61

Размещено на http://www.allbest.ru/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

Буздин Антон Александрович

Москва - 2008

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Института биоорганической химии им.М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Официальные оппоненты:

Доктор биол. наук М.Б. Евгеньев

Доктор биол. наук К.А. Лукьянов

Член-корреспондент РАН, доктор биол. наук профессор Н.В. Томилин

Научный консультант:

Академик РАН, доктор биол. наук профессор Е.Д. Свердлов

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится "24" сентября 2008 г. в часов на заседании

Специализированного совета при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997,г. Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан " " 2008 г.

Учёный секретарь

Специализированного совета

доктор химических наук В.А. Олейников

Актуальность темы

Выход молекулярной генетики на качественно новый уровень - уровень исследования и сопоставления структуры и функций целых геномов - возможен лишь при развитии арсенала соответствующих экспериментальных подходов. Первым этапом могло бы являться получение исчерпывающих структурных данных, вторым - расшифровка на их основе функциональной роли тех либо иных участков генома. Возможно, наилучшим из имеющихся структурных подходов с точки зрения полноты охвата проблемы является тотальное секвенирование геномной ДНК и библиотек транскриптов различных тканей исследуемого организма. Вместе с тем, регуляторные участки генома таким способом выявить невозможно. Кроме того, подход очень дорог и требует огромного напряжения усилий множества учёных. Применение технологии микрочипов не может быть полноценной заменой полного секвенирования, так как не позволяет различать слабодивергировавших представителей мультигенных семейств, а также те последовательности, в состав которых входят повторяющиеся элементы.

Изменения в структуре ДНК, прямо или косвенно связанные с изменением количества копий геномных повторов, являются одним из важнейших факторов эволюции геномов и, соответственно, видообразования. Мобильные элементы обладают значительным регуляторным потенциалом, обеспечивающим контроль экспрессии их собственных генов. В то же время, известно, что активность многих уникальных функциональных участков генома, например, многих генов, модулируется располагающимися по соседству вставками мобильных элементов.

Кроме того, изучение геномных повторов, в особенности - мобильных элементов и их фракции, активной у позвоночных, ретроэлементов - может дать исследователям новые полиморфные маркёры, которые могут быть использованы как для филогенетических, так и для медико - и популяционно-генетических исследований. Поэтому сравнение распределения ретроэлементов между геномами представляется одной из важнейших задач молекулярной генетики.

Применяемые для решения этой задачи большинством исследователей экспериментальные подходы не дают возможности проводить анализ на уровне целых геномов. Казалось бы, наилучшим выходом могла бы стать тотальная идентификация геномных повторов в базах данных. Однако этот подход имеет важный недостаток: все данные о наличии повторов в различных локусах генома берутся из баз данных и, учитывая, что для всех крупных проектов секвенируют ДНК лишь небольшого количества представителей исследуемого вида, подавляющее большинство информации о полиморфных в популяции повторах теряется. Кроме того, прицентромерные и прителомерные участки с трудом поддаются анализу и недопредставлены во всех опубликованных последовательностях ДНК эукариот со сложным геномом. Таким образом, базы данных содержат неполную информацию. К тому же, таким способом можно исследовать только те объекты, геномная последовательность которых частично или же почти полностью установлена.

Поэтому актуальной представляется задача создания экспериментальных методов, позволяющих проводить полногеномное сравнение распределения повторяющихся элементов между организмами и их функциональной характеристики независимо от информации, содержащейся в базах данных.

Цель работы.

Основной целью настоящей работы являлась разработка экспериментальных подходов, позволяющих проводить полногеномное сравнение распределения геномных повторов в ДНК представителей разных видов или между различными особями одного вида. Разработанные методики предполагалось применить для идентификации и структурно-функциональной полногеномной характеристики ретроэлементов, специфичных для генома человека. Такие ретроэлементы присутствуют только в ДНК человека, но не в геномах других наиболее родственных видов (шимпанзе Pan paniscus u Pan troglodytes) и других организмов. На основе обнаруженных функционально активных человек-специфичных ретроэлементов планировалось выявить потенциальные регуляторы активности известных генов, которые могли выступать как важные факторы в ходе молекулярной эволюции генома человека.

Научная новизна и практическая ценность. В ходе выполнения работы были разработаны методы прямого экспериментального сравнения участков интеграции геномных повторов между ДНК близкородственных видов. Методы являются уникальными и не имеют аналогов в опубликованной литературе. Первый метод, TGDA (англ. Targeted Genomic Differences Analysis), основан на вычитающей гибридизации геномных последовательностей, фланкирующих повторы, а второй, Diffir (англ. Differences in the integration sites of low and medium copy number interspersed repeats technique) - на дифференциальной гибридиазации фланкирующих участков генома на фильтре.

В ходе разработки вышеуказанных методов оказалось, что неспецифическая гибридизация нуклеиновых кислот в значительной мере осложняет создание и анализ получаемых клонотек. Для повышения специфичности отбора совершенных дуплексов при гибридизации нами был разработан новый методический подход, названный MDR (англ. Мispaired DNA Rejection), основанный на селективной энзиматической деградации некорректно спаренных ДНК-дуплексов. MDR потенциально применим для повышения специфичности целого семейства методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот в растворе с последующей ПЦР-амплификацией, например, вычитающей гибридизации и метода клонирования совпадений.

