Биохимические механизмы адаптации к битоксибациллину в онтогенезе насекомых holometabola

Интенсификация этих процессов активизирует антирадикальную защиту, что является значимым звеном в цепи реакций, обеспечивающих взаимосвязь между составом липидов, степенью их окисления и структурой мембран.

Наряду с этим хитозан определенно воздействовал на уровень активности и спектр молекулярных форм ферментов фенолоксидазной системы. Вероятно, имеется какой-то исходный набор изоформ ФО, обеспечивающий потребности организма в норме.

Поэтому последующее действие на насекомых бактериальным препаратом, клеточные стенки бактерий которого имеют, вероятно, некоторое сходство с хитозаном, могут вызывать более быструю и эффективную реакцию уже подготовленной ферментативной системы.

Довольно сходный тип реакции был описан в отношении такой же сложной ферментативной системы цитохрома Р-450 по отношению к постоянно действующим одним и тем же ксенобиотикам (Арчаков, 1979; Ковалев, Шипулина, 1992; Сибиряк, Вахитов, Курчатова, 2003). В нашем эксперименте достаточно выраженные изменения активности почти всех наблюдаемых биохимических ферментов приходятся на третьи сутки содержания пчел на хитозане.

Заметное влияние хитозана, как сигнальной молекулы, на биохимические процессы позволяет предположить, что они могут оказывать преадаптивное действие на насекомых (Рис. 11).

Ферментативные системы «откликались» значительно раньше при действии на пчел БТБ, чем у пчел не получавших хитозан. В течение первых суток количество ГАГ повышалось примерно в 4 раза.

Интенсивность образования ГАГ в первые часы заражения позволяет предположить активацию этих процессов хитозаном как до заражения, так и после него. Значительный «запас» глюкуронидов, вероятно, способствовал более интенсивной нейтрализации токсических агентов на протяжении первых суток при заражении БТБ.

В течение суток происходило снижение активности Г6ФДГ с последующим восстановлением почти до контрольного уровня, однако уровень активности при предварительном содержании пчел на хитозане оказывался значительно выше, чем у пчел, не получавших хитозан. Активность ферментов фенолоксидазной системы к концу 1-х суток возрастала почти в 1,5 раза.

Для того, чтобы оценить возможное проявление биологической активности хитосахаридов на других видах насекомых, подобного рода эксперименты были поставлены на личинках 4 возраста второй генерации колорадского жука и личинках 2 возраста комнатной мухи. Результаты экспериментов приведены в таблице 6. Использовали комнатную муху и колорадского жука для определения воздействия хитосахаридов на онтогенез насекомых, и было установлено, что их добавка в корм личинок оказывала влияние на время развития насекомых. Процент выхода имаго снижался в варианте с подкормкой хитином и сохранялся на высоком уровне в вариантах с хитозаном и NAGA.

На скорость развития личинок мухи большее влияние оказал хитозан и NAGA, а на личинок колорадского жука - NAGA.

Таким образом, можно утверждать, что хитозан и NAGA обладают выраженной биологической активностью по отношению к организму насекомых, что заключается в повышении выживаемости особей при действии неблагоприятных факторов, а также в изменении стереотипа поведенческих реакций во времени. При этом характер действия хитосахаридов зависел от степени полимеризации и деацетилирования, стадии онтогенеза и вида насекомого.

Таблица 6

Зависимость выживания колорадского жука, комнатной мухи и медоносной пчелы от концентраций хитосахаридов

*-различия с контролем достоверны, p=0,95

Для медоносной пчелы наибольшая степень адаптивного действия установлена для хитозана, что выражается в индукции гуморальных факторов защитных реакций, формируя так называемый ферментативный структурный след адаптации.

5. Роль критических периодов онтогенеза в проявлении трансгенерационного эффекта защитных реакций в ряду поколений Musca domestica

Тесная взаимосвязь иммунной и нейроэндокринной систем с генетическими механизмами преобразования насекомых может играть значительную роль в формировании долговременной иммунной памяти, обеспечивающей устойчивость на протяжении всего онтогенеза, а возможно и в последующих поколениях, что до сих пор для них считалось невозможным.

