59

Размещено на http://www.allbest.ru/

Генетическое разнообразие и эволюция Mycobacterium Tuberculosis

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Мокроусов Игорь Владиславович

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Вишневский Борис Израилевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессорЗаикина Надежда Александровна

доктор медицинских наук, профессор Бойцов Алексей Геннадьевич

доктор биологических наук Дмитриев Александр Валентинович

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации

Защита состоится "______"__________ 2009 года в _____ часов на заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д.12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН.

Автореферат разослан "_______"____________________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Бурова Л.А.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

В настоящее время, туберкулез (ТБ), эпидемически распространенный во многих регионах мира, относят к "вновь вернувшимся заболеваниям". По оценке ВОЗ, треть населения Земли инфицирована Mycobacterium tuberculosis; общее количество заболевших и умерших от туберкулеза в 2006 г. составило 9,2 млн и 1,7 млн человек, соответственно (WHO, 2008). M. tuberculosis может адаптироваться к воздействию факторов иммунного ответа организма хозяина и селективному давлению антибиотиков посредством точечных мутаций. Последнее десятилетие прошлого века было отмечено появлением и началом широкого распространения лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя туберкулеза во многих странах мира, включая Россию.

Применение методов сполиготипирования, IS6110-RFLP - и MIRU-VNTR-анализа для эпидемиологического типирования штаммов M. tuberculosis позволило определить семейства родственных штаммов и создать компьютерные базы данных, содержащие информацию о генотипических профилях штаммов (Brudey et al., 2006). Наличие доступных, обновляющихся и представительных баз данных имеет также исключительное значение и для разработки стандартизованной терминологии для обозначения циркулирующих вариантов (генотипов) возбудителя туберкулеза.

Среди генетических линий/семейств, выделяемых внутри вида M. tuberculosis, генотип Beijing характеризуется в целом генетической однородностью и широким географическим распространением (Bifani et al., 2002; Glynn et al., 2002), что может свидетельствовать о его недавней глобальной диссеминации. В настоящее время, этот генотип привлекает внимание и с клинической точки зрения, поскольку штаммы Beijing демонстрируют повышенную вирулентность (Вишневский и др., 2003; Lopez et al., 2003), ассоциацию с лекарственной устойчивостью (Нарвская, 2003) и высокую трансмиссивность (Caminero et al., 2001; Narvskaya et al., 2002). Клональная популяционная структура и однонаправленность эволюции M. tuberculosis как вида в целом делают возможным частный анализ его отдельных филогенетических линий как редуцированной модели вида.

В этой связи, изучение особенностей генетического разнообразия и эволюционного процесса M. tuberculosis генотипа Beijing, генетических механизмов развития лекарственной устойчивости M. tuberculosis и поиск новых информативных маркеров для молекулярной эпидемиологии туберкулеза, является чрезвычайно актуальным и своевременным.

Цель исследования: Изучить микро- и макроэволюционные изменения в геноме и разработать методологические подходы для мониторинга циркулирующих штаммов M. tuberculosis.

Задачи работы:

1. Провести анализ филогенетически значимых фрагментов генома M. tuberculosis генотипа Beijing.

2. Осуществить филогеографический анализ, провести реконструкцию происхождения и путей распространения циркулирующих вариантов M. tuberculosis генотипа Beijing

3. Изучить генетические основы развития лекарственной устойчивости как формы микроэволюции M. tuberculosis.

4. Разработать методологические подходы на основе информативных молекулярных маркеров для эффективного мониторинга и диагностики лекарственной устойчивости циркулирующих штаммов M. tuberculosis.

Научная новизна

Впервые в мире проведена компьютерная реконструкция происхождения и исторических путей глобальной диссеминации штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing.

Разработана концепция существования древних и современных линий генотипа Beijing.

mycobacterium tuberculosis штамм эпидемиологический

Впервые на основе компьютерного моделирования эволюции локусов VNTR показан ускоренный характер роста субпопуляции клонального варианта В0/Beijing в России.

Предложена переоценка роли мутаций в embB306 как маркера устойчивости к этамбутолу. Выдвинута гипотеза о дополнительном механизме устойчивости к этамбутолу M. tuberculosis, не связанном с изменениями в гене арбинозилтрансферазы embB.

Практическая значимость исследования

Созданная и обновляемая глобальная база данных по 11 локусам VNTR штаммов M. tuberculosis Beijing (1853 штамма на 30.06.2009) эффективно применяется для филогенетических исследований и эпидемиологического мониторинга циркуляции штаммов этого генотипа.

Разработан способ быстрой детекции штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing, его основных филогенетических линий и клонального варианта В0/Beijing на основе использования инвертированной IS6110-ПЦР и VNTR типирования.

Разработана минимальная схема на основе семи локусов VNTR для первичного скринингового типирования штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing, циркулирующих в России.

Показана высокая информативность сочетанного применения методов IS6110-RFLP и VNTR типирования для дифференциации штаммов M. tuberculosis при эпидемиологических исследованиях.

Предложен способ определения генетического расстояния между географическими популяциями клональных видов бактерий.

Разработан способ экспрессного определения основных мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину и изониазиду, в генах rpoB (кодоны 516, 526, 531) и katG315 на основе методологии мультиплексной аллель-специфической ПЦР.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Генетическое разнообразие M. tuberculosis сформировалось в результате миграций населения. Генотип Beijing M. tuberculosis возник на территории северного Китая более 2000 лет назад; его проникновение в другие регионы мира было опосредовано миграциями из Юго-Восточной Азии.

2. Генотип Beijing M. tuberculosis включает две крупные филогенетические линии - "древнюю" и "современную" - с различной структурой генома и эволюционным потенциалом. Быстрая детекция этих линий возможна на основе инвертированной IS6110-ПЦР.