Для функциональной характеристики геномных повторов мы разработали новый экспериментальный подход, впервые позволяющий проводить полногеномные исследования промоторной активности геномных повторов как на качественном, так и на количественном уровне. Этот подход, названный GREM (англ. Genomic Repeat Expression Monitor), основан на гибридизации геномных последовательностей, фланкирующих повторы, с 5'-концевыми фрагментами кДНК.

Разработанные подходы были успешно применены для полногеномной идентификации специфичных для генома человека представителей ретроэлементов семейств HERV-K (HML-2) u L1. Был проведён детальный структурный анализ человек-специфичных ретроэлементов. В составе последовательности длинных концевых повторов элементов группы HERV-K (HML-2) найдена ранее неизвестная точка начала транскрипции, расположенная на границе областей R и U5 - в участке, отличающемся от канонического для экзогенных ретровирусов (граница областей U3 и R). По-видимому, появление новой точки начала транскрипции связано с адаптивной эволюцией данного семейства эндогенных ретровирусов человека. Также было установлено, что человек-специфичные представители HERV-K (HML-2) обладают значительным сходством нуклеотидной последовательности и для них была выведена консенсусная последовательность.

Было обнаружено новое семейство ретроэлементов, состоящее из химерных последовательностей, образованных при однократной или двукратной смене матрицы в ходе обратной транскрипции. Представители нового семейства были найдены в геномах млекопитающих и у нитчатого гриба Magnaporthe grisea. Это позволяет сделать вывод о высокой эволюционной консервативности обнаруженного явления.

Кроме того, в интронах двух генов человека - SLC u SLB - выявлены человек-специфичные представители HERV-K (HML-2), инициирующие транскрипцию антисмысловых РНК, перекрывающихся с последовательностями экзонов этих генов. В системе in vitro показано, что экспрессия этих антисмысловых транскриптов на физиологическом уровне, наблюдаемом для эмбриональных и герминогенных тканей, приводит к 2-3 - кратному снижению концентрации мРНК соответствующих генов. Таким образом, обнаружены первые два случая человек-специфичной регуляции экспрессии генов за счет антисмысловой транскрипции, регулируемой ретроэлементами.

1. Повышение специфичности гибридизации в растворе

Работа была проведена Е.В. Гогвадзе, Т.В. Чалой, Е.Д. Свердловым и А.А. Буздиным.

Хорошо известный недостаток гибридизации сложных смесей ДНК - побочная гибридизация ДНК геномных повторов, присутствующих в сравниваемых образцах. В результате такого "неспецифического" отжига, итоговые клонотеки изобилуют химерными последовательностями, получившимися при гибридизации повторяющихся частей из неортологичных локусов (Рис.1). Такие химеры абсолютно бесполезны при анализе клонотек и даже вредны, поскольку для того, чтобы понять, является ли последовательность химерой или же целевым продуктом гибридизации, приходится проводить достаточно трудоёмкий анализ каждой последовательности поотдельности. Химеры в среднем могут занимать 40-60% библиотек ДНК. Хотя ситуация может быть несколько улучшена при добавлении к гибридизационной смеси конкурирующей фракции геномной ДНК, обогащённой последовательностями повторов, количество нежелательных химерных клонов в библиотеках всё же остаётся высоким (см. ниже). Для того, чтобы улучшить создавшуюся ситуацию, нашей группой был разработан метод, названный Mispaired DNA Rejection (MDR), позволяющий свести к минимуму содержание химер в конечных библиотеках. Метод основан на том, что подавляющее большинство взаимно-отжигающихся геномных повторов, хотя и содержат значительную гомологию нуклеотидной последовательности, но всё же не полностью идентичны друг другу. Поэтому их ДНК-дуплексы не являются совершенными и содержат протяжённые или же короткие участки неспаренных нуклеотидов. Это могут быть как одиночные нуклеотиды, так и значительные по длине выпетливания. Все такие структурные отклонения от нормы, то есть совершенных ДНК-дуплексов, могут узнаваться и расщепляться особыми нуклеазами, названными здесь мисмэтч-специфическими нуклеазами (МСН). МСН служат in vivo как участники репарации геномной ДНК или в ходе прохождения жизненного цикла вирусов. В настоящее время МСН широко применяются для поиска и детекции мутаций (детально рассмотрено в литературном обзоре). В настоящем разделе речь пойдёт об использовании МСН для селективного расщепления химерных дуплексов в гибридизационных смесях, что позволяет снизить число побочных химерных клонов с 44-60 до 0-4%.

Рисунок 1. Образование химерных клонов в гибридизационных библиотеках.

1.1 Метод MDR: селективная деградация неправильно спаренных гетеродуплексов

Для тестирования эффективности MDR была разработана тест-система (Рис.2), включающая (1) расщепление геномной ДНК частощепящей рестриктазой, (2) лигирование различных олигонуклеотидных супрессионных адапторов, (3) денатурацию-гибридизацию двух порций ДНК, содержащих разные супрессионные адапторы, (4) заполнение концов дуплексов ДНК-полимеразой, (5) обработка МСН и (6) ПЦР-амплификацию (с использованием эффекта ПЦР супрессии, детально описан в литературном обзоре) тех гетеродуплексов, которые не были расщеплены на предыдущей стадии. Nested ПЦР с праймерами A2 и B2 повышает специфичность процедуры так, что в результате амплифицируется исключительно ДНК гетеродуплексов. Контрольные эксперименты содержали все те же самые стадии, помимо этапа (5), то есть обработки гибридов нуклеазами.

