Аденилатциклазы растений: характеристика и роль в реализации защитных механизмов при стрессах

Размещено на http://www.allbest.ru/

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Аденилатциклазы растений: характеристика и роль в реализации защитных механизмов при стрессах

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

аденилатциклаза растение стресс

Актуальность темы. Проблема иммунитета растений является в настоящее время одной из важнейших, и достижения в этой области связаны с практическими вопросами, стоящими перед сельским хозяйством. В тесной связи с данной проблемой находится и понятие «стресс», включающее в себя механизмы первичных ответных реакций растительных организмов [Кузнецов и др., 1990; Кузнецов, 2001; Шакирова, 2003]. Известно, что у растений функционирует восемь сигнальных систем, обеспечивающих своевременную реакцию и координацию метаболизма растений на всем протяжении жизненного цикла, а также при изменении условий обитания [Тарчевский, 2001]. Среди них аденилатциклазная сигнальная система является одной из наименее исследованных; в литературе имеются лишь скудные сведения о ее функционировании у растений, как в норме, так и при стрессах.

Эффективность работы любого сигнального пути в значительной степени зависит от фермента-триггера сигнала. Для аденилатциклазной системы таким ферментом является аденилатциклаза, синтезирующая циклический аденозинмонофосфат (цАМФ). Считается, что у растений есть одна изоформа мембранной аденилатциклазы (мАЦ) [Тарчевский, 2001], а наличие «растворимой» формы (рАЦ) этого фермента до сих пор ставится под сомнение [Kamenetsky et al., 2006]. В то же время, у животных идентифицированы 9 изоформ мАЦ, а рАЦ на сегодняшний день обнаружена у многих про- и эукариот. Между тем необходимо отметить, что общие принципы работы рассматриваемой сигнальной системы у разных видов организмов в значительной степени универсальны. Это касается единого принципа организации рецепторов, встроенных в клеточные мембраны, ассоциированных с ними G белков, структуры ключевых ферментов и т. д. Исходя из этого, следует ожидать, что у растений функционирует более сложно организованный, чем представляется сегодня, аденилатциклазный сигнальный путь, включающий многие компоненты, возможно, аналогичные или похожие по структуре и функциям на соответствующие элементы этого сигналинга у животных. В этой связи разработка проблемы трансдукции внутри- и межклеточных сигналов посредством аденилатциклазной системы у растений и влияние на этот процесс специфических и неспецифических стрессоров представляется весьма актуальной.

Цель работы: изучить механизмы активации аденилатциклазной сигнальной системы, а также мембраносвязанной и «растворимой» форм аденилатциклаз у растений под влиянием стрессов различной природы, длительности и интенсивности.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Установить зависимость между вирулентностью и мукоидностью ряда штаммов возбудителя кольцевой гнили картофеля - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieck.et Kotth) Skaptason et Burk (Cms) и интенсивностью сорбции патогена на клетках двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к данному возбудителю.

2. Выявить рецепторы к экзополисахаридам (ЭПС) Cms на плазмалемме клеток растений картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к данному патогену.

3. Определить основные кинетические параметры тотальных мАЦ и рАЦ растений картофеля (оптимум рН, Km, Vmax,) в норме и под действием кратковременного биотического стрессора (ЭПС Cms).

4. Изучить влияние абиотического и биотического стрессоров различной длительности и интенсивности на внутри- и внеклеточную концентрационную динамику цАМФ в клетках разных видов растений (арабидопсис, картофель).

5. Изучить специфичность системного ответа аденилатциклазного пути и мАЦ растений картофеля на биотический и абиотический стрессоры, а также установить сортовые особенности системного ответа этого пути растений картофеля на биотический стрессор.

6. Выявить у растений (картофель, пшеница) изоформу мАЦ, иммунородственную 6-ой изоформе мАЦ животных. Изучить влияние длительных биотического и абиотического стрессоров на активизацию синтеза этой изоформы мАЦ.

7. Изучить спектры изоформ рАЦ у разных видов растений (картофель, пшеница) в норме и под влиянием длительных биотического и абиотического стрессоров.

8. Изучить влияние биотического стрессора на изменение активности мАЦ и рАЦ во фракциях ядер и хлоропластов, выделенных из клеток растений картофеля сортов, контрастных по устойчивости к бактериальному патогену.

9. Исследовать на ультраструктурном уровне локализацию рАЦ во внутриклеточных компартментах растений картофеля. Изучить влияние биотического стрессора на перераспределение цАМФ в компартментах данных клеток.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Вирулентность и мукоидность возбудителя в патосистеме картофель-кольцевая гниль (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) коррелируют с интенсивностью его сорбции на поверхности растений. Количество рецепторов к экзометаболитам этого же возбудителя на плазмалемме клеток картофеля связано с сортовой устойчивостью этой культуры.

2. Компонентами аденилатциклазной системы растений разных видов являются «растворимая» АЦ, а также изоформа мАЦ, иммунородственная 6-ой изоформе мАЦ животных. Длительные специфические стрессы не приводят к интенсификации синтеза этих форм фермента.

3. При воздействии биотического стрессора на растения картофеля одним из основных регуляторных механизмов модулирования активности аденилатциклазной сигнальной системы является изменение кинетических параметров «растворимой» и мембраносвязанной форм фермента. Высокая скорость, кратковременность, а также системность активации аденилатциклазного сигнального пути растений являются необходимым условием успешной реализации защитных механизмов при воздействии специфических и неспецифических стрессоров.

4. Как локальное, так и системное изменение уровня цАМФ у растений может выступать маркерным признаком специфической устойчивости.

