Далее мы проанализировали дискриминирующие способности различных комбинаций VNTR локусов с целью найти комбинацию, наиболее дискриминирующую штаммы Beijing, но основанную на ограниченном количестве локусов. Критериями составления комбинаций служили количество аллелей и аллельное разнообразие локусов (Табл.4). В результате, представляется, что комбинация В, состоящая из семи локусов, обеспечивает разумный баланс между ограниченным количеством локусов и достаточно высоким индексом дискриминации, близким к таковому VNTR-схемы 15+3. Следует отметить, что при всех комбинациях включение трех гипервариабельных локусов играло критическую роль (Табл.4).

Рис.8. Дендрограмма UPGMA на основе профилей 27 локусов VNTR 48 штаммов M. tuberculosis Beijing с преимущественно различными профилями IS6110-RFLP. Кластер B0 (B0 и сходные профили RFLP) показан серым фоном. Профили А0 и В0 выделены жирным шрифтом.

Таблица 4. Дискриминирующая сила методов генотипирования российских штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing *

*выборка 48 штаммов с преимущественно различными профилями IS6110-RFLP.

** Форматы из 12 локусов (Supply et al. 2001); 15 и 24 локусов (Supply et al., 2006); три гипервариабельных локуса (Iwamoto et al., 2007). Редуцированная схема A (HGI>0.1): QUB-11b, Mtub21, QUB-26, MIRU26, ETR-A, MIRU40, MIRU31, MIRU20, QUB-3232, VNTR-3820, VNTR-4120. Редуцированная схема B (HGI>0.1, количество аллелей >3): QUB-11b, Mtub21, QUB-26, MIRU26, QUB-3232, VNTR-3820, VNTR-4120. Редуцированная схема C (HGI>0.5 или количество аллелей >3): QUB-26, MIRU26, QUB-3232, VNTR-3820, VNTR-4120.

Сравнение дискриминирующих возможностей 27-VNTR и IS6110-RFLP методов (Рис.8, Табл.4) показало, что IS6110-RFLP метод лучше дифференцировал штаммы, дополнительно разделяя VNTR-кластеры, например, крупный VNTR-кластер, который включал сходные штаммы с характерным двойным фрагментом в верхней части профиля (показано серым фоном на Рис.8). Один из этих штаммов имел профиль В0 (27% в нашей базе данных (Нарвская, 2003)) и в данном исследовании мы определили этот кластер штамма В0 и родственных штаммов как В0-кластер.

Таблица 5. Аллельное разнообразие 27 локусов VNTR российских штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing *

*выборка 48 штаммов с преимущественно различными профилями IS6110-RFLP.

VNTR генотипирование преобладающих IS6110-RFLP кластеров штаммов Beijing

Как было упомянуто выше, два профиля IS6110-RFLP, А0 и В0, были выявлены у значительной доли штаммов Beijing, циркулирующих на северо-западе России (27% и 23% в нашей коллекции) и в целом по стране (Нарвская, 2003, Bifani et al., 2002; Surikova et al., 2005).72 штамма, представляющие эти профили (38 штаммов А0 и 34 штамма В0), были исследованы методом VNTR-типирования, при этом в исследование были включены 17 немономорфных локусов, отобранных на основе анализа выборки 48 штаммов Beijing с различными профилями IS6110-RFLP (см. выше). В целом, VNTR-типирование выявило как внутри-, так и межкластерную дифференциацию. В частности, 34 штамма В0 было разделено на 11 типов; 26 штаммов входили в кластеры, из которых самый крупный кластер включал 22 штамма (HGI=0.585). С другой стороны, штаммы А0, среди которых не было выявлено доминирующего VNTR-кластера, были разделены на 12 типов (33 кластеризованных штамма, HGI=0.860).

Рис.9. Дендрограмма UPGMA профилей 17 локусов VNTR объединенной выборки 120 российских штаммов M. tuberculosis Beijing.

