Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Биохимические механизмы адаптации к битоксибациллину в онтогенезе насекомых holometabola

03.00.04 - биохимия

Салтыкова Елена Станиславовна

Уфа 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Николенко Алексей Геннадьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Анисимов Анатолий Иванович, Санкт-Петербургский государственный аграрный университет

доктор биологических наук, профессор, Ибрагимов Ринат Исмагилович, Башкирский государственный университет

доктор биологических наук, доцент Князева Ольга Александровна, Башкирский государственный медицинский университет

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится «___» __________200__ г. в _______ часов на заседании Объединенного Диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН.

Адрес: 450054, Уфа, пр. Октября, 71, www.anrb.ru/molgen/dissov.html.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН

Автореферат разослан “__ “ ______________ 200_ г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Бикбулатова С. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Устойчивость насекомых к патогенным микроорганизмам и продуктам их жизнедеятельности обусловлена хитинизированными покровами, скоординированным взаимодействием биохимических механизмов с деятельностью клеточных структур гемолимфы, жирового тела и кишечника, выстланного перитрофической мембраной, а также особенностями структуры и функционированием генома.

К настоящему времени изучены и описаны основные биохимические защитные механизмы насекомых. Часть из них базируется на индукции протеолитических каскадов, приводящих к меланизации и коагуляции гемолимфы при ранении, а также продукции активных кислородных метаболитов и сигнальных молекул, в том числе участвующих в распознавании антигенов (Marmaras et al., 1996; Teopold et al., 2004; Ling, Yu, 2005; Jiravanichpaisal et al, 2006; Williams, 2007). Существуют системы, продуцирующие биологические восстановители и активированные глюкозиды, агглютинины с различной углеводной специфичностью, участвующие в процессах распознавания (Basseri et al., 2002; Галактионов, 2004; Ottaviani, 2005), и набор антимикробных пептидов, обуславливающих бактерицидные и фунгицидные свойства гемолимфы (Черныш, 1998; Львов, Николенко, 1999; Bulet et al., 2004). Защитная система, опосредованная клетками гемолимфы, участвует совместно с гуморальными факторами в фагоцитозе, синтезе антимикробных пептидов, а также в гистолизе и гистогенезе в процессе метаморфоза (Глупов, 2001; Гайфуллина и др., 2004). Таким образом, данные биохимические системы насекомых принимают участие не только в защитных процессах, но и регуляции онтогенеза, что, как считает ряд исследователей, обусловлено сугубо врожденными факторами (Leclerc, Reicchart, 2004).

Исследования последних лет опровергают сложившиеся представления о непреодолимой грани между врожденной и адаптивной защитной системой насекомых (De Gregorio et al., 2001; Eason et al., 2004). Основная проблема заключается в том, что до сих пор биохимические механизмы устойчивости насекомых к патогенным микроорганизмам изучались без учета их метаболической взаимозависимости и онтогенетических особенностей функционирования. В то же время наличие адаптивного ответа у насекомых допускает возможность существования специфичных и долговременных биохимических защитных реакций. Эти процессы должны быть связаны с онтогенетическими особенностями насекомых, поскольку личинка кардинально отличается от взрослой особи. Они, как правило, занимают разные экологические ниши, имеют различную пищевую специализацию, а также продолжительность существования, что может играть важную роль в функционировании биохимических механизмов и факторов, опосредованных гемоцитарной защитой.

Следует отметить, что для изучения перечисленных аспектов необходима новая модель эксперимента. Она должна базироваться на изучении динамики общих биохимических и клеточных защитных реакций насекомых на начальном этапе инфекционного процесса, использовании патогенного препарата общего типа действия (для чего был использован битоксибациллин), естественном способе заражения насекомых, применении патогена в дозировках и степени вирулентности, не вызывающих глубоких патологических изменений в организме насекомого, а также с учетом стадий онтогенеза. Эти особенности модели не всегда учитывались в исследованиях последних лет (Ekengren, Hultmark, 2001; Tzou et al., 2001; Zambon et al, 2005; Sorensen et al, 2005).

Энтомопатогенные кристаллофорные бактерии Bacillus thuringiensis антагонистичны для многих видов насекомых. На основе различных штаммов Bac. thuringiensis создан широкий спектр микробиологических препаратов, в том числе битоксибациллин, который содержит жизнеспособные споры бактерий и продуцируемый ими экзотоксин (Смирнов и др., 1982; Кандыбин, 1989). Практика применения данного препарата в системе защиты от насекомых-вредителей способствует появлению устойчивых особей с эффективными механизмами распознавания и элиминации патогенных бактерий.

Не менее важны онтогенетические и другие условия функционирования биохимических защитных механизмов и для прикладных исследований. В процессе поиска и практического применения, биологически активных в отношении насекомых веществ, часто не учитываются условия формирования защитных реакций, предшествующие контролируемой стадии эксперимента. Это замечание можно отнести к изучению южных подвидов медоносной пчелы, интродуцированных в климатические условия средней полосы России. По аналогичной причине пока не увенчались успехом попытки разработки препаратов на основе хитозана для пчеловодства (Албулов, 2008).

Ранее в исследованиях биохимических защитных механизмов насекомых, как правило, использовались иные методологические подходы, связанные с инъекционными способами введения и/или заведомо высокими концентрациями препаратов. На фоне торможения защитных реакций сформировалось представление о неспособности насекомыми формировать адаптивный ответ (Флоренсов, Пестова, 1990; Vidal et al., 2001; Hultmark, 2003). Сохраняются суждения об исключительной роли отбора особей с наиболее успешной реализацией защитных систем в возникновении устойчивых популяций насекомых. Роль иммунизации при этом считается несущественной, в том числе в силу малой продолжительности жизни насекомых. пчела битоксибациллин патогенный адаптоген

Результаты отдельных исследований можно рассматривать как принцип формирования адаптивного ответа к конкретному патогену (Kurtz, 2005; Gaifullina et al., 2005). Более того, в последние годы появились сообщения, свидетельствующие о трансгенерационной передаче индуцированного адаптивного ответа у общественных насекомых, высказываются предположения о возможных механизмах данного явления (Moret, Schmid-Hempel, 2000; 2001; Sadd et al., 2005). Тем не менее, до сих пор не раскрыты онтогенетические условия формирования подобного феномена, возможно, раскрывающего исключительные возможности насекомых к формированию широкого спектра устойчивости в короткий эволюционный период (Марков, 2006; Колчанов, 2007).