Рисунок 2. Схема метода MDR, использованная для тестирования эффективности обработки гетерогибридов МСН.

геномный повтор промоторная активность

Для того, чтобы исследовать эффект от применения конкурирующей фракции ДНК, обогащенной геномными повторами, на процесс гибридизации и на качество итоговых библиотек, в некоторых экспериментах на стадии гибридизации добавляли 100-кратный избыток быстро реассоциирующей фракции геномной ДНК человека C_otA, сильно обогащённой геномными повторами. На стадии (5) использовались две МСН: нуклеаза Surveyor, расщепляющая неспаренные участки в составе гетеродуплексов, а также нуклеаза Mung Bean, расщепляющая участки одноцепочечной ДНК, и, следовательно, способная атаковать петлевые структуры в составе химерных гибридов. Эксперименты проводили на ДНК млекопитающих, поскольку они относятся к одним из наиболее сложных геномов эукариот и дают чрезвычайно сложные гибридизационные смеси, гораздо более сложные, чем, например, ампликоны кДНК. Поэтому, в случае успеха для геномных ДНК млекопитающих, можно быть уверенными в применимости метода для более простых смесей (кДНК или геномы меньшей сложности). Проводили шесть различных гибридизаций при следующих условиях: (H1), две порции геномной ДНК человека гибридизовали при 65°C (T65) без добавления фракции C_otA ⁽C_otA-) и без расщепления МСН (N-); (H2), ДНК человека и шимпанзе гибридизовали при T65, C_otA-, N-; (H3), ДНК человека, T65, C_otA+, N-; (H4), ДНК человека, T85, C_otA+, N-; (H5), ДНК человека и шимпанзе, T65, C_otA-, с добавлением нуклеазы Surveyor; (H6), ДНК человека, T65, C_otA+, с добавлением нуклеазы Mung bean.

Получившиеся библиотеки клонировали в E. coli, и из каждой из них отсеквенировали по 50 вставок (всего 300 последовательностей). Для определения химерных клонов мы использовали следующие критерии: вся последовательность целиком не должна иметь гомологов в геномных базах данных, а её 5' - и 3' - концевые фрагменты должны идеально соответствовать геномным последовательностям. На рисунке 3 приведены результаты анализа полученных шести библиотек. Видно, что добавление фракции C_otA и повышение гибридизационной температуры с 65 до 85°C практически не оказывают никакого эффекта на количество химерных клонов, в отличие от действия МСН. Как Mung bean, так и Surveyor показали мощный анти-химерный эффект, выразившийся в снижении их количества с 44-60% до 0-4% клонов.

Рисунок 3. Сравнение шести библиотек ДНК, полученных при разных условиях гибридизации без и с использованием МСН. H1, гибридизация ДНК человек-человек, 65°C (T65), без конкурентной фракции C_otA (C_otA-), без добавления МСН (N-); H2, ДНК человек-шимпанзе, T65, C_otA-, N-; H3, ДНК человек-человек, T65, C_otA добавлена (C_otA+), N-; H4, ДНК человек-человек, T85, C_otA+, N-; H5, ДНК человек-шимпанзе, T65, C_ot A-, добавлена нуклеаза Surveyor; H6, ДНК человек-человек, T65, C_otA+, добавлена нуклеаза Mung bean. (A) Высота цветных столбцов соответствует доле химерных клонов в полученных библиотеках. (Б) Высота столбцов соответствует доле клонов, содержащих последовательности геномных повторов.

Многие отсеквенированные вставки содержали геномные повторы, что неудивительно, поскольку повторы занимают порядка 50% ДНК млекопитающих. Повторяющиеся последовательности со 100% идентичностью могут соответствовать нескольким геномным локусам в ДНК хозяина, что существенно осложняет задачу их картирования. Поэтому часто встаёт задача минимизации содержания последовательностей повторов в библиотеках. В наших экспериментах получилось, что доля повторов значительно различалась в разных библиотеках: C_otA - библиотеки содержали много повторяющихся последовательностей независимо от добавления МСН (87-93% всех отсеквенированных клонов), C_otA+/N - библиотеки-несколько меньшую долю повторов (76-78%), тогда как C_otA+/N+ библиотека (H6, с добавлением нуклеазы Mung bean) содержала всего 44% вставок с повторяющейся ДНК. Результаты свидетельствуют, что наилучшие результаты могут быть получены при конструировании библиотек с одновременным использованием МСН и конкурентных фракций вроде C_otA.

1.2 Приложение MDR для поиска эволюционно консервативных последовательностей в геномах человека и обезьян

Нами было проведено исследование применимости метода MDR для межвидовой ДНК-гибридизации. Для этого, в двух гибридизационных экспериментах (H2 и H5) гибридизовались ДНК человека и шимпанзе. Геномы человека и шимпанзе являются наиболее близкородственными и показывают 98% идентичность нуклеотидной последовательности. Получилось, что использование MDR снизило количество химерных последовательностей с 44% практически до нуля. Все отсеквенированные вставки из библиотеки, обработанной нуклеазой Surveyor (H5), содержали последовательности, высоко консервативные для этих двух геномов (средняя идентичность 98.3%). Некоторые вставки содержали участки, эволюционно консервативные для всех отсеквенированных на тот момент (ноябрь 2004) геномов млекопитающих - человека, шимпанзе, мыши и крысы. Из этого следовало, что MDR можно применять для поиска эволюционно консервативных последовательностей в различных геномах. Для исследования этого предположения, мы провели ещё одну межвидовую гибридизацию (H7), между геномами человека и обезьяны Нового света мармозеткой Callithrix pygmaea, при 65°C, с обработкой нуклеазой Surveyor. Геном мармозетки гораздо сильнее дивергировал от генома человека, чем ДНК шимпанзе [предковые линии гоминид и обезьян Нового света разошлись около 45 миллионов лет назад], дивергенция в среднем составляет 20% последовательности ДНК.71% вставок библиотеки содержал умеренно (14%) дивергировавшие повторяющиеся элементы, присутствующие как в геноме мармозетки, так и у человека. Оставшиеся 29% представляли уникальные последовательности.