3. Вариант Beijing/В0, выявляемый в 25% российских штаммов генотипа Beijing, является "успешным" вариантом, для которого характерен существенно более быстрый популяционный рост в сравнении с общей популяцией Beijing в России.

4. Первичное скрининговое типирование штаммов Beijing в России возможно на основе анализа семи локусов VNTR. Использование методов IS6110-RFLP и VNTR необходимо для детального генотипирования M. tuberculosis.

5. Разработанный метод мультиплексной аллель-специфической ПЦР для анализа основных мутаций резистентности в генах rpoB и katG эффективен для выявления большинства штаммов M. tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду. Наличие мутации в embB306 недостаточно для развития устойчивости M. tuberculosis к этамбутолу.

Апробация работы

Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на российских и международных семинарах, конгрессах и конференциях в 2001-2009 гг.: 3^rd International Conference “Infectious diseases in the Barents region” (Архангельск, Россия, 09.2001); Meeting of IAEA Multicenter Project (Дели, Индия, 03.2001); Meeting of Mycobacteria and Tuberculosis Study Group of Pasteur Institutes (Алжир, Алжир, 02.2001); International Conference “Tuberculosis: old problem in new millennium” (Новосибирск, Россия, 07.2002); 4^th Nordic Baltic Congress on Infectious Diseases (С. - Петербург, Россия, 05.2002); 12^th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Милан, Италия, 04.2002); 4^th International Conference “Infectious diseases in the Barents region” (Петрозаводск, Россия, 2003); 24^th Congress of European Society of Mycobacteriology (Тарту, Эстония, 07.2003); Annual Scientific Symposium of the International Network of Pasteur Institutes (Тегеран, Иран, 17-19.11.2004); 10^th International Workshop on virus evolution and molecular epidemiology (Хельсинки, Финляндия, 30.08. - 05.09.2004); 25^th Congress of European Society of Mycobacteriology (Альгеро, Италия, 27-30.06.2004); Meeting of Mycobacteria and Tuberculosis Study Group of Pasteur Institutes (Париж, Франция, 16-18.02.2004); VI Всероссийский конгресс по молекулярной диагностике (Москва, 28-30.11.2007).30^th Congress of European Society of Mycobacteriology (Порту, Португалия, 5-8.07.2009).

По теме диссертации опубликовано 54 статьи в рекомендованных ВАК РФ журналах и 5 глав в трех монографиях.

Внедрение результатов исследования в практику

На основе результатов работы подготовлены следующие документы:

1. Патент на изобретение №2287586 (Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Нарвская О.В., Вишневский Б.И., Способ экспрессного определения устойчивости к рифампицину у микобактерий туберкулеза). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20.11.2006. Приоритет: 27.05.2003.

2. Патент на изобретение №2339040 (Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Нарвская О.В., Вишневский Б.И., Способ экспрессного определения устойчивости к изониазиду у микобактерий туберкулеза). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20.11.2008. Приоритет: 08.02.2006.

3. Заявка на патент (Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф., Вязовая А.А., Вишневский Б.И., Нарвская О.В. Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа Beijing). Рег. №2008118836, приоритет от 12.05.2008

Результаты исследований внедрены в практическую деятельность ФГУ "Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии Росмедтехнологий".

Личное участие автора в получении результатов

Основные результаты получены лично автором. Выделение штаммов и определение их чувствительности к противотуберкулезным препаратам было проведено в ФГУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" в лаборатории микробиологии туберкулеза при участии д. м. н. профессора Б.И. Вишневского, д. м. н. Т.Ф. Оттен и к. б. н. О.А. Маничевой. Молекулярно-генетические исследования, компьютерный и статистический анализ данных были проведены автором в лаборатории молекулярной микробиологии ФГУН "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 228 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, 3 главы результатов собственных исследований, обсуждение результатов), выводов и приложения. Иллюстративный материал включает 14 таблиц и 48 рисунков. Список литературы содержит 349 наименований, из них 31 отечественный и 318 иностранных источников.

Содержание работы

Материалы и методы

В работе были использованы препараты ДНК штаммов M. tuberculosis, выделенных в лаборатории микробиологии туберкулеза Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии в основном от постоянных жителей Северо-Запада РФ. В исследование были также включены ДНК штаммов M. tuberculosis, выделенных в Китае (n=122 [Пульмонологическая больница Пекина]), Вьетнаме (n=117 [Национальный институт гигиены и эпидемиологии, Ханой]), Болгарии (n=133 [Институт микробиологии БАН, София]), Белоруссии (n=165 [Витебский государственный медицинский университет]), Казахстане (n=144 [Национальный медицинский университет им. Асфендиярова, Алматы]), и Киргизии (n=56 [Институт молекулярной генетики и медицины, Бишкек]). Все штаммы, включенные в исследование, были выделены от взрослых (возраст более 15 лет), эпидемиологически несвязанных больных туберкулезом легких.

Определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам проводили методом абсолютных концентраций согласно приказу Минздрава РФ № 109 от 21 марта 2003 г.

Определение мутаций устойчивости к ПТП проводили с использованием методов мультиплексной аллель-специфической ПЦР (МАС-ПЦР (гены rpoB [кодоны 516, 526, 531], katG315, embB306) и ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктаз MspI (katG315) и NlaIII / HaeIII (embB306) (Табл.1)

Таблица 1. Последовательности праймеров, сконструированных в данной работе и использованных для анализа генов резистентности.

Ген	Праймер, зонд	Последовательность (5'-)
katG	katG1F	AGCTCGTATGGCACCGGAAC
	katG4RB	AACGGGTCCGGGATGGTG
	katg0F	GCAGATGGGGCTGATCTACG
	katg4R	AACGGGTCCGGGATGGTG
	katg5R	ATACGACCTCGATGCCGC
rpoB	ROF	GTCGCCGCGATCAAGGA
	RIR	TGACCCGCGCGTACAC
	R516B	GCTGAGCCAATTCATGGA
	R526B	GTCGGGGTTGACCCA
	R531B	ACAAGCGCCGACTGTC
embB	EmbF	ATTCGGCTTCCTGCTCTGG
	EmbR	GAACCAGCGGAAATAGTTGG
	Emb1F	GGGCGGGGCTCAATTGCC
	Emb2R	GCGCATCCACAGACTGGCGTC
	Emb306A	GACGACGGCTACATCCTGGGCA
	Emb306B	GGTCGGCGACTCGGGCC

Геномная дактилоскопия штаммов M. tuberculosis.