Таким образом, изучение вопросов онтогенетических и внутривидовых особенностей реализации биохимических защитных реакций, метаболической взаимозависимости компонентов данных систем, возможности преадаптации насекомых, условий формирования долговременных биохимических защитных реакций и возможности их трансгенерации может изменить общее представление о механизмах биохимической устойчивости насекомых к неблагоприятным факторам среды, обеспечивающих адаптивную пластичность видов класса Insecta.

Цель данной работы заключалась в выявлении онтогенетических закономерностей реализации биохимических защитных механизмов при действии битоксибациллина у насекомых с полным типом превращения. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать новую модель эксперимента для изучения экзогенных воздействий на насекомых, охарактеризовать на этой основе реализацию основных биохимических защитных реакций насекомых, в том числе определить временные рамки фаз их развития.

2. Определить онтогенетические особенности формирования биохимических защитных реакций насекомых при действии битоксибациллина.

3. Выявить внутривидовые особенности формирования биохимических защитных реакций и оценить возможность использования биохимических параметров для характеристики состояния пчелиных семей.

4. Оценить возможность иммунизации насекомых и их способность к развитию долговременной иммунной памяти на основе биохимических защитных механизмов, особенностей их онтогенетического формирования.

5. Охарактеризовать онтогенетические особенности влияния биологически активных для насекомых веществ на функционирование биохимических механизмов защиты и перспективы их применения в качестве адаптогенов.

6. Оценить влияние критических периодов в онтогенезе насекомых на активацию биохимических защитных систем и долговременность их реакции.

7. Определить роль критических периодов в проявлении эффекта трансгенерации биохимических защитных реакций в ряду поколений насекомых.

Научная новизна. Выявлена тесная взаимосвязь антиоксидантной и фенолоксидазной систем в формировании начального этапа реализации защитных реакций у насекомых. Выявлены онтогенетические различия в проявлении биохимических защитных реакций и их связь с клеточными структурами гемолимфы насекомых. Это проявляется в преобладании на личиночной стадии неспецифических, а на имагинальной - специфических биохимических механизмов. Доказана возможность преадаптации насекомых воздействием нелетальными дозами битоксибациллина, выражающейся в стимулирующем влиянии на развитие защитных реакций и повышении выживаемости в целом. Показана возможность применения хитозана в качестве адаптогена для медоносной пчелы. Выявлена возможность формирования долговременной иммунной памяти насекомых. Показана значимость критических периодов онтогенеза насекомых в формировании долговременных защитных реакций, связанных с фазами стадий развития. Фенолоксидазная и антиоксидантная системы, участвующие в реализации устойчивости насекомых, многократно повышают свою активность при воздействии бактериальным препаратом в критические периоды развития. Показано, что индуцированная активность защитных реакций у личинок насекомых воспроизводится на последующих этапах онтогенеза, а также в последующих двух поколениях на той же стадии развития насекомого без дополнительного влияния индуцирующего фактора.

Практическая значимость. Получены данные по высокой биологической активности хитозана в отношении хозяйственно значимых насекомых, которая выражается в преадаптивном действии и во влиянии на скорость морфогенетических процессов, что было показано на медоносной пчеле и колорадском жуке. Применение хитозана в пчеловодстве или в области защиты растений рекомендовано с учетом нового регламента, основанного на четком определении физиологического статуса и стадий развития насекомых. Обоснована возможность использования начального этапа реализации биохимических защитных реакций в качестве тест-системы для диагностики состояния пчелиных семей. На основе выявленных внутривидовых различий у медоносной пчелы в характере развития биохимических защитных реакций предложены биохимические критерии в качестве показателей адаптированности пчелиной семьи к климатическим условиям Урала.

Положения, выносимые на защиту:

1. Стадия онтогенеза и начальный этап воздействия битоксибациллином являются значимым моментом в определении преимущественного типа реализации биохимических реакций насекомых. Нейтрализация сублетальных доз патогенного препарата происходит за счет реактивации биохимических защитных систем, высоких доз битоксибациллина - посредством реакции защитного торможения биохимических процессов.

2. Воздействие битоксибациллином в сублетальной концентрации оказывает на насекомых иммунизирующее действие и способствует формированию, как кратковременных биохимических защитных реакций, так и долговременной иммунной памяти у продолжительно живущих особей. Иммунизация насекомых вносит вклад в развитие общей устойчивости популяций наряду с действием отбора.

3. Ключевыми моментами онтогенеза у насекомых с полным типом превращения являются критические периоды при переходе от личиночной стадии развития к куколке и от куколки к имаго. Критические периоды онтогенеза у насекомых характеризуются перестройкой многих функциональных систем организма, повышенной реактивностью биохимических защитных реакций и более высокой чувствительностью к внешним воздействиям.

4. Активность факторов защитных реакций, индуцированная в критические периоды онтогенеза, у личинок насекомых воспроизводится как на последующих этапах онтогенеза, характеризуя наличие долговременной иммунной памяти, так и в последующих поколениях насекомых на той же онтогенетической стадии, подтверждая трангенерационный эффект передачи индуцированных биохимических механизмов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях «Изучение, рациональное использование природных ресурсов», (Уфа, 1991), «Biologically Active Polysaccharides», (Oslo, 1998), «Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии», (Челябинск, 1999), 6th European Training Course on Carbohydrates, (Hungary, 2000), 4^th Carbohydrate Bioengineering Meeting, (Stockholm, 2001), VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002), «Экологические аспекты интенсификации сельскохозяйственного производства» (Пенза, 2002), на XII съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2002), на III съезде Всероссийского Общества Генетиков и Селекционеров (Москва, 2004), на Межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока, (Новосибирск, 2006), на IX Всероссийском популяционном семинаре «Особь и популяция - стратегия жизни» (Уфа, 2006), на Международной конференции «Current Evolutionary Thinking in Biology, Medicine and Sociology» (Новосибирск, 2007), на XIII съезде Русского энтомологического общества (Краснодар, 2007), на III съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002) и IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на IX Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008).

