ингибированием СО) в отношении бактерии A. eutrophus, а также других микроорганизмов, не изучены. Исследованы выходы полимера и активность ключевых ферментов синтеза ПГА. Исходя из ранее полученной кинетической зависимости м/S, бактерии A. eutrophus выращивали в режиме аккумуляции ПГА на модельных газовых смесях, содержащих СО в диапазоне 5-25 % об. Установлено, что в присутствии СО, независимо от концентрации ингибитора в газовой смеси, в клетках A. eutrophus происходило накопление полимера до 70-75 % от сухого вещества при сохранении общего урожая биомассы практически на уровне контроля (рис. 4.9). Незначительное снижение урожая отмечено при повышении концентрации СО в газовой смеси свыше 20 % об. В ходе опытов исследована динамика активностей ключевых ферментов синтеза ПГА (в-КТ, АА-КоА-редуктазы, бутиратдегидрогеназы и ПГБ-синтазы) и установлено, что СО не ингибирует внутриклеточную систему синтеза ПГА у бактерий A. eutrophus. Проявление активности всех ферментов зарегистрировано в клетках во всех фазах роста в ходе накопления ПГА как при отсутствии, так при наличии СО в среде.

Показатели газообмена культуры мало зависели от концентрации СО в газовой фазе. Примечательно, что стехиометрия потребления компонентов (СО2:О2:Н2), характеризующая количественную связь между исходным субстратом и образуемым продуктом и являющаяся у водородных бактерий показателем эффективности использования энергетического субстрата, также не претерпевала существенных изменений относительно показателей культуры, лимитированной по азоту и аккумулирующей ПГА в периодическом режиме выращивания. Таким образом, воздействие СО не влияло на кинетические и продукционные характеристики культуры, лимитированной азотом и находящейся в режиме аккумуляции ПГА, и не ухудшало данные показатели.

Защитная реакция клеток на воздействие СО в определенной мере может быть связана с состоянием и проницаемостью клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, которые во многом определяются составом жирных кислот липидов.

Контроль 15 % СО

Рис. 4.9. Показатели выхода биомассы и ПГА и активности ферментов клеточного цикла ПГА у бактерий A. eutrophus в режиме синтеза ПГА в присутствии СО

При сопоставлении состава ЖК липидов A. eutrophus, аккумулирующих ПГА на средах без СО и в присутствии ингибитора (таблица 4.1), не обнаружено существенного влияния изучаемых факторов на общее содержание мембранных липидов, а также ЖК ЛПС клеточных стенок, состав которых практически не изменялся. Однако выявлены некоторые отличия в направленности изменения состава жирных кислот мембранных липидов бактерий при сопоставлении одно- и двухфакторного воздействия. При сочетанном воздействии на культуру двух неблагоприятных факторов (СО + дефицит азота), аналогично однофакторному лимитированию по азоту в культуре A. eutrophus, по мере увеличения концентрации полимера в клетках также происходило повышение насыщенности липидов, практически в 2 раза. Однако это повышение было связано с существенным увеличением доли насыщенной 16:0 кислоты (с 46.7 до 61.3 %) и в меньшей степени - циклизацией соответствующих моноеновых кислот, в отличие от азотного дефицита и аналогично ингибированию СО. Доля циклопропановых кислот при этом возрастала незначительно (от 1.3 до 4.3-5.5 %), и только в 60-часовой культуре составила 10 %. Отмечено значительное снижение относительного содержания моноеновой 16:1щ7 (с 29.0 до 7.5 %). Доля 18:1щ7 при этом практически не менялась и была значительно ниже, чем в условиях дефицита азота. При ингибировании роста культуры СО в турбидостате направленность в изменении ЖК спектра была аналогичной - происходило увеличение степени насыщенности мембранных липидов за счет увеличения доли 16:0 и некоторого повышения доли циклопропановых кислот (таблица 4.1).

Таким образом, выявленное более выраженное изменение насыщенности ЖК мембранных липидов бактерий под воздействием СО, при котором мембрана становится более жесткой и менее проницаемой, возможно, защищает клеточные структуры от повреждающего воздействия окиси углерода. Такая защита в свою очередь, может служить причиной отсутствия существенных изменений физиолого-биохимических характеристик культуры, синтезирующей ПГА в присутствии монооксида углерода. На этой основе исследован процесс образования ПГА на водородсодержащих продуктах, получаемых газификацией гидролизного лигнина или бурых углей КАТЭК, и впервые в биотехнологической практике реализован процесс биосинтеза ПГА на синтез-газе (патент РФ №2207375).

В результате выполненного цикла работ исследованы закономерности синтеза и накопления ПГА в культурах высокопродуктивных водородокисляющих прокариот, определены условия, обеспечивающие высокие выходы полимеров (свыше 80-85 %), в том числе различного химического строения. Результаты использованы для масштабирования технологии и ее реализации в условиях опытного производства.