Именно поэтому большую роль в изменении фенотипической реализации генотипа могут играть критические периоды развития насекомых. Они связаны с периодами преобразования особей в ходе индивидуального развития и могут представлять собой наиболее значительные этапы для действия отбора в процессе эволюции.

По мнению Л.И. Корочкина (2002) стало очевидным, что живые системы обладают оперативной “памятью”, которая находится в непрерывном контакте со средой и могут использовать средства природной эмбриогенетической инженерии для быстрого наследуемого перехода из одного режима функционирования в другой.

Такими важными моментами в процессе индивидуального развития, когда при действии стимулирующих факторов внешней среды происходит «запечатление той самой оперативной памятью» необходимых процессов, могут стать периоды повышенной чувствительности. Стимуляция защитных систем в эти периоды может способствовать возникновению так называемого трансгенерационного эффекта, т.е. некоторым адаптивным изменениям в активации или регуляции некоторых защитных механизмов, которые смогут передаваться в нескольких поколениях насекомых.

Подобного рода эффект был описан на шмелях и дафниях, однако биохимические механизмы и реализующие их условия отмечены не были (Moret, 2001; Kurtz, 2004; Moret, 2006).

Для выявления чувствительных периодов в онтогенезе насекомых фиксировали изменение активности ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем, участвующих в формировании покровов при метаморфозе и при воздействии аскорбиновой кислоты - модулятора данных защитных процессов и активного антиоксиданта. В формировании экзоскелета насекомых важную роль играют производные тирозина, в связи с чем, процессы линьки и метаморфоза сопровождаются у насекомых изменениями в обмене тирозина (Гилмур, 1968; Terwilliger, 1999; Kramer et al., 2001), начальный путь превращения которого катализируют ферменты, наделенные фенолоксидазной активностью.

У насекомых выделены и описаны тирозиназа и дифенолоксидаза, активность которых значительно изменяется в онтогенезе. Использование определенных различий в субстратном предпочтении может быть полезным при выяснении сложных ферментативных механизмов линьки и метаморфоза у насекомых. Хорошими субстратами для всех фенолоксидаз являются дифенолы, однако, только тирозиназа способна катализировать гидроксилирование тирозина с образованием дигидроксифенилаланина (ДОФА).

Отличительной особенностью этой реакции является также то, что для ее протекания требуется присутствие доноров электронов (Fontecave, Pierre, 1998; Rodriguez-Lopez et al., 2001; Гукасян, 2002). Для определения максимумов и минимумов в активности этих ферментов в онтогенезе, исследовали подробную динамику активности этих ферментов, а также изменение активности в эти периоды под влиянием донора электронов и регулятора активности этих ферментов аскорбиновой кислоты (Рис. 12).

Несмотря на изменения активности ферментов, при дисперсионном анализе с применением критерия Краскелла-Уоллиса нами было получено подтверждение значимости фактора «возраст» для признака активности ферментов при р?95%: фактические значения критерия Н превышали табличные как для тирозиназы (Н_факт=7.83; Н_табл=7.82), так и для дифенолоксидазы (Н_факт=4.76; Н_табл=4.71).

В альтернативных экспериментах было рассмотрено действие битоксибациллина на личинок комнатной мухи в концентрации, исключающей летальное действие (Табл. 7), отсекая фактор отбора устойчивых особей, но оказывающей при этом определенное стимулирующее действие на защитные системы.

При воздействии бактериальным препаратом битоксибациллином в концентрации 0,01% (концентрация была отобрана в предварительных экспериментах, вызывающая гибель особей на уровне контроля, около 5-8%) на разных сроках развития личинок комнатной мухи можно отметить следующее. При действии БТБ на 3-х суточных личинок отмечали достоверное сокращение сроков развития личиночной стадии примерно на трое суток и почти на 2 суток сокращение сроков развития пупариев. При этом процент окуклившихся личинок и вылетевших имаго был выше, чем в контроле.