Кластер B0 (B0 и сходные профили RFLP) показан серым фоном. Количество штаммов показано если >1.

Кластерный анализ профилей VNTR 120 штаммов Beijing с идентичными (А0 и В0) и различными профилями IS6110-RFLP, позволил разделить штаммы на 53 генотипа, для оценки степени родства которых была построена дендрограмма на основе 17 локусов (Рис.9). Интересно отметить, что штаммы с профилем А0 были равномерно распределены в различных ветвях VNTR-дендрограммы (Рис.9), что может отражать или повышенную стабильность этого профиля IS6110-RFLP, или конвергентную эволюцию IS6110. В отличие от профиля А0, 44 штамма В0-кластера были сгруппированы и на VNTR-дендрограмме (Рис.9).

В0, иначе называемый W148, наиболее часто встречаемый российский вариант Beijing, который широко циркулирует на территории постсоветсткого пространства и доминирует в США и Германии среди штаммов, выделенных от иммигрантов из бывшего СССР (Нарвская и др., 1999, 2002; Черноусова и др., 2001; Шемякин и др., 2003; Bifani et al., 2002; Kruuner et al., 2001; Kubica et al., 2004). Близкое расположение на VNTR-дендрограмме этих штаммов, выделенных от больных из разных регионов северо-запада России в различные годы, подчеркивает их истинную клональность. В то же время, "звездная" VNTR-филогения штаммов В0-кластера, при которой центральный крупный тип связан короткими лучами с его однолокусными производными (Рис.10), свидетельствует о взрывной диссеминации штаммов этого кластера, который действительно может представлять "успешный" клон, широко и исторически недавно распространившийся по всей России, благодаря своим особым патогенным свойствам. Проведенное нами компьютерное моделирование эволюции и коалесценции 17 полиморфных локусов VNTR российских штаммов Beijing с использованием Байесовой статистики позволило оценить темпы роста популяций кластера B0 и российской популяции Beijing в целом. Полученные результаты показывают существенно более быстрый (в 10.6 раза) рост субпопуляции В0 в сравнении с популяцией Beijing в целом и, в свою очередь, подтверждают "успешность" этого клонального варианта M. tuberculosis в России.

Рис.10. Минимальное дерево штаммов В0-кластера на основе профилей VNTR. Размер круга приблизительно пропорционален количеству штаммов.

Ввиду высокой трансмиссивности и вероятной гипервирулентности варианта В0/W148 (Вишневский и др. 2002; Нарвская, 2003) наличие простого ПЦР теста для его быстрой детекции представляется полезным и своевременным. Почти все штаммы этого кластера (42 из 44) имели характерное сочетание аллелей локусов MIRU26 и QUB26 (по 7 копий в каждом), которое не наблюдалось у других штаммов. В то же время, применение полного филогенетического анализа позволило корректно идентифицировать все 44 штамма В0-кластера (Рис.9).

Суммируя вышеизложенное, группа близкородственных штаммов Beijing (кластер В0), очевидно, представляет "успешный" клон M. tuberculosis широко и недавно распространившийся в России. VNTR типирование на основе редуцированной схемы из семи полиморфных локусов и IS6110-RFLP типирование критически дополняют друг друга при высокоразрешающем эпидемиологическом типировании штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing, циркулирующих в или импортируемых из России.

Следует отметить, что классический формат 12 локусов VNTR показал свою явную недостаточность для тонкого эпидемиологического типирования M. tuberculosis (Табл.3). В то же время, данные по различным регионам мира, накопленные за последние годы, имеют большую ценность для анализа глобального генетического разнообразия, результаты которого представлены в следующем разделе.

