Аденилатциклазы растений: характеристика и роль в реализации защитных механизмов при стрессах

С этой целью к среде роста пробирочных растений картофеля добавляли экзополисахариды возбудителя кольцевой гнили (0,1%) и измеряли концентрацию цАМФ, конечного продукта аденилатциклазной сигнальной системы (АСС), в различных частях растений через 1, 15, 120 и 480 мин. В работе использовали два сорта: Луговской (резистентный), Лукьяновский (восприимчивый). Исследования показали, что уже через 1 мин воздействия ЭПС в растениях резистентного сорта наиболее высокая концентрация цАМФ наблюдалась в средней и верхней частях стебля, превышая контроль в 100 и 138 раз, соответственно (Рис. 9, А). У растений восприимчивого сорта ни в одной из частей уровень цАМФ не достигал контроля.

Рис. 9. Динамика концентрации цАМФ в различных частях растений и среде роста картофеля в присутствии ЭПС Cms в среде роста.

А-1 мин; Б- 15 мин; В-45 мин; Г- среда роста

Через 15 мин у растений устойчивого сорта концентрация цАМФ ниже контроля была только в верхней части стебля (8-12 см от корня), в то время как у восприимчивого сорта его уровень наиболее значительно повышался только в корне (Рис. 9, Б). Через 120 мин во всех частях растения картофеля устойчивого сорта уровень данного вторичного мессенджера был ниже контроля. Напротив, у растений восприимчивого сорта в большинстве отрезков уровень цАМФ значительно превышал контроль, за исключением верхушечной части, где цАМФ вообще не детектировался при пороге определения данным методом 10 пМ (Рис. 9, В). Через 480 мин во всех частях растений обоих сортов концентрация цАМФ также не выявлялась.

Активный синтез и перераспределение концентраций цАМФ по растению сопровождались значительным выходом данной сигнальной молекулы в среду роста растений. Наиболее высокий уровень цАМФ в среде роста растений устойчивого сорта - 197 % от контроля, наблюдался через 120 мин инкубации с ЭПС (Рис. 9, Г). У растений восприимчивого сорта в среду роста выводилось значительно большее количество цАМФ и максимальная концентрация его приходилась на 1 и 120 мин (Рис.9, Г).

В литературе имеются сведения о том, что динамика уровня цАМФ в растениях в норме имеет волнообразный характер [Каримова и др., 1993], и это подтверждается данными экспериментов, приведенных на Рис. 9.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что ЭПС Cms вызывают системное изменение активности аденилатциклазной сигнальной системы клеток растений картофеля. Первоначальной причиной этого, скорее всего, следует считать взаимодействие данных экзометаболитов с рецепторами плазмалеммы клеток картофеля, что приводит к сопряжению таких рецепторов с мембраносвязанной аденилатциклазой и регулирующими ее активность G-белками. В силу предполагаемых свойств рассматриваемых рецепторов, а также сложнокомпонентного состава ЭПС, можно предположить, что степень активации или ингибирования данной сигнальной системы зависит от устойчивости сорта к Cms.

Однако возникает вопрос - каким образом за достаточно короткий промежуток времени происходит передача сигнала на значительное расстояние, и какова его природа, поскольку цАМФ способен мигрировать от места синтеза в клетке на расстояние меньшее, чем 1 мкм [Rich et al., 2000; Zippin et al., 2003] и на роль такого сигнала претендовать не может. Этому также препятствует высокая активность фосфодиэстеразы цАМФ и энергозависимость транспорта цАМФ за пределы клетки [Орлов, Максимов, 1999; Тарчевский, 2002]. Салициловая кислота не является мобильным сигналом, а представляет собой лишь мишень для его восприятия [Чиркова, 2002]. Ее антагонист, жасмоновая кислота, продуцируется растением не ранее, чем через 20 мин после воздействия элиситора [Gundlach et al, 1992]. Более вероятным претендентом на роль раннего подвижного сигнала может быть изменение мембранного потенциала, вызванное изменением внеклеточного рН и модуляцией активности цАМФ-зависимых ионных каналов. ЭПС Cms, через рецепторы влияя на активность мАЦ, способствуют локальному повышению в клетке уровня цАМФ, что, по-видимому, приводит к открытию цАМФ-зависимых ионных каналов, в первую очередь кальциевых [Volotovski et al., 1998; Trewavas et al., 2002]. Быстрый вход в клетку Са²⁺ может вызвать деполяризацию мембраны, и инициировать возникновение потенциала действия (ПД) [Медведев, 1998; Гималов и др., 2004; Пятыгин, 2008], который с весьма высокой скоростью, 20-30 см/мин, распространяется по стеблю растения вверх [Тарчевский, 2001а; Felle, Zimmermann, 2007]. По литературным данным, ПД в свою очередь может активировать мАЦ [Pall, 1977; Reddy et al, 1995]. Зафиксированное в представленных экспериментах повышение уровня цАМФ в верхушке стебля растения картофеля устойчивого сорта уже через 1 мин вполне может быть объяснено именно этим. В то же время торможение сигнала в клетках растений восприимчивого сорта через 1 мин воздействия, скорее всего, связано с ингибированием ЭПС активности мАЦ. Основания для такого вывода подробно были изложены при обсуждении кинетических параметров АЦ. Одной из причин дальнейших флуктуаций в концентрации цАМФ в различных частях растений картофеля является, в частности, способность ЭПС Cms значительно закислять среду роста и, как следствие, апопласт клеток. Это должно приводить к индукции повторяющегося ПД, что может оказывать модулирующее влияние на активность мАЦ [Пятыгин, 2008]. Поскольку клетки устойчивого сорта более эффективно, чем восприимчивого, восстанавливают внеклеточный рН-гомеостаз [Романенко и др., 1998], ПД, формируемый ими, должен отличаться от такового в клетках восприимчивого сорта. Отражением этого является заметное затухание колебаний цАМФ уже через 120 мин в клетках устойчивого сорта. У восприимчивого сорта восстановление внеклеточного рН-гомеостаза более растянуто во времени при воздействии ЭПС [Романенко и др., 1998], что указывает на неоперативную работу ионных потенциалобразующих каналов и, как следствие, на замедленную системную активацию аденилатциклазного сигнального пути в клетках растений этого сорта. Полное угасание детектируемого сигнала у растений обоих сортов через 480 мин, вероятно, свидетельствует об адаптивной перестройке метаболизма клеток под воздействием биотического стрессора у растений обоих сортов.