Таблица 7

Жизненные показатели Musca domestica L. при действии БТБ в концентрации 0,01% на разных сроках развития личинок

L - личинка, P - куколка, I - имаго, цветом отмечено, что различие между опытом и контролем достоверно (Р0,05)

При воздействии бактериальным препаратом на 6-ти суточных личинок достоверно возрастал средний вес пупария и увеличивался срок развития личиночной стадии. Действие БТБ на 8-ми суточных личинок достоверно уменьшало процент окуклившихся особей и вылетевших имаго. При воздействии препаратом на 10-ти суточных личинок наблюдался самый высокий процент окуклившихся особей и вылетевших имаго.

Значительные изменения наблюдали в активности ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем на последующих стадиях развития комнатной мухи (Рис. 12). При воздействии БТБ на 3-х суточных личинок наблюдали возрастание активности дифенолоксидазы в 8 раз в гемолимфе у этих же личинок, но на 6-е сутки развития, и в 9 раз у куколок 1-х суток развития. Самую высокую активность тирозиназы также наблюдали на этих же сроках развития, что подтверждает наличие долговременной онтогенетической стимуляции данных ферментов. Наибольшая активность пероксидазы также проявлялась на стадии формирования куколок, подтверждая взаимодействие данных систем и участие в формировании куколочных покровов.

При воздействии битоксибациллином на 8-ми суточных личинок комнатной мухи можно отметить повышение активности дифенолоксидазы и тирозиназы у 10-ти суточных личинок во многих тканях организма, кроме гемолимфы (Рис. 13).

Дифенолоксидаза превышала контрольный уровень почти в 2 раза у суточных пупариев в общем гомогенате и передней части куколки, у четырехсуточных пупариев этот фермент почти в 3 раза превышал контрольные значения в задней и передней частях куколки, а также в кишечнике у суточных имаго.

В остальных случаях активность этих ферментов была сопоставима с контролем. Трехкратное превышение контрольного уровня активности каталазы наблюдали в передней части суточных пупариев. Более чем в 2 раза этот показатель превышал контрольные значения в передней и задней частях у 4-х суточных пупариев. Пероксидазная активность превышала контрольный уровень более чем в 2,5 раза у 10-ти суточных личинок в кишечнике и в голове.

У суточных пупариев пероксидаза активировалась почти в 3,5 раза по отношению к контролю в покровах, у всех этот показатель превышал контроль более чем в 2 раза в кишечнике, а у 2-х суточных имаго также в покровах. В данном случае можно отметить, что воздействие бактериальным препаратом на насекомых проводилось в те моменты онтогенеза, когда активность данных ферментов была максимальной. На последующих стадиях онтогенеза активность данных ферментов была значительно снижена.

Таким образом, можно отметить следующие особенности. При воздействии на 3-х суточных личинок бактериальным препаратом сохранялась стабильно повышенная активность всех параметров в покровах и гемолимфе, при действии на 6-ти суточных личинок активность сохранялась, в основном, в тканях кишечника и во внутреннем содержимом пупариев. При действии на 10-ти суточных личинок активность сохранялась, в основном, в покровах, в тканях головы и содержимом у пупариев.

Общим для всех этих экспериментов было то, что при воздействии на 3-х, 6-ти и 10-ти суточных личинок, когда рассматриваемые ферменты иммунитета были на минимуме своей функциональной активности, наблюдался рост и сохранение активности данных параметров на последующих стадиях онтогенеза в определенных органах и тканях. При этом жизнеспособность особей в определенной мере повышалась. У 8-ми суточных личинок, наоборот, в этот период был некоторый подъем активности данных ферментов, но при воздействии на них БТБ наблюдалось на последующих стадиях общее снижение активности ферментов и жизненных показателей.

Эти экспериментальные данные свидетельствуют о наличии критических и основных периодах онтогенеза. Возникает при этом идея малого параметра, высказанная А.М. Молчановым (1975), и особенно принятая в биохимии, обозначающая узкое место в реакции или функциональной системе. Как правило, такими узкими местами являются ферменты с низкой каталитической активностью или обладающие важными регуляторными функциями (Анохин, 1975; Панин ,1983). Такой ферментативной системой, по-видимому, в данном случае может быть фенолоксидазная система. Вероятно, что активация наблюдаемых защитных процессов в гемолимфе и покровах, а также в содержимом пупариев, и дальнейшее сохранение повышенной активности в этих же тканях в онтогенезе могут указывать на интенсификацию защитных процессов именно здесь.