Десять из них были консервативны среди геномов человека, шимпанзе, мыши и крысы, а три других были консервативны между ДНК человека и шимпанзе. Для того, чтобы подтвердить высокую степень консервативности этих последовательностей между человеком и мармозеткой экспериментально, была проведена ПЦР-амплификация и секвенирование соответствующих локусов для трёх таких последовательностей. Оказалось, что действительно все отсеквенированные локусы показывали высокую степень консервативности между геномами со средним значением межвидовой гомологии 95%, что говорит о примерно 4-кратном понижении средней скорости мутирования для этих локусов.

Представленные результаты убедительно свидетельствуют о том, что метод MDR может быть полезен для улучшения качества самых разных библиотек, получаемых при реассоциации ДНК, включая вычтенные или нормализованные геномные и кДНК-библиотеки. Хотя в наших экспериментах нуклеаза Surveyor оказалась более эффективной, чем Mung Bean, в других случаях последняя может быть также весьма полезна. В частности, обработка Mung Bean может помочь при гибридизации кДНК, когда образуется значительное количество несовершенных дуплексов при отжиге друг на друга в целом негомологичных последовательностей с похожими нуклеотидными мотивами. Поэтому, для рутинного применения можно рекомендовать смесь обеих нуклеаз. Метод также может значительно упростить решение задачи экспериментального поиска эволюционно консервативных последовательностей в несеквенированных геномах. Указанные особенности позволяют надеяться на широкую применимость метода для нужд молекулярной генетики.

2. Метод TGDA: вычитающая гибридизация участков, фланкирующих геномные повторы

Метод TGDA (от англ. Targeted Genomic Differences Analysis) разрабатывался совместно с Е.Д. Свердловым, Ю.Б. Лебедевым, С.В. Устюговой, К.В. Ходосевичем и И.З. Мамедовым. TGDA позволяет проводить полногеномный сравнительный анализ геномных повторов в ДНК изучаемых организмов.

Принцип метода. TGDA состоит из трёх основных стадий:

(1) Селективная амплификация последовательностей ДНК, фланкирующих повторяющиеся элементы в сравниваемых геномах, с использованием универсального праймера к последовательности повтора и при помощи эффекта “ПЦР-супрессии”.

(2) Обработка полученных ампликонов экзонуклеазой ExoIII для получения 5'-выступающих концов (эта стадия критична для всего процесса; она призвана убрать из ампликонов, полученных после (1) стадии, остающиеся в них последовательности мобильных элементов.

(3) Основанная на ПЦР вычитающая гибридизация (ВГ) обработанных ампликонов.

Для вычитания один из ампликонов (так называемый драйвер, англ. driver) берётся в значительном избытке над другим, называемым трейсер, англ. tracer. ВГ (подробно описана в литературном обзоре) позволяет напрямую идентифицировать последовательности (назовём их мишени), присутствующие в трейсере, но отсутствующие в драйвере.

Мы применили TGDA для поиска вставок мобильных элементов, специфичных для генома человека. Сейчас известны 5 таких семейств мобильных элементов, все они относятся к ретроэлементам. Это некоторые представители эндогенных ретровирусов HERV-K (HML-2), и ретропозонов LINE L1, Alu, SINE-R и SVA. Для проведения экспериментов мы выбрали два семейства ретротранспозонов: HERV-K (HML-2) и L1, которые, в отличие от остальных трёх семейств, обладают гораздо более сложной структурой и большим спектром потенциальных воздействий на функционирование генома. В качестве трейсера использовались ампликоны, полученные из ДНК человека, а в качестве драйвера - ампликоны, полученные из ДНК шимпанзе.

Для того, чтобы количественно охарактеризовать эффективность метода, мы нашли экспериментальное значение обогащения результирующей смеси по фланкам человек-специфичного (чс) LTR: определяли концентрацию фланкирующей последовательности известного чсLTR из локуса 19q13.2 (258) в исходном трейсере и в смеси, полученной в ходе ВГ. При этом, если метод TGDA работает, должно было происходить обогащение смеси по этой последовательности.

Действительно, в случае использования матрицы смеси после вычитания, видимый чс ПЦР продукт появлялся на 4 цикла раньше, чем в случае использования исходного трейсера, что свидетельствует о 16-кратном обогащении вычтенной библиотеки фланками чсLTR. Это значение хорошо согласуется с теоретически ожидаемым (~20-кратное обогащение), что свидетельствует о высокой эффективности метода.

Высокая специфичность селекции на первой стадии TGDA продемонстрирована определением первичной структуры вставок в случайно выбранных клонах полученной библиотеки. Все вставки содержали ожидаемые фрагменты LTR.