Публикации. Основные результаты исследований отражены в 22-х научных статьях, в том числе 16 в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследований, экспериментальной части, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы (452 работы, в том числе 308 зарубежных). Работа изложена на 363 страницах, содержит 42 таблицы и 61 рисунок.

Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад автора заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Благодарность. Выражаю благодарность коллегам по лаборатории биохимии адаптивности насекомых за конструктивные замечания, помощь и поддержку в выполнении данной работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследований были использованы одновозрастные личинки, куколки и имаго колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say. из природной популяции и комнатной мухи Musca domestica L. лабораторной линии Cooper, рабочие особи темной лесной Apis mellifera mellifera L. и серой горной кавказской Apis mellifera caucasica Gorb. медоносной пчелы, доставленные с пасеки республики Башкортостан. Условия содержания насекомых соответствовали специальным методикам ведения лабораторной культуры колорадского жука (Беньковская, 2001), медоносной пчелы и комнатной мухи (Салтыкова, 2000). Обработка биологических объектов адаптогенами (хитозан и аскорбиновая кислота), а также модельное воздействие в лабораторных условиях на насекомых битоксибациллином (БТБ), представляющим спорокристаллический препарат на основе Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, проводили по методикам, разработанным Е.С. Салтыковой (2000), Л.Р. Гайфуллиной (2004). В экспериментах использовали гемолимфу, гомогенаты кишечника, нервных ганглиев, жирового тела, мышечной массы или целый гомогенат насекомого в зависимости от поставленных экспериментальных задач. Повторность экспериментов была не менее трех раз. Опыты включали по 3 биологических и аналитических повтора.

Приготовление клеточных препаратов гемолимфы производили фиксированием мазков 96%-ым этанолом и окрашиванием по методу Романовского-Гимзы (Кост, 1957). Типы форменных элементов гемолимфы определяли по классификации М.И. Сиротиной (1961). Титр и углеводную специфичность гемагглютининов гемолимфы насекомых определяли по D.Stynen (1982). Спектрофотометрическое измерение фенолоксидазной (ФО) активности проводили по Е.Ю. Животенко (1987), пероксидазной (ПО) активности - по А.Н. Бояркину (1951). Активность каталазы измеряли по методу В.М. Мерщиева [1990]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по С. Чевари (1985). Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) измеряли по Н.В. Алексахиной (1979), удельную активность выражали в мкМ/мин/мг белка. Активность протеиназ и ингибиторов протеиназ (ИП) проводили по S. Saul, M. Sugumaran (1986), выражали в ед.акт./мин/мг белка. Количество ТБК (тиобарбитуровой кислоты) - реагирующих продуктов (МДА - малоновый диальдегид) определяли по Д.И. Стальной и др. (1977) и выражали в нМ/г ткани. Активность кислой фосфатазы (КФ) оценивалась по скорости гидролиза 2-нафтилфосфата (Филиппова, 1985). Содержание гликозоаминогликанов (ГАГ) определяли по П.Н. Шараеву (1987) в мг/г ткани. Активность тирозиназы, дифенолоксидазы (ДФО), супероксиддисмутазы и пероксидазы выражали приростом оптической плотности в минуту, в перерасчете на концентрацию белка (ед.акт./мин/мг белка), удельную активность каталазы выражали в нМ/мин/мг белка. Концентрацию белка определяли по О. Лоури (Lowry et al., 1951). Электрофорез молекулярных форм фенолоксидазы проводили в 7,5% полиакриламидном геле по системе B. Davis (1962). Выявление ферментативной активности на электрофореграммах осуществляли по Г.Ю. Раушенбах (1997).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием среднеарифметического значения, ошибки средней, доверительного интервала, дисперсионного анализа с применением критерия Фишера и непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Достоверность различия средних определяли по t-критерию Стюдента (Лакин, 1990). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ StatSoft (Statistica 6.0).

Основные результаты и их обсуждение

1. Биохимические защитные реакции насекомых на начальном этапе развития инфекционного процесса

К настоящему времени сведения об особенностях функционирования защитных систем у насекомых имеют фрагментарный характер и отражают ограниченную феноменологию этих процессов (Magalhaes et al., 2008; Aggarwal et al., 2009).

Наличие высокоразвитой антимикробной врожденной защиты, а главное, особенности развития биохимических процессов в первые сутки, значимость скорости развития защитных реакций и взаимосвязь систем, обеспечивающих первичный ответ при внедрении патогена, зачастую оставались за пределами внимания исследователей.

Битоксибациллин был выбран в качестве препарата широкого энтомопатогенного действия с довольно устойчивыми характеристиками при применении его в лабораторных условиях.

Многолетние лабораторные исследования позволили выявить определенные закономерности в реакциях насекомых при применении данного бактериального препарата (Салтыкова, 2000). При этом определенные особенности воздействия данного препарата более наглядно могли быть продемонстрированы на насекомых с полным типом превращения.

С этой целью для определения фаз развития защитных реакций у различных представителей наиболее эволюционно молодых отрядов насекомых была разработана лабораторная модель воздействия бактериальным препаратом.

Было отработано воздействие на насекомых разными концентрациями битоксибациллина для выявления реакций ферментативных систем, которые входят в систему защитных реакций насекомых при действии экзогенных факторов. Были выявлены определенные фазы реализации биохимических защитных реакций, характер их реагирования (Табл. 1).

Таблица 1

Схема развития защитных реакций у медоносной пчелы при действии БТБ

Установлено, что необходимым условием для инициации защитных процессов, не связанных с развитием патологии в течение первых суток, является применение нелетальных концентраций. Именно при таких условиях были выявлены определенные принципы реализации защитных реакций.