По результатам предварительного биотеста и проведенных ранее исследований (Салтыкова, 2000), NAGA был выбран нами в качестве фактора, условно модулирующего действие патогена, для проведения эксперимента, в котором определялась длительность биохимических защитных реакций на действие факторов разной природы (NAGA и высокая температура) в онтогенезе M.domestica.

В данном эксперименте определялся уровень активности дифенолоксидазы, каталазы и пероксидазы личинок, куколок и имаго M.domestica в 4-х вариантах: 1) контроль, 2) личинки перенесли тепловой стресс, 3) личинки развивались в среде, содержащей NAGA, 4) личинки развивались в среде, содержащей NAGA, и перенесли тепловой стресс. Воздействие проводили в критические периоды онтогенеза, для того чтобы определить продолжительность активации защитных механизмов. Действие NAGA и высокой температуры на личинок вызвало достоверное повышение (Р>0,95) активности каталазы, пероксидазы и дифенолоксидазы на куколочной и имагинальной стадиях (Табл. 8).

Полученные нами данные, демонстрирующие после воздействия температурного фактора на насекомых, повышенный уровень активности ферментов антиокислительной системы и дифенолоксидазы на последующих этапах онтогенеза, свидетельствует о долговременности функционирования стимулированных температурным фактором антиоксидантной и фенолоксидазной систем. Повышение активности ферментов фенолоксидазной и антиокислительной систем при действии температурного фактора у насекомых рассматриваются как часть защитных реакций, направленных на снижение цитотоксического действия перекиси водорода и на регуляцию уровня биогенных аминов (Раушенбах и др., 1993; Сухорукова, 2002).

Таблица 8

Активность каталазы, пероксидазы и дифенолоксидазы в онтогенезе M.domestica при действии NAGA и высокой температуры

В затемненных клетках различие опыта с контролем достоверно (Р>0,95).

L - личинка, P - куколка, I - имаго. K - контроль, Т°С - личинки перенесли тепловой стресс, NAGA - личинки перенесли действие NAGA, NAGA+ Т°С - личинки перенесли действие NAGA и тепловой стресс.

Воздействие NAGA на личинок M.domestica также стимулировало защитные системы организма насекомого, вызывая стойкое повышение уровня активности дифенолоксидазы на следующих стадиях онтогенеза. На фоне теплового стресса NAGA оказывало стабилизирующее действие на активность антиокислительных ферментов. Возможно, предварительное содержание насекомых на NAGA активизирует процесс ферментативной деградации перекиси водорода при тепловом стрессе и стабилизирует активность антиокислительных ферментов на уровне, приближающемся к соответствующим контролю значениям. Вместе с тем, NAGA повышал у насекомых уровень метаболизма в целом, физиологическими показателями чего являлись сокращение сроков развития личинок и куколок, увеличение веса куколок, а также оказывал компенсаторное действие при тепловом стрессе, значительно повышая жизнеспособность особей (Рис. 14).

Действие NAGA на M.domestica L. индуцировало дополнительные изоформы фенолоксидазы, отличные от тех, что инициировались при тепловом стрессе (Рис. 15). Действие теплового фактора индуцировало у личинок изоформу фенолоксидазы с Rf 0,5, специфичную для куколочной стадии. Данная молекулярная форма фермента сохранялась у имаго. Действие NAGA на личинок индуцировало ряд изоформ фенолоксидазы, также стабильно воспроизводившихся на последующих стадиях онтогенеза.

Наибольшее внимание обращают на себя молекулярные формы с Rf 0,3 и 1. Данные изоформы фермента специфичны для строго определенных этапов развития комнатной мухи. Изоформа с Rf 0,3 характерна для куколочной стадии развития, а изоформы с Rf1 - для моментов перехода одной онтогенетической стадии в другую: при окукливании, у молодых куколок и фаратных имаго. И если исходить из положения, что в морфогенетических и защитных процессах насекомых задействованы сходные механизмы (Natori et al., 1999), то молекулярные формы фенолоксидазы с Rf 0,3 и 1, инициируемые на строго определенных этапах онтогенеза M.domestica, могут индуцироваться и при развитии иммунной реакции у насекомых.