Сполиготипирование было использовано для анализа полиморфизма DR-локуса (наличие или отсутствие 43 спейсеров) по Kamerbeek et al. (1997). Профили сполиготипирования сравнивали с международной базой сполиготипов SpolDB4 (Brudey et al., 2006).

Анализ дополнительных 25 спейсеров локуса DR проводили по Sebban et al. (2002). Для "право-левого" сполиготипирования (left-right (L-R) spoligotyping (Filliol et al., 2000)) использовали праймеры Ris1, Ris2 и DRa. Продукты ПЦР гибридизовали по стандартной технологии сполиготипирования с мембранами, содержащими 43 и 25 спейсерные пробы. Это позволило выявить специфические участки в DR локусе (повторы или спейсеры), содержащие элемент IS6110 и определить его положение относительно локуса DR.

IS6110-RFLP-типирование проводили по van Embden et al. (1993). Профили обрабатывали пакетами GelCompar 4.1 (Applied Maths, Бельгия) и Taxotron (Grimont, 2003) для построения дендрограмм по алгоритму UPGMA.

Анализ 27 локусов VNTR - 24 локусов Supply et al. (2006) и 3 гипервариабельных локусов Iwamoto et al. (2007) - проводили, как описано ранее. Пакеты PAUP 4.0 (Swofford, 2003) и PHYLIP 3.6 (Felsenstein, 2004) были использованы для построения наиболее парсимонной дендрограммы и минимально охватывающего дерева, соответственно; при этом аллели локусов VNTR рассматривали как дискретные переменные. Подход на основе статистики Байеса был использован для датировки времени коалесценции аллелей VNTR как описано ранее (Wirth et al., 2008) с использованием программ MSVAR (Baumont, 1999) и Tracer 1.4.1 (Rambaut, Drummond, 2008). Анализ каждой популяции включал проведение 5 независимых симуляций Монте-Карло на основе 20000 шагов цепи Маркова.

Инвертированную IS6110-ПЦР проводили с использованием праймеров Ris1 и Ris2 (Ross, Dwyer, 1993), расположенных на 3' - и 5'-концах элемента IS6110 и амплифицирующих фрагменты между близкорасположенными (до 2 тпн) копиями IS6110.

Для рестрикционного анализа элемента IS1547 и возможных инсерций в нем IS6110 проводили ПЦР с различными комбинациями праймеров на последовательности IS6110 и IS1547. Для рестрикционного анализа продуктов ПЦР и картирования их сайтов узнавания использовали рестриктазы AluI, RsaI, PvuII, PstI и MboII.

Гибридизационный анализ по Саузерну профилей IS1547-RFLP был проведен с использованием фрагмента длиной 1,32 тпн, включающего весь элемент IS1547, и системы ECL для мечения и детекции нуклеиновых кислот (Amersham Pharmacia Biotech) с использованием тех же блотов, содержащих тотальную ДНК, обработанную PvuII, и использовавшихся для анализа IS6110-RFLP.

ПЦР-анализ длины гена Rv3135 и наличия и количества инсерций IS6110 в локусе NTF проводили как описано ранее (Musser et al., 2000, Vera-Cabrera et al., 2001, Plikaytis et al., 1994).

Сбор данных по VNTR локусам и создание глобальной базы данных VNTR штаммов Beijing. Поиск опубликованных данных по 11 локусам MIRU-VNTR ## 2, 4, 10, 16, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40 (Supply et al., 2001) штаммов Beijing выявил 1302 штамма База данных постоянно обновляется и 30 мая 2009 г. включала профили 1853 штаммов., включая и штаммы генотипированные в нашей лаборатории. Профили из 11 цифр (соответствующих 11 локусам MIRU-VNTR) были внесены в файл Excel и, после автоматической сортировки, штаммы были разделены на типы с уникальными профилями. Популяции и суб-популяции, включенные в анализ, представляли Россию, Китай, Сингапур, Вьетнам, Японию, Бангладеш, Южную Африку и Австралию.

Индекс Хантера-Гастона (Hunter-Gaston Index, HGI) был использован для оценки генетического разнообразия (Hunter, Gaston, 1988). Тест 2x2 ч² был использован для оценки значимых различий между двумя группами штаммов; значения ч² с корректировкой по Ятсу, p и соотношение шансов OR рассчитывали с 95% доверительным интервалом с помощью программы EpiCalc 2000 1.02 (Gilman, Myatt, 1998).

Расчет наблюдаемого расстояния OD (observed distance) между географическими популяциями проводили по предложенной нами фоомуле:

,

где N есть общее число вариантов (типов), выявляемых в объединенной коллекции популяций А и B, A_i и B_i - частоты i-того типа в этих популяциях. Полученную матрицу генетических расстояний между географическими популяциями M. tuberculosis Beijing, рассчитанную на основании частот встречаемости их VNTR-типов, применили для многомерного масштабирования с использованием программы PROXSCAL пакета SPSS 11.5 для Windows (SPSS, Чикаго, США).

Поиск информации об исторических связях между странами и регионами, включенными в данное исследование, проводили с использованием Интернет-ресурсов и поисковых систем Google (http://www.google.com/), Entrez Pubmed (http://www.ncbi. nlm. nih.gov/sites/entrez) и History Cooperative (http://www.historyco operative.org/).