Обработка личинок колорадского жука БТБ вызывает нарастание числа веретеновидных фагоцитирующих клеток, что подтверждает полученные ранее результаты на других видах насекомых (Сиротина, 1961; Рагялис, 1982). При этом повышается активность антиоксидантных ферментов. Кроме того, у личинок колорадского жука гемоцитарный ответ на битоксибациллин (0,1%) выражается двукратным увеличением процента эноцитоидов, клеток продуцирующих гуморальные факторы.

Повышение интенсивности дифференцировки эноцитоидов, продуцирующих биохимические факторы защиты, в том числе фенолоксидазы и агглютинины, в течение первых суток развития инфекции достоверно подчеркивает значимость гуморальных факторов у личинок в данный период.

Внедрение чужеродных агентов в короткий срок индуцирует в организме насекомых комплекс скоординированных клеточных и, опосредованных ими, биохимических защитных реакций (Глупов, 1992; Gillespie, Kanost, 1997).

В гемолимфе в течение суток наблюдали значительные изменения в активности пероксидазы (к 1 часу развития процесса активность фермента увеличивалась почти в 100 раз).

Каталаза снижала свою активность к 4 часам от начала заражения, а к концу вторых суток ее активность увеличивалась почти в 5 раз, что свидетельствует о возрастании значимости антиоксидантных процессов (Рис. 1). Активность тирозиназы от начала действия битоксибациллином постепенно снижалась к концу первых суток почти в 10 раз.

Судя по всему, наиболее задействованы в защитной реакции биохимические факторы клеточных элементов гемолимфы, и это в значительной степени происходит к концу первых суток после воздействия бактериальным препаратом.

Что же касается кишечника, активность пероксидазы значительно возрастала в течение первого часа действия препарата, второй период роста активности начинался от 4 часов (Рис. 1).

Рост активности каталазы начинался несколько раньше, от 2 часов. Рост активности дифенолоксидазы до уровня контроля наблюдали от 4 часов и до конца первых суток. К концу первых суток нарушается сбалансированное взаимодействие двух антиоксидантных ферментов в самом кишечнике и в кишечном секрете личинок.

Рис. 1. Изменение активности ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем в гемолимфе и кишечнике у личинок 3 возраста колорадского жука при действии БТБ (данные приведены относительно контроля); - достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95), активность ферментов выражена в ед. ак./мин/мг белка

У личинок комнатной мухи начала третьего возраста, обработанных 0,01% БТБ фиксировали изменение активности ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем в течение первых суток в гемолимфе. От начала эксперимента активность тирозиназы к 1 часу в 5 раз превышала контрольный уровень (Рис. 2). Активность пероксидазы снижалась незначительно в течение первого часа, превышая контрольный уровень почти в 2 раза и образуя пик активности (3,5 раза по отношению к контролю) к 2 ч от начала действия бактериального препарата. Рост активности каталазы приходится на время снижения активности пероксидазы, а спад активности приходится, наоборот, на период роста активности пероксидазы.

Очевидно, что согласованная активация данных систем направлена на формирование куколочных покровов (Салтыкова, 2003). А достоверное сокращение сроков развития личинок косвенно подтверждает адаптивный характер происходящих изменений на уровне организма.

Рис. 2. Активность ферментов фенолоксидазной и антиоксидантной систем в гемолимфе у личинок Musca domestica в начале 3 возраста при действии БТБ (данные приведены относительно контроля); достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95).

В лабораторных условиях битоксибациллин (0,5%), скормленный пчелам вместе с сиропом per os, как энтомопатогенный препарат, оказывал определенное воздействие на насекомых. Это требует соответственно быстрой перестройки внутренних систем для адекватного ответа, вызывая значительное функциональное напряжение. Снижение степени воздействия битоксибациллина при остальных равных условиях (продолжительность воздействия, возраст организма и др.) будет вызывать меньшую степень повреждений и тип направленности метаболических процессов с начала действия фактора. Для выявления внутривидовых различий на начальной стадии процесса, вызываемого действием различных концентраций БТБ (0,01% и 0,5%), использовались подвиды медоносной пчелы Apis mellifera mellifera L. и Apis mellifera caucasica Gorb. с пасек Башкирского госагроуниверситета.

В максимальной концентрации активность Г6ФДГ у темной лесной пчелы в 4 раза превышала активность фермента у серой горной кавказской пчелы к 1 часу от начала развития защитных реакций (Рис. 3). При этом, если у темной лесной пчелы с повышением концентрации БТБ наблюдалось снижение уровня активности фермента, то у серой горной пчелы, напротив, активность возрастала.

Рис. 3. Изменение биохимических показателей у Apis mellifera mellifera при действии БТБ в зависимости от концентрации (данные приведены относительно контроля); 1 - 0,01% БТБ, 2 - 0,5% БТБ. достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95).

Повышение активности Г6ФДГ при действии на темную лесную пчелу минимальной концентрации БТБ может свидетельствовать о повышении уровня активности окислительно-восстановительных процессов, нуждающихся в НАДФН₂ (фенолоксидазный каскад, система цитохрома Р-450 и т.д.) (Tzou et al., 2001; Zambon et al., 2005). К 1 часу от начала действия 0,01% БТБ на темную лесную пчелу также наблюдалось превышение активности пероксидазы в 2,5 раза по отношению к контролю, чем в концентрации 0,5%.

Уровень содержания ГАГ у темной лесной пчелы в действующей концентрации БТБ 0,01% постепенно нарастал, особенно на отрезке от 4 до 24 часов. И незначительно изменялся в пределах контрольного уровня при повышенной концентрации.

У темной лесной пчелы в концентрации 0,5% к 1 часу содержание ГАГ резко снижалось, повышаясь до контрольного уровня к 4 часам и далее.