Глобальная база данных MIRU-VNTR и филогеографический анализ генотипа Beijing

Сравнение профилей 11 локусов MIRU-VNTR 1302 штаммов Beijing позволило разделить штаммы на 204 типа c идентичными профилями по 11 локусам. Четыре наиболее крупные типа - М11, М2, М28 и М33 - включали большинство (50.5%) штаммов. Оценка индекса разнообразия HGI показала, что наиболее однородными были 4 российские популяции (HGI<0.7), а наиболее гетерогенными - восточно-азиатские популяции и Австралия (Рис.11). Рис.11 также показывает географическое распределение 10 основных типов (58.6% штаммов), принимая во внимание различную долю штаммов Beijing в локальных популяциях M. tuberculosis. Рис.12 показывает филогенетические отношения для 48 глобально или локально доминирующих типов. Как видно, наиболее крупный тип М11 находится в центральной позиции, в то время как большинство других типов напрямую происходит от типа М11 путем изменения одного из локусов (Рис.12). Центральное положение и наибольший размер типа М11 указывают на его предковое положение. Этот тип включает большинство штаммов, превалирует в Евразии, но отсутствует в Австралии и Южной Африке. Другой достаточно крупный тип М2 более специфичен для и доминирует в России но также, хотя и в меньших пропорциях, встречается и в Восточной Азии. Другие относительно крупные типы преобладают в отдельных регионах, например, М12 - в Японии, М8 - в Вухане, М33 - в Шанхае и Вьетнаме, хотя присутствуют и в других регионах (Рис.11).

Рис.11. Географическое распределение основных MIRU-типов генотипа Beijing M. tuberculosis.

Размер диаграмм приблизительно пропорционален % штаммов Beijing в общей популяции M. tuberculosis. Значения индекса разнообразия HGI для отдельных регионов основаны на комбинации 12 локусов MIRU.

Более внимательное рассмотрение распределения типов/популяций в пределах минимальной филогенетической сети показывает, что китайские штаммы расположены по всей сети, как во внутренних, так и во внешних и терминальных узлах (Рис.12). Вместе с наибольшим разнообразием китайских популяций, это отражает их наибольшую древность. Япония и Вьетнам представляют промежуточный случай, т.к. их штаммы представлены в центральном типе М11, но обнаруживаются несколько реже, чем китайские штаммы, в других типах. С другой стороны, штаммы из Австралии и Южной Африки находятся только в терминальных типах и представляют, вероятно, наиболее молодые популяции. Наконец, большинство российских штаммов расположено в центральных типах М11 и М2, но при этом демонстрирует наибольшую однородность (HGI), что может отражать их относительно давнее проникновение, но лишь недавнюю диссеминацию на территории России.

Рис.12. Наиболее парсимонная филогенетическая сеть (минимальное охватывающее дерево) 48 основных типов MIRU-VNTR внутри генотипа Beijing M. tuberculosis, представляющих различные географические регионы. Каждая ветвь представляет одно событие (одно изменение в одном локусе). Пунктирные линии обозначают возможные альтернативы.

Высокая гетерогенность популяции может отражать ее длительную эволюцию, т.е. древность. Особый случай представляет Сингапур, гетерогенность популяции которого может отражать множественные проникновения различных вариантов Beijing из географически отдаленных частей Азии в течение сравнительно короткого периода времени. Учитывая положение Сингапура как важнейшего торгового перекрестка, начиная со второй половины 19 и особенно в 20 веках, это предположение представляется правдоподобным.

Для оценки географического компонента генетического разнообразия штаммов Beijing и реконструкции путей его исторического распространения мы сравнили локальные популяции штаммов Beijing. Рис.11 и Рис.12 показывают распределение основных типов, которые представляют большинство, но не все профили. Поэтому мы исследовали разнообразие штаммов Beijing на основе информации о всех VNTR профилях в нашей базе данных. Генетические расстояния между географическими популяциями были рассчитаны по предложенной нами формуле и полученная матрица расстояний была использована для многомерного масштабирования (multidimensional scaling, MDS), которое было проведено путем последовательного исключения удаленных популяций (Рис.13).