Научная новизна.Впервые у растений выявлена «растворимая» аденилатциклаза во многих компартментах клеток, определена ее молекулярная масса и показано, что под воздействием длительных стрессоров различной природы количество изоформ рАЦ не увеличивается. Также впервые у растений выявлена изоформа мембраносвязанной аденилатциклазы, иммунородственная 6-ой изоформе аденилатциклазы животных и показано отсутствие интенсификации синтеза этой изоформы под воздействием длительных стрессоров различной природы. Показано, что ЭПС Cms осуществляют аллостерическую и изостерическую регуляцию активности мАЦ в клетках растений обоих сортов: у устойчивого - положительную, у восприимчивого - отрицательную. Впервые определены кинетические параметры «растворимой» АЦ растений и показано, что ЭПС Cms активируют эту форму фермента у растений резистентного сорта и ингибируют у восприимчивого сорта. Впервые показано, что модулирование активности аденилатциклазной сигнальной системы под воздействием биотического стрессора (ЭПС Cms) у растений сортов, контрастных по устойчивости к данному фактору, связано с изменением кинетических параметров мембраносвязанной и растворимой форм аденилатциклаз. Установлено, что при воздействии специфического стрессора имеется зависимость активации аденилатциклазного сигнального пути от устойчивости сорта к данному фактору внешней среды, тогда как при неспецифическом стрессовом воздействии реакция данной системы одинакова у двух сортов. Показано, что под воздействием биотического стрессора скорость передачи внутриклеточного сигнала от изучаемой сигнальной системы значительно выше у растений устойчивого сорта, чем у восприимчивого. Результаты исследований обобщены в схему передачи внутри- и межклеточных сигналов с помощью аденилатциклазной сигнальной системы растений при воздействии специфических и неспецифических стрессоров.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты вносят существенный вклад в познание механизмов внутриклеточной сигнализации у растений при воздействии стрессоров различной природы и специфичности и выявляют ряд неизвестных до настоящего времени элементов молекулярных механизмов конститутивного иммунитета растений. Это также значительно дополняет теорию иммунитета растений. Совокупность проведенных исследований позволяет предложить в качестве маркерного признака степени специфической устойчивости локальное и системное изменение уровня цАМФ в растениях, что в дальнейшем даст возможность работать над созданием сортов с высокой устойчивостью к различным неблагоприятным факторам внешней среды.

Апробация работы: Основные результаты работы докладывались на Симпозиуме «Signal system of рlant cell» (Москва, 2001), на международных конференциях «Физиология растений - основа биотехнологии» (Пенза, 2003), «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), Всероссийских научных конференциях «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007), «Роль сельскохозяйственной науки в развитии АПК Приангарья» (Иркутск, 2007).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 19 работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения и выводов, и списка литературы (519 источников, в том числе 107 российских и 412 иностранных). Работа изложена на 318 страницах, содержит 64 рисунка и 12 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пробирочные растения картофеля (Solanum tuberosum L.) cортов: Лукьяновский - восприимчивый по отношению к возбудителю кольцевой гнили картофеля, и Луговской - устойчивый, в возрасте 3-4 недели размножали черенкованием и культивировали на агаризованной среде Мурасиге-Скуга в факторостатных условиях [Бутенко и др., 1984]. Растения этих сортов получены из коллекции НИИ картофельного хозяйства (НИИКХ), п. Коренево, Московская область.

Рыхлый тканевый каллус выращивали на листовых и стеблевых эксплантах на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга в течение 7-10 дней при влажности воздуха 70 % и температуре 25° С, в темноте.

Суспензионную культуру клеток картофеля получали из каллуса безвирусных растений картофеля in vitro, используя питательную среду Мурасиге и Скуга [Murashige, Skoog, 1962], без добавления агара, при постоянном покачивании на ротационном шейкере.

Проростки пшеницы. В работе использовали два сорта пшеницы: Иркутскую озимую и яровую Тулунский 12 , выращенные при 22° С в течение 3-х дней.

Культивирование бактерий. Культура Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieck.et Kotth) Skaptason et Burk, мукоидного, вирулентного штамма 5369 была получена из НИИКХ (пос. Коренево, Московской обл.). Штаммы CsR14 (вирулентный мукоидный), Cic31 (вирулентный немукоидный), Cs3NM (средневирулентный немукоидный), CsR5 (авирулентный мукоидный) и Cs4 (авирулентный немукоидный) были любезно предоставлены д-ром Metzler (Университет г. Турку, Финляндия). Бактериальную культуру выращивали в колбах на среде, содержащей 10 г/л диализата дрожжевого экстракта («Sigma», CША), 15 г/л глюкозы («Реахим», Россия), 5 г/л CaCO₃ («Реахим», Россия), 20 г/л агара («НИЦФ», Россия), рН 7,0 при температуре 25° С, в темноте.

Выделение и очистка ЭПС. Выделение и очистку ЭПС Сms из культурального фильтрата проводили методом колоночной ионообменной хроматографии [Strobel, 1967].

Коньюгирование ЭПС с флюорохромным красителем. 30 мг ЭПС и 1,3 мг РИТЦ (родаминизотиоцианат) ("Serva", Германия) отдельно растворяли в 2 мл 100 мМ фосфатного буфера, рН 8.8, смешивали и оставляли для коньюгации при 4^оС на 15 ч. Коньюгат очищали от несвязанного красителя колоночной гель-хроматографией с использованием сефадекса G-25 ("Sigma", США) и элюировали бидистиллированной водой. Фракцию, содержащую конъюгат, упаривали до сухого состояния на роторном испарителе и хранили при 4^оС.

Определение сорбционной способности Cms. 1 мл бактерий с одинаковыми для всех штаммов титрами (2 х 10⁸ клеток/мл) добавляли к 1 мл 3-х и 7-суточных суспензионных клеток картофеля (титры 10³ и 5 х 10² клеток/мл, соответственно) двух сортов: Луговской - устойчивый, Лукьяновский - восприимчивый. Коинкубацию проводили в течение 2 и 9 час, после чего суспензию для удаления несвязавшихся бактерий центрифугировали при 1.500 g и дважды промывали средой культивирования, после чего подсчитывали в камере Горяева на микроскопе Laboval 4 (“Carl Zeiss”, Германия) количество бактерий, прикрепившихся к суспензионным клеткам. По каждому варианту было проанализировано 80-100 растительных клеток.