По-видимому, в низкой концентрации у темной лесной пчелы репаративные процессы преобладают над деструктивными, в концентрации 0,5% уровень многих процессов снижается в соответствии с принципом защитного торможения (Мелехов, 1992) и реакции, обеспечивающие восстановительные процессы, начинают активироваться к концу суток. У серой горной пчелы эти процессы запаздывают на сутки (Рис. 4).

Рис. 4. Изменение биохимических показателей у Apis mellifera caucasica при действии БТБ в зависимости от концентрации (данные приведены относительно контроля); 1 - 0,01% БТБ, 2 - 0,5% БТБ. достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95).

В отношении тирозиназы у всех пчел наблюдалась одна и та же тенденция: с возрастанием концентрации битоксибациллина достоверно увеличивалась удельная активность данного фермента, что отличало ее от других выше рассмотренных процессов. При этом темные лесные пчелы по скорости и уровню развития реакции достоверно превосходили серых горных пчел.

Вероятно, это связано с тем, что тирозиназа принимает участие в процессах обеспечивающих распознавание и интернализацию патогена с фагоцитирующими клетками. Участие данного фермента в распознавании ранее было показано исследователями на других видах насекомых (Ashida, 1983; Teopold et al., 2004).

Учитывая все вышеизложенное, можно полагать, что у серой горной кавказской пчелы перестройка в режим энергосбережения и перераспределения внутренних ресурсов происходит с некоторым запаздыванием (как правило, к концу первых суток), что во многом может определять уязвимость серой горной пчелы и более высокую устойчивость темной лесной пчелы в данных климатических условиях.

Очевидно, что повреждения, вызванные сублетальными концентрациями препарата, эффективно снимаются преимущественно при интенсификации метаболизма, в случае высоких концентраций для последующей ликвидации повреждений в основном наблюдается снижение уровня метаболических процессов.

Таким образом, выбор стратегии реализации защитных реакций у рассматриваемых видов насекомых в зависимости от интенсивности действующего фактора определяется в течение первых суток. Он отражает элементы общности в развитии защитных процессов (увеличение количества фагоцитирующих клеток, взаимодействие фенолоксидазной и антиокислительной системы при воздействии БТБ), но в то же время демонстрирует функциональный полиморфизм компонентов защитных систем на видовом и подвидовом уровне.

2. Онтогенетические и внутривидовые различия в формировании биохимических защитных реакций насекомых

Функциональные особенности защитных реакций насекомых складывались как результат приспособления к конкретным условиям жизни вида, то же самое касается и онтогенетических стадий развития (Cui et al., 2000; Housseaw et al., 2001; Dash et al., 2008). Стратегия формирования защитного ответа у разных по времени развития стадий онтогенеза может отличаться, как и принципы реализации защитных реакций внутри вида, способствуя расширению видового ареала.

При воздействии БТБ на насекомых на разных стадиях онтогенеза в организме особей наблюдался рост титра гемагглютининов. Титр агглютининов в гемолимфе колорадского жука изменялся в онтогенезе, увеличиваясь к имагинальной стадии (Табл. 2).

Таблица 2

Титры агглютининов гемолимфы в онтогенезе L. decemlineata на начальном этапе развития инфекции при действии БТБ

Возраст	Контроль	0,1%БТБ	0,5% БТБ
		2 ч	4 ч	24 ч	2 ч	4 ч	24 ч
личинки 3 возраста	64	64	64	64	64	64	128
личинки 4 возраста	512	512	512	1024	2048	4096	4096
куколки	256	256	256	512	256	512	512
имаго 1G	1024	1024	1024	1024	1024	2048	256
имаго W	1024	2048	2048	2048	2048	4096	4096

Имаго 1G - имаго 1-ой генерации, имаго W - перезимовавшие имаго

Причем с увеличением концентрации препарата увеличивалась и скорость изменения агглютинирующей активности гемолимфы. Наиболее интенсивный рост титра гемагглютининов регистрировался при действии нелетальной и пятикратно увеличенной концентрации БТБ у личинок 4 возраста и перезимовавших имаго.

Необходимо отметить, что гемагглютинины L. decemlineata на всех стадиях онтогенеза проявляли сходную углеводную специфичность, связываясь только со сложными олиго- и полимерными сахарами - сульфатированным полисахаридом гепарином, хитозаном со степенью полимеризации 15 и гиалуроновой кислотой (ГУК).

При всем том гемагглютинины L. decemlineata не обладали сродством к N-ацетил-D-глюкозамину (NAGA) - ацетилированной структурной единице хитозана. Очевидно, для связывания гемагглютининами L. decemlineatа углевод должен обладать достаточной молекулярной массой или дополнительными связями.

При действии БТБ у личинок 4 возраста и перезимовавших имаго минимальная ингибирующая концентрация ГУК не изменялась, тогда как у хитозана и гепарина она увеличивалась вдвое.

Данное наблюдение говорит не только об увеличении количества агглютининов в гемолимфе имаго колорадского жука, имеющих сродство к хитозану и гепарину, но и о включении специфических по отношению к БТБ механизмов защиты, поскольку токсины, нарабатываемые B. thuringiensis, имеют в своем составе сходные с хитозаном гликозидные фрагменты (Dulmage, Rhodes, 1971). При действии БТБ у личинок 3 возраста наблюдались увеличения дифенолоксидазной и каталазной активности.

Начальный этап действия БТБ у 1-суточных личинок 4 возраста сопровождался повышением уровня активности тирозиназы и пероксидазы, а в середине 4-го личиночного возраста - увеличением активности всех рассматриваемых ферментов.

Первые часы действия препарата у имаго L. decemlineatа сопровождались некоторым снижением уровня активности фенолоксидаз и повышением пероксидазной активности в гемолимфе (Рис. 5).

Активность каталазы не имела достоверных различий с контрольным уровнем. В рассматриваемых нами системах гуморального ответа, согласно литературным данным, можно выделить два механизма защиты: неспецифический - дифенолоксидазная, каталазная и пероксидазная активности гемолимфы, и специфический - агглютинирующая и тирозиназная активности гемолимфы (Marmaras et al., 1996; Nakamura et al., 2001; Сухорукова, 2002).