Предполагается, что механизм образования новых молекулярных форм фенолоксидаз при действии NAGA заключается в изменении степени гликозилирования фенолоксидаз и функциональным отбором необходимых изоформ на предыдущих стадиях онтогенеза. Что не оказывает влияния на субстратную специфичность ферментной системы, но способствует лучшему выполнению их функций при развитии защитной реакции насекомых на действие патогена (Салтыкова и др., 2003).

К настоящему времени установлено, что молекулы фенолоксидазы (а именно, тирозиназы) насекомых ответственны за распознавание антигенов (Ratkliffe, 1985).

В результате воздействия на M.domestica теплового стресса и (или) NAGA в последующих поколениях насекомого на отдельных стадиях онтогенеза отмечаются повышенные уровни активности каталазы, пероксидазы и фенолоксидазы, а также обнаруживаются ее индуцированные изоформы.

Причем, активность ферментов антиокислительной системы и фенолоксидазы обнаруживает повышенный уровень при тепловом стрессе родительского поколения только в поколении F1, а при действии NAGA на родительское поколение - в двух последующих поколениях. Аналогичным образом, молекулярные формы фермента, индуцируемые тепловым стрессом в родительском поколении, сохраняются только в поколении F1. Легкие же изоформы с Rf >1, индуцированные в родительском поколении действием NAGA, стабильно воспроизводятся в двух последующих поколениях комнатной мухи.

С точки зрения классической менделевской теории наследственности, передача адаптивного ответа организма на условия среды последующим поколениям невозможна.

Однако появилось много экспериментальных данных, не вписывающихся в классическую теорию наследственности и свидетельствующих в пользу выдвинутого Ж.Б.Ламарком принципа наследования приобретенных признаков (Каллис, 2000; Чураев, 2000; Стил и др., 2002), включающих механизмы эпигенетического наследования, активации транспозонов и др.

Следовательно, интерпретация полученных данных может не ограничиваться отбором особей с повышенным уровнем активности рассматриваемых ферментативных систем, поскольку, с точки зрения аспектов неоламаркистской концепции, полностью не исключена и возможность наследования наблюдаемых индуцированных онтогенетических изменений в защитных ферментативных системах.

Таким образом, на основе полученных данных можно полагать, что фенолоксидазная система участвует в формировании долговременной иммунной памяти, отбором необходимых гликозилированных молекулярных форм фермента при контакте с патогеном на предшествующих стадиях онтогенеза, которые сохраняются на протяжении двух последующих поколений без дополнительного воздействия фактором. Условием возникновения трансгенерационного эффекта являются чувствительные периоды онтогенеза, характеризующие моменты метаморфоза насекомых.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты экспериментов и анализ литературных данных позволяют утверждать, что начальный этап формирования биохимических и клеточных защитных реакций у насекомых с полным типом превращения является определяющим для течения дальнейших этапов и финала действия бактериального препарата. На начальном этапе происходит распознавание, задействуются необходимые пусковые механизмы защитных реакций и формируется эффективная стратегия реализации метаболических процессов. Ранее было показано, что насекомые обладают сложной и эффективной системой конституциональных механизмов (Черныш, 1999; Глупов, 2001). Динамика изменений биохимических и клеточных показателей гемолимфы позволяет выявить основные фазы развития защитных реакций (30 мин; 1ч; 2ч; 4ч; 24ч) у насекомого при действии бактериальным препаратом. У них увеличивается процент содержания фагоцитов в гемолимфе, активируются фенолоксидазная и антиоксидантная системы. Используя различные концентрации битоксибациллина, выявили, что повреждения, вызванные малыми дозами патогена, эффективно снимаются при интенсификации метаболизма, при высоких дозах наблюдается снижение уровня метаболических процессов. Такая направленность отчетливо выражена на начальной стадии действия битоксибациллином в лабораторных условиях на A.m.mellifera, в отличие от A.m.caucasica, а также на личинках колорадского жука. Внутривидовые особенности реагирования биохимических и клеточных защитных систем у медоносной пчелы заключаются в скорости преодоления пороговой чувствительности к бактериальному препарату. Пчелы A.m.mellifera отличаются от пчел A.m.caucasica повышенной фагоцитарной реакцией гемолимфы и более ранней активацией окислительно-восстановительных процессов.