Выделение протопластов. Для выделения протопластов использовали листья пробирочных растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили. Отделенные от растений листья измельчали на фрагменты размерами 4-6 мм² в среде Мурасиге - Скуга на 0,06 М К-Na фосфатном буфере, рН 5,8 и инфильтрировали методом создания обратного давления в шприце ферментативным раствором следующего состава в конечных концентрациях: 1 % мацерозим (“Меrck”, Германия); 1 % целлюлаза (“Sigma”, США); 0,5 % гемицеллюлаза (“Sigma”, США); 0,3 М сорбит; 3мМ CaCl2; 1 % БСА (“Реахим”, Россия); 0,06 М K-Na фосфатный буфер, рН 5,8: среда Мурасиге - Скуга (1:1). Общий объем среды составлял 3 мл. Для защиты белковой части рецепторов в среду выделения добавляли 1% БСА в качестве конкурентного субстрата для возможных примесей протеаз в используемых препаратах пектолитических ферментов [Diekmann et al., 1994]. Растворы с фрагментами листьев помещали во флаконы и ставили на качалку при температуре 28°С на 3 часа. Полученную суспензию фильтровали через капрон и дважды промывали средой выделения без ферментов.

Инкубация протопластов с ЭПС. Протопласты инкубировали с избытком ЭПС Cms, коньюгированного с родаминизотиоцианатом (РИТЦ) в течение 1 часа в темноте. Затем дважды отмывали от несвязавшегося комплекса ЭПС-РИТЦ средой выделения без ферментов. Не менее 50 протопластов каждого сорта просматривали в люминесцентном микроскопе МЛ-2АУ4.2 («Ломо», Россия). Использовали пропускающий светофильтр СС-15, запирающий светофильтр ЖС-18. Контролем служили неокрашенные протопласты.

Суспензионная культура клеток картофеля. Суспензионную культуру фиксировали в жидком азоте, фильтровали, и гомогенизировали в буфере выделения следующего состава: 50 мМ трис-HCl, рН 7.4, 0.1 мМ теофиллина, 1мМ дитиотреитола, 0.5 мг/мл растворимого поливинилпирролидона (“Fluka” Швеция), связывающего фенолы. Для дополнительного связывания фенолов (при определении содержания цАМФ) [Каримова и др., 1990] при гомогенизации использовали ионообменную смолу Dowex-50 (“Sigma”, США) в весовом соотношении 1:5 (смола:растительный материал). Далее смесь фильтровали через два слоя мелкоячеистого капрона и центрифугировали 40 мин при 20000 g. Для повышения специфичности иммунной реакции в иммуноферментном анализе (ИФА), образец очищали от присутствия других циклических нуклеотидов с помощью нейтральной окиси алюминия.

Растения картофеля in vitro фиксировали в жидком азоте, затем делили на участки длиной около 4 см. Далее подвергали процедурам, описанным для суспензионной культуры клеток.

Очистка осадка и супернатанта от примесей других циклических нуклеотидов. На колонку с нейтральной окисью алюминия с толщиной слоя 1 см³, уравновешенную буфером выделения, наносили 1 мл супернатанта или осадка, ресуспендированного в буфере выделения. Элюцию проводили тем же буфером и анализ спектра веществ осуществляли с помощью хроматографического оборудования (“Uvicord”, Швеция), при длине волны 276 нм. Стандартами служили аденозин, 5ґ-АМФ, цАМФ, цГМФ, цТМФ, цЦМФ (“Sigma”, США) в концентрации 100 пМ. В этом случае цАМФ элюировался раньше других соединений и обнаруживался уже во втором мл, что согласуется с литературными данными [White, Zenser, 1971]. Общий объем элюата составлял около 8 мл. Далее элюат упаривали на роторном испарителе под вакуумом досуха, сухой остаток растворяли в 100% диметилсульфоксиде («Реахим», Россия) для удаления солей, затем центрифугировали при 20000 g. Диметилсульфоксид из осадка удаляли ацетоном («Экос-1», Россия). Пробу высушивали на воздухе при комнатной температуре. Количество цАМФ определяли ИФА.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Анализ начинали с иммобилизации антигена на поверхности планшета. С этой целью в лунки полистироловых планшетов для ИФА («Ленинградский ЗМП», Россия) вносили по 0.1 мл смеси следующего состава: 1 мл исследуемого образца + 0.08 мл 25%-ного глутарового альдегида («Sigma», США) + 1 мг/мл БСА («Sigma», США). Планшеты инкубировали 15 часов при 37⁰С и лунки трижды промывали буфером ФТБС (0.02 М Na-фосфатный буфер, 0.1 М NaCl («Реахим», Россия), 0.3 % Твин-20 («Ferak», Германия), рН 7,0). Затем для предотвращения неспецифического связывания антител с твердым носителем в каждую лунку добавляли по 0.1 мл лошадиной сыворотки («Аллерген», Россия), разведенной 1:10 ФБС (ФТБС без твина) и планшеты выдерживали 1 ч при 37° С. После этого в лунки вносили по 0.1 мл первичных кроличьих антител против цАМФ (“Sigma”, США) в концентрации 60 мкг/мл, разведенных в ПБС. Материал инкубировали 2 ч при 37⁰С и промывали трижды ФТБС. Затем повторяли обработку образцов лошадиной сывороткой. Далее в лунки вносили по 0.1 мл меченных пероксидазой вторичных козьих антител (“Sigma”, США), разведенных 1:800 в 0.1 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 8.3 и через 1 ч инкубации при комнатной температуре отмывали трижды ФТБС. После этого осуществляли трехразовое промывание лунок планшетов 0.1 М фосфатно-цитратным буфером, рН 5.6, для удаления детергента, создающего высокий фон неспецифического окрашивания при развитии цветной реакции на пероксидазу. Затем в каждую лунку добавляли 0.1 мл 0,16% ортофенилендиамина («Sigma», США), растворенного в том же самом фосфатно-цитратном буфере и 3 мкл 3% перекиси водорода. Окраска развивалась в течение 20 мин. Реакцию останавливали добавлением 0.1 мл/лунку 4 N серной кислоты («Реахим» Россия). Измерения интенсивности поглощения света растворами проводили на спектрофотометре C-101-46 (“BioRad”, Германия) при длине волны 490 нм. Контролем служил буфер выделения без растительных образцов. Калибровочную кривую строили по цАМФ (“Sigma”, США). Нижний предел определения данного метода - 10 пМоль цАМФ в пробе. Эксперименты проводили в восьми аналитических и трех биологических повторностях.