Выводы о наличии или отсутствии индивидуальных LTR, выявленных с помощью TAGDА в соответствующих геномных локусах, делали на основании результатов ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими исследуемое внедрение ретроэлемента. При этом ДНК, содержащая LTR в соответствующем локусе, должна давать продукт примерно на 970 пн длиннее, чем продукт, полученный с матрицы, не содержащей LTR.

Всего нами было найдено в библиотеке 25 чс LTR, 23 из них были идентифицированы впервые. Полученная с помощью TGDA библиотека содержала 60% клонов, несущих вставки, специфичные для генома человека.

3. Метод Diffir: дифференциальная гибридизация фланков геномных повторов на фильтре

Альтернативный метод, названный "Differences in the integration sites of low and medium copy number interspersed repeats technique " (DiffIR), был разработан для тех же целей, что и TGDA. Его отличием является возможность исследовать специфичность интеграции повторов в формате чипа, в ходе гибридизации иммобилизованных на твердофазном носителе фланков исследуемого типа геномных повторов со сравниваемыми геномными ДНК. Метод был применён для того же объекта - семейства эндогенных ретровирусов человека HERV-K (HML-2), для поиска специфичных для генома человека интеграций этих ретроэлементов. Метод можно использовать для идентификации любых дифференциальных внедрений геномных повторов при сравнении близкородственных геномов. Принцип DiffIR - комбинирование селективной амплификации геномных фрагментов, фланкирующих исследуемую группу повторов, и дифференциальной гибридизации клонов полученных библиотек (метод детально описан в тексте диссертации).

При этом стадия селективной амплификации, включающая в себя фрагментацию геномной ДНК частощепящей эндонуклеазой рестрикции, лигирование супрессионных адапторов и nested ПЦР, идентична первому этапу TGDA. Получающиеся ампликоны клонируют в плазмидный вектор и анализируют при помощи дифференциальной гибридизации. Зондами для гибридизации служат те же ампликоны фланков геномных повторов, но полученные с использованием других супрессионных адапторов. Например, при поиске повторов, специфичных для генома человека, ДНК клонов, несущих вставки амплифицированных фланков повторов человека наносят на фильтр, а гибридизуют их с меченными ампликонами фланков человека и шимпанзе. Эти последние ампликоны получают с использованием других супрессионных адапторов - для того, чтобы одинаковые адапторные последовательности не вызывали "неспецифической" кросс-гибридизации клонов и зонда. Дифференциально гибридизующиеся клоны секвенируют и каким-либо независимым способом проверяют, действительно ли они уникальны для того или иного генома (например, при помощи локус-специфической ПЦР, как описано в предыдущем разделе).

В ходе модельного эксперимента была проанализирована лишь небольшая часть библиотеки. При этом отсеквенировали 40 как дифференциальных, так и недифференциальных клонов. Все они содержали ожидаемые фрагменты адапторов и действительно являлись фланками эндогенных ретровирусов исследуемого семейства.22 из отсеквенированных 40 клонов были дифференциальными и гибридизовались с зондами на фланки ЭРВ человека, но не шимпанзе. Локус-специфическая ПЦР показала, что 16 из этих 22 клонов действительно соответствовали человек-специфичным ЭРВ. Таким образом, специфичность дифференциальной гибридизации была оценена как 73%. Наличие ложно-дифференциальных клонов (6 из 22) может быть связано с появлением или исчезновением рестриктных сайтов в одном из сравниваемых геномов (для фрагментации геномной ДНК используются рестриктазы) и, соответственно, с артефактной недопредставленностью некоторых локусов в анализируемых ампликонах.

4. Приложение методов TGDA и Diffir для молекулярной генетики человека

Работа выполнялась коллективом авторов, включавшим С.В. Устюгову, Е.В. Гогвадзе, К.В. Ходосевича, Ю.Б. Лебедева, Е.А. Ковальскую, Е.Д. Свердлова и А.А. Буздина. Химерные ретроэлементы грибов исследовались в сотрудничестве с Марк-Анри Лебраном и Кристель Барбизан из совместной лаборатории CNRS u фирмы Bayer (Лион, Франция).

4.1 Идентификация человек-специфичных инсерций эндогенных ретровирусов

Структурный анализ известных чс LTR. Проанализировав последовательности человек-специфичных LTR, найденные нами и другими авторами (всего 41 последовательность), мы обратили внимание, что все они, за исключением одного LTR, обладают значительной структурной гомологией и формируют один кластер на филогенетическом древе.

Основываясь на 40 последовательностях высоко гомологичных чс LTR, мы создали консенсусную последовательность (HS консенсус) для эволюционно молодого семейства HS. Эта последовательность содержит 9 характеристических нуклеотидных позиций (приведены в тексте диссертации). Проведённый поиск выявил в геномных базах данных 142 индивидуальные полноразмерные (длиной ~970 пн) последовательности, от 100 дo 97% идентичные HS консенсусу (приведены в Табл.1 раздела Supplementary Material на web сайте http://humgen. siobc. ras.ru). Мы выбрали этот диапозон идентичности, поскольку степень взаимной идентичности среди 40 LTR, использованных для создания консенсуса, варьировала от 99.8 дo 97.6% со средним значением 98.1%. Единственный чс LTR из контига AC022567, который не мог быть отнесён к семейству HS (см. выше), не имел высокоподобных (более 97% идентичности) последовательностей в геномных базах данных.