Рис.13. Отношения географических популяций M. tuberculosis генотипа Beijing, представленные в виде графа MDS на основе матрицы расстояний VNTR-OD.

Все популяции (a.), евразийские популяции (b. и c.), китайские популяции (d.).

Сокращения: П, Пекин; Ш, Шанхай; Ву, Вухань; ГК, Гонконг; Син, Сингапур; СВ, северный Вьетнам; ЮВ, южный Вьетнам; Я, Япония; СЗР, северо-западная Россия; ЦР, центральная Россия; Ур, Урал; ВС, восточная Сибирь.

Филогеография генотипа Beijing в контексте коэволюции H. sapiens и M. tuberculosis

Большие водные пространства между континентами были наиболее эффективным генератором генетической дивергенции между человеческими популяциями (Cavalli-Sforza et al., 1996). Такая же ситуация наблюдается и для возбудителя туберкулеза, чей общий паттерн генетического разнообразия поразительно напоминает таковой H. sapiens. Внимательное рассмотрение географического распределения VNTR-генотипов Beijing (Рис.11) выявило ряд географических градиентов. Представляется, что наиболее значительный эффект оказали большие водные, но не наземные пространства, что видно на примере Австралии и Южной Африки, где регион-специфические и "другие" типы составили большинство их популяций Beijing (Рис.11). На филогенетической сети видно, что австралийские и южно-африканские VNTR-типы не перекрываются, но образуют собственные субкластеры, тем не менее, соединенные с остальной сетью через центральный и очевидно предковый тип М11 (Рис.12). В свою очередь, на MDS-графе Австралия и Южная Африка представляют далеко расположенные outliers, что, в частности, несколько затрудняет анализ отношений между остальными тесно расположенными евразийскими популяциями (Рис.13а). Тем не менее, даже на общем графе всех изученных популяций можно ясно выделить субкластер четырех российских популяций, более диспергированное положение китайских популяций и относительно дистальное положение японской популяции (Рис.13а). На наш взгляд, это свидетельствует о корректности проведенного анализа в целом и одновременно подкрепляет менее очевидные аффинитеты между географическими отдаленными популяциями M. tuberculosis, вероятно, отражающие скрытые или менее известные паттерны миграций человека, сформировавшие разнообразие возбудителя туберкулеза. Например, удивительна и неожиданна некоторая близость популяций Гонконга и южного Вьетнама (Рис.13а), северо-западной России и Восточной Сибири (Рис.13с).

Сравнение доли штаммов Beijing в общей популяции штаммов M. tuberculosis (см. различный диаметр диаграмм на Рис.11) показало наибольшее распространение этого генотипа в северно-центральном и северо-восточном Китае. Учитывая наиболее высокий процент первоначального и наиболее древнего MIRU-типа М11 в Пекинском регионе Китая, все эти данные указывают на этот регион как место происхождения генотипа Beijing. Низкое и сходное, судя по значениям HGI, разнообразие всех географически отдаленных российских популяций указывает на исторически недавнее широкое распространение штаммов этого генотипа в России, вероятно в 20-м веке. Ограниченное распространение этих штаммов в России до 19-го века может быть связано с холодными климатическими условиями и крайне низкой плотностью населения в доиндустриальный период (Климанов и др., 1995), в отличие, например, от аналогичных показателей в Южной Африке (ср. более высокий индекс HGI южноафриканской (Кейптаун) популяции Beijing). С другой стороны, высокий процент древнего типа М11 среди российских штаммов подразумевает исторически отдаленное время его первоначального проникновения в Россию. Поскольку Beijing не является эндемичным для Европы, опубликованный анализ главных компонент разнообразия европейских человеческих популяций (Cavalli-Sforza, 1996, 2001) позволяет исключить миграции, которые в равной степени затрагивали Россию и Европу, как источник исключительного проникновения штаммов Beijing в Россию. К таковым относятся финно-угорская, скифская, и гуннская экспансии (Christian, 1998; Cavalli-Sforza, 2001). Рассмотрев различные эпизоды человеческой истории, в конечном итоге, нам представляется, что проникновение штаммов Beijing в Россию могло быть связано с евразийской экспансией монгольской империи Чингизхана в 13-15 веках. Средневековая монгольская империя впервые в истории тесно связала отдаленные части евразийского суперконтинента и создала единую экономическую и культурную систему, охватывавшую огромное пространство Евразии (McNeill, 1976; Christian, 2002). Это был также и период значительного межэтнического смешения, т.к. монгольская армия увеличивалась путем поглощения армий завоеванных наций, включая и ханьцев, основного китайского субэтноса (Christian, 1998). Монгольские завоевания также объединили Евразию и эпидемиологически, усилив циркуляцию носителей возбудителей различных болезней (McNeill, 1976). Действительно, Чингизхан дошел до центра Европы, но на очень короткое время, что было достаточно для диссеминации исключительно контагиозных штаммов Y. pestis, но не возбудителя туберкулеза. Даже если азиатские генотипы M. tuberculosis и были занесены в Европу в то время, их редкие носители были уничтожены последующей эпидемией чумы. В то же время, взаимопроникающее взаимодействие Руси и Орды было тесным и длительным, и вполне возможно, что монгольское вторжение и последующее длительное их сосуществование стали причиной проникновения и закрепления генотипа Beijing в северной Евразии (современной России).