Метод дифференциального центрифугирования в градиенте плотности для выделения фракции ядер и хлоропластов из листьев растений картофеля. Растения гомогенизировали в ступке при температуре 4°С в буфере выделения, описанном выше. Гомогенат (1,5 мл) наносили на градиент сорбита («Реахим», Россия) (0,75М, 1,5М, 2,5М и 4М по 2 мл.) и центрифугировали 30 мин при 600g на холоду. Хлоропласты собирали в 1 и 2 слоях, ядра на границе между 3 и 4 слоями. Оценку чистоты фракции выделенных органелл осуществляли под контролем люминесцентного микроскопа МЛ-2АУ4.2 («Ломо», Россия). С этой целью ядра окрашивали DAPI (“Sigma”, США), хлоропласты обладали собственной ярко-красной флюоресценцией.

Методика подготовки образцов для определения активности рАЦ и мАЦ. Фракции, обогащенные ядрами и хлоропластами, инкубировали 30 мин с 0,01% октил-В-D-глюкопиранозидом («Amresco», США) при температуре 4°С для освобождения растворимой АЦ. Затем образцы центрифугировали при 105000g 3 часа. Полученный осадок использовали для определения активности мембранносвязанной АЦ, а супернатант - для определения активности растворимой АЦ. Реакцию начинали внесением растительного белка в количестве 100-150 мкг/г сырой массы в 500 мкл инкубационной среды: 50 мМ трис-HCl, рН 7.2, 0,1 мМ теофиллин, 1мМ дитиотреитол, 0,5 мМ АТФ (“Sigma”, США), 3 мМ MgSO₄ («Реахим» Россия). В некоторые пробы из осадка и из супернатанта добавляли специфические эффекторы мембранносвязанной и «растворимой» форм АЦ: 3 мМ MnCl₂ («Реахим» Россия) или 20 мМ NaHCO₃ («Реахим», Россия) - для активации рАЦ, 10 мМ NaF («Реахим» Россия) - для стимуляции мАЦ, а также 10 мкМ сурамина («Sigma», USA) - специфического ингибитора мАЦ, разобщающего G-белок с рецептором. Реакцию проводили при 27°С в течение 30 мин и останавливали кипячением в течение 3 мин на водяной бане. Далее, для повышения специфичности иммунной реакции, образец дополнительно очищали от присутствия других циклических нуклеотидов с помощью нейтральной окиси алюминия («Merk», Германия). Белок в растительной пробе определяли по методу Брэдфорд.

Методика определения оптимума рН, и кинетических характеристик мАЦ и рАЦ из корней растений картофеля. Корни пробирочных растений картофеля отделяли от стебля и гомогенизировали в среде выделения и в режимах центрифугирования как указано выше. Получали две фракции: супернатант, содержащий рАЦ и осадок, содержащий мАЦ. Для определения оптимума рН проводили анализ активности мАЦ, описанный выше с некоторыми изменениями. Выделенный растительный белок (см. Подготовка образца для определения концентрации цАМФ) в количестве 100-150 мкг/г сырой массы, помещали в буферные растворы (500 мкл) с различными значениями рН (6.0; 6.7; 7.4 и 8.0), содержащие компонент, предохраняющий SH-группы белков, а также ингибиторы протеиназ и фосфодиэстеразы цАМФ и инкубировали 30 мин с 0.5 мМ АТФ при температуре 27° С. Реакцию останавливали кипячением и далее определяли концентрацию цАМФ. Для определения кинетических параметров мАЦ и рАЦ, белок из осадка и супернатанта, инкубировали с различными концентрациям АТФ (0,07 мМ; 0,2 мМ; 0,4 мМ; 0,5 мМ) и 3 мМ MgSO₄ в каждом варианте. В отдельные варианты для мАЦ добавляли 10 мМ NaF, для рАЦ - 3 мМ MnCl₂, или 20 мМ NaHCO₃. Реакцию проводили в течение 30 мин при 27° С и останавливали кипячением. В пробах проводили определение концентрации цАМФ. В некоторые образцы вносили 10 мкМ сурамина для ингибирования мАЦ или 40 мкМ КН-7, являющегося специфическим ингибитором рАЦ животных [Zippin, 2003].

Выявление мембранных липидов во фракциях клеток после ультрацентрифугирования. Для подтверждения отсутствия мембранных липидов в супернатанте после ультрацентрифугирования гомогената растительных клеток (105 000g, 3 ч), проводили тонкослойную хроматографию образцов, полученных из супернатанта и из осадка (Пустовалова, 1999). Приготовление образцов для электронной микроскопии и иммунноэлектронная цитохимия для выявления цАМФ и рАЦ. Исследования проводили на корнях (цАМФ, рАЦ) и листьях (рАЦ) in vitro растений картофеля. Опытом служили растения, к среде роста которых добавляли 0,1% ЭПС Cms (15 мин), контролем - растения в обычной среде роста. Приготовление образцов проводили по методу Миронова и др. (1994) с использованием первичных антител к цАМФ («Sigma», США), рАЦ (антитела любезно предоставлены сотрудниками лаборатории Баха и Левина, Корнельский университет, Нью-Йорк, США) и вторичных антител, меченных золотом («Sigms», США).