Результаты и обсуждение

АНАЛИЗ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ IS - И PPE-ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Более 1130 штаммов M. tuberculosis, выделенных в Санкт-Петербургском НИИ фтизиопульмунологии, было изучено методами IS6110-RFLP и сполиготипирования в лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ имени Пастера в 1996-2007 гг. Эта коллекция ДНК (профилей генотипирования) послужила для формирования выборок, соответствующих задачам исследования.

Около половины (52%) всех изученных штаммов принадлежали к генетическому семейству Beijing и имели характерный профиль сполиготипирования из девяти (с 35 по 43) сигналов гибридизации (Рис.1). Профили IS6110-RFLP большинства (~95%) из этих штаммов имели от 14 до 19 фрагментов и были близкородственны (более 85% сходства). Визуально эти профили были сходны с опубликованными профилями штаммов Beijing из Восточной Азии и других регионов мира (Bifani et al., 2002). Мы определили эти штаммы как "типичные" штаммы Beijing (Рис.1). Пять процентов штаммов имели сполиготип, характерный для семейства Beijing, но профили IS6110-RFLP с меньшим количеством фрагментов, и сходные только на 60-70% (Рис.1). Мы определили эти штаммы как "атипичные" штаммы Beijing. В дальнейшее углубленное исследование были включены 4 атипичных (2 основных профиля) и 24 типичных (12 разнообразных профилей) штамма Beijing.

Рис.1. Дендрограмма профилей IS6110-RFLP M. tuberculosis и примеры сполигопрофилей Beijing, H37Rv и BCG.

Для получения целостного представления о структуре локуса DR штаммов, помимо стандартного набора из 43 спейсеров, мы провели анализ 25 "новых" спейсеров (van Embden et al., 2000), который выявил наличие 6 "новых" спейсеров (№№ 48, 49, 50, 66, 67, 68) у всех штаммов Beijing (Рис.2). Применение "право-левого" сполиготипирования выявило upstream-расположенную инвертированную копию элемента IS6110 у всех штаммов (Рис.2). Не исключено, что присутствие этой копии IS6110 может быть связано с рекомбинационными событиями, приведшими к делетированию большинства спейсеров в локусе DR генотипа Beijing.

Рис.2. Структура локуса DR большинства штаммов Beijing.

Для оценки родства репрезентативных штаммов семейства Beijing был проведен филогенетический анализ на основе сравнения их профилей гибридизации IS6110-RFLP. Профили были визуально сравнены и переведены в бинарный формат для расчета матрицы расстояний и ее анализа. Применение алгоритмов Neighbor-Joining (NJ) (Рис.3) и максимального правдоподобия (Quartet-Puzzling) дало сходные результаты и показало, что оба атипичных профиля имели наибольшую длину ветвей.

Рис.3. Дендрограмма репрезентативных профилей IS6110-RFLP штаммов Beijing, построенная с использованием алгоритма NJ. Жирным шрифтом выделены атипичные штаммы.

Дальнейший анализ потенциально полиморфных локусов IS1547 (Fang et al., 2001) и Rv3135 (Musser et al., 2000) имел целью оценить их пригодность для межштаммовой дифференциации внутри генотипа Beijing.

ПЦР, рестрикционный и гибридизационный анализ наличия и взаиморасположения копий элементов IS6110 и IS1547 показал, что большинство штаммов Beijing (типичные профили IS6110-RFLP) содержат две копии элемента IS1547 (локусы iplA и iplB), одна из которых (iplB) разделена вставкой IS6110, а другая (iplA) остается интактной (Рис.4b). При этом IS1547/iplA был единственным интактным локусом у атипичных штаммов Beijing (Рис.4а), которые, очевидно, представляют более древнюю ветвь семейства Beijing. Дупликация первоначальной копии IS1547/iplA могла представлять единое и уникальное событие во всех линиях M. tuberculosis или только в предшественнике генотипа Beijing и, учитывая что оба локуса iplA и iplB расположены в 1 и 4 квадрантах хромосомы рядом с oriC (Рис.4), могла произойти в результате X-инверсии вокруг oriC (Eisen et al., 2000).

Рис.4. Схематическое положение локусов IS1547 (iplA, iplB) у атипичных (a) и типичных (b) штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing.

Анализ полиморфизма гена Rv3135-PPE.

ПЦР-анализ гена Rv3135-PPE, выявил два варианта длины данного гена - 1.02 тпн у типичных и 1.97 тпн у атипичных штаммов Beijing. Штамм H37Rv, использованный в качестве контроля, имел фрагмент ПЦР ожидаемого размера (0.63 тпн). Тридцать штаммов других генотипов, относящихся к 2 или 3 генетическим группам, имели фрагменты длиной от 0.31 до 0.63 тпн. В отличие от некоторых изученных геномных локусов, чей полиморфизм существенно или частично связан с мобильным элементом IS6110 (IS1547, mtp40, DR-локус), полиморфизм гена Rv3135 обусловлен другими механизмами. Этот ген относится к семейству, кодирующему протеины PPE (Pro-Pro-Glu), имеющие отношение к антигенной вариабельности M. tuberculosis (Cole et al., 1998).68 генов этого семейства рассеяны по хромосоме штамма H37Rv и содержат как консервативные, так и вариабельные участки. Ранее Мюссер и соавт. (2000) предположили, что каждый выявленный вариант Rv3135 связан с другими вариантами путем редкой однонаправленной делеции, и таким образом, вариант 1,02 тпн наиболее вероятно произошел из предкового варианта 1,97 тпн. Поскольку оба выявленных нами аллеля являются наибольшими по размеру вариантами, мы полагаем, что все российские штаммы Beijing являются эволюционно достаточно "старыми". Также эти данные указывают на то, что атипичные штаммы представляют эволюционно наиболее древнюю ветвь и предшествовали типичным штаммам Beijing, с которыми они имели общего предка.