Возвращаясь к вопросу о происхождении генотипа Beijing, допуская гипотезу его проникновения в Россию в 13-15 веках, его возникновение в Северно-центральном Китае, очевидно, имело место до этого периода. Проведенный нами предварительный анализ профилей MIRU-VNTR штаммов Beijing из региона его происхождения (Пекина) определил время их коалесценции в ~2000 лет, что, вероятно, и является консервативной (минимальной) оценкой возраста генотипа Beijing.

Генотип Beijing в Евразии. На Рис.13bс отношения между евразийскими популяциями показаны в различных проекциях координат, которые позволяют наблюдать разные компоненты их генетического разнообразия. Рис.13b наиболее ярко отражает географическую вариабельность. В частности, центрально-китайские популяции расположены в центральной части графа, а обе вьетнамские популяции близки друг к другу и находятся несколько в стороне от других популяций. Япония представляется outlier'ом, что объясняется как географическими, так и политическими причинами (Cheow, 2006; http://www.badley. info/history/Japan. index.html). Наконец, российские популяции находятся в нижней правой части графа дистально от других популяций. Как можно ожидать, северо-западная и центральная российские популяции наиболее близки друг к другу. С другой стороны, близкое положение уральской относительно центрально-китайских популяций (Пекин, Вухань) (Рис.13b) и Японии (Рис.13с) весьма неожиданно. Как уже можно было видеть на более сжатом графе (Рис.13а), китайские популяции генотипа Beijing рассеяны в центральной части графа. Это может отражать их более длительную, чем российских популяций, дивергенцию и, в целом, предковое положение. Другие координаты (Рис.13с) выявляют менее очевидные, чем явно географические, аффинитеты, которые также трудно объяснить и доступным историческим и лингвистическим знанием. В то же время, в верхней части графа на Рис.13с явно присутствует кластер прибрежных популяций Юго-Восточной Азии - Гонконга, Вьетнама, Сингапура, и, в меньшей степени, Шанхая, что может, действительно, отражать их длительное взаимодействие вследствие морской торговли.

Интересно отметить некоторый аффинитет сингапурской и гонконгской популяции M. tuberculosis (Рис.13а), что логично следует из их общего китайского происхождения (Conference on Chinese population, 2002). В то же время, они ясно различаются между собой по причине различных источников происхождения (соответствующих китайских миграций). В Гонконге 96% населения говорит на кантонском диалекте, т.е. лингвистически они близки к соседней южнокитайской провинции Гуандун (Harrison, So, 1996). В то же время источники китайского населения в Сингапуре были существенно более разнообразны и только 6% являются носителями кантонского диалекта (Singapore Department of Statistics, 2001).