Количественная оценка меток к цАМФ. Изображение участков клеток , полученных с ультратонких срезов всех анализируемых вариантов, предварительно приводили к единому масштабу с помощью программы Adobe Photoshop 7.0.1. и измеряли общую площадь, площадь каждого компартмента и длину мембран (плазмалемма, тонопласт), после чего подсчитывали в них электронноплотные частицы золота, отражающих локализацию цАМФ, используя программу SigmaScan Pro 5. Полученные величины пересчитывали на 10 мкм² суммарной площади компартмента каждого типа, а для мембран - на 10 мкм их длины. По каждому варианту использовали 15-18 изображений.

Иммунопреципитация с применнием сефарозы-А и первичных антител.

Иммунопреципитацию проводили по стандартному протоколу, предлагаемому фирмой «ABCAM» (Великобритания). Против рАЦ использовали моноклональные антитела животных, которые были получены к N концу каталитического домена растворимой аденилатциклазы животных, и обладали только одним эпитопом, содержащим 14 аминокислот (EIESVPDQRAVKVN), благодаря чему достигалась их высокая специфичность [Zippin et al., 2003], титр1:10; титр поликлональных антител против мАЦ-6 животных составлял 1:50 (“ABCAM”, Великобритания). Первичные поликлональные антитела были получены к 121 аминокислоте N-конца молекулы мАЦ, отличающегося наибольшим консерватизмом (“Abcam”, Великобритания).

Электрофорез. Электрофорез белков проводили в блоках 10 % полиакриламидного геля в модифицированной системе Лэммли [Laemmli, 1970], используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN III («Bio-Rad», США), согласно инструкции производителя.

Иммуноблотинг. Иммуноблотинг проводили по Timmons, Dunhar (1990) на приборе фирмы «Bio-Rad» (США). Титр первичных моноклональных антител к рАЦ составлял 1:1000, поликлональных к мАЦ-6 - 1:500. Использовали вторичные антитела (титр 1:1000), коньюгированные с пероксидазой («Sigma», США).

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили в трех биологических повторностях. Аналитические повторности в зависимости от используемого метода составляли от трех до восьми. Полученные результаты обработаны статистически, с вычислением ошибки среднего, в некоторых случаях коэффициента корреляции и значений достоверности различий между вариантами опыта и сортами (Р).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сорбция штаммов Сms, отличающихся по мукоидности и вирулентности, на поверхности суспензионных клеток двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к данному патогену. Существенная роль в процессе колонизации тканей патогеном и экспрессии или супрессии защитных реакций растений принадлежит, в частности, экзополисахаридам (ЭПС), формирующим мукоидное окаймление бактерий [Denny, 1995; Romantschuk, 1992]. Однако имеющиеся литературные данные о роли мукоидности в проявлении патогенности (вирулентности) при бактериозах весьма малочисленны и противоречивы [Geier, Geider, 1992; Bermpohl et al., 1996]. Использование в качестве модели in vitro-растений картофеля и шести различающихся по вирулентности штаммов Cms показало, что на восприимчивом сорте (Лукьяновский) эти штаммы проявили вирулентные свойства, соответствующие характеристикам, описанным в литературе, а по отношению к устойчивому сорту (Луговской) все штаммы оказались авирулентными [Романенко и др., 1998; 2002]. Результаты проведенных экспериментов позволили установить, что наиболее ярко сорбция Cms проявлялась на 7-суточной культуре ткани. На клетках устойчивого сорта исследуемые шесть штаммов Cms сорбировались в незначительной степени, тогда как на суспензионных клетках восприимчивого сорта довольно эффективно сорбировались пять из шести штаммов Cms (Рис. 1). Между сорбцией и вирулентностью Cms, а также между сорбцией и мукоидностью тех же штаммов наблюдалась корреляция с заметной и высокой теснотой связи соответственно.

Рис.1. Интенсивность сорбции шести штаммов Cms на суспензионных клетках картофеля

По имеющимся литературным данным [Романенко и др., 1999] в клеточных оболочках растений картофеля локализованы рецепторы к ЭПС Cms. В оболочках клеток растений восприимчивого сорта их присутствует на порядок больше, чем у клеток резистентного сорта [Романенко и др., 1999]. Кроме того, рецепторы только восприимчивого сорта содержат положительно заряженные аминокислоты [Романенко и др., 1999], а в составе штаммов Cms обнаружены фосфатные и сульфатные группы, имеющие отрицательный заряд. Следует заметить, что по их содержанию все шесть штаммов значительно различались [Ломоватская, 2001]. Поэтому в паре восприимчивый сорт - Cms наблюдаемая интенсивная сорбция реализовалась через большое количество рецепторов к ЭПС Cms и усиливалась за счет ионных взаимодействий между аминокислотами рецепторов и фосфатными группами в составе ЭПС Cms, тем более, что между сорбцией и этими группами установлена корреляция с заметной теснотой связи. Поскольку у суспензионной культуры клеток устойчивого сорта специфических детерминант значительно меньше, а в их составе отсутствовали положительно заряженные аминокислоты, процесс сорбции был выражен весьма незначительно.

Выявление рецепторов к экзополисахаридам Сms на плазмалемме клеток растений картофеля. Первичный контакт возбудителя с клеточными стенками растений картофеля также позволяет экзополисахаридам бактерий диффундировать через оболочку в район плазмалеммы растительной клетки. Это представляется вполне возможным, так как ЭПС Cms весьма гетерогенны по молекулярным массам (от 1 кДа до более, чем 700 кДа) [Рымарева, 2001; Шафикова, 2003]. Исходя из этого, логично было предположить, что на плазматической мембране клеток растений картофеля должны присутствовать рецепторы к ЭПС Cms. Данные детерминанты выявляли методом люминесцентной микроскопии на протопластах, полученных из клеток мезофилла листа растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к Cms. Коинкубация протопластов с комплексом ЭПС-РИТЦ (родаминизотиоцианат) и последующим неоднократным отмыванием средой инкубации приводило к голубоватому свечению протопластов в люминесцентном микроскопе. Его интенсивность имела существенные сортовые отличия: протопласты листьев устойчивого сорта практически не флуоресцировали, тогда как протопласты, выделенные из листьев восприимчивого сорта, светились довольно интенсивно (Рис. 2).