С данной точки зрения можно заключить, что на начальном этапе развития защитных реакций у колорадского жука на стадии личинки 3 возраста преобладают неспецифические механизмы, а у половозрелого имаго - специфические.

Рис. 5. Динамика активности ферментов фенолоксидазной (ФОС) и антиокислительной (АОС) систем в гемолимфе имаго L.decemlineata при действии БТБ. Данные нормированы по контролю. * - достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95).

В гуморальном ответе личинки 4 возраста представлены как неспецифические, так и специфические механизмы защиты. Вероятно, это связано с тем, что у колорадского жука личинка 4 возраста занимает относительно длительный период развития, с течением которого в защитном ответе личинки начинают работать элементы специфической защиты - тирозиназа и агглютинины.

Действие БТБ вызвало у личинок колорадского жука 3 и 4 возраста достоверное повышение процента защитных клеток гемолимфы (Рис. 6).

Различие в доле веретеновидных фагоцитов обусловлено, скорее всего, различным процентным соотношением гемоцитов данного типа у личинок 3 и 4 возрастов в норме, так как к 24 часам развития защитной реакции в обоих вариантах процент активных фагоцитов увеличивается в 1,7 раза.

Доля эноцитоидов, напротив, нарастает с различной интенсивностью у личинок 3 и 4 возрастов: если у первых к 24 часам развития инфекции процент эноцитоидов возрастает вдвое, то у вторых - втрое.

Таким образом, у личинок на начальном этапе развития защитных реакций с возрастом достоверно увеличивается интенсивность гемоцитарной дифференциации в направлении клеток, вырабатывающих факторы гуморального иммунитета.

Рис. 6. Доля веретеновидных фагоцитов (А) и эноцитоидов (Б) у личинок 3 возраста и 3-х суточных 4 возраста L.decemlineata на начальном этапе развития инфекции. * - различие опыта и контроля достоверно, Р>0,95.

Характер гемоцитарной реакции куколки на обработку нелетальной дозой БТБ отличается от личиночной некоторым снижением доли веретеновидных фагоцитов.

Действие 0,1% БТБ на 10 суточных имаго 1 генерации вызвала резкое увеличение процента веретеновидных фагоцитов. При этом доля сферулоцитов и эноцитоидов постепенно уменьшалась к 24 часам развития инфекции.

Приспособленность темной лесной пчелы к суровым природно-климатическим условиям может определяться уровнем и последовательностью проявления активности различных ферментов и набором физиолого-биохимических реакций, которые могут отличаться от таковых у серой горной кавказской пчелы.

Действие бактериального препарата, вызывая видимые изменения кишечника и клеточного состава гемолимфы, должно вызывать закономерные изменения метаболических процессов.

У темной лесной пчелы рост удельной активности Г6ФДГ начинался к 4 часам (Табл. 3).

Уровень активности каталазы у всех пчел был достаточно высок, поэтому на этом фоне изменения активности были незначительны.

Таблица 3

Изменение биохимических показателей у рабочих пчел Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica при действии 0,05% битоксибациллина

Данные нормированы по контролю, темным фоном отмечено недостоверное отличие от контрольного уровня, Р ? 95%; активность Г6ФДГ, каталазы, КФ и эстеразы измеряли в мМ/мин/мг белка; пероксидазу, ДФО, тирозиназу и протеазы - в ед.ак./мин/мг белка; уроновые кислоты - в мг/г ткани

Небольшие различия в активности пероксидазы были отмечены к 1 часу, наиболее высокий уровень отмечали у темной лесной пчелы.

По уровню дифенолоксидазной активности на начальной стадии воздействия БТБ наблюдались существенные различия между подвидами; наиболее высокий уровень удельной активности отмечался у темной лесной пчелы.

Наибольшие различия наблюдали по уровню активности кислой фосфатазы, более высокий уровень активности в течение первых 4 часов был у темной лесной пчелы с последующим снижением к концу суток, и наоборот, самый низкий был у серой горной пчелы. Самый высокий уровень содержания ГАГ наблюдали у темной лесной пчелы и низкий у серой горной пчелы.

При первичном действии на пчел 0,05% БТБ количество прогемоцитов у темной лесной пчелы было относительно стабильным в течение суток и составляло около 80% от общего числа клеток гемолимфы, из которых 20% составляли делящиеся прогемоциты (Рис. 7 А).

Постепенно увеличивался процент веретеновидных фагоцитов, в начале эксперимента они составляли всего лишь 2%, но к 4 часам количество их возросло до 16%, уменьшаясь к концу 1 суток почти вдвое. Количество прогемоцитов у серой горной пчелы в начале эксперимента несколько превышало 80% (Рис. 7 Б).

У серой горной пчелы к 1 часу от начала эксперимента снижается количество амебоидных фагоцитов (от 9% до 1%) и пропорционально увеличивается количество веретеновидных фагоцитов.

Рис. 7. Изменение гемограммы у пчел Ap. m. mellifera (А) и Ap. m. caucasica (Б) при действии 0,05% битоксибациллина; Мкц-макронуклеоциты, Эоз- эозинофилы; Вер.фгц- веретеновидные фагоциты, Ам.фгц-амебоидные фагоциты, Дпг-делящиеся прогемоциты, Пг-прогемоциты

Таким образом, нелетальные дозы патогенного препарата вызывают у насекомых активную гуморальную реакцию с участием специфических гемагглютининов и фенолоксидазной и антиокислительной систем на начальном этапе защитного процесса, различающуюся по уровню специфичности на разных этапах онтогенеза насекомого.

В то же время гуморальные защитные реакции насекомых функционируют в тесной взаимосвязи с клеточными компонентами гемолимфы, являющимися как источниками, так и мишенями для целого ряда факторов гуморального иммунитета.