Были выявлены также существенные различия в биохимических и клеточных защитных механизмах на разных этапах онтогенеза у колорадского жука. С точки зрения иммунизации личинка третьего возраста и имаго колорадского жука представляются совершенно разными организмами (Глупов, 1993; Marmaras et al., 1996; Nakamura et al., 2001; Сухорукова, 2002). В гуморальном ответе нами выделялись два механизма защиты: неспецифический - дифенолоксидазная, каталазная и пероксидазная активности гемолимфы, и относительно специфический - агглютинирующая и тирозиназная активности гемолимфы. Таким образом, в онтогенезе были выявлены явные различия в индуцировании защитных механизмов у личинок и взрослых особей. В повышении устойчивости к бактериальному препарату у личинки задействованы менее специфичные защитные системы (ферменты антиоксидантной системы, дифенолоксидаза, клетки гемолимфы - эноцитоиды и сферулоциты). В случае половозрелого имаго ведущая роль в данном процессе переходит к более специфичным механизмам защиты (гемагглютинины, тирозиназа, иммунокомпетентные клетки - веретеновидные фагоциты). Увеличение активности фенолоксидаз на начальном этапе повторного воздействия БТБ на личинок L.decemlineata при снижении активности антиокислительных ферментов лишний раз указывает на взаимодействие фенолоксидазного и антиоксидантного путей (см. схему).

Очевидно, что основанный на этом взаимодействии механизм сопровождается временным ингибированием собственных антиоксидантных систем и играет важную роль в антимикробном иммунитете насекомых за счет производства высокореактивных интермедиатов (Салтыкова, 2000; Whitten et al., 2001).

Возможна преадаптация насекомых, способствующая повышению их устойчивости к действию средовых факторов, при введении им биологически активных веществ, например хитозана, которые создают ферментативный структурный след адаптации (Меерсон, 1999). Показана преактивация конституциональных защитных систем с помощью антиоксиданта - аскорбиновой кислоты (Салтыкова и др., 2000), посредством которой можно модулировать реакцию фенолоксидазной и антиоксидантной защитных систем у насекомых. Аскорбиновая кислота тормозит образование дофахинона за счет восстановления, снижая активность дифенолоксидазы в гемолимфе и жировом теле у пчел. Но при этом увеличивается активность тирозиназы, поскольку для ее активации нужен восстановитель - аскорбиновая кислота, что приводит к увеличению диоксифенилаланина, а это в свою очередь последовательно стимулирует реакцию ацетилирования для удаления излишков дофамина, что более характерно для гемолимфы, а также покровов и жирового тела (см. схему).

В экспериментах была показана возможность иммунизации насекомых, как под воздействием бактериального препарата, так и при действии адаптогенов. В данном случае под иммунизацией мы понимаем стойкое усиление активности, либо реактивности защитных систем, рост резистентности организма насекомого к повторному воздействию повреждающего фактора. Мы полагаем, что иммунизация колорадского жука низкой концентрацией БТБ стимулирует в гемоцитах экспрессию факторов, активирующих фенолоксидазы и ингибирующих активность антиокислительных ферментов, для накопления определенного уровня цитотоксического арсенала к моменту перехода начального этапа повторной инфекции в острое течение болезни. Наконец, в экспериментах с нелетальными дозами патогена, которые оказывают легкое стимулирующее действие на организм насекомого (так называемый эффект гормезиса) было показано, что иммунизация потенциально вносит вклад в рост общей устойчивости популяции наравне с естественным отбором (Гайфуллина и др., 2002).

Длительность сохранения иммунизации зависит от множества факторов. Наиболее долговременно, часто в течение всего онтогенеза, иммунная память сохраняется при воздействии бактериальным препаратом на организм насекомого в критические периоды развития, приходящиеся на моменты частичной или полной перестройки организма в период, предшествующий линьке личинки в куколку или куколки в имаго (Салтыкова и др., 2005). При этом заметно возрастает роль более специфичных биохимических защитных систем. Более того, в экспериментах с комнатной мухой мы наблюдали эффект трансгенерационной передачи ряда признаков - повышение уровня активности антиоксидантной системы и появления индуцированных молекулярных форм фенолоксидазы в последующих поколениях без дополнительной стимуляции.