Таким образом, на плазмалемме клеток растений картофеля имеются рецепторы к ЭПС Cms, имеющие количественные отличия у двух сортов, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Cорбция ЭПС Cms на плазмалемме клеток картофеля

А - сорт Луговской (резистентный), контроль, световая микроскопия, Д - флуоресцентная микроскопия; Б - сорт. Лукьяновский (восприимчивый), контроль, световая микроскопия, Е - флуоресцентная микроскопия; В - сорт резистентный ЭПС+РИТЦ, световая микроскопия, Ж - флуоресцентная микроскопия, Г- сорт восприимчивый, ЭПС+РИТЦ, световая микроскопия, З - флуоресцентная микроскопия.

Поскольку ЭПС могут выступать как в роли элиситоров, так и супрессоров [Романенко и др., 1999; Шафикова, 2003], можно предположить, что у растений устойчивого сорта данные детерминанты имеют большее сродство к элиситорным компонентам ЭПС, тогда как у восприимчивого сорта - к супрессорным, что должно сказываться на работе сигнальных внутриклеточных путей, а затем и на качестве защитных реакций растений. Кроме того, большее количество рецепторов у восприимчивого сорта также может быть причиной супрессии защитных сигналов, так как известно, что в зависимости от концентрации, экзометаболиты патогена могут быть специфическими элиситорами или супрессорами [Дьяков, 2005].

Определение кинетических параметров тотальных мАЦ и рАЦ из корней растений картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms и опосредованное влияние ЭПС Cms на эти параметры. Для объективной оценки изучаемых форм фермента необходимо знание оптимальных условий их функционирования и кинетических характеристик, а также характер изменений этих параметров под воздействием неблагоприятных факторов внешней среды, в частности ЭПС Cms. Объектом экспериментов служили корни пробирочных растений картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms. В опытном варианте корни растений инкубировали в течение 1 мин с 0,1% ЭПС Cms. Осадок после гомогенизации и ультрацентрифугирования, обогащенный микросомальной фракцией, служил источником мембраносвязанной аденилатциклазы; в супернатанте определяли активность растворимой аденилатциклазы. Супернатант содержал только рАЦ, поскольку в нём отсутствовали мембранные липиды, тогда как в осадке были выявлены все основные липидсодержащие составляющие растительных мембран. Кроме того, применялся ингибиторный анализ, для чего в образцы микросомальной фракции добавляли сурамин, разобщающий связь G-белка с рецептором. При этом происходило значительное ингибирование активности мАЦ во всех вариантах у обоих сортов. Для подавления активности рАЦ применялся ингибитор 2-(1Н-бензоимидазол-2-сулфанил)-пропионовая кислота-(5- бромо-2-гидроксибензилиден)-гидразид (КН-7), специфически блокирующий активность этого фермента в клетках животных [Stessin et al., 2006]. Однако на растениях картофеля ингибирования рАЦ не наблюдалось. Проведенные эксперименты позволили выявить оптимум рН активности мАЦ, который составил 7,4.

Кинетические параметры мАЦ

Мембраносвязанная АЦ из клеток корней растений устойчивого к Cms сорта имела максимальную скорость реакции и сродство к субстрату почти в 2,5 и 2 раза выше соответственно, чем у мАЦ из растений восприимчивого сорта. В контроле у мАЦ из растений восприимчивого сорта наблюдалось субстратное ингибирование, которого почти не было у мАЦ из устойчивого сорта. Фторид натрия повышал уровень V_max мАЦ клеток растений обоих сортов практически в одинаковой степени, и понижал степень сродства к субстрату, причем в большей степени у устойчивого сорта (Табл. 1; Рис. 3,4). ЭПС Cms оказывали разнонаправленный эффект на активность изучаемого фермента у растений обоих сортов. У устойчивого сорта V_max мАЦ возрастало почти в 3 раза, при этом K_m была почти такой же, как в контроле. У восприимчивого сорта V_max снижалась практически в 7 раз, но K_m и сродство к субстрату не менялись, что свидетельствует о неконкурентном ингибировании активности фермента по изостерическому типу.

Таблица. 1. Кинетические параметры мАЦ из растений картофеля и влияние на них NaF и ЭПС Cms

Фторид натрия на фоне ЭПС значительно повышал максимальную скорость реакции у мАЦ из клеток растений обоих сортов, не меняя при этом K_m (Табл. 1; Рис. 3,4). Здесь необходимо отметить, что ЭПС Cms оказывали не прямое воздействие на данный фермент, а влияли опосредованно через механизм лиганд-рецепторного взаимодействия в системе in vivo, из чего следует, что в регуляции активности мАЦ принимает участие комплекс лиганд-рецептор-G белок-мАЦ. Это заставляет рассматривать процесс также и в рамках аллостерических взаимодействий, где регуляция активности фермента должна осуществляться через конформационное изменение последнего в результате контакта фермента с G белком.

Рис. 3. Влияние ЭПС Cms на кинетические параметры мАЦ, сорт Луговской (устойчивый)

Рис.4. Влияние ЭПС Cms на кинетические параметры мАЦ, сорт Лукьяновский (восприимчивый)

Данные по влиянию сурамина на активность мАЦ растений картофеля и активацию мАЦ фторидом натрия, реализуемую через ГТФ-связывающий центр G белков, позволяют заключить, что мАЦ в растениях картофеля также регулируется G белками, хотя остается совершенно не ясным, какого типа G белки функционируют в данном случае у растений каждого из сортов. На основе полученных результатов можно сказать, что под влиянием биотического стрессора активность мАЦ растений картофеля модулируется по изостерическому и аллостерическому типам. У устойчивого сорта наблюдается положительная аллостерическая регуляция, у восприимчивого - отрицательная.