Для того, чтобы найти частоты встречаемости характеристических нуклеотидных позиций HS консенсуса во всех членах HS семейства, а также в LTR, не являющихся членами группы HS, мы сделали множественное выравнивание найденных в этой работе 142 HS и 89 известных не-HS LTR (выравнивание помещено в разделе Supplementary Material на сайте http://humgen. siobc. ras.ru). Результаты показали, что 8 диагностических позиций консенсусной последовательности действительно являются уникальными характеристиками семейства HS.

Дальнейший анализ последовательностей представителей семейства HS позволил выделить в его составе два подсемейства, названные нами HS-a и HS-b, представленные, соответственно, 63% и 37% последовательностями LTR. Подсемейство HS-a высоко гомологично консенсусной последовательности HS и характеризуется внутригрупповой дивергенцией 1.5%, что соответствует возрасту 5.8 миллионов лет. Все LTR семейства HS-a, для которых это известно, являются специфичными для генома человека. Представители подсемейства HS-b несут 5 характеристических сцепленных однонуклеотидных замен в положениях 907, 909, 912, 921 и 950 консенсусной последовательности HS (дана в тексте диссертации).

Подсемейство HS-b эволюционно старше, чем HS-a, для него значение внутригрупповой дивергенции составляет 2.6%, соответственно, возраст 10.3 миллиона лет. По крайней мере 3 члена подсемейства HS-b не являются человек-специфичными, а присутствуют также в геноме шимпанзе.

По всей вероятности, материнские последовательности HS семейства возникли в геноме общего предка линий гориллы, шимпанзе и человека около 10.7 миллионов лет назад, дав группу HS-b. Эта группа, оставаясь активной, 5.8 миллионов лет назад, то есть примерно во время расхождения предковых линий человека и шимпанзе, в свою очередь, дала начало группе HS-a, которая на настоящий момент составляет большую часть (63%) всего семейства HS, по-видимому, в силу большей ретропозиционной активности. Интересно, что группа HS-a оказалась наиболее активной также и в геноме шимпанзе, как следует из результатов недавно проведённого группой Скотта Девина (Scott Devine) анализа шимпанзе-специфичных элементов.

Анализ чс LTR HERV-K (HML-2), картированных в интронах генов. С помощью сервера UCSC Browser (http://genome. ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway), мы обнаружили 30 представителей семейства в интронах известных человеческих генов (Рис.4).

Рисунок 4. Распределение вставок человек-специфичных LTR в интронах генов. Гены сгруппированы согласно функции своих продуктов (данные о представленности генов в различных группах для генома человека взяты с сайта http://www.geneontology.org/ компании Celera).

Было установлено, что LTR в интронах генов имеют неслучайную ориентацию: в 29 из 30 генов LTR направлен в сторону, противоположную направлению транскрипции гена. Это может быть объяснено тем, что внедрение LTR, обладающих сильным сигналом терминации транскрипции, в интроны генов в прямой ориентации вызывало бы преждевременную терминацию транскрипции этих генов, и, как следствие, приводило бы к их инактивации. Поэтому аллели, несущие в интронах LTR в прямой ориентации, должны были неизбежно отбрасываться в ходе эволюции генома человека. Сохранение аллеля, содержащего LTR в прямой ориентации в интроне одного гена, возможно, связано с инактивацией терминатора этого LTR. Из рисунка 4 видно, что вставки чсLTR имеют тенденцию к избыточной представленности в интронах генов, кодирующих белки, участвующие во внутриклеточной передаче сигнала, а также среди генов белков, обладающих ферментативной активностью (~2-кратное отклонение от среднестатистического распределения). Такая "избирательность" эволюционно недавних внедрений LTR в интроны некоторых групп генов на настоящий момент остаётся необъяснённой. Избыточное содержание вставок в генах - участниках систем передачи сигнала может быть связано с регуляторной ролью этих систем и согласуется с моделью эволюции геномов, выдвинутой Кингом и Уилсоном, согласно которой основной движущей силой фенотипических изменений являются прежде всего изменения регуляторных систем организма. Также возможно, что наблюдаемая предпочтительность интеграции связана с наиболее активным функциональным статусом именно этих групп генов и, как следствие, с большей открытостью хроматина в соответствующих локусах.

4.2 Идентификация человек-специфичных вставок ретроэлементов L1

Следующим объектом, для которого был применён метод TGDA, стало семейство ретротранспозонов L1, содержащее чс элементы, а также около 50 до сих пор активных представителей в геноме человека. Как и в случае HERV-K (HML-2), искали чс интеграции ретроэлементов. Работа проводилась в 2002-2003 годах, когда в базах данных не содержалось информации по геному шимпанзе, и единственным способом поиска чс элементов являлся экспериментальный анализ.

Продукты ВГ клонировали в E. coli, затем секвенировали последовательности вставок из случайно отобранных клонов. Все вставки содержали ожидаемые фрагменты L1 семейств L1PA2 и L1Hs, что, как и в случае LTR HERV-K (HML-2), демонстрировало высокую селективность метода. Как и в случае LTR HERV-K (HML-2), с целью определения специфичности данных L1 для генома человека, проводился ПЦР-анализ со специфичными геномными праймерами, фланкирующими интеграцию ретроэлемента. Из 29 отобранных клонов видоспецифичность интеграции определили для 26 последовательностей, 24 из них были чс, а 2 клона содержались также в геноме шимпанзе. Это говорит о том, что чс (целевые) последовательности содержатся приблизительно в 92% клонов библиотеки.