Таким образом, проблема управления популяциями насекомых требует знания специфики их развития, в том числе и особенностей формирования защитных реакций каждой стадии онтогенеза. Большие усилия по созданию инсектицидов, разработке интегрированных систем управления численностью насекомых-вредителей, поиск новых веществ, регулирующих рост растений, сводятся на нет в результате недостаточного внимания к особенностям формирования устойчивости насекомых, игнорированию их чрезвычайно высокой внутривидовой гетерогенности, в т.ч. внутривидовых и межвидовых различий в стратегии развития защитных реакций.

Выводы:

1. В экспериментальной модели выявлены определенные фазы реализации биохимических защитных реакций: фаза неспецифической реакции (до 1ч.), латентная фаза (1-4 часа), начало запуска специализированных защитных реакций (4-6 часов), их нарастание (6-24 часов), стабильное развитие защитных реакций (24-48 часов) и последующая фаза, определяющая адаптацию.

2. Выявлено наличие двух стратегий реализации у насекомых биохимических защитных систем на начальном этапе действия битоксибациллина. Сублетальные концентрации препарата формируют защитные реакции, направленные на ликвидацию последствий повреждающего фактора, на фоне активации общего метаболизма. Высокие концентрации битоксибациллина вызывают активацию защитных реакций, направленных на локализацию и элиминацию патогена на фоне общего снижения метаболизма.

3. На примере колорадского жука определены онтогенетические различия в реализации защитных реакций у насекомых к битоксибациллину: на стадии личинки преобладает развитие неспецифических механизмов защиты, увеличивается доля эноцитоидных гемоцитов; у имаго увеличивается доля фагоцитирующих гемоцитов, формируются механизмы специализированной защиты.

4. Выявлены подвидовые особенности реакций защитных систем у темной лесной пчелы по сравнению с южными подвидами: повышение фагоцитарной активности клеток гемолимфы, возрастание активности антиоксидантных ферментов, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, ферментов фенолоксидазной системы, поддержание повышенного уровня гликозоаминогликанов. Полученные биохимические критерии предложены в качестве показателей адаптированности пчелиной семьи к климатическим условиям Урала.

5. Обнаружена способность насекомых к формированию долговременных защитных реакций в онтогенезе. Повторное воздействие битоксибациллином на последующей фазе развития насекомого вызывает всплеск активности антиоксидантных и фенолоксидазных ферментов в гемолимфе, повышение титра специфических агглютининов, ускоряется дифференциация фагоцитирующих клеток из прогемоцитов.

6. Показана возможность применения хитозана в качестве индуктора защитных реакций у насекомых, что проявляется в быстрой нейтрализации токсичного эффекта битоксибациллина и повышение выживаемости насекомых.

7. Выявлены критические периоды онтогенеза у насекомых, сопутствующие процессам линьки, которые определяют формирование долговременных биохимических защитных реакций к внешним воздействиям.

8. Выявлено наличие трансгенерационного эффекта в реализации биохимических механизмов на примере комнатной мухи: индуцированная в родительском поколении в критические периоды онтогенеза активность биохимических защитных реакций сохраняется у личинок и имаго в последующих наблюдаемых двух поколениях без дополнительного стимулирования.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ, В ТОМ ЧИСЛЕ В ЖУРНАЛАХ РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК

1. Поскряков А.В., Салтыкова Е.С., Амирханов Д.В. Активность инсектицидов и ферменты детоксикации в онтогенезе колорадского жука // Агрохимия, 1993, № 9, С.63-68

2. Салтыкова Е.С., Поскряков А.В., Николенко А.Г., Хайруллин Р.М. Иммуномодулирующее действие хитоолигосахаридов на медоносную пчелу Apis mellifera // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2000. №5. С.563-568

3. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г. Влияние хитосахаридов на медоносную пчелу Apis mellifera L. // Агрохимия. 2001. №2. С.70-73

4. Беньковская Г.В., Салтыкова Е.С., Поскряков А.В., Николенко А.Г. Влияние хитина и его производных на онтогенез колорадского жука // Агрохимия. 2001. №6. С.73-77

5. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г. Влияние хитосахаридов на биохимические процессы у медоносной пчелы в условиях действия экстремально высокой и низкой температур // Агрохимия. 2002. №3. С. 70-74.