Кинетические параметры рАЦ. Прежде всего, обращает на себя внимание тот факт, что максимальная скорость реакции и K_m у рАЦ из корней растений обоих сортов в контроле были практически одинаковы (Рис.5,6). NaHCO₃ в концентрации 20 мкМ повышал V_max рАЦ также в равной степени у обоих сортов, незначительно меняя K_m и сродство к субстрату (Табл. 2). ЭПС Сms более чем в 2 раза повышали максимальную скорость реакции у рАЦ из растений устойчивого сорта и в 2 раза снижали K_m, что приводило к возрастанию сродства к субстрату. В то же время у восприимчивого сорта V_max снижалась почти в 4 раза, а K_m оставалась почти на том же уровне (Рис.5,6). При этом у обоих сортов наблюдалось субстратное ингибирование. Предположительно, механизмы этого явления у растений двух сортов различны, так как изменение сродства к субстрату рАЦ наблюдалось только у устойчивого сорта (Рис.5,6). Воздействие бикарбоната на фоне ЭПС оказывало практически одинаковый эффект на рАЦ из обоих сортов, а именно повышало V_max и снижало сродство к субстрату, хотя субстратное ингибирование при этом усиливалось.

Рис. 5. Влияние ЭПС Cms на кинетические параметры рАЦ, сорт Луговской (устойчивый)

Рис. 6. Влияние ЭПС Cms на кинетические параметры рАЦ, сорт Лукьяновский (восприимчивый)

По литературным данным [Litvin et al., 2003], действие бикарбоната в клетках животных основано на конформационных изменениях молекулы рАЦ, что приводит к закрытию активного сайта и облегчению связывания второго иона металла, вследствие чего повышается V_max и в последующем снижается субстратное ингибирование. При этом авторы использовали концентрации субстрата, превышающие таковые в наших экспериментах в 10 и более раз, а бикарбоната - на три порядка. Можно предположить, что при гораздо меньших концентрациях субстрата (0,07 - 0,5 мМ) и бикарбоната (20 мкМ) механизм действия НСО₃^- будет иным.

Таблица. 2. Кинетические параметры рАЦ из растений картофеля и влияние на них NaHCO₃ и ЭПС Cms

При этом следует заметить, что в предварительных экспериментах нами было установлено, что более высокая концентрация бикарбоната (40 мкМ) оказывала ингибирующий эффект на активность рАЦ. Эти результаты позволяют предположить, что рАЦ растений имеет свои структурные особенности, хотя это требует дальнейшей проверки, в частности, использования очищенного препарата фермента. Пока остается неясным механизм воздействия ЭПС Cms на рАЦ растений картофеля. Так как воздействие данного неблагоприятного фактора продолжалось всего 1 мин, необходимо, чтобы агент, модулирующий активность рАЦ, за столь короткое время распространился по цитоплазме и достиг внутриклеточных компартментов - мест локализации рАЦ. Исходя из таких установок, можно предположить, что на такую роль могут претендовать ионы кальция, поскольку, во-первых, скорость их распространения в клетке очень высока - несколько секунд [Медведев, 1998] и, во-вторых, под воздействием внешних факторов, например, элиситоров, изменение концентрации этого вторичного мессенджера в клетке носит дискретный характер за счет различного его содержания во внутриклеточных компартментах [Zimmermann et al., 1997; Lecourieux et al., 2002; Sanders et al., 2002]. Кроме того, эндогенный цАМФ является регулятором активности кальциевых каналов [Volotovski et al., 1998; Rudd, Franklin-Tong, 1999]. Также есть данные, полученные на животных, где показано, что кальций дозозависимо повышал активность рАЦ, снижая K_m и повышая сродство фермента к субстрату [Steegborn et al., 2005]. Окончательный ответ на то, как влияют различные концентрации кальция на активность рАЦ из клеток растений картофеля, можно будет получить только в результате специальных экспериментов. Пока же наблюдаемые различия в кинетических параметрах рАЦ растений обоих сортов картофеля позволяют сделать вывод о том, что в каталитических доменах исследуемого фермента у двух сортов картофеля, несмотря на одинаковую молекулярную массу самого фермента, имеются отличия, следствием чего может стать различная регуляция активности рАЦ ионами кальция.

Влияние биотического и абиотического стрессов на внутри- и внеклеточную концентрационную динамику цАМФ в клетках разных видов растений.

К настоящему времени хорошо изучен конечный этап реализации защитно-приспособительных механизмов, например, индукция под воздействием теплового шока специфических белков [Кузнецов и др., 1987; Кузнецов, 2001; Федосеева и др., 2008]. Хотя природа сигнала, инициирующего активацию соответствующих транскрипционных факторов, остается слабоизученной, есть данные, что в этом процессе существенная роль принадлежит цАМФ. У растений его концентрация значительно меняется под воздействием различных видов стрессоров [Яворская, 1990; Cooke et al., 1994]. Исходя из этого можно предположить, что интенсивность и специфичность действующего стрессового фактора также должна оказывать дифференцированный эффект на активность аденилатциклазной сигнальной системы, а долговременная реализация ответных реакций растительных клеток может быть связана с активизацией этой системы уже в первые минуты воздействия стрессоров. Поэтому необходимо было во-первых, определить концентрационную динамику цАМФ в клетках, а также в культуральной среде на начальных этапах действия теплового шока различной интенсивности (37° С и 50°С, суспензионная культура арабидопсиса). Во-вторых, изучить концентрационную динамику цАМФ в клетках при воздействии биотического стрессового фактора (ЭПС Cms, суспензионная культура сортов картофеля, контрастных по устойчивости к Cms).