Ранее, на примере других видов микроорганизмов (H. pylori, вирус JC) было показано, что неожиданное географическое распределение их генотипов может отражать скрытые или менее очевидные паттерны миграций человека (Wirth et al., 2004; Pavesi, 2005; Takasaka et al., 2006). Аналогично, загадочное родство отдаленных популяций M. tuberculosis Пекина и Гонконга (Рис.5.7d) может отражать пока неизвестные эпидемиологические связи между этими китайскими регионами.

Проникновение штаммов Beijing в Южную Африку вероятно произошло исторически недавно. Наиболее вероятно, что генотип Beijing был завезен в Южную Африку по морскому торговому пути из Юго-Восточной Азии в течение последних 400 лет. В 17-18 веках в результате деятельности Голландской Ост-Индской компании, голландские колонисты мыса Доброй Надежды (нынешний регион Кейптауна) в больших количествах завозили рабов из голландских колоний в Африке и Азии, включая Индонезию (Vink, 2003). Потомки этих рабов, известные как "капские малайцы", в настоящее время составляют большинство населения Западной Капской провинции (Vink, 2003; http://www.nationmaster.com/encyclopedia/South-Africa). Таким образом, штаммы Beijing попали в Южную Африку исторически недавно и не непосредственно из региона их исторического происхождения (Китая), а из вторичного очага (Индонезии). Исторические данные подтверждаются и генетическими: на филогенетической сети штаммов Beijing все основные южноафриканские VNTR-типы расположены терминально и, таким образом, являются эволюционно наиболее молодыми (Рис.12). С другой стороны, следует отметить, что крупнейший южноафриканский тип М28 также присутствует и в Гонконге, Сингапуре и Вьетнаме и, в меньшей степени, в Шанхае (Рис.11,12); все они являются прибрежными регионами. Таким образом, наблюдаемый градиент распределения типа М28 отражает другой и более недавний путь попадания штаммов Beijing в Южную Африку, а именно, морской торговый путь из портов Юго-Восточной Азии. При этом, исключительное положение Шанхая объясняется его закрытостью для внешних контактов до середины 19 века (Liu, 2005). В любом случае, терминальное положение Южной Африки на MDS-графе отражает "эффект основателя" первоначально небольшой популяции генотипа Beijing M. tuberculosis, занесенной из Восточной Азии и адаптировавшейся к местной человеческой популяции в течение нескольких последующих столетий.

Генотип Beijing в Австралии. Начиная с 19 века, в связи с открытием золота, имела место существенная и стабильная миграция из южного Китая в Австралию (Jones, 2005; Morgan, 2006; Hugo, 2007). Однако азиатская (в том числе и китайская) иммиграция в Австралию была фактически прекращена в начале 20 века официальным введением "Политики Белой Австралии", которая продолжалась до 1970 года (Hugo, 2007). С другой стороны, следует обратить внимание на то, что большинство штаммов M. tuberculosis в нашей базе данных VNTR имеет две копии в локусе MIRU4, в то время как все австралийские штаммы имеют три копии в этом локусе. На филогенетической сети основной австралийский тип М198 отличается от центрального типа-предшественника М11 только по одному локусу (MIRU4) (Рис.12). Следовательно, не исключено, что австралийские штаммы Beijing эволюционировали из типа М198, привнесенного из юго-восточной Азии. Поскольку разнообразие австралийской коллекции достаточно высоко (HGI 0.9), этот процесс, вероятно, начался не несколько десятилетий назад а, скорее, в конце 19 века.