Анализ локуса NTF

Локус NTF является филогенетическим маркером, специфическим для семейства Beijing. Выделяют три варианта штаммов Beijing в зависимости от наличия и количества инсерций IS6110 в этом локусе (Рис.5). Клональная популяционная структура вида M. tuberculosis определяет однонаправленный эволюционный сценарий локуса NTF Beijing при котором интактный локус является наиболее древним вариантом. Проведенный нами анализ установил, что атипичные штаммы имели интактный локус NTF и, таким образом, относились к древней ветви внутри генотипа Beijing. Типичные штаммы содержали одну прямую инсерцию IS6110 в правом плече локуса NTF и относились к современной линии генотипа Beijing, определенной нами как вариант NTF:: IS6110.

Рис. 5. Схема и эволюционный сценарий локуса NTF штаммов Beijing M. tuberculosis (на основе обобщения данных Plikaytis et al., 1994; Kurepina et al., 1998). Треугольники и тонкие стрелки показывают инсерции IS6110 и их ориентацию.

Генотипирование штаммов M. tuberculosis, выделенных в Пекине, Китай.

Генотип Beijing был впервые идентифицирован в штаммах, выделенных в регионе Пекина (англ. Beijing). В этой связи, мы дополнительно включили в наше исследование выборку ДНК 123 штаммов M. tuberculosis, выделенных в Пекине в 2003-2005 гг. Эти штаммы включали 40 чувствительных и 83 лекарственно-устойчивых штамма, большинство из которых (n=56) были мультирезистентными.

Все штаммы были подвергнуты сполиготипированию, которое разделило их на 14 сполиготипов. Сравнение с международной базой данных SpolDB4 (Brudey et al., 2006) позволило отнести большинство штаммов к известным типам и (под) семействам. Наибольший кластер включал штаммы с полным профилем Beijing из девяти сигналов с 35 по 43. Кроме того, 8 штаммов (6 типов) представляли усеченные производные генотипа Beijing, в которых отсутствовали отдельные спейсеры; по принятой классификации (Brudey et al., 2006) эти профили были определены как Beijing-подобные. Таким образом, 113 (91,9%) из 123 китайских штаммов принадлежали к генотипам семейства Beijing. Интересно отметить, что в 1992-1994 гг. штаммы Beijing также преобладали (89.4%) в пекинской популяции M. tuberculosis (van Soolingen et al., 1995).

Дальнейшее разделение 113 китайских штаммов Beijing на типичные и атипичные (современные и древние, соответственно) было проведено путем анализа локуса NTF. Этот анализ выявил, что 27 (24%) штаммов имели интактный участок NTF и относились к древней линии внутри генотипа Beijing, в то время как 86 штаммов имели прямую инсерцию IS6110 в правом плече локуса NTF и относились к современной линии генотипа Beijing. Данные по лекарственной устойчивости изученных китайских штаммов в целом и в зависимости от генотипа/линии приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Устойчивость к отдельным препаратам китайских штаммов M. tuberculosis древней и современной линий внутри генотипа Beijing.

Лекарственная устойчивость *	Штаммы древней линии генотипа Beijing (n=27), количество и %	Штаммы современной линии генотипа Beijing (n=86), количество и %	p	OR, 95% CI
S (1944)	9 (33,3)	32 (37,2)	0,7	0,84 [0,34; 2,10]
H (1952)	17 (63,0)	47 (54,7)	0,5	1,41 [0,58; 3,43]
R (1970)	21 (77,8)	47 (54,7)	0,03	2,90 [1,07; 7,91]
E (1960)		9 (10,5)
Z (1980)	6 (22,2)	8 (9,3)	0,08	2,79 [0,87; 8,91]
Устойчивость к любому препарату	21 (77,8)	56 (65,1)	0,2	1,88 [0,68; 5,15]
MDR	17 (63,0)	38 (44,2)	0,09	2,15 [0,88; 5,23]

* В скобках - год начала применения препарата для противотуберкулезной химиотерапии (Iseman, 2002). S, стрептомицин, H, изониазид, R, рифампицин, E, этамбутол, Z, пиразинамид. MDR, устойчивость к по крайней мере рифампицину и изониазиду.

Древние и современные штаммы Beijing: концепция, эволюция и диагностика

Суммируя вышеизложенное, применение нескольких независимых генетических маркеров позволило разделить изученные российские штаммы Beijing на две неравные группы. Первая (95%, "типичные" штаммы) характеризовалась сходными многофрагментными профилями IS6110-RFLP, наличием гена Rv3135 длиной 1,02 тпн и двух копий IS1547 (iplA и iplB, вторая из которых содержала инсерцию IS6110). Вторая группа (5%, "атипичные" штаммы) характеризовалась профилями IS6110-RFLP с меньшим количеством фрагментов, наличием Rv3135 длиной 1,97 тпн и одной интактной копией IS1547 (iplA). По нашему мнению, все атипичные штаммы имели общего предка с типичными штаммами, но являются эволюционно более древними, что также иллюстрируется NJ-филограммой на основе анализа профилей IS6110-RFLP (Рис.3). Сравнение полученных результатов анализа инсерций IS1547 и гена Rv3135 с результатами анализа локуса NTF показало, что атипичные штаммы имели интактный локсус NTF, в то время как вариант NTF: IS6110 был характерен для типичных штаммов. Доминирующие типичные штаммы Beijing, которые мы предлагаем называть современными, вероятно имеют монофилетическое происхождение, а их широкое распространение началось исторически сравнительно недавно, т.к. эти штаммы различаются по быстро меняющимся профилям IS6110-RFLP, но имеют идентичную структуру других полиморфных, но более консервативных локусов.

Древние штаммы составляют слишком малую долю в российской популяции Beijing (5%) для достижения статистической значимости при их сравнении с современной группой. В то же время анализ китайских штаммов Beijing, среди которых доля древних штаммов была более заметна (24%), выявил интересные тенденции их различия и не только по нейтральным локусам генома (например, NTF).