3. Особенности иммунизации насекомых и реактивность биохимических защитных механизмов при воздействии битоксибациллином

Способность насекомых к иммунизации, повышающей устойчивость особей, обычно вызывали сомнение. Сроки сохранности приобретенного иммунитета остаются спорными, считается, что в отношении некоторых микроорганизмов он исчезает быстро, в отношении других медленно (Полтев, 1969; Cui et al., 2000).

Очевидно, что в данных исследованиях не были учтены особенности онтогенеза насекомых и подробное изучение биохимических процессов при иммунизации.

Кроме того, спорным остается значимость вклада иммунизации в формирование общей устойчивости насекомых (Pesh et al., 2000; Омельянчук, 2001). Открыт также вопрос о влиянии иммунизации на формирование онтогенетической адаптации насекомых (Cohen, Crittenden, 2004; Lopez-Martinez et al., 2008).

Предварительная обработка насекомых нелетальной дозой БТБ изменяла соотношение защитных клеток гемолимфы при повторном заражении в сравнении с неиммунизированными особями.

Следствием иммунизации личинок в 3 возрасте являлось увеличение доли сферулоцитов и эноцитоидов в первые часы после повторного заражения личинок 4 возраста.

Иммунизация личинок в 1-е сутки 4 возраста проявлялась в увеличении доли активных фагоцитов на начальном этапе развития инфекции в сравнении с неиммунизированными особями (Рис. 8 А).

Рис. 8. Изменение доли веретеновидных фагоцитов у иммунизированных личинок 4 возраста (А) и имаго первой генерации (Б) колорадского жука.

Обработка личинок 4 возраста нелетальной дозой БТБ оказала иммунизирующее действие при повторном заражении куколок, стимулируя у последних направление дифференциации гемоцитов в сторону веретеновидных фагоцитов, образующихся как при активации амебоидных фагоцитов, так и из прогемоцитов (Рис. 8 Б).

Действие нелетальных доз БТБ на имаго колорадского жука (1-ой генерации и перезимовавших) производило иммунизирующий эффект, увеличивая процент активных фагоцитов в первые часы после повторного заражения.

Реализация биохимических защитных механизмов при повторном заражении L.decemlineata также характеризуется онтогенетическими особенностями.

У личинок 4-го возраста она проявляется в стабилизации активности ферментов антиокислительного комплекса и в повышении реактивности дифенолоксидазы и титра агглютининов, а у имаго - в повышении активности тирозиназы и титра агглютининов (Рис. 9).

Рис. 9. Динамика активности ферментов фенолоксидазной (ФОС) и антиокислительной (АОС) систем в гемолимфе имаго L.decemlineata при двукратном действии БТБ. Данные нормированы по контролю. * - достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95)

Таким образом, и при двукратном действии бактериального препарата иммунный ответ личинки 4-го возраста сочетает как неспецифическую реакцию, так и элементы специфических механизмов защиты, тогда как у перезимовавшего имаго агглютинирующая и тирозиназная активности гемолимфы обеспечивают эффективное распознавание.

В целом, повышенная активность биохимических и клеточных реакций на повторное введение бактериального препарата и сохранение эффекта иммунизации при смене возрастов личинок и онтогенетических стадий L.decemlineata позволяют говорить о способности насекомых к развитию иммунной памяти.

Эксперимент по выживаемости мух и колорадского жука при иммунизации на стадии личинок показал, что предварительная обработка маленькой концентрацией битоксибациллина 0,001% (СК₁₆) повышала выживаемость мух при действии повторной концентрацией 0,005% (СК₅₀), а также при действии БТБ 0,02% (СК₈₄) (Рис. 10).

Рис. 10. Иммунизирующее действие нелетальной концентрации (НК) БТБ на насекомых А - смертность (%) имаго Musca domestica L.; Б - смертность (%) Leptinotarsa decemlineata Say. НК - нелетальная концентрация, СК50 и СК84- концентрации, вызывающие гибель 50% и 84% особей соответственно.

Повторное воздействие на пчел через 7 суток более высокой концентрацией бактериального препарата вызвало значительные изменения в динамике активности практически всех показателей (Табл. 4).

Таблица 4

Динамика биохимических показателей у иммунизированных пчел

Уровень удельной активности Г6ФДГ у серой горной пчелы при повторном заражении значительно ниже, чем у темной лесной пчелы, что, возможно, свидетельствует о большей активации гликолитических процессов у последних.

Количество уроновых кислот у серой горной пчелы возрастало. У иммунизированной темной лесной пчелы количество их на протяжении первых суток уменьшался, что позволяет предположить у этой группы пчел интенсивный процесс гликоконьюгации, способствующий связыванию токсических продуктов.

Так, например, было показано, что у других видов насекомых при токсических воздействиях активируется ключевой фермент пентозного шунта Г6ФДГ и образование активированных глюкозидов, принимающих участие в гликоконьюгации токсинов (Ekengren, Hultmark, 2001; Sorensen et al., 2005).

Примечание: активность дифенолоксидазы, тирозиназы, протеаз, пероксидазы указаны в условных единицах, эстераз и кислой фосфатазы в мг/мин/мг белка, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, каталазы мкМ/мин/мг белка, малонового диальдегида в нМ/мг ткани, уроновых кислот мг/г ткани; темный фон обозначает недостоверное различие с контролем при Р?95 %.

Дифенолоксидазная активность после обработки БТБ низкой концентрации не менялась у всех групп пчел относительно контроля. Однако при воздействии БТБ удвоенной концентрации этот показатель оставался относительно стабильным только у темной лесной пчелы. Активность тирозиназы при обработке малыми дозами БТБ почти не отличалась от исходного уровня у всех пчел; в то же время на удвоенную концентрацию препарата максимальная реакция выявлена в группе семей темной лесной пчелы, тогда как для серой горной пчелы эти отклонения не столь значительны.

Таким образом, иммунизирующее действие низких доз битоксибациллина способствует повышению реактивности защитных клеточных и гуморальных факторов при повторном действии БТБ на насекомых, способствуя формированию долговременной иммунной памяти.