В тесной связи с изложенным находится и вопрос специфичности защитных реакций растений. Молекулярные механизмы, определяющие этот феномен, еще до конца не выяснены. Есть данные, что на ранних этапах любых стрессовых воздействий экспрессируются прежде всего механизмы неспецифической защиты [Kreps et al., 2002; Swindell, 2006], хотя из других источников следует, что на их фоне формируются специфические защитные реакции [Seki, 2002; Xiong et al., 2002]. В основном процесс эволюции картофеля как культурного растения направлен на развитие специфической устойчивости к патогенам, являющимися биотическими стрессорами. В то же время низкая положительная температура выступает для картофеля в роли неспецифического стрессового фактора, так как данная культура не холодостойка. Поэтому представляло интерес выяснить, какова системная реакция аденилатциклазного сигнального пути растений тех же сортов картофеля на кратковременные (1 мин) стрессы: неспецифический абиотический (4^о С) и специфический биотический (ЭПС Cms). Кроме того, в рамках этой задачи необходимо было выяснить роль мембраносвязаннной аденилатциклазы в инициации системного сигнала. Для решения этого вопроса было проведено несколько вариантов экспериментов.

1. Инкубация in vitro растений картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms, в среде роста, содержащей 0,1 % ЭПС Cms.

2. Выдерживание растений картофеля тех же сортов в среде роста, охлажденной до 4° С.

3. Предварительная инкубация растений картофеля в течение 1 ч при комнатной температуре в среде роста, содержащей 10 мкМ сурамина - ингибитора мАЦ, разобщающего связь рецептора с G белком.

4. Предварительная инкубация растений в среде с сурамином с последующей обработкой 0,1 % ЭПС Cms в течение 1 мин.

5. Повторение операции п.3, с последующим переносом растений в среду роста, охлажденную до 4° С.

По окончании экспозиции растения фиксировали жидким азотом и измеряли уровень цАМФ в верхней части стебля с листьями. Прежде всего, следует отметить, что уже через 40 мин инкубации растений в растворе сурамина, у них наблюдалось завядание, начинающееся с верхних листьев. Этот процесс носил обратимый характер и исчезал довольно быстро после перенесения растений в стандартную среду роста. ЭПС Cms, как и в предыдущих экспериментах, вызывали отчетливую и противоположно направленную реакцию аденилатциклазной сигнальной системы (АСС) у растений обоих сортов. Как следует из таблицы 3 АСС в клетках устойчивого сорта активизировалась в 16 раз по сравнению с контролем, в то время как у восприимчивого сорта наблюдалось ингибирование этой сигнальной системы, и ее активность снизилась в 27 раз (Табл. 3).

Таблица 3. Концентрация цАМФ (нМ/ г сыр массы) в верхней части стебля и листьях растений картофеля после воздействия кратковременных стрессов и сурамина

Напротив, кратковременный низкотемпературный стресс вызывал примерно одинаковый ответ АСС в растениях обоих сортов, а именно, возрастание уровня цАМФ в 1,7 и в 1,9 раза по сравнению с контролем у резистентного и восприимчивого сортов, соответственно (Табл. 3). Видно, что, несмотря на предварительную инкубацию с сурамином, вызывающим значительное ингибирование мАЦ, последующее добавление ЭПС в ту же среду с сурамином приводило к более интенсивному ответу АСС у растений устойчивого сорта, чем у восприимчивого. В то же время, сурамин плюс 4°С вызывали примерно одинаковое снижение активности АСС у обоих сортов: в 5,3 и 5,6 раза соответсвенно (Табл. 3).Предполагаемый механизм передачи системого сигнала от АСС при биотическом стрессе уже обсуждался выше. Увядание растений в среде с сурамином подтверждает эту информацию: блокировка работы мАЦ снижает уровень цАМФ в клетке, что, вероятно, приводит к нарушению функционирования ионных каналов, и как следствие, к истечению из клетки осмотически активных ионов, таких как К⁺. Поскольку сурамин подавлял активность мАЦ не полностью, это все же позволило реализоваться системному сигналу. При абиотическом стрессе у обоих сортов растений картофеля, как теплолюбивой культуры, преобладает неспецифическая составляющая стрессорного ответа, реализующаяся прежде всего через изменение текучести липидного матрикса плазмомембраны [Кузнецов, 2001; Kasperska, 2004; Пятыгин, 2003, 2008]. Это влечет за собой конформационные изменения в мембраносвязанных белках [Пятыгин, 2003], что, в частности, приводит к активации мАЦ в клетках корня растений картофеля. Параллельно на плазмалемме возникает потенциал действия, обусловленный изменением активности Н⁺-насоса и ионных каналов, причем к последним относятся как цАМФ-зависимые, так и другие каналы, неспецифически реагирующие на изменение температуры окружающей среды [Гималов и др., 2004; Пятыгин, 2003, 2007]. Можно предположить, что в последующем механизм системной активации АСС будет аналогичен таковому при биотическом стрессе. Вероятно, в силу неспецифического характера низкой температуры как стрессового фактора, величина мембранного потенциала действия, возникающего при этом, должна быть практически идентичной у обоих сортов, что обеспечивает примерно одинаковую активацию мАЦ и, следовательно, АСС в клетках этих сортов.