Сравнение профилей лекарственной устойчивости китайских штаммов Beijing выявило, что устойчивость к рифампицину и пиразинамиду, а также профили устойчивости MDR и HRZ были ассоциированы с древней группой Beijing (Табл.2). В случае изониазида эта ассоциация была статистически незначима, в то время как устойчивость к стрептомицину была очень слабо связана с современной группой. Похожие наблюдения о связи с мультирезистентностью и устойчивостью к стрептомицину и изониазиду были сделаны Кремер и соавт. на штаммах Beijing, выделенных в Гонконге и Вьетнаме (Kremer et al., 2009). Противотуберкулезная химиотерапия была введена в медицинскую практику только 60 лет назад (Iseman, 2002), и до этого ни древние, ни современные штаммы Beijing не подвергались селективному давлению антибиотиков. Сравнение с порядком начала использования отдельных препаратов для лечения туберкулеза (Iseman, 2002) и значений P, отражающих статистическую значимость, выявило интересную полуколичественную тенденцию: устойчивость к исторически недавно введенным в противотуберкулезную терапию препаратам (рифампицину и пиразинамиду) была ассоциирована с древними штаммами, причем особенно заметно - с самым недавним (пиразинамидом). С другой стороны, это различие между древними и современными штаммами сглажено или даже обращено для более "старых" изониазида и стрептомицина, соответственно (Табл.2).

Cреди российских штаммов Beijing древние штаммы составили 5%. Ранее было показано, что их доля составила 14% в Гонконге и 25% во Вьетнаме (Kremer et al., 2009). Согласно нашей гипотезе, которая обсуждается и развивается ниже, первичное распространение штаммов Beijing имело место в Китае более 2000 лет назад, в то время как проникновение этих штаммов в Северную Евразию было исторически недавним и могло быть связано с расширением Монгольской империи в 13-15 веках. В этой связи, представляется, что соотношение субпопуляций древних/современных штаммов Beijing является характерной чертой, которая отражает древность локальной популяции этого генотипа, присутствующей на конкретной территории, и, в то же время, находится под определенным влиянием исторически недавних мер по борьбе с туберкулезом.

Применение инвертированной IS6110-ПЦР для генотипирования M. tuberculosis и детекции генотипа Beijing выявило, что штаммы Beijing имеют одинаковый профиль из трех (260, 290 и 490 пн - типичные штаммы) или двух (290 и 490 пн - атипичные штаммы) фрагментов (Рис.6). В этой связи, мы оценили этот метод не для дифференциации штаммов, а в качестве альтернативного сполиготипированию метода для простой ПЦР-детекции генотипа Beijing.

Анализ 865 проб ДНК штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных в 1997-2007 гг. в России (N=575), Китае (N=117), Вьетнаме (N=122), Болгарии (N=51) был проведен методами сполиготипирования в качестве "золотого" стандарта идентификации генотипа Beijing и методом инвертированной IS6110-ПЦР (Рис.6). В результате, 408 штаммов было определено как относящиеся к генотипу Beijing. Дополнительно, 61 штамм Beijing был определен как относящийся к атипичным штаммам ("древнему" варианту этого генотипа), при этом результаты анализа локуса NTF и инвертированной IS6110-ПЦР совпали.

Для оценки пригодности предлагаемого метода для быстрого анализа клеточных лизатов с низкой концентрацией ДНК был проведен анализ выборки из 144 клеточных лизатов штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных в Казахстане, и 56 образцов ДНК, выделенных из мокроты больных туберкулезом легких в Киргизии. Для большинства (125 из 144) лизатов и всех 56 проб ДНК из мокроты были получены интерпретабельные ПЦР-профили, из которых 112 было определено как соответствующие генотипу Beijing. Сравнение с последующими результатами сполиготипирования подтвердило результат инвертированной IS6110-ПЦР. Отсутствие амплификации для некоторых лизатов может быть связано с ингибированием ПЦР и/или недостаточным количеством ДНК, поэтому эффективность метода применительно к клеточным лизатам составила 90.8%.



Рис.6. Примеры профилей инвертированной IS6110-ПЦР штаммов M. tuberculosis, выделенных в Китае (a.), Вьетнаме (b.), Болгарии (c.) и России (d.).

Стрелки указывают фрагменты специфичные для штаммов Beijing. Bj - генотип Beijing. * - "древний" вариант генотипа Beijing.

Учитывая клиническую значимость генотипа Beijing, наличие простого метода его детекции насущно необходимо. Сполиготипирование является, по определению, "золотым стандартом" для определения принадлежности штамма к этому генотипу. Простой метод на основе обычной ПЦР - метод инвертированной IS6110-ПЦР, предложенный нами, может служить полезным дополнением к классическим методам генотипирования M. tuberculosis, IS6110-RFLP и сполиготипирования. Дополнительными достоинствами метода являются: возможность выявления древних и современных штаммов Beijing, неограниченность генотипом Beijing и пригодность для первичного скрининга при эпидемиологическом типировании M. tuberculosis. В нашем исследовании метод был апробирован на представительной коллекции штаммов Beijing из основных эндемичных зон этого генотипа - России, Китая и Вьетнама; в дальнейшем было бы интересно его тестирование и на штаммах из вторичных регионов распространения, например, США, Южной Америки и Южной Африки.