4. Биохимические основы использования биологически активных веществ в качестве адаптогенов для насекомых

В ряде работ было показано, что олигосахариды, олигонуклеотиды, олигопептиды и оксигенированные производные ненасыщенных жирных кислот и каротиноидов могут действовать как элиситоры (Чалова, Озерецковская, 1976; Ryan, Farmer, 1991; Тарчевский, 1992; Jing et al., 2007). При обычных, стационарных условиях их регуляторная функция мало заметна, но при сильных изменениях окружающей среды или действии патогенных организмов, когда усиливается распад биополимеров, она проявляется в подключении триггерных механизмов обеспечения выживания организмов. Особый интерес представляет использование с этой целью хитиновых олигосахаридов. В литературе имеются единичные сведения по использованию хитиновых олигосахаридов в качестве биологически активных соединений на насекомых (Furukawa et al., 1999; Zaharoff et al., 2007), так было показано, что хитозан вызывает экспрессию генов антибактериальных пептидов у тутового шелкопряда, повышая уровень гуморального иммунитета.

Наличие хитиновых структур у насекомых и комплексов деградирующих их ферментов позволяет предположить, что продукты катаболизма хитина могут выполнять достаточно важные регуляторные функции в организме насекомых. Пчелы в течение 5 дней содержались на обычном сиропе и для сравнения на сиропе с хитозаном, и ежедневно из садков отбирались насекомые для проведения биохимических исследований 5 раз с промежутком в 1,5 часа в одно и тоже время суток. Наблюдая суточную и недельную динамику биохимических показателей в норме, можно отметить плавное протекание биохимических реакций, без значительных подъемов и спадов (Табл. 5).

При скармливании пчелам хитозана и регистрации активности ферментов в течение пяти суток отмечалось повышение активности пероксидазы с пиком на третьи сутки. Несколько снижалось содержание ТБК-реагирующих продуктов, особенно на третьи сутки, когда отмечался пик активности антиокислительных ферментов.

Ранее было показано, что производные хитина проявляли значительную активность против гидропероксид- и пероксид- радикалов, стимулируя активность лизосомальной системы (Xue et al., 1998). Следовательно, правомерным будет утверждение того, что хитозан стимулировал активность систем, снижающих уровень пероксид радикалов.

Таблица 5

Недельная динамика активности биохимических показателей пчел в норме и при действии хитозана

Вариант	Г6ФДГ (мМ/мин/ мг белка)	Каталаза (мМ/мин/ мг белка)	ПО (ед.акт./ мин/мг белка)	МДА (нМ/г ткани)	ФО (ед.акт./ мин/мг белка)	Протеиназы (ед.акт./ мин/мг белка)	ИП (ед.акт/ мин/мг белка)	ГАГ (мг/г ткани)
Недельная динамика (контрольные пчелы)
1 сут.	0,0018 0,0003	44,81 0,27	0,171 0,017	4,64 0,15	0,111 0,004	12,79 0,01	4,23 0,02	2,54 0,05
2 сут.	0,0021 0,0003	30,77 0,27	0,135 0,033	5,05 0,06	0,125 0,017	2,91 0,04	4,79 0,03	2,16 0,03
3 сут.	0,0160 0,0002	55,81 0,37	0,145 0,004	5,24 0,04	0,257 0,026	0,43 0,01	1,38 0,11	3,64 0,01
4 сут.	0,0051 0,0006	25,22 0,21	0,124 0,003	7,43 0,10	0,155 0,030	4,41 0,01	2,41 0,24	3,21 0,02
5 сут.	0,0058 0,0004	45,99 0,41	0,241 0,001	11,61 0,09	0,401 0,014	0,56 0,06	2,44 0,03	1,82 0,26
Недельная динамика при действии хитозаном на пчел
1 сут.	0,0058 0,0004*	45,06 0,59	0,077 0,001*	5,42 0,08	0,162 0,012*	0,82 0,04*	1,61 0,09*	3,14 0,12*
2 сут.	0,0041 0,0003*	35,25 1,55*	0,141 0,003*	4,64 0,12	0,101 0,009*	0,52 0,01*	1,79 0,01*	5,48 0,06*
3 сут.	0,0148 0,0012*	53,39 0,14	0,197 0,008*	3,22 0,13*	0,174 0,003*	0,43 0,01	1,14 0,07*	6,72 0,23*
4 сут.	0,0215 0,0015*	35,11 0,22*	0,109 0,021	6,23 0,09	0,119 0,014*	0,93 0,04*	2,81 0,028	5,96 0,005*
5 сут.	0,0055 0,0004	82,01 1,04*	0,139 0,005*	9,22 0,11*	0,641 0,023*	0,47 0,01*	2,47 0,03	2,28 0,01*

*-доверительный интервал, p=0,95

Начиная с третьих суток, происходило повышение активности Г6ФДГ. С первых суток наблюдался устойчивый рост ГАГ с пиком активности между 3-ми и 4-ми сутками от начала эксперимента. Спад активности Г6ФДГ и содержания ГАГ происходили к концу пятых суток.

Можно предположить, что хитозан, воздействуя на определенные рецепторы, подвергается дальнейшей деградации системой хитинолитических ферментов и включается в обмен углеводов.

При этом может происходить активация пентозофосфатного пути и метаболически связанного с ним процесса образования эндогенных гликозоаминогликанов.

Подобного рода механизмы были отмечены при клиническом патогенезе у млекопитающих в результате применения экзогенной субстанции гликозоаминогликанов, выделенных из плацентарных тканей, что способствовало индуцированию восстановительных процессов (Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., 2006).

Помимо образования УДФ-глюкозидов в глюкуронат-ксилулозном цикле, который также имеется у насекомых, повышение активности пентозофосфатного пути способствует образованию НАДФН₂, что может активировать систему цитохромоксидаз, фенолоксидаз, синтез экдистероидов и других важных защитных процессов, заинтересованных в использовании НАДФН₂ Подобного рода процессы были отмечены у лабораторных крыс при экспериментальных нагрузках (Лабори, 1970; Парк, 1973), а также у насекомых (Rabea et al., 2006).

...