Выявление у растений изоформы мАЦ, иммунородственной 6-ой изоформе мАЦ животных. Влияние длительных биотического и абиотического стрессоров на активизацию синтеза этой изоформы мАЦ у растений. В литературе отсутствуют сведения, касающиеся изоферментного состава мАЦ растений, хотя имеется информация, что одни и те же агенты (Mn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺) могут оказывать различный, а зачастую и противоположный эффект на активность растительной мАЦ [Carricarte et al., 1988; Lusini et al.,1990]. Этот факт косвенно указывает на возможность присутствия у растений нескольких изоформ мАЦ. Поскольку под воздействием различных внешних агентов, например, элиситоров или изменения температуры у растений наблюдается быстрое и кратковременное возрастание внутриклеточной концентрации кальция [Бияшева и др., 1993; Volotovski et al., 1998; Гималов и др., 2004], представлялось необходимым исследовать также возможность активизации синтеза этой изоформы мАЦ у растений, подвергнутых длительным стрессорам биотической и абиотической природы. Для этого использовали два сорта картофеля, контрастные по устойчивости к Cms, а также сорта озимой и яровой пшеницы. Для создания длительной биотической стрессовой нагрузки растения картофеля инкубировали 72 часа с 0,1% ЭПС Cms. Проростки яровой и озимой пшеницы подвергали длительному воздействию абиотического стрессора, а именно выдерживали 72 часа при +4° С. Выявление изоформы мАЦ, иммунородственной 6 - ой изоформе мАЦ животных, проводили с помощью первичных антител к 6 изоформе мАЦ животных в осадке, полученном после ультрацентрифугирования гомогената растительной ткани.

Образец, содержащий только антитела, дал две белковых полосы, не совпадающие по мол. массе с экспериментальными образцами (Рис. 10).

Проведенные эксперименты позволили выявить у растений картофеля и пшеницы изоформу мАЦ, иммунородственную 6-ой изоформе мАЦ животных, которая имела мол. массу 182 кДа. Стоит сказать, что предсказанный молекулярный вес соответствующей изоформы животных составляет только 130 кДа (“Abcam”, Великобритания). Возможно, это связано с чистотой исследуемой фракции: так как изучаемая форма фермента является мембранным белком, то для ее очистки необходима солюбилизация с применением дополнительных сильных детергентов. В используемых нами условиях выделения (0,01% октиглюкопиранозид в качестве детергента) скорее всего, выделяется комплекс рецептор-G белок-мАЦ. Поэтому сделать окончательное заключение о молекулярной массе по имеющимся данным пока не представляется возможным. Длительное воздействие стрессов, специфичных для каждого вида растения, не привело к интенсификации синтеза данной изоформы (Рис. 10).

Полученные результаты позволяют расширить имеющиеся представления об организации аденилатциклазной сигнальной системы растений. Так как из внешней среды к растениям поступает масса разнообразных сигналов, каждая сигнальная система должна иметь тонкие механизмы адекватной по силе и качеству передачи информации на геном. Система вторичных мессенджеров, в том числе цАМФ и Са⁺², путем варьирования внутриклеточной амплитуды колебаний концентраций позволяет успешно производить такую настройку [Медведев, Маркова, 2001; Willoughby et al, 2006; Parekh, 2008]. Для достижения оптимальной концентрации сигнальных молекул могут использоваться различные механизмы, одним из которых и являются ряд изоформ АЦ, отличающихся по чувствительности к ионам кальция. У растений в плазмалемме имеются кальциевые ионные каналы, специфически регулируемые цАМФ [Talke et al., 2003; Lemtiri-Chlieh, Berkowitz, 2004]. Кроме того, есть данные, что под воздействием некоторых неблагоприятных факторов внешней среды, например, экзометаболитов грибных патогенов, в клетках растений наряду с цАМФ быстро повышается концентрация кальция [Kurosaki et al., 1987]. Поэтому функционирование у растений изоформы мАЦ, ингибируемой физиологическими концентрациями кальция, представляется вполне логичным. Можно предположить, что конститутивный спектр изоформ мАЦ зависит от условий их обитания. Экстремальные условия обитания (длительная засуха, засоление, деаэрация), вероятно, могут привести к изменению изоферментного спектра мАЦ.

Рис. 10. Иммуноблотинг белков мембранной фракции клеток растений после иммунопреципитации с поликлональными антителами к 6-ой изоформе мАЦ животных.1 - пшеница озимая, 23° С; 2 - пшеница озимая, 4° С, 72 часа;3 - пшеница яровая, 23° С; 4 - пшеница яровая, 4° С, 72 часа; 5 - картофель, с. Луговской (устойчивый); 6 - картофель, с. Луговской, +ЭПС, 72 часа; 7 - картофель, с. Лукьяновский (восприимчивый); 8 - картофель, с. Лукьяновский, +ЭПС, 72 часа; АТ-антитела к 6-ой изоформе мАЦ животных.

Выявление рАЦ у разных видов растений и влияние длительного биотического и абиотического стрессоров на изменение изоферментного состава рАЦ. Имеющиеся в литературе сведения о наличии рАЦ в растениях весьма противоречивы и не отличаются полнотой [Moutinho et al., 2001; Roelofs, Van Haastert, 2002]. Поскольку предполагается, что степень активности рАЦ растений связана с их устойчивостью, представляло интерес выявить не только имеющиеся в норме изоформы рАЦ, но и исследовать влияние на них длительных стрессоров различной природы.

Эксперименты показали, что в образцах растений картофеля и пшеницы как в контрольных вариантах, так и в опытных, выявилась только одна полоса преципитации с мол. массой 190 кДа (Рис. 11).

Рис. 11. Иммуноблотинг белков из надосадочной фракции клеток растений после иммунопреципитации с моноклональными антителами к «растворимой» аденилатциклазе растений.АТ- антитела к рАЦ животных; 1 - картофель, с. Лукьяновский (восприимчивый); 2 - картофель, с. Лукьяновский, +ЭПС, 72 часа; 3 - картофель, с. Луговской (устойчивый); 4 - картофель, с. Луговской, +ЭПС, 72 часа; 5 - пшеница озимая, 23°С; 6 - пшеница озимая, 4°С, 72 часа; 7 - пшеница яровая, 23°С; 8 - пшеница яровая, 4°С, 72 часа;

По литературным данным, у животных полноразмерная рАЦ имеет молекулярную массу 187 кДа, что почти совпадает с молекулярной массой выявленной нами рАЦ у растений. В литературе имеются сведения, что рАЦ обладает высокой гомологией у разных видов организмов, например, малярийного плазмодия, дрозофилы, высших животных, а также человека [Барковский, Ачинович, 2003]. По растениям есть две работы, в которых найдено сходство в нуклеотидной последовательности фрагмента рАЦ из пыльцы лилий с рАЦ грибов, а также рАЦ из клеток листьев табака с рАЦ дрожжей [Ichikawa et al., 1997; Moutinho et al., 2001]. Конечно, эти сведения не позволяют проводить полную аналогию структуры рАЦ животных и растений, но дают основание предполагать, что у этой формы фермента из клеток животных и растений имеются одинаковые консервативные последовательности, позволяющие узнавать моноклональными антителами животных соответствующий белок растений. Довольно неожиданными представляются результаты об отсутствии влияния длительных специфических стрессоров на появление других изоформ рАЦ в клетках проростков пшеницы и растениях картофеля. Вероятно, у растений регуляция активности рАЦ под воздействием длительных неблагоприятных факторов осуществляется посредством других механизмов.