Все найденные в данной работе чс L1 принадлежали к группам L1PA2 и L1Hs. Лишь небольшая часть (26%) этих чс L1 принадлежала к группе Ta, которая известна как единственная транспозиционно активная в настоящее время группа L1. В этой работе нами было найдено внедрение L1, принадлежащего к группе L1PA2, которое является полиморфным в человеческой популяции. Следовательно, (i) по крайней мере два семейства L1 были активны в предковой линии человека после расхождения её с предковой линией шимпанзе и (ii) при поиске полиморфных интеграций L1 не следует ограничивать поиск группой L1 Ta. Один чс L1 являлся представителем открытого в данной работе химерного семейства ретроэлементов U6-L1, детально описанного в заключительном разделе. К сожалению, количество найденных в интронах генов чс L1 было мало, что не дало возможности проанализировать распределение вставок по функциональным группам генов.

5. Анализ транскрипционной активности геномных повторов

5.1 Метод GREM: полногеномный поиск промоторно-активных повторов

Транскрипция LTR полноразмерного провируса может приводить к образованию двух видов продуктов: РНК вирусных генов (если инициируется на 5' LTR, см. Рис.5), либо, в случае промоторной активности 3' LTR, РНК уникальных не-вирусных последовательностей, которые фланкируют провирус с 3' конца.

Рис.5. Схема транскрипционной активности одиночных (слева) и провирусных (справа) LTR. Транскрипция с провирусного 5' LTR даёт РНК вирусных генов, тогда как экспрессия одиночных или 3' провирусных LTR приводит к транскрипции геномных последовательностей хозяина, фланкирующих 3' конец ретроэлемента.

Метод GREM, детально описанный в тексте диссертации, состоит из трёх основных стадий: (1) синтез полноразмерной библиотеки кДНК, молекулы которой несут специфическую маркёную последовательность, введённую на 5' конец кДНК, (2) селективная ПЦР-амплификация геномных последовательностей, фланкирующих повтор, и (3) гибридизация кДНК и фрагментов, фланкирующих повторы, с последующей ПЦР-амплификацией гетеродуплексов геномной ДНК\кДНК.

Первая стадия GREM нацелена на амплификацию полноразмерных молекул кДНК, маркированных с 5' конца введённой последовательностью адапторного олигонуклеотида. Такое мечение достигается благодаря применению эффекта “cap-switch" в ходе синтеза кДНК. Достигнув 5' конца мРНК-матрицы, олиго (dT) - праймированная ревертаза нематрично добавляет несколько добавочных дезоксицитидиновых нуклеотидов на 3' конец кДНК. При этом олигонуклеотид, содержащий олиго-рибо (G) последовательность на 3' конце, гибридизуется на дезоксицитидиновый трэк, что образует праймер, позволяющий ревертазе сменить матрицу и дополнительно досинтезировать на 3' конец первой цепи кДНК последовательность адаптора. Этот подход позволяет достаточно точно помечать 5'-концы кДНК, соответствующие точкам старта транскрипции (Рис.6). Затем на матрице первых цепей получают вторые цепи кДНК.

На второй стадии проводилась селективная ПЦР-амплификация геномных локусов, фланкирующих 3' концы HS LTR. Гибридизация кДНК с получаемым ампликоном используется для селекции именно тех молекул кДНК, которые содержат последовательность HS LTRs на 5' конце. Амплификация геномных фланков - это критически важный шаг, обеспечивающий специфичность всей процедуры в целом.

На последней стадии, кДНК гибридизуется с 3'-геномными фланками LTR. Для того, чтобы селективно амплифицировать гетеродуплексы, содержащие как геномные фланки LTR, так и 5' концевые фрагменты кДНК, образованных благодаря промоторной активности LTR, мы проводили ПЦР с праймером на 5'маркёрную последовательность в составе кДНК и праймер, специфичный для адаптора, лигированного к геномной ДНК.

В результате амплифицировались только целевые гетеродуплексы.

Полученные в ходе последней амплификации гетеродуплексы, названные Expressed LTR Tags (ELT), далее клонировали и секвенировали. Каждый ELT содержал 3'-концевой фрагмент HS LTR, участок 3' - фланкирующей геномной ДНК, а также адапторную последовательность.

Детекция промоторной активности HS LTR при помощи GREM.

Анализ последовательностей ELT позволял однозначно картировать соответствующие им одиночные и 3' провирусные LTR. Однако же, картирование невозможно в случае провирусных 5' LTR, поскольку транскрибируемые с них провирусные последовательности многократно повторены в геноме и обладают высокой степенью идентичности (Рис.5). Результаты анализа библиотек ELT, полученные для двух тканей: паренхимы яичка и семиномы, а также созданная на их основе первая в мире карта промоторно активных геномных повторов семейства HS LTR, представлены в следующем разделе. Для пяти случайно отобранных одиночных LTR, обладающих промоторной активностью согласно данным GREM, нам удалось при помощи метода 5'RACE с точностью до нуклеотида картировать точку начала транскрипции (Рис.6). Во всех случаях, транскрипция инициировалась с одного и того же неканонического промотора, расположенного на границе участков R и U5 последовательности HS LTR.