Под воздействием мягкого теплового шока (37° С) концентрация цАМФ в суспензионных клетках резко возрастала после 1 мин инкубации и значительно понижалась через 15 мин воздействия. Аналогичное явление наблюдалось и в среде роста клеток (Рис. 7). При 50° С через 1 мин выявлялся также пик внутриклеточной концентрации цАМФ, причем он превышал аналогичный показатель при 37° С почти в два раза, а через 15 мин наблюдалось его повторное значительное повышение. Еще одной интересной особенностью можно считать изменение соотношения внутри- и внеклеточного цАМФ при 50° С, а именно превышение в 1,5 и в 2 раза уровня внеклеточного цАМФ над внутриклеточным через 3 и 5 мин, соответственно (Рис. 7). Таким образом, и мягкий и жесткий тепловые стрессоры вызывают пик концентрации цАМФ уже через 1 мин воздействия. По литературным данным, при 37°С это приводит к активации систем защиты от теплового шока, в частности к индукции синтеза БТШ [Федосеева и др., 2008]. Плавное снижение концентрации цАМФ в последующие 15 мин скорее всего свидетельствует о завершении этапа тревоги и переходу растительного организма к адаптации [Шакирова, 2001].

Рис. 7. Влияние мягкого (37°С) и жесткого (50°С) теплового шока на изменение концентрации цАМФ в суспензионной культуре арабидопсиса

Результаты позволяют предположить, что под воздействием жесткого стресса (50°С) в суспензионных клетках арабидопсиса активация аденилатциклазной сигнальной системы индуцирует, как минимум, три программы (или стадии) изменения клеточного метаболизма. Резкое повышение уровня цАМФ через 1 мин, а затем не менее резкое его падение, говорят о возникновении реакции тревоги. Очевидно, на этом этапе могут экспрессироваться гены, ответственные за синтез специфических БТШ. Однако через 5 мин воздействия уровень цАМФ в клетке, с одной стороны, резко, в 25 раз, снижался по сравнению с 1 мин, а с другой стороны, внеклеточная концентрация превышала внутриклеточную. Вследствие этого, вероятно, происходит качественное переключение метаболических путей, что по литературным данным приводит к развитию программируемой клеточной смерти (апоптоз) в суспензионных клетках арабидопсиса [Федосеева и др., 2008]. Подтверждением этому служит также факт развития апоптоза у дрожжей при резком снижении уровня цАМФ в клетке [Breitenbach et al., 2005]. Повторное повышение внутриклеточной концентрации цАМФ через 15 мин жесткого стресса указывает, скорее всего, на включение третьей программы (стадии), итогом которой, вероятно, будет некротическая гибель клеток, но это предположение нуждается в экспериментальном подтверждении. В этом случае не имеет принципиального значения, как долго продержится экстремально высокий уровень цАМФ, поскольку для индукции переключения генетических программ в клетке достаточно, вероятно, очень короткого промежутка времени. Биотический стрессор (ЭПС Cms) оказывал неодинаковое воздействие на аденилатциклазную систему суспензионных клеток картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms. В клетках устойчивого сорта самый высокий уровень цАМФ наблюдался уже через 1 мин воздействия, и к 45 мин постепенно снижался (Рис. 8, А). При этом динамика внеклеточной концентрации цАМФ имела противоположно направленный характер, постепенно возрастала к концу эксперимента. В то же время у восприимчивого сорта накопление цАМФ происходило очень медленно, и отставало по уровню от такового у устойчивого сорта и только к 45 мин наблюдалось его весьма значительное внутриклеточное возрастание (Рис. 8, Б). Концентрация цАМФ в среде роста почти на всем протяжении эксперимента оставалась на уровне внутриклеточной, и только к 45 минутам значительно возрастала, хотя и не достигала его. Замедленная аккумуляция цАМФ в клетках восприимчивого сорта позволяет говорить о задержке трансдукции сигнала, возможно в результате ингибирования активности соответствующих аденилатциклаз, что было показано выше. Вполне возможно, что это происходит по причине конкурентного связывания некоторых компонентов ЭПС Cms рецепторами клеточных оболочек картофеля. Гетерогенность состава ЭПС позволяет предположить, что супрессорные компоненты ЭПС имеют большее сродство к рецепторам клеток картофеля, но с течением времени они замещаются элиситорными составляющими ЭПС, что и отражается на постепенном повышении уровня внутриклеточного цАМФ у клеток восприимчивого сорта.

Рис. 8. Влияние ЭПС Cms на концентрацию цАМФ в суспензионных клетках картофеля и среде роста, А - сорт Луговской (устойчивый); Б - сорт Лукьяновский (восприимчивый)

Несмотря на то, что механизм восприятия сигнала при абиотическом и биотическом стрессах различен, и у суспензии арабидопсиса и у клеток устойчивого сорта реакция аденилатциклазной сигнальной системы в первую минуту воздействия практически одинакова. Вполне возможно, что это является одним из проявлений общего принципа устойчивости, независимо от специфичности действующего стрессового фактора. Очевидно, что данный принцип един для всех молекулярных систем растительных организмов: например, комплекс шапероновых белков HSC70-SGT1, найденный у арабидопсиса и табака, необходим как для регуляции гормональных ответов, так и для проявления защитных реакций при тепловом стрессе и при инфицировании вирулентными патогенами [Noлl et al., 2007]. Анализ полученных данных позволяет заключить, что успешная реализация защитных ответов растений возможна только, если активация сигнальной системы, в частности, аденилатциклазной, под воздействием любых стрессовых факторов, будет кратковременной, а также строго дозированной по интенсивности.

Различия в скорости и интенсивности, а также специфичность системного ответа аденилатциклазного сигнального пути сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили, на биотический и абиотический стрессоры

Так как уже было показано, что ЭПС Cms способны специфически взаимодействовать с рецепторами плазмалеммы клеток картофеля, то логично ожидать, что данное взаимодействие приведет к активации сигнальных путей растений картофеля. Поэтому представляло интерес исследовать системную активацию аденилатциклазного сигнального пути у растений картофеля сортов, контрастных по устойчивости к Cms, под влиянием экзополисахаридов данного возбудителя.