Функционирование мАЦ и рАЦ в ядрах и хлоропластах клеток растений картофеля. Влияние ЭПС возбудителя кольцевой гнили на активность этих форм фермента. У растений к настоящему времени установлены еще не все элементы аденилатциклазного сигнального пути, имеющиеся у животных (не найдены, в частности EPAC и ACAPs-белки), однако активность аденилатциклазы выявлена методами электронной цитохимии в мембранах ядер и хлоропластов [Witters et al., 2005], хотя при этом осталось неясным, к какому типу АЦ она относилась. Кроме того, в ряде работ [Carricarte et al., 1988; Lusini et al., 1991; Ichikawa et al., 1997; Moutinho et al., 2001] биохимическими методами были выявлены тотальная мембраносвязанная и «растворимая» формы аденилатциклазы.

Совокупность таких литературных данных явилась предпосылкой для постановки цели исследования, а именно выявления различных форм АЦ (растворимой и мембраносвязанной) в растительной клетке, в первую очередь, в органеллах - носителях генетической информации - в ядре и хлоропластах. Кроме того, учитывая важную роль АЦ в обеспечении каскадных сигнальных реакций, была поставлена еще одна цель - выявить реакцию различных форм этого фермента из клеток растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили (Cms), на опосредованное воздействие экзополисахаридами данного возбудителя. В работе использовались in vitro растения двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к Cms. ЭПС Cms добавляли в среду роста растений, экспозиция составляла 1 мин. Чистота выделенных фракций ядер и хлоропластов составляла 80-85 %. Для выявления во фракциях органелл двух форм АЦ - мембраносвязанной и растворимой использовали специфические эффекторы соответствующих форм этого фермента: NaF для стимуляции мАЦ, а MnCl₂ и NaHCO₃ - для активации рАЦ. Измерения активности проводили при рН 7,4.

Мембраносвязанная и ««растворимая»» АЦ ядер клеток растений устойчивого сорта. Было установлено, что в контрольном варианте (без добавления ЭПС Cms в среду роста растений) активность мАЦ, выявляемая в присутствии NaF, была в 3 раза ниже, чем растворимой, определяемой с помощью MnCl₂ и NaHCO₃ . Уровни активности рАЦ под воздействием этих агентов были почти одинаковыми. После кратковременной инкубации (1 мин) корней растений картофеля с ЭПС (опыт), наблюдалось увеличение активности обеих форм АЦ со специфическими эффекторами в 4,5-7 раз, соответственно, причем наибольшая величина активации была получена в варианте с NaHCO₃ (Рис.12). Мембраносвязанная и ««растворимая»» АЦ хлоропластов клеток растений устойчивого сорта. В контроле (без ЭПС) уровень активности рАЦ превышал таковую мАЦ примерно в 1,3-2 раза в присутствии MnCl₂ и NaHCO₃, соответственно (Рис. 12). ЭПС Cms в различной степени стимулировали как мАЦ, так и рАЦ хлоропластов. В максимальной степени - в 17 раз - активировалась мембранная АЦ (эффектор NaF); уровень рАЦ в варианте с MnCl₂ был выше относительно контроля в 9 раз, а при добавлении NaHCO₃ - в 3,5 раза (Рис.12).

Рис. 12. Влияние 0,1% ЭПС Cms на активность различных форм АЦ из органелл клеток растений картофеля, пМоль цАМФ/мг белка в мин, сорт Луговской (устойчивый).

Мембраносвязанная и ««растворимая»» АЦ ядер клеток растений восприимчивого сорта. Как следует из полученых данных (Рис. 13), активности обеих форм АЦ между собой существенно не различались, но были значительно ниже, чем у устойчивого сорта - в 10 и 23 раза, соответственно. ЭПС ингибировали активности обеих форм данного фермента, причем мАЦ в 2 раза, рАЦ - в 1,2 раза в присутствии MnCl₂ и в 1,6 раза при добавлении NaHCO₃ (Рис. 13).

Мембраносвязанная и ««растворимая»» АЦ хлоропластов клеток растений восприимчивого сорта. Активность мАЦ в контроле (без ЭПС) была значительно - в 5 раз ниже, чем у растений устойчивого сорта, в то время как уровень активности растворимой формы АЦ соответствовал аналогичному показателю у устойчивого сорта (Рис. 13). ЭПС, как и во фракции ядер, значительно ингибировали активность обеих форм фермента - мАЦ в 3,5 раза, рАЦ в присутствии двух типов эффекторов - в 13-14 раз, соответственно (Рис.13).

Рис. 13. Влияние 0,1% ЭПС Cms на активность различных форм АЦ из клеток растений картофеля, пМоль цАМФ/мг белка в мин, сорт Лукьяновский (восприимчивый).