Рисунок 6. Картирование точки начала транскрипции в составе последовательнсти LTR. A), картирование 5'-концевых частей кДНК, полученных в ходе ПЦР с праймером CS на 5' конец кДНК и с уникальными геномными праймерами G, на консенсусной последовательности семейства HS группы LTR HERV-K (HML-2). Последовательности потенциальных регуляторных участков даны курсивом. Б), схема ОТ-ПЦР-подхода к определению провирусной точки инициации транскрипции в составе LTR transcription. LTRfor3 и LTRfor4 - это LTR-специфичные праймеры на участки ниже и выше картированной точки начала транскрипции у одиночных LTR, соответственно. Gag - праймер, специфичный для вирусного гена gag. В), выравнивание фрагмента LTR длиной ~300 пн, который обладал промоторной активностью в экспериментах с экспрессией репортёрного гена, и консенсусной последовательности HS HERV-K LTR.

Транскрипционный уровень LTR линейно коррелирует с представленностью соответствующих ELT. Для исследования зависимости между представленностью ELT в библиотеках и транскрипционной активностью LTR, проводили ОТ-ПЦР с парами праймеров, один из которых, направленный наружу от LTR, был специфичным к 3' концевому участку LTR, а второй - к уникальному геномному локусу, лежащему ниже 3'-конца LTR. Уровень транскрипции измеряли относительно гена бета-актина. Для выборки из 20 протестированных HS LTR, частоты встречаемости ELT в библиотеках линейно коррелировали с уровнем соответствующих им транскриптов, измеренным при помощи ОТ-ПЦР для обеих тканей, со значениями коэффициента корреляции 0.91 и 0.89 для паренхимы яичка и семиномы, соответственно. Это свидетельствует об адекватности метода GREM задаче одновременного качественного и количественного анализа промоторной активности исследуемой группы повторов.

5.2 Приложение GREM для поиска промоторно-активных эндогенных ретровирусов, специфичных для ДНК человека

Метод GREM использовали для создания библиотек ELT нормальной паренхимы яичка и соответствующей опухоли, семиномы. Биологические образцы брались от одного и того же пациента, так что распределение ELT между библиотеками отражает ткане - и опухоль-специфичность экспрессии чсЭРВ. Для каждой ткани было отсеквенировано 500 клонов ELT. За вычетом плазмидных перестроек и плохо отсеквенированных последовательностей, осталось 395 и 419 ELT для паренхимы и семиномы, соответственно. Анализ ELT позволил нам однозначно картировать промоторно активные одиночные и 3'-провирусные LTR.

Впервые было проведено полногеномное сравнение in vivo-промоторной активности специфичных для генома человека эндогенных ретровирусов в нормальной и опухолевой тканях. Оказалось, что по крайней мере 50% HS элементов обладают промоторной активностью. Индивидуальные LTR экспрессировались на уровне от ~0.001 до ~3% относительно транскрипции гена бета-актина (Рис.7). Не наблюдалось связи между особенностями первичной структуры HS элементов и их транскрипционной активностью. И наоборот, функциональный статус LTR (одиночный, 5' или 3' провирусный) был одним из важнейших факторов: промоторные силы одиночных и 3' провирусных LTR были почти идентичны в обеих тканях, тогда как 5' провирусные LTR показали более сильную промоторную активность (вдвое и впятеро для паренхимы и семиномы, соответственно; Рис.8). Это свидетельствует о наличии в провирусной последовательности некоторых пока не известных регуляторных элементов.

Рисунок 7. Сравнение относительных уровней транскрипции некоторых генов человека и LTR. Относительные уровни транскрипции определяли при помощи ОТ-ПЦР, относительно уровня гена бета-актина (обозначен как 100%). A, паренхима яичка; Б, семинома.

Кроме того, важнейший фактор, влияющий на промоторную активность LTR - это расстояние от генов. Относительное содержание промоторно активных LTR в ген-богатых локусах значительно выше, чем в локусах, обеднённых генами.

Данные также свидетельствуют в пользу селективного подавления транскрипции 3' провирусных LTR, расположенных в интронах генов. Такая транскрипционная супрессия может быть нацелена на подавление активности провирусных генов, расположенных вблизи генов хозяина. Также в паренхиме яичка наблюдалось существенное понижение промоторной силы одиночных LTR в интронах генов. Это может свидетельствовать о существовании пока неустановленных механизмов подавления активности “лишних" промоторов, созданных мутациями или вирусными вставками, и расположенными вблизи генов или в интронах. Такой механизм может минимизировать деструктивный эффект "незапланированных" транскриптов - например, образование антисмысловых РНК. Многие транскрипционно компетентные LTR были картированы вблизи известных генов, и 86-90% этих генов транскрибируются в яичках. При этом не было выявлено никакой корреляции между уровнем транскрипции генов и соответствующих им LTR.

Рисунок 8. Сравнение относительной промоторной силы одиночных, 5' провирусных и 3' провирусных LTR (на один LTR). Серые и чёрные столбцы представляют относительные промоторные силы LTR указанных типов в паренхиме яичка и в семиноме, соответственно.

Таким образом, было проведено первое исчерпывающее качественное и количественное исследование промоторов человека, предоставленных небольшой группой эндогенных ретровирусов. Конечно, подавляющее большинство ретровирусных последовательностей, занимающих около 8% генома человека, ещё только предстоит исследовать. Но оптимизм внушает то, что разработанная методология вполне позволяет это сделать при наличии необходимых (достаточно скромных) временных и материальных ресурсов.

Детальные результаты картирования и анализа ELT, а также вся имеющаяся на сегодняшний день (31.12.2007) информация по структуре и функциональному статусу соответствующих HS LTR, содержатся в сводной таблице, доступной в Интернет по адресу: http://www.thescientificworld.com/supplements/2007.270/Buzdin_031307_SuppTable1. xls