ВЫВОДЫ

1. Проведен поиск продуцентов ПГА среди светящихся, водородокисляющих и цианобактерий. Выявлены перспективные штаммы, обладающие способностью к синтезу ПГА, в таксономических группах водородных и светящихся бактерий.

2. В сравнительном аспекте исследован состав липидов у прокариот, относящихся к разным таксономическим группам, и показано, что все они синтезировали преимущественно структурные компоненты клеточных мембран: водородокисляющие и светящиеся бактерии - фосфолипиды, цианобактерии - фосфолипиды и гликолипиды. Доминирующими фосфолипидами у изученных штаммов являлись фосфотидилэтаноламин, и в меньшей степени, фосфатидилглицерин и диацилфосфатидилглицерин. В составе липидов цианобактерий доминировали моногалактозилдиглицерин, дигалактозилдиглицерин, сульфолипид и, в меньшей степени, фосфатидилглицерин.

3. Показано, что водородокисляющие и светящиеся бактерии синтезировали ограниченный набор жирных кислот, среди которых основными являются прямоцепочечные насыщенные и моноеновые кислоты С16 и С18 ряда - пальмитиновая, пальмитолеиновая и цис-вакценовая - и циклопропановые кислоты. Для каждой группы обнаружены свои особенности в соотношении этих кислот. Для светящихся бактерий характерен преимущественный синтез пальмитолеиновой кислоты, водородокисляющие и СО-окисляющие бактерии синтезировали пальмитолеиновую и цис-вакценовую кислоты в равных пропорциях. Изученные цианобактерии отличались большим разнообразием состава жирных кислот и среди них встречались организмы, синтезирующие только насыщенные и моноеновые кислоты, насыщенные моноеновые, диеновые и триеновые кислоты с разным положением двойных связей в молекуле и тетраеновые кислоты.

4. Изучены особенности роста и конструктивного обмена Н2- и СО-окисляющих бактерий при действии экстремальных значений температуры и рН среды, которые приводили к уменьшению удельной скорости роста и эффективности использования энергетического субстрата. Обнаружено, что насыщенность жирных кислот в липидах возрастала при повышении температуры, при снижении - падала; в кислой среде стимулировался синтез циклопропановых жирных кислот и возрастала насыщенность липидов, в щелочной среде насыщенность липидов уменьшалась. Данные изменения позволяют бактериям сохранить способность к росту и размножению в достаточно широком диапазоне температур и активной реакции среды, однако, без существенного перераспределения в составе основных и запасных клеточных макромолекул.

5. При неоптимальных условиях газового питания (Н2, СО2 и О2) концентрация и соотношение в клетках азотсодержащих компонентов (общего азота и белка) и запасных макромолекул (липидов и ПГА), включая суммарное содержание липидов и их жирнокислотный состав, практически не изменялись.

6. Присутствие в газовом субстрате ингибитора - монооксида углерода вызывало адаптивную реакцию мембран бактерий A. eutrophus и S. сarboxydohydrogena: стимулировался синтеза циклопропановых кислот, повышалась насыщенности липидов, усиливался синтеза цитохромов, что в итоге сохраняло неизменным соотношение основных и запасных веществ в клетке.

7. Лимитирование роста минеральными макроэлементами (N, P, S, K, Mg) существенно влияло на метаболизм жирных кислот липидов водородных бактерий и карбоксидобактерий, вызывая увеличение насыщенности липидов за счет синтеза циклопропановых кислот и снижения доли моноеновых кислот. Наряду с этим, при лимитировании роста происходило значительное перераспределение в составе клеточных макромолекул в сторону усиления синтеза ПГА - резервных макромолекул липидной природы. В режиме аккумуляции ПГА выход полимера у бактерий R. eutropha достигал 86 % и выше.

8. Накопление и деструкция полимера сопровождалась возникновением размерной гетерогенности клеток. Наибольшая активность ключевых ферментов синтеза ПГА - в-кетотиолазы, АА-СоА-редуктазы и ПГА-синтазы - зафиксирована в начальный период синтеза полимера; далее она снижалась и мало менялась в ходе накопления ПГА. Активность деполимеризующих ферментов в период синтеза ПГА низка, но отчетливо проявлялась в фазу эндогенной деградации полимера.

9. Доказана протекторная роль внутриклеточного пула П3ГБ, обеспечивающая рост и размножение клеток R. eutropha при неоптимальных условиях среды и отсутствии экзогенного источника углерода.

10. Доказана возможность синтеза природными штаммами хемолитотрофных водородокисляющих бактерий гетерополимерных ПГА, содержащих в своем составе мономеры с коротко- и среднецепочечной длиной углеродной цепи и различным соотношением мономеров.