Представленные результаты позволяют выдвинуть гипотезу о механизмах внутриклеточной сигнализации растений. Ранее полагали, что синтезирующийся на плазмалемме цАМФ диффундирует далее в цитоплазме, запуская последующие каскадные реакции с участием различных протеинкиназ и факторов транскрипции, «переносящих» сигналы в ядро [Тарчевский, 2001]. Однако, опираясь на полученные результаты, где активность различных форм АЦ наблюдалась в ядре и хлоропластах уже через 1 мин после опосредованного воздействия неблагоприятного фактора, и, принимая во внимание литературные данные об ограниченной диффузии цАМФ от места синтеза [Zippin et al., 2003], сложно представить, что весь набор предполагаемых реакций может протекать за столь короткое время. Поэтому представляется более вероятным, что трансдукция сигнала с помощью аденилатциклазной системы у растений может осуществляться также через микродомены, локализованные как вблизи плазмалеммы, так и во внутриклеточных органеллах. В любом случае, прежде всего сигнал от внешнего раздражителя воспринимает мАЦ плазмалеммы. Степень ее активности зависит от нескольких составляющих: от величины и характера действующего внешнего раздражителя, а также количества и качества рецепторов и соответствующих G белков [Sunahara, Taussig, 2002]. Возникает вопрос, каким образом сигнал довольно оперативно передается на внутриклеточные органеллы. Мы уже показали, что активирующим агентом для рАЦ являются ионы бикарбоната. По литературным данным у животных, бикарбонат в сочетании с кальцием, оказывает мощный синергический эффект на активность растворимой АЦ, локализованной в ядрах и митохондриях [Litvin et al., 2003]. У растений показано, что благодаря соответствующим карбоангидразам, бикарбонат-ионы распространены не только в фотосинтезирующих органах [Пронина, Семененко, 1988; Иванов и др., 2007], но и в корнях [Wegner, Zimmermann, 2004]. Кроме того, бикарбонат-ионы присутствуют не только в хлоропластах, где участвуют в процессе фотосинтеза, но также в митохондриях и цитоплазме. Предполагается, что они выполняют функции стабилизации рН, особенно при воздействии стрессовых факторов [Иванов и др., 2007]. Вероятно, что и ионы кальция, как вездесущего и активного вторичного мессенджера тоже должны оказывать модулирующее водействие на мАЦ и рАЦ, локализованные во внутриклеточных компартментах растений. Такое предположение связано с одной стороны, с наличием в клетках растений феномена «кальциевой волны», выполняющего сигнальные функции, и с другой, с литературными данными, где показана тесная взаимосвязь изменения уровней цАМФ и ионов кальция под воздействием нвешних неблагоприятных факторов. Кроме того, в этом процессе, участвуют ассоциированные с аденилатциклазой белки (cyclase-associated proteins - САРs), выполняющие роль ремодулирующего актин агента при трансдукции внутриклеточных сигналов [Hubberstey, Mottillo, 2002]. Мутации кДНК, кодирующей этот белок в арабидопсисе, приводили к нарушению морфологии клеток и размера листьев в результате появления дефектов в элементах цитоскелета [Barrero et al., 2002]. Стабилизация актинового цитоскелета у дрожжей вызывала неконтролируемое повышение уровня цАМФ, приводя к развитию апоптотической гибели клеток [Gourlay, Ayscough, 2006]. Влияние ЭПС Cms на все формы АЦ ядер и хлоропластов, из клеток растений картофеля, вероятно, осуществляется через рецепторы клеточных стенок и плазмалеммы, у устойчивого сорта, возможно, к элиситорным компонентам ЭПС и, далее, через G белки. Сигнал через ряд посредников поступает к рАЦ, локализованной, в ядрах и хлоропластах клеток картофеля. У восприимчивого к Cms сорта, напротив, происходит частичное ингибирование данных форм фермента, с участием, скорее всего, супрессорных компонентов ЭПС и соответствующих рецепторов и G-белков.

Как следует из представленных экспериментальных данных, активация «растворимой» формы аденилатциклазы связана с сортовой устойчивостью растений картофеля. Вероятно, следует ожидать, что различные формы АЦ имеются также и в других внутриклеточных компартментах растений.

Все изложенное позволяет сделать заключение, что в отличие от данных зарубежных авторов, где во внутриклеточных компартментах обнаружена только рАЦ [Zippin et al., 2003], наши исследования позволили выявить в ядре и хлоропластах клеток растений картофеля мАЦ и рАЦ. Это расширяет имеющиеся представления о составе и механизмах действия сигнальных микродоменов органелл, призванных осуществлять тонкую последовательную регуляцию внутриклеточных процессов.

Влияние биотического стресса на перераспределение цАМФ в компартментах клеток картофеля. Локализация рАЦ в органеллах этих клеток. Для описания механизма трансдукции внутриклеточных сигналов существует две взаимоисключающих гипотезы, касающихся диффузии цАМФ: по одной из них цАМФ от плазмалеммы (места синтеза) двигается до ядра [Assman, 2005], по другой цАМФ не может диффундировать от места синтеза более, чем на 1 мкм, поскольку она быстро переводится фосфодиэстеразой цАМФ в расциклизованную неактивную форму. При этом в органеллах фунционируют собственные источники цАМФ, например рАЦ в клетках животных [Zippin et al., 2003]. Поэтому. представлялось необходимым изучить локализацию цАМФ во внутриклеточных компартментах, а также исследовать влияние биотического стрессора на перераспределение в них данного мессенджера. Работа была проведена на растениях картофеля сортов, контрастных по устойчивости к Cms, методом электронной иммуноцитохимии. цАМФ выявляли в клетках корня растений обоих сортов картофеля. Неспецифическая реакция (обработка срезов только ВАТ или неиммунной сывороткой, затем ВАТ) отсутствовала во всех вариантах опыта. В контрольных вариантах (без обработки растений ЭПС) метки к цАМФ наблюдались во многих компартментах клеток. Однако, их распределение по органеллам клеток существенно отличалось у растений обоих сортов (Рис. 14, А,Б).

В клетках контрольных растений устойчивого сорта наибольшее количество меток к цАМФ наблюдалось на плазмалемме, затем в эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях (Рис. 14А, 15). В аналогичном варианте у восприимчивого сорта максимум меток к цАМФ был обнаружен в эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях, а затем уже на плазмалемме (Рис. 14Б, 16). Воздействие ЭПС Сms (15 мин) приводило к перераспределению меток к цАМФ в органеллах клеток растений обоих сортов (Рис. 14А,Б; 17, 18).

Рис. 14. Влияние ЭПС Cms (0,1%, 15 мин) на изменение количества меток к цАМФ во внутриклеточных компартментах клеток корня растений картофеля,(шт/10 мкм²), А - резистентный сорт; Б - восприимчивый сорт. Вак -вакуоль; КС - клеточная стенка; МХ - митохондрия; Пл - плазмалемма; Тон - тонопласт; Цит - цитозоль; ЭР - эндоплазматический ретикулум; Я - ядро; ЯМ - ядерная мембрана.