Коэволюция биологических видов, в том числе, H. sapiens и патогенных микроорганизмов, развивается через взаимоформирование/взаимоотражение их популяционных структур. Тридцать лет назад Уильям Мак-Нил показал влияние локальных и глобальных эпидемий на человеческую историю, наиболее известным и исторически недавним примером которых является "Черная смерть" средневековья (McNeill, 1976). В настоящем исследовании рассмотрена обратная гипотеза: популяционная структура микроорганизмов, в том числе и возбудителя туберкулеза, формируется в процессе сосуществования с популяцией хозяина, и датировка ключевых событий в эволюции микробных популяций в последние 100 тыс. лет возможна при сравнении с историей миграций человеческих популяций.

Проведенный сравнительный анализ выявил строгую географическую специфичность локальных вариантов M. tuberculosis. В частности, близость российских субпопуляций может отражать недавнее распространение штаммов Beijing, усиленное массовыми миграциями населения в России 20 века. Напротив, некоторые слабые и менее ожидаемые аффинитеты отдаленных популяций Beijing (северный Вьетнам и Южная Африка, северо-западная Россия и Восточная Сибирь, Пекин и Гонконг) могут отражать скрытые паттерны человеческих миграций или еще неизвестные эпидемиологические связи отдаленных регионов, что требует дальнейшего, в том числе, и палеомикробиологического, исследования. Накопление новых данных по VNTR локусам и другим маркерам, таким как SNPs и делеции, в том числе и из новых регионов мира, включая также и архивные и палеомикробиологические образцы, позволят провести более точную филогеографическую реконструкцию для M. tuberculosis и прольют новый свет на его эволюционную историю, тесно переплетенную с историей H. sapiens.

Выводы

1. Современная глобальная популяция M. tuberculosis генотипа Beijing характеризуется генетической неоднородностью и, в целом, сформировалась в результате человеческих миграций. Генотип Beijing возник на территории северного Китая более 2000 лет назад и проник в другие регионы мира из Юго-Восточной Азии: в Россию - в средние века, в Южную Африку с 17 века и в Австралию в конце 19 века.

2. Генотип Beijing включает две крупные филогенетические линии ("древние" и "современные" штаммы), которые различаются по структуре локусов NTF, IS6110, IS1547 и Rv3135-PPE и особенностям развития лекарственной устойчивости.

3. Субпопуляция варианта В0/Beijing отличается существенно более быстрым (в 10,6 раза) ростом в сравнении с популяцией Beijing в целом, что показывает "успешный" характер этого клонального варианта M. tuberculosis, распространенного в России.

4. Метод инвертированной IS6110-ПЦР пригоден для детекции штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing и его двух основных филогенетических линий, а VNTR-типирование - для детекции и дифференциации штаммов кластера В0.

5. Разработанная минимальная схема VNTR-типирования на основе 7 локусов (QUB-11b, Mtub21, QUB-26, MIRU26, QUB-3232, VNTR-3820, VNTR-4120) эффективна для скринингового анализа штаммов M. tuberculosis Beijing. Сочетанное применение методов VNTR и IS6110-RFLP необходимо для высокоразрешающего типирования M. tuberculosis.

6. Разработанный метод мультиплексной аллель-специфической ПЦР для анализа основных мутаций резистентности в генах rpoB и katG эффективен для выявления большинства мультирезистентных штаммов M. tuberculosis, циркулирующих в России и других странах с высоким уровнем заболеваемости туберкулезом.

7. Мутации резистентности в katG315, embB306, и rpoB531 наиболее часто встречаются у штаммов генотипа Beijing в сравнении со штаммами других генотипов.

8. Мутации в гене embB306, выявленные у 30% штаммов M. tuberculosis, чувствительных к этамбутолу, не могут служить маркером устойчивости к этамбутолу.

9. Разработанные методологические подходы на основе применения комплекса информативных молекулярных маркеров могут быть использованы для проведения филогенетических и филогеографических исследований, эффективного мониторинга и диагностики лекарственной устойчивости циркулирующих штаммов M. tuberculosis.

Список публикаций по теме диссертации