M. tuberculosis может адаптироваться к селективному давлению антибиотиков посредством точечных мутаций, возникновение и закрепление которых представляет собой форму микроэволюции генома. Разработка методологии МАС-ПЦР для детекции мутаций устойчивости к основным противотуберкулезным препаратом и анализ распределения этих мутаций в основных филогенетических линиях M. tuberculosis стали еще одним из практических приложений настоящего исследования.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ И ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Разработанный нами метод детекции мутаций устойчивости к ПТП у M. tuberculosis на основе аллель-специфической ПЦР, основан на необходимости точной гомологии праймера по его 3'-концу с ДНК-мишенью для эффективной элонгации полимеразой. Специфический внутренний праймер сконструирован на основе аллеля дикого типа исследуемого кодона: 3'-конец праймера соответствует основанию в котором предполагается наличие мутации. В случае дикого типа аллеля, внутренний алелль-специфический и один из внешних консервативных праймеров амплифицируют специфический индикаторный фрагмент. В случае мутации, аллель-специфический праймер не отжигается и индикаторный фрагмент не амплифицируется, что указывает на резистентный фенотип. Пример использования метода для детекции мутаций в кодоне rpoB531 показан на Рис.7.



Рис.7. Определение мутаций в кодоне rpoB531 методом МАС-ПЦР. Короткие стрелки показывают праймеры, длинные двусторонние стрелки - фрагменты ПЦР. (а) фрагмент гена rpoB (b) гель-электрофорез продуктов МАС-ПЦР; дор.2 - штамм с мутацией в rpoB531.

Анализ мутаций в "горячем участке" rpoB (кодоны 516, 526, 531)

Условия обоих вариантов предлагаемого метода МАС-ПЦР (одношаговый и гнездный) были оптимизированы для достижения максимальной специфичности на 36 образцах ДНК (любезно предоставленных Я. Ван Эмбденом), имевших следующее распределение аллелей rpoB: дикий тип - 13, 531TTG - 7, 531TGG - 2, 516GTC - 4, 516TAC - 3, 516GGC - 1, 522CAG - 1, 526TAC - 2, 526GAC - 3, 526CTC - 1.

Анализ 233 проб ДНК RIF-устойчивых штаммов, выделенных от эпидемиологически несвязанных больных в 1997-2005 гг. (Санкт-Петербург, Ленинградская и Новгородская области), был проведен методом простой одношаговой МАС-ПЦР. Мутации в одном из трех изученных кодонов rpoB 516б 526 или 531 были выявлены у 192 (82,4%) штаммов. Таким образом, метод обеспечивает достаточно высокую чувствительность определения устойчивости МБТ к рифампицину. Анализ методом МАС-ПЦР выявил мутации в rpoB у 2 из 97 RIF-чувствительных штаммов; таким образом, специфичность метода составила 97,9%.

Анализ проб из 27 клеточных лизатов был проведен методом гнездной аллель-специфической ПЦР. Во всех случаях, результаты анализа лизатов и очищенной ДНК из тех же штаммов совпадали.

Анализ мутаций в katG315

Условия разработанного метода МАС-ПЦР были отработаны на 45 штаммах, имевших следующее распределение аллелей katG315: дикий тип (AGC) - 23, ACC - 22, как было установлено ранее методом ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктазы MspI.

Дальнейший анализ 204 ДНК INH-устойчивых штаммов, выделенных от эпидемиологически несвязанных больных в 1997-2005 гг. (Санкт-Петербург, Ленинградская и Новгородская области) выявил мутации в katG315 у 191 (93,6%) штамма.

Анализ проб неочищенной ДНК был проведен на выборке из 25 клеточных лизатов. Во всех случаях результаты МАС-ПЦР анализа katG315 для лизатов и очищенной ДНК тех же штаммов совпадали.

Штамм W, вызвавший эпидемию мультирезистентного туберкулеза в Нью-Йорке в начале 1990-х гг. (Bifani et al., 1999), устойчив к изониазиду вследствие редкой двойной мутации в katG315 AGCACA. Применение метода МАС-ПЦР позволило успешно определить ее наличие в образце ДНК штамма W (любезно предоставленном П. Смоллом, Стэнфордский университет, США), т.к. эта мутация приводит к еще более существенному неспариванию по двум основаниям на 3'-конце праймера.

Можно отметить ряд полезных особенностей разработанных нами методов для анализа генов katG и rpoB. Анализ методом МАС-ПЦР гена rpoB обеспечивает расширенный мутационный анализ кодонов 516 и 526, поскольку, как мы установили, метод выявляет мутации не только во второй позиции этих кодонов (которая точно соответствуют 3'-концу праймеров), но и мутации в первой позиции кодонов, которые находятся в - 1 позиции по отношению к 3'-концу аллель-специфических праймеров. Анализ методом МАС-ПЦР гена katG позволяет определить две наиболее важные мутации устойчивости в этом гене, связанные с устойчивостью к изониазиду. Вариант katG 315-ACC является наиболее частым в мире, особенно в регионах с высоким уровнем циркуляции резистентных штаммов, а вариант 315-ACA характерен для штамма W, вызвавшего эпидемию мультирезистентного туберкулеза в штате Нью-Йорк в 1990-е годы и распространенного в США (Bifani et al., 1999).

Анализ мутаций в embB306

Всего было исследовано 29 штаммов фенотипически устойчивых к этамбутолу, 26 из них были устойчивы к рифампицину и изониазиду, т.е., были мультирезистентными. Было выявлено следующее распределение аллелей embB306: ATG (дикий тип) - 15, BTG - 10, ATH - 4 штамма (согласно вырожденному генетическому коду, B обозначает G, C, или T, а H обозначает A, C, или T). Исходя из опубликованного распределения мутаций в embB306 (Ramaswamy, Musser, 1998; Martin, Portaels, 2007), наиболее вероятно, что ATH представляет ATA (Ile), а BTG - GTG (Val) или CTG (Leu). Наш результат анализа мутаций в embB306 у EMB-устойчивых штаммов в целом не отличался от опубликованных данных (Ramaswamy, Musser, 1998). Неожиданным было выявление мутаций в embB306 в существенном проценте EMB-чувствительных штаммов.

Таблица 3. Распределение аллелей embB306 среди этамбутол-чувствительных штаммов M. tuberculosis с различными профилями резистентности.