У устойчивого сорта на первое место вышли эндоплазматический ретикулум и митохондрии, затем ядро, ядерная мембрана и цитозоль. У восприимчивого сорта наиболее значительно этот показатель возрастал в эндоплазматическом ретикулуме, затем в гораздо меньшей степени в митохондриях, вакуолях и цитозоле. На первый взгляд максимум данной сигнальной молекулы у растений обоих сортов наблюдался практически в одних и тех же органеллах, но по количеству меток в процентах к контролю сорта весьма значительно различались (Табл.4). В клетках устойчивого сорта количество меток к цАМФ в ядре превышало более чем в 20 раз показатель в контроле; у восприимчивого сорта - только в 1,5 раза. У восприимчивого сорта наблюдалось существенно меньше меток к цАМФ во всех компартментах, за исключением цитозоля (превышение в 12 раз против контроля).

Таблица.4. Количество гранул золота, соответствующих локализации цАМФ в различных компартментах клеток растений картофеля, у сортов, контрастных по устойчивости к Cms, % к контролю

Обозначения: КС - клеточная стенка; Пл - плазмалемма; Цит - цитозоль;

ЭР - эндоплазматический ретикулум; МХ - митохондрия; Вак - вакуоль; Тон - тонопласт; Я - ядро; ЯМ - ядерная мембрана.

Рис.15. Локализация цАМФ в митохондриях (МХ) (звездочки), на мембране эндоплазматического ретикулума (ЭР) (светлая стрелка), на плазмалемме (длинные стрелки), в клеточной стенке (короткие стрелки). Клетки меристемы корня растений картофеля, сорт Луговской, контроль.

Рис.16. Локализация цАМФ в ядре (Я), ядерной мембране, цитозоле (длинные стрелки) и в клеточной стенке (короткие стрелки). Клетки меристемы корня растений картофеля,сорт Лукьяновский, восприимчивый, контроль

Рис.17. Локализация цАМФ в вакуоли (В) (двухсторонние стрелки), на тонопласте (жирные стрелки). Клетки меристемы корня растений картофеля, сорт Луговской (устойчивый), опыт (+ЭПС)

Рис.18. Локализация цАМФ в митохондриях (МХ, короткие стрелки), на мембране эндоплазматического ретикулума (ЭР, звездочки), в цитозоле (длинные стрелки), в ядре (Я, вклейка внизу, звездочки). Клетки меристемы корня растений картофеля. Сорт Лукьяновский, (восприимчивый), опыт (+ЭПС)

Таким образом, под воздействием биотического стрессора (ЭПС Cms) у растений устойчивого сорта наблюдается более высокая интенсивность распространения внутриклеточного сигнала через аденилатциклазный сигнальный путь, по сравнению с восприимчивым сортом.

Поскольку одним из источников цАМФ в клетке является рАЦ, которая нами была обнаружена биохимическими методами в хлоропластах и ядрах клеток растений тех же сортов картофеля, необходимо было выявить локализацию этой формы АЦ во всех внутриклеточных компартментах, тем более, что имеющиеся литературные данные не отвечают на этот вопрос [Tu,1979; Bhalta, Chopra, 1984; Willoughby, Cooper, 2006]. Иммунно-цитологические исследования показали, что рАЦ присутствовала во многих компартментах клеток корня и листа растений картофеля обоих сортов. Оказалось неожиданным, что данная форма фермента была обнаружена в клеточной стенке и межклетнике (Рис. 19). Это позволяет высказать предположение, что такая локализация рАЦ, также как ряда других ферментов, участвующих в первичных защитных ответах растений, призвана трансдуцировать самые ранние «сигналы тревоги» растительного организма, а также осуществлять межклеточную передачу сигналов. Кроме того, частицы золота, отражающие локализацию рАЦ, были обнаружены в митохондриях, хлоропластах, вакуолях, цитозоле, а также при эндоплазматическом ретикулуме. В митохондриях метки к рАЦ выявлялись преимущественно в матриксе, тогда как в хлоропластах наблюдались как в строме, так и около гран (Рис. 20). Для сравнения, в клетках животных локализация рАЦ была ранее выявлена в ядре, митохондриях и на элементах цитоскелета [Zippin et al., 2003].

Рис. 19. Локализация рАЦ в межклетнике, клеточных стенках и вакуолях (стрелки). Клетки корня растений картофеля. Сорт Луговской, устойчивый

Рис. 20. Локализация рАЦ в хлоропластах (Х) и вакуоли. Клетка листовой паренхимы растения картофеля. Сорт Лукьяновский, восприимчивый

Заключение

Аденилатциклазная сигнальная система растений на сегодняшний день остается малоизученной, и пока нет полной схемы рецепции и трансдукции внутри- и межклеточных сигналов с ее участием. В работе показано, что как специфические, так и неспецифические стрессоры приводят к активации данной сигнальной системы у растений.

Весь комплекс проведенных исследований позволяет предложить схему, описывающую участие аденилатциклаз растений в передаче внутри- и межклеточных сигналов при специфических и неспецифических стрессах (Рис. 21). Независимо от вида стресса, восприятие сигнала начинается с контакта неблагоприятного фактора с клеточной стенкой, а затем и плазматической мембраной клетки. При биотическом стрессе, в частности под воздействием ЭПС Cms, происходит взаимодействие рецепторов клеточных стенок и плазмалеммы с экзометаболитами данного возбудителя. Вероятно, в этом случае одним из основных механизмов регуляции активности мАЦ является небольшое, но достаточное для индукции сигнала количество рецепторов на клеточной стенке и плазмалемме клеток растений устойчивого сорта. При этом активация аденилатциклазной сигнальной системы должна быть связана с G_s белком - активатором мАЦ. Напротив, значительное количество и разнообразие рецепторов к ЭПС у клеток растений восприимчивого сорта, вероятно, обладающих сродством как к супрессорным, так и к элиситорным компонентам ЭПС [Романенко и др., 1999а, Шафикова и др., 2003], предполагает наличие G_i белка, ингибирующего активность мАЦ. Конечно, следует учитывать, что в этой системе имеется фермент, разрушающий цАМФ - фосфодиэстераза, но, поскольку в настоящей работе было показано, что повышение или понижение активности мАЦ совпадают с изменением уровней внутриклеточного цАМФ, можно полагать, что определяющая роль принадлежит аденилатциклазе. Кроме того, ЭПС вызывают кратковременное обратимое нарушение клеточного гомеостаза у растений картофеля, причем скорость восстановления гомеостаза имеет сортовую зависимость [Романенко и др., 1996]. Это явление, вероятно, связано с изменением активности ряда ионных каналов, включая кальциевые. В связи с этим становится очевидной и актуальной роль обнаруженной нами изоформы мАЦ растений, иммунородственной 6-ой изоформе АЦ животных, которая ингибируется физиологическими концентрациями кальция [Cooper et al., 1998]. Таким образом, уже на уровне плазмалеммы происходит формирование сигнального импульса от аденилатциклазной сигнальной системы, стимулирующего возникновение целого ряда параллельных и цепных внутриклеточных реакций [Kurosaki et al., 1987; Volotovski et al., 1998; Willoughby, Cooper, 2006].