6. Гайфуллина Л.Р., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. Клеточный иммунитет насекомых // Успехи современной биологии. 2003. том 123. №2. С. 195 - 206.

8. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Сухорукова О.В., Николенко А.Г. Экспрессия фенолоксидазной системы при использовании хитосахаридов в качестве иммуномодуляторов // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2003. № 4. С.346-350.

9. Гайфуллина Л.Р., Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Николенко А.Г. Иммунные реакции личинок и имаго колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say) при применении препарата биологической защиты картофеля // Агрохимия. 2004. №9. С. 1-7

10. Sokolyanskaya M.P., Benkovskaya G.V., Saltykova E.S., Udalov M.B. and Nikolenko A. G. Biochemical Changes in the Larvae of the Housefly (Musca domestica L.) During Selection by Different Stressors // Resistant Pest Management Newsletter. 2004. V. 14. №. 1. Р.43.

11. Беньковская Г.В., Николенко А.Г., Салтыкова Е.С., Ишмуратова Н.М, Харисов Р.Я, Ишмуратов Г.Ю. Адаптогенное действие препарата биосил на медоносную пчелу и комнатную муху // Агрохимия. 2005. №3. С. 74-78.

12. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Гайфуллина Л.Р., Новицкая О.П., Поскряков А.В., Николенко А.Г. Реакция отдельных физиологических барьеров при бактериальной инфекции у различных рас медоносной пчелы Apis mellifera // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2005.Т.41. № 3. С.254-258.

13. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Сухорукова О.В., Удалов М.Б., Поскряков А.В., Николенко А.Г. Внутривидовые различия гуморального защитного ответа у медоносной пчелы Apis mellifera // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2005. Т.41. №4. С.314-318.

14. Салтыкова Е.С., Львов А.В., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г. Межрасовые различия экспрессии генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина, дефензина у пчел Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2005.Т.41. №5. С.404-407.

15. Saltykova E.S., Benkowskaya G.V. The Mechanism of bacterial insecticide resistance in colorado potato beetle // Resistant Pest Management Newsletter. 2005. V.15. №1. Р.33-34.

16. Gayfullina L.R., Saltykova E.S., Benkowskaya G.V., Nikolenko A.G. Humoral immune reactions participation in resistance formation of colorado beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) larvae and imago to a biopreparation for potato // Resistant Pest Management Newsletter. 2005. V. 15. № 1. Р.9-12.

17. Беньковская Г.В., Салтыкова Е.С., Сухорукова О.С., Николенко А.Г. Метаболическая регуляция двух типов фенолоксидазной активности в онтогенезе комнатной мухи // Онтогенез. 2006. Т.37. № 2. С.142-148.

18. Gayfullina L.R., Saltykova E.S., Nikolenko A.G. Cellular immune reactions participating in resistance formation of Colorado beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) larvae and imago to a Biopreparation for potato // Resistant Pest Management Newsletter. 2006. V. 15. № 2. P. 22-24.

19. Гайфуллина Л.Р., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. Структура и механизмы индуцированного гуморального иммунитета насекомых // Журнал Успехи современной биологии. 2006. Т.126. №6. С.617-629.

20. Gayfullina L.R., Saltykova E.S., Nikolenko A.G. Induction of the additional phenoloxidase isoforms in insects under N-acetyl-D-glucosamine and bitoxibacillin action // Resistant Pest Management Newsletter. 2007. V. 16. №. 2. Р. 22-24.

21. Салтыкова Е.С, Беньковская Г.В, Николенко А.Г. Внутривидовые различия в механизмах формирования защитных процессов у медоносной пчелы Apis mellifera // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2007. Т.43. №2. С. 53-57.

22. Салтыкова Е.С., Гайфуллина Л.Р., Николенко А.Г. Изменение порога чувствительности Apis mellifera к действию патогена в различные периоды голодания // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2008. т. 44. № 4. с. 409-417.

Размещено на Allbest.ru