Фенотип a embB306 b	Чувствит.	S	H	R	SH	SR	SHR	Всего
ATG-Met (wt)	43	14	1	3	11	5	29	104
BTG-Val/Leu	-	-	-	-	1	-	23	24
ATH-Ile	-	1	1	-	5	-	17	24
Всего	43	15	2	3	17	5	69	154

^a S, стрептомицин, H, изониазид, R, рифампицин. embB306 аллели: wt - дикий тип (wild type).

Анализ выборки 154 EMB-чувствительных штаммов с различными профилями устойчивости к другим препаратам выявил расхождение между результатами генотипического и фенотипического тестов для 47 (30,5%) из 154 штаммов, которые были чувствительны к этамбутолу, но имели мутацию в embB306. Повторение экспериментов подтвердило результаты обоих методов. Более того, это расхождение между результатами фенотипического и генотипического тестов было ограничено только штаммами, устойчивыми к другим препаратам, прежде всего, мультирезистентными штаммами (Табл.3). Так, 35 из 64 EMB-чувствительных штаммов, устойчивых к стрептомицину, рифампицину и изониазиду, имели мутацию в embB306. Напротив, такие мутации не были выявлены ни в одном из 39 полностью чувствительных штаммов. На наш взгляд, впервые обнаруженное нами необычное явление можно объяснить наличием другой мишени для этамбутола в микробной клетке помимо арабинозилтрансферазы EmbB. Не исключено, что комбинированное действие ПТП запускает такой дополнительный механизм чувствительности к этамбутолу, несмотря на возможное возникновение и закрепление мутаций в embB306. Практически, наши результаты показывают ограниченную применимость мутации в embB306 как маркера устойчивости к этамбутолу.

В различных регионах мира отмечена географическая вариабельность распределения специфических мутаций устойчивости. Это определяет необходимость предварительного анализа молекулярной основы лекарственной устойчивости локально циркулирующих штаммов до внедрения молекулярных методов в широкую практику. Метод МАС-ПЦР позволяет осуществить быстрый, эффективный, в т. ч., ретроспективный, анализ больших коллекций ДНК, полученных в предшествующие годы, для оценки мутационных профилей katG315 и rpoB и применимости метода в конкретном регионе. Анализ распределения наиболее часто встречающихся мутаций устойчивости в кодонах katG315 и rpoB531 среди основных генотипов M. tuberculosis выявил их высокую частоту у штаммов генотипа Beijing в сравнении со штаммами других генотипов (для краткости называемых "не-Beijing"). Мутация S315T в гене katG была выявлена у 96,7% INH-устойчивых штаммов Beijing против 89,0%, INH-устойчивых штаммов не-Beijing (OR 3,6; 95% CI 1,0-14,6). Представляется, что выявление только мутации katG S315T позволяет выявить высокую долю INH-устойчивых штаммов, циркулирующих в России.

Мутация в кодоне rpoB531 была выявлена существенно чаще у RIF-устойчивых штаммов Beijing, нежели не-Beijing: 77,3% против 28,0% (OR 8,78; CI 95% 4,82-16,00). Следует отметить, что кодон rpoB531 является наиболее часто мутирующим в любом регионе мира (30-50% RIF-устойчивых штаммов) (van Rie et al., 2001; Marttila et al., 2008), однако обращает на себя внимание столь высокий процент этой мутации среди штаммов Beijing в России, что было показано не только нами, но и в большинстве других исследований (Генерозов и др., 2000; Toungoussova et al., 2002; Lipin et al., 2007).

В целом, в глобальном контексте, штаммы Beijing не представляются неизбежно ассоциированными с мультирезистентностью (Tuyen et al., 2000; Prodinger et al., 2001). В нашем исследовании 25.6% тотально чувствительных штаммов и 40% STR-монорезистентных штаммов принадлежали к генотипу Beijing. В то же время, наши данные показывают, что эти штаммы, циркулирующие в России, высокотрансмиссибельны и мультирезистентны, и чаще, чем другие генотипы, приобретает мутации в наиболее часто мутирующих кодонах генов резистентности katG315 и rpoB531.

Помимо прямого использования для детекции устойчивости, мутации, связанные (rpoB RRDR, katG315) или условно связанные (embB306) с резистентностью, могут служить дополнительными эпидемиологическими маркерами для дискриминации близкородственных, но уже начавших процесс дивергенции штаммов (учитывая более высокую скорость развития устойчивости, чем скорость изменения профилей IS6110-RFLP). Например, штаммы с идентичными профилями IS6110-RFLP, выделенные от эпидемиологически несвязанных больных, могли быть дифференцированы на основе аллельного полиморфизма embB306. Ранее мы и другие исследователи показали пригодность использования таких мутаций в embB306 и rpoB при эпидемиологическом обследовании очагов (Chaves et al., 2000; Narvskaya et al., 2002b).

В отличие от генов резистентности, изменения в локусах VNTR в целом нейтральны, что определяет их пригодность для решения задач филогенетического и эпидемиологического анализа, результаты которого представлены ниже.

ПРИМЕНЕНИЕ ЛОКУСОВ VNTR ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ЭВОЛЮЦИИ M. TUBERCULOSIS.

Оценка нового поколения VNTR маркеров для высокоразрешающего генотипирования

Анализ штаммов с различными профилями IS6110-RFLP. В результате анализа дендрограммы всех профилей IS6110-RFLP штаммов Beijing базы данных лаборатории молекулярной микробиологии СПб НИИЭМ им. Пастера было отобрано 48 репрезентативных профилей (65-95% сходства [Рис.8]). Эти штаммы послужили для оценки дискриминирующей способности VNTR типирования, основанного на анализе отдельных локусов VNTR и их различных комбинаций (Табл.4), при этом метод IS6110-RFLP рассматривали в качестве "золотого стандарта", т.е. наиболее дискриминирующего метода. Всего было оценено 27 локусов VNTR, аллельное разнообразие которых в нашей выборке различалось значительно (Табл.5).

...