Рис. 21. Участие аденилатциклазной сигнальной системы в защитных ответах растительных клеток. РКС - рецепторы клеточных стенок; РПМ -рецепторы плазматической мембраны; G - G белок; тмАЦ - трансмембранная аденилатциклаза; рАЦ - «растворимая» аденилатциклаза; ФДЭ - фосфодиэстераза цАМФ; ПКА - протеинкиназа А; ФТ - факторы транскрипции; СС - системный ответ

В итоге, происходит модуляция активности рАЦ и мАЦ в компартментах клеток. В этом процессе немаловажное значение принадлежит и ионам бикарбоната, способным в определенных концентрациях активировать рАЦ. Представленная цепь событий позволяет ответить на вопрос о роли аденилатциклазной сигнальной системы в дифференциации ответов растений при воздействии неспецифического стрессора, а также в сортовой устойчивости растений под влиянием специфического стрессора и предложить к использованию в селекционной работе в качестве маркера специфической устойчивости изменение активности аденилатциклазной сигнальной системы растений.

Выводы

1. Вирулентность и мукоидность возбудителя в патосистеме картофель-кольцевая гниль (Cms) коррелируют с интенсивностью его сорбции на поверхности растений. Восприятие сигналов от патогена осуществляется в том числе через рецепторы плазмалеммы клеток картофеля к экзополисахаридам возбудителя, имеющим количественные отличия у сортов, контрастных по устойчивости к Cms.

2. У растений сортов картофеля, контрастных по устойчивости к бактериальному возбудителю, оптимальные значения рН активности мембраносвязанной АЦ в норме и под воздействием ЭПС Cms совпадают и составляют 7,4. Впервые показано, что ЭПС Cms осуществляют аллостерическую и изостерическую регуляцию активности мАЦ в клетках растений обоих сортов: у устойчивого - положительную, у восприимчивого - отрицательную.

3. Впервые определены кинетические параметры «растворимой» АЦ. ЭПС Cms оказывают разнонаправленный эффект на V_max рАЦ у растений обоих сортов картофеля: у устойчивого сорта повышают и, напротив, понижают у восприимчивого сорта.

4. Одним из условий успешной реализации защитных ответов растений при воздействии специфических и неспецифических стрессоров является кратковременная и достаточная по интенсивности активация аденилатциклазной сигнальной системы растений.

5. Системная активация аденилатциклазной сигнальной системы при неспецифическом стрессе у обоих сортов картофеля практически одинакова, в отличие от специфического стресса, где установлена зависимость активации этого сигнального пути от устойчивости сорта к данному стрессору.

6. Впервые в растениях обнаружена изоформа мАЦ, иммунородственная 6-ой изоформе мАЦ животных. Длительные специфические стрессы не приводят к интенсификации синтеза данной изоформы.

7. Впервые показано, что у растений, относящихся к разным видам (картофель, пшеница), выявлена одна форма рАЦ. Длительные биотический и абиотические стрессы, специфические для каждого вида растений, не индуцируют синтез других изоформ этой формы фермента.

8. Впервые биохимическими методами в ядре и хлоропластах клеток растений картофеля выявлены мАЦ и рАЦ. Кратковременный биотический стрессор активировал эти формы фермента у устойчивого сорта и ингибировал у восприимчивого. Методом электронной иммунноцитохимии рАЦ выявлена во многих компартментах клеток картофеля. Установлено, что у растений цАМФ присутствует во многих внутриклеточных компартментах. Под воздействием ЭПС Cms сигнал от аденилатциклазного сигнального пути (цАМФ) в клетках растений устойчивого сорта значительно интенсивнее и быстрее достигает ядра, чем в клетках растений восприимчивого сорта.

9. Маркерным признаком специфической устойчивости может выступать как локальное, так и системное изменение уровня цАМФ у растений.

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендуемых для публикации ВАК РФ

1. Романенко А.С., Ломоватская Л.А., Граскова И.А., Саляев Р.К. Вирулентность, способность к сорбции возбудителя кольцевой гнили и пероксидазная активность клеток сортов картофеля, различающихся по устойчивости к данному патогену // ДАН, 1999, Т. 368, № 3, с.430-432.

2. Романенко А.С., Ломоватская Л.А., Граскова И.А., Саляев Р.К. Высокая инфекционная нагрузка возбудителя кольцевой гнили картофеля вызывает у растения-хозяина необычные симптомы заболевания // ДАН. 2000. Т. 374. № 5.С. 712-714.

3. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Саляев Р.К. Апоптоз как защитная реакция клеток растений картофеля при патогенезе кольцевой гнили // ДАН. 2002. Т. 382, № 6, с.847- 849.

4. Романенко А.С., Ломоватская Л. А., Граскова И.А. Некрозы как необычные симптомы кольцевой гнили картофеля // Физиология растений. 2002. Т.49 №5, с.773-778.

5. Ломоватская Л. А., Романенко А.С., Криволапова Н.В. Связывание экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили картофеля плазмалеммой клеток растения-хозяина с разной устойчивостью к данному патогену // Биологические мембраны. 2002. Т.19, №2, с.179-182.

6. A.S. Romanenko, L. A. Lomovatskaya, T.N. Shafikova, G.B. Borovskii, N.V. Krivolapova. Potato Cell Membrane Reseptors to Ring Rot Pathogen Extracellular Polysaccharides // J. Phytopathology. 2003. 151, N1, p.1-6.

7. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н., Саляев Р.К. Возможная роль эндогенного цАМФ картофеля в развитии системного сигнала при патогенезе кольцевой гнили // ДАН. 2004. Т. 394. № 5, с. 715-717.

8. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В. Упрощенный метод определения цАМФ в растениях с помощью модифицированного иммуноферментного анализа // Известия РАН. Серия биол. , 2005, № 6, с.1-4.

9. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н., Саляев Р.К. Активность трансмембранной и «растворимой» форм аденилатциклазы в клеточных органеллах растений картофеля при бактериальном патогенезе // ДАН. 2006. № 4. Т. 409. С. 570-573.

10. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н., Саляев Р.К. Системная активация аденилатциклазы, лолокализованной в плазмалемме клеток картофеля при бактериальном патогенезе // ДАН. 2007. Т. 413. №3. С.420-423.

11. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н. Функционирование «растворимой» и связанной с мембраной форм аденилатциклазы в органеллах растительных клеток при биотическом стрессе // Биологические мембраны. 2007. Т. 24, №5. С. 363-371.

12. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Филинова Н.В., Копытчук В.Н., Саляев Р.К. Выявление «растворимой» аденилатциклазы в растениях картофеля // ДАН. 2008. Т. 420. № 3. С. 412-414.

13. L. A. Lomovatskaya, A.S. Romanenko, N.V. Filinova. Plant adenylate cyclases (minireview) // J. Recept. Signal Transduct. Res. 2008. V. 28. is. 6. P. 531-542.

Рецензируемые журналы

14. Romanenko A.S., Lomovatskaya L. A., Krivolapova N.V. Identification of potato cells plasma membrane reseptors to ring rot pathogen extra-cellular polysaccharides // Academic Open Internet Journal. 2002. V.7. part 2. Р.1 - 6.

15. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В. Количественное определение цАМФ в растениях модифицированным методом иммуноферментного анализа // Вестник Харьковского национального аграрного университета, серия биология. 2004. вып.1. С.129-135.

16. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н.. Участие цАМФ клеток картофеля в передаче системного сигнала при патогенезе кольцевой гнили // Физиология и биохимия культ. раст., 2005., Т.37. №2. С. 126-131.

17. Шафикова Т.Н., Романенко А.С., Ломоватская Л.А., Криволапова Н. В., Боровский Г.Б. Взаимодействие экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили с рецепторами плазматической мембраны клток картофеля // Физиология и биохимия культ. раст. 2005. Т. 37. № 2. С. 166-172.

18. L. A. Lomovatskaya, A.S.Romanenko, N.V. Krivolapova, V. N. Kopytchuk.

Partisipation of potato cells cAMP in the transfer of systemic signal in ring rot pathogenesis // Academic Open Internet Journal. 2005. V.15, part 2. Р.1-7.

19. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н.

Влияние биотического стресса на активность различных форм аденилатциклазы в органеллах клеток растений картофеля // Журнал стрессовой физиологии и биохимии. 2006. Т.2. № 2. С.7-13.

Тезисы и материалы конференций:

20. А.С.Романенко, Л.А. Ломоватская, И.А. Граскова. Вирулентность, мукоидность и способность к сорбции возбудителя кольцевой гнили картофеля. //Тезисы докладов 4 съезда Общества физиологов растений России, Москва, 4-9 октября 1999г.

21. А.С.Романенко, Л.А. Ломоватская, И.А. Граскова. Возбудитель кольцевой гнили вызывает у картофеля нехарактерные симптомы заболевания// Там же.

22. L. A. Lomovatskaya, A.S.Romanenko. Different binding of Clavibacter michiganensis sp. sepedonicus extracellular polysaccharides in the plasma membrane of cell potato cultivars with contrasting resistance to this pathogen // International Symposium «Signaling sistems of plant cells» Moscow. Russia 2001.

23. L. A. Lomovatskaya, A.S.Romanenko. Apoptosis as possible defense reaction of potato plant cells at ring rot pathogenesis// ELSO Meetings. 2002. poster abstracts.

24. Ломоватская Л.А., А.С. Романенко, Н.В. Криволапова. Влияние экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили картофеля на содержание цАМФ в суспензионных клетках сортов картофеля, контрастных по устойчивости к данному патогену// Тезисы докладов 5 съезда Общества физиологов растений России, Пенза, 15-21 сентября 2003 г.С.182.

25. Ломоватская Л.А., А.С. Романенко, Н.В. Криволапова, В.Н. Копытчук.

Влияние экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили на динамику цАМФ в растениях сортов картофеля, контрастных по устойчивости к данному патогену // Материалы Всероссийской научной конференции “Стрессовые белки растений”, Иркутск, 2004 г.

26. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Филинова Н.В., Копытчук В.Н. Функционирование «растворимой» и связанной с мембраной форм аденилатциклазы в органеллах растительных клеток при биотическом стрессе // Тезисы докладов международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Сыктывкар, 2007. С. 238.

27. Ломоватская Л.А., А.С. Романенко, Н.В. Криволапова, В.Н. Копытчук.

Эндогенный цАМФ клеток картофеля может участвовать в развитии системного сигнала при патогенезе кольцевой гнили // Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию Иркутского НИИСХ

«Роль сельскохозяйственной науки в развитии АПК Приангарья», 2007, г. Иркутск. С.144-147.

28. А.С. Романенко, Ломоватская Л.А., Н.В.Филинова. Различные формы аденилатциклазы растений: внутриклеточная трансдукция сигнала при биотическом и абиотическом стрессах // Материалы Всероссийской конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2007.

29. Ломоватская Л.А., А.С. Романенко, Н.В. Филинова В.Н. Копытчук. Системная активация аденилатциклазы, локализованной в плазмалемме клеток картофеля при бактериальном патогенезе // Там же.

30. Н.В. Филинова, Ломоватская Л.А., А.С. Романенко, В.Н. Копытчук Участие «растворимой» и трансмембранной форм аденилатциклазы органелл клеток картофеля в сигналинге при бактериальном патогенезе // Там же.

Размещено на